专利名称：：含有高浓度的芳香族防腐剂的peg-官能化的丝氨酸蛋白酶的制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的丝氨酸蛋白酶制剂(在下文中多次剂量(multidose)药物组合物)，其包括用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的丝氨酸蛋白酶、缓冲剂和芳香族防腐剂。
背景技术：
：凝血因子(bloodclottingfactor)Vila(FVIIa)被证实是一种用于治疗血液凝固病症(bloodclottingdisorders)，比如血友病Α、血友病B、Glanzmann，s血小板机能不全(thrombasthenia)和因子VII(a)缺乏的重要治疗剂。其也常用于增强危及生命的、弥漫性或外科手术难以接近的出血，但是未患有血液凝固病症的人类的血液凝固。目前市售可获得的重组因子Vila(rFVIIa)制剂Novc^even(NovoNordiskA/S,Denmark)是以小瓶(约3.OmL容器体积)呈现，包含1.2mg重组人因子VIIa、5.84mgNaCl、2.94mgCaCl2、2H20、2.64mgGlyGly、0.Hmg聚山梨醇酯80和60.Omg甘露醇的冷冻干燥块(freeze-driedcake)。在使用前，将该产品用2.OmL注射用水(WFI)重构至pH5.5，从而得到约0.6mg/mL浓度的因子Vila。使用防腐的、液体制剂而不是在注射之前立即用WFI重构的冷冻干燥的块存在一些优点。一个这样的优点是防腐的液体更方便使用。防腐的液体的另一个优点是患者或护理者可以由相同的小瓶分几次剂量给药。对于其中必需给药较大量(例如10_20mg)的活化的因子VII多肽(例如rhFVIIa)的治疗应用，利用制剂如Novokven组合物不方便，因为需要给药相当大的体积(例如15-30mL)。因此，还仍然存在浓的FVII多肽制剂的需要，以使适量的FVII多肽可以以小的体积提供。丝氨酸蛋白酶比如因子VII多肽的液体制剂由于自溶(autolysis)而降解，因为它们自身都是生物酶和底物(substrate)。因子II、VII、IX和X是四个这样的丝氨酸蛋白酶的实例。制剂蛋白酶比如FVII多肽对于制药工业是一项重大挑战，因为FVII多肽容易切割同一制剂中的其它FVII多肽，导致它们失活。在液体制剂中，FVII多肽在几小时期间内自失活，当FVII多肽的浓度高时，该问题特别严重。因此，在制备FVII多肽的液体制剂中，自溶是要克服的最大障碍。之前已经描述了包含因子VII抑制剂/稳定剂的因子VII多肽的液体制剂。然而，这些因子VII抑制剂/稳定剂必须与因子VII多肽分子一起注射，这样的因子VII抑制剂/稳定剂对人的作用通常是未知的。WO2005/002615Al公开了一种液体、水性药物组合物，其包括因子VII多肽；适于保持PH范围为约5.0至约9.0的缓冲剂；至少一种包含金属的试剂，其中所述金属选自除了锌以外的氧化态+11的第一过渡族(series)金属；和非离子型表面活性剂。WO2005/016365Al公开了一种液体、水性药物组合物，其包括至少0.01mg/mL的因子VII多肽(i)；适于保持PH范围为约5.0至约9.0的缓冲剂(ii)；和至少一种包括-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2基序的稳定剂(iii)(例如苯甲脒或精氨酸)。多次剂量制剂对于可注射的药物产品来说是有利的。如果经几天的数个注射剂量取自于同一小瓶，防腐剂经常是管理机构的要求。在可注射的产品中，已经使用了大量不同(S.Nema,N.R.WashkuhnandR.J.Brendel=Excipientsandtheiruseininjectableproducts,PDAJournalofPharmaceuticalScienceandTechnology51(4),166-171)ο然而，防腐剂的存在通常降低了因子VII多肽的溶解性，这是与在液体中的这样的丝氨酸蛋白酶的制剂相关的另一个主要问题。存在包括相对高浓度的活化因子VII多肽和防腐剂的新的多次剂量液体药物组合物的需要。发明简述本发明涉及具有在溶液中提高的稳定性的可溶性FVII多肽的形成。本发明还涉及具有在液体溶液中的提高的稳定性的经稳定的FVII多肽的形成。本发明人已经制备了FVII多肽液体制剂，其适于多次剂量的收回(retraction)。这样的制剂可以通过混合芳香族防腐剂与用一个或多个聚乙二醇部分官能化的因子VII多肽获得。在第一个方面，本发明涉及液体、水性药物组合物，其包括(i)因子VII(a)多肽，其用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化，所述PEG部分具有的分子量为至少300Da；(ii)缓冲剂，其适于保持pH在约5.0至约9.0的范围内；和(iii)至少一种芳香族防腐剂，浓度为至少0.lmg/mL。更特别地，本发明涉及液体、水性药物组合物，其包括(i)用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的因子VII(a)多肽，所述PEG部分具有的分子量为5，000-50,OOODa；(ii)适于保持pH在约5.0至约9.0的范围内的缓冲剂；和(iii)至少一种浓度为至少0.lmg/mL的芳香族防腐剂。本发明的第二个方面涉及用作药物的如本文定义的液体、水性药物组合物。本发明的第三个方面涉及如本文定义的液体、水性药物组合物用于制备用于治疗因子VII(a)-应答性病症的药物的用途。本发明的第四个方面涉及用于治疗因子VII(a)-应答性病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给药有效量的如本文定义的液体、水性药物组合物。本发明的第五个方面涉及气密容器，其包含如本文定义的液体、水性药物组合物和任选的惰性气体。本发明的第六个方面涉及用于配制如本文定义的组合物的试剂盒，所述试剂盒包括(a)第一容器，包括冷冻干燥形式的至少所述因子VII多肽(i)；(b)第二容器，包括水性重构液体，所述液体至少包括至少一种芳香族防腐剂(ii)。附图简述图1说明了在包含rFVIIa和间甲酚的溶液中，rFVIIa倾向于随着间甲酚的浓度从0-3mg/ml增加而沉淀更多。图1也图解了在ΙΟΚ-PEG-rFVIIa和间甲酚的[在其它方面相同的]溶液中，ΙΟΚ-PEG-rFVIIa随着间甲酚的浓度从0-3mg/mL增加而沉淀非常少至完全没有。此外，图1显示出。在包含6mg/mL苯酚的溶液中，10k-PEG-rFVIIa比rFVIIa更易溶解(沉淀更少)。发明详述如上所述，本发明在于新的经稳定的液体、水性药物组合物的开发，所述药物组合物包含高浓度的用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的因子VII多肽和相对高浓度的芳香族防腐剂。更特别地，所述液体、水性药物组合物包括(i)因子VII多肽，其用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化，所述PEG部分具有的分子量为至少300Da；(ii)缓冲剂，其适于保持pH在约5.0至约9.0的范围内；和(iii)至少一种芳香族防腐剂，浓度为至少0.lmg/mL。用PEG部分官能化的因子VII多肽(i)因子VII多肽所述药物组合物的生物作用主要是由于存在因子VII多肽，但是可以包括与所述因子VII多肽相结合的其它活性成分。如本文使用的术语“因子VII多肽”包括野生型因子VII(即，具有在美国专利No.4，784，950中公开的氨基酸序列的多肽)，以及显示出相对于野生型因子VII基本上相同的或提高的生物活性的因子VII的变体。术语“因子VII”包括其未切割(酶原)的形式的因子VII多肽，以及已经经蛋白水解加工而产生其相应生物活性形式的那些，其可称为因子Vila。通常，因子VII在残基152和153之间切割而得到因子Vila。术语“因子VII多肽”也包括其中因子VIIa生物活性相对于野生型因子VIIa的活性实质上修饰、稍微或降低的多肽，包括变体。这些多肽包括，但不限于这样的因子VII或因子Vila，其中已经引入了修饰或破坏该多肽的生物活性的特定的氨基酸序列改变。因子VIIa在血液凝固上的生物活性得自其下述能力(1)结合组织因子(TF)，和(2)催化因子IX或因子X的蛋白酶切割，以产生活化的因子IX或X(分别为因子DCa或Xa)。为了评价本发明成功的目的，可以通过参照本文描述的测定(aSSay)4测量制剂促进血液凝固的能力来量化该液体配制的因子VII多肽的生物活性(“因子VII生物学活性”)。在该测定中，生物活性表示为相对于对照样品凝血时间的减少，并且与包含1单位/mL因子VII活性的混合(pooled)人血清标准相比将其转化成“因子VII单位”。可选地，因子VIIa生物活性可以通过下述方式量化(i)在包括嵌入类脂膜的TF和因子X的系统中，测量因子VIIa或因子VII相关多肽产生活化的因子X(因子Xa)的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；(ii)在水性体系中，测量因子X水解(“InVitroProteolysisAssay(体外蛋白水解分析)”，参见下文的测定幻；(iii)利用基于表面等离子体共振的装置测量因子VIIa或因子VII-相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBSLetts.413:359-363,1997)；(iv)测量因子VIIa和/或因子VII相关多肽导致的合成底物的水解(“hVitroHydrolysisAssay(体外水解测定)”，参见下文的测定1)；或(ν)在TF-非依赖性的体外系统中，测量凝血酶的产生(参见下文的测定3)。相对于野生型因子VIIa具有基本上相同或提高的生物活性的因子VII变体包括，当在如上所述的一种或多种凝固测定(测定4)、蛋白水解测定(测定幻或TF结合测定中试验时，显示在相同细胞类型中产生的因子VIIa的特异活性的至少约25%，优选至少约50%，更优选至少约75%和最优选至少约90%的的那些。相对于野生型因子VIIa具有基本上降低的生物活性的因子VII变体包括，当在如上所述的一种或多种凝固测定(测定4)、蛋白水解测定(测定2)或TF结合测定中试验时，显示低于约25%，优选地低于约10%，更优选地低于约5%和最优选低于约1%的在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的特异活性的那些。具有相对于野生型因子VII实质上地修饰的生物活性的因子VII变体包括，但不限于，显示TF-非依赖性因子X蛋白分解活性的因子VII变体及结合TF但不会切割因子X的因子VII变体。因子VII的变体，不论是否显示与野生型因子VII实质上相同或更好的生物活性，或，可选择地，显示相对于野生型因子VII实质上修饰或降低的生物活性，包括但不限于，通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代而具有不同于野生型因子VII序列的氨基酸序列的多肽。具有与野生型因子VII基本上相同生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括S52A-FVIIa,S60A_FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352182-192，1998)；显示增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体，如在美国专利No.5，580，560所公开的；在残基290和291之间或残基315和316之间被蛋白水解切割的因子Vila(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48:501-505,1995)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等，Arch.Biochem.Biophys.363=43-54,1999)；如在PCT/DK02/00189中公开的FVII变体；和显示增加的蛋白水解稳定性的FVII变体，如在W002/38162中公开的(ScrippsResearchInstitute)；如在WO99/20767中公开的(UniversityofMinnesota)具有修饰的Gla结构域(domain)并显示增强的膜结合的FVII变体；和如在WO01/58935中公开的(MaxygenApS)FVII变体。具有与野生型FVIIa相比增加的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括如在WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、WO03/27147、WO03/37932、WO02/38162(ScrippsResearchInstitute)中公开的FVII变体；和如在JP2001061479(Chemo-Sero-TherapeuticResInst.)中公开的具有增强活性的FVIIa变体。具有相对于野生型因子VII实质上降低或修饰的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem29:3413-3420,1990)、S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.270:66-72,1995)、FFR-FVIIa(Hoist等人，Eur.J.Vase.Endovasc.Surg.15:515-520,1998)和缺失Gla结构域的因子Vila(Nicolaisen等人，FEBSLetts.317:245-249,1993)。因子VII多肽的实例包括，但不限于野生型因子VII、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII,V158D/M298K-FVII、andS336G_FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII,L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII,L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII,L305V/V158T/M298Q-FVII,L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/K316H-FVII,S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII,M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVII,S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII,K316Q/L305V/E296V-FVII,K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII,F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII,F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII,F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII,F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII,F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII,F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-因子VII、S60A-因子VII；R152E-因子VII、S344A_因子VII、缺失Gla结构域的因子VIIa；和PllQ/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G29IN-FVII、R315N/V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在233Thr到240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII，在304Arg到329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII，及在氨基酸序列Ilel53-Arg223中具有取代、缺失或添加的FVII。在某些实施方案中，所述因子VII多肽为人因子VIIa(hFVIIa)，优选重组(recombinant)人因子Vila(rhVIIa)。在其它的实施方案中，所述因子VII多肽为因子VII序列变体。在某些实施方案中，所述因子VII多肽具有不同于野生型人因子VII的糖基化。在目前大多数感兴趣的实施方案中，所述蛋白质为其活化形式的因子VII多肽。在多个实施方案中，例如其中所述因子VII多肽为因子VII相关多肽或因子VII序列变体的那些，当在如本说明书描述的“体外蛋白水解测定”(测定幻中试验时，因子VII多肽的活性和天然人因子(nativehumanfactor)Vila(野生型FVIIa)的活性之间的比例为至少约1.25、优选的至少约2.0或4.0、最优选的至少约8.0。在某些实施方案中，所述因子VII多肽为因子VII相关多肽，特别是变体，其中当在如所述的"体外水解测定"(参见下文的测定1)中试验时，所述因子VII多肽的活性和天然人因子Vila(野生型FVIIa)的活性之间的比例为至少约1.25；在其它的实施方案中，所述比例为至少约2.0；在进一步的实施方案中，所述比例为至少约4.0。在药物组合物中，通常期望活性成分的浓度使得应用的单位剂量不引起不必要的患者不适。因此，通常不期望超过约2-10mL的单位剂量。因此，为了本发明的目的，因子VII多肽的浓度通常比较高，即至少0.lmg/mL。在不同的实施方案中，因子VII多肽的存在浓度为0.l-90mg/mL；0.5_80mg/mL；1.0_80mg/mL；1.5_70mg/mL；2_60mg/mL；3_50mg/mL；或5-50mg/mL；或10_50mg/ml；或15-50mg/mlo因子VIIa的浓度方便地表示为mg/mL或IU/mL，Img通常代表43，000-56,000IU未修饰的rFVIIa。(对于PEG化(pegylated)的因子Vila，该特异活性可以降低)。因子VII多肽典型地表示为其中一个或多个寡核苷酸共价连接到多肽链的氨基酸的糖型(glycoform)，最典型地为天门冬酰胺-连接的(N-连接的)或丝氨酸-连接的(0-连接的)。因子VII的天然存在的糖基化位点在位置Asn-145(N145)、Asn-322(N322)、Ser-52(S52)和Ser-60(S60)。PEG部分根据本发明，术语“用PEG部分官能化的”与术语“PEG化的”是同义的。代表因子VII多肽的官能化的一个或多个PEG部分共价连接到因子VII多肽的多肽主链的任何部分或共价连接到为因子VII多肽组成部分的低聚糖(“糖基PEG化的(glycopegylated)因子VII多肽”)。糖基PEG化的因子VII详细描述在申请人之前的申请WO2004/000366Al和WO2005/014035Al中。这就是说，所述PEG部分通常具有的分子量为至少300Da，比如300-100，OOODa；比如约5，000-50，OOODa；比如约10，000至约45，OOODa；比如约35，000至约45，000；比如约39，000至42，OOODa,比如约40，000至约41，OOODa；比如约500-20，OOODa,或500-15，OOODa,或2，000-15，OOODa,或3，000-15，OOODa,或3，000-12,OOODa,或约10Da。所述PEG部分可以是直链或支链的。术语40K指约40，000至41，OOODa的PEG部分。如对于本领域技术人员显而易见的是，所述PEG部分可以需要“连接基团”，以使该PEG部分连接至如上所述的因子VII多肽。术语“连接基团”是用来指能够连接聚合物分子的低聚糖部分的官能团。有用的连接基团为例如、胺、羟基、羧基、醛、酮、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜或卤代乙酸酯。在与聚合物反应之前，所述低聚糖部分上的连接基团可以被活化。可选地，在与低聚糖部分反应之前，所述聚合物上存在的基团可以被活化。所述活化基团，无论是否存在于低聚糖部分或聚合物部分上，都可以是活化的离去基团的形式。术语活化的离去基团包括在有机-或酶-调节的取代反应中容易被替换的部分。活化的离去基团是本领域已知的，参见例如Vocadlo等人，InCarbohydrateChemistryandBiology,Vol2,Wiley-VCHVerlag,Germany(2000)；Kodama等人，TetrahedronLetters34:6419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.274:37717(1999)。用于活化聚合物的方法和化学过程描述在文献中。用于活化聚合物的通常使用的方法包括用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、二环氧化物、环氧氯丙烷、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等(参见例如^υ1ογ(1991)活化官能团，Proteinimmobilization,FundamentalsandApplications,MarcelDekker,N.Y.；Wong(1992),ChemistryofproteinConjugationandCrosslinking,CRCPress,BocaRaton；Hermanson等人，(1993),ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,N.Y.；Dunn等人，Eds.PolymericDrugsandDrugDeliverySystems,ACSSymposiumSeriesVol.469,AmericanChemicalSociety,1991.)用于实施本发明的反应的活性基团和种类通常为在相对温和条件下进行的那些。这些包括，但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)和加成(addition)到碳-碳和碳-杂原子键(例如迈克尔反应，Diels-Alder加成反应)。这些及其它有用的反应描述在例如March，AdvancedOrganicChemistry，第3版，JohnWiley&Sons,N.Y.1985；Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego,1996;Feeney等人，ModificationsofProteins,AdvancesinChemistrySeries,Vol.198,AmericanChemicalSociety,1982。可以选择所述反应性官能团，以使它们不会参与或干扰组合(assemble)低聚糖和聚合物部分所必需的反应。可选地，可以通过保护基团的存在保护反应性官能团以防止其参与反应。对于有用的保护基团的实例，参见例如Greene等人，ProtectivegroupsinOrganicSynthesis,JohnWiley&Sons,N.Y.,1991。用于将糖类连接到其它分子的一般方法是在文献中已知的(参见，例如Lee等人，Biochemistry28:1856(1989)；Bhatia^A,Anal.Biochem.178:408(1989)Janda^A,J.Am.Chem.Soc.112:8886(1990)；和Bednarski等人，WO92/18135。缓冲剂(ii)为了使所述液体、水性药物组合物用于直接肠胃外(parenteral)给药至哺乳动物比如人类，通常需要所述组合物的PH值保持在合理的限度内，比如约5.O至约9.O。为了在给定条件下确保合适的PH值，所述药物组合物还包括适于保持pH在约5.O至约9.O范围内的缓冲剂(ii)。术语“缓冲剂”包括保持溶液pH在约5.0至约9.0的可接受范围的那些试剂或试剂的组合。在一个实施方案中，所述缓冲剂(ii)为至少一种选自下述的组分MES、PIPES、ACES、BES,TES,HEPES,TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸(例如乙酸钠或乙酸钙)、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸的酸和盐。应当理解所述缓冲剂可以包括两种或多种组分的混合物，其中该混合物能够提供在特定范围内的PH值。这样的缓冲剂的实例为乙酸和乙酸钠。选择缓冲剂的浓度以便保持溶液的优选的pH。在多个实施方案中，缓冲剂的浓度为I-IOOmM；比如l-50mM；比如l_25mM；或2_20mM。在一个实施方案中，所述组合物的pH值保持从约5.0至约8.0；比如从约5.0至约7.5；从约5.0至约7.0；从约5.0至约6.5，从约5.0至约6.0,从约5.5至约7.0；从约5.5至约6.5，从约6.0至约7.0,从约6.4至约6.6，或从约5.2至约5.7。芳香族防腐剂(iii)所述药物组合物进一步包括至少一种浓度为至少0.lmg/mL的芳香族防腐剂(iii)ο组合物中通常包括防腐剂以抑制微生物生长；即芳香族防腐剂具有抑菌/杀菌作用。然而，本发明人发现芳香族防腐剂与抗氧化剂组合对因子VII多肽在水性溶液的的稳定性还有非常显著的影响，特别地以相当高浓度下配制的那些。在下文中，术语“芳香族”指在其结构中包含碳原子的6元不饱和环(即苯环)的化合物。本发明的芳香族防腐剂的实例包括苯酚、苯甲醇、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、氯甲酚、羟苯甲酸甲酯(methylparaben)、羟苯甲酸丙酯、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)禾口节索氯铵(benzethoniumchloride)。在本发明的一个实施方案中，所述至少一种芳香族防腐剂(iii)为间甲酚和/或苯酚和/或苯甲醇和/或氯甲酚。该至少一种芳香族防腐剂(iii)通常以0.1-30.Omg/mL,比如0.1-20.0mg/mL的浓度包括，所述浓度取决于芳香族防腐剂的PH范围和类型。例如，典型的浓度是1.0-5.Omg/mL,比如1.0-4.0mg/mL的间甲酚；1.0-10.0mg/mL,比如l_6mg/mL的苯酚；5.0-30.0mg/mL,比如5.0-20.0mg/mL的苯甲醇；或1.0-5.0mg/mL,比如1.0-3.0mg/mL的氯甲酚。抗氧剂(iv)已经发现，可以通过混合芳香族防腐剂(iii)和抗氧剂(iv)进一步增强因子VII多肽在水性组合物中的稳定性。所述至少一种抗氧剂的存在浓度通常为至少0.lmg/mL。在不同的实施方案中，所述至少一种抗氧剂(iv)选自L-蛋氨酸、D-蛋氨酸、蛋氨酸类似物、包含蛋氨酸的肽、蛋氨酸同系物、抗坏血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽(gluthatione)、胱氨酸和胱硫醚(cysstathionine)。在一个优选的实施方案中，所述抗氧剂为L-蛋氨酸。所述至少一种抗氧剂的浓度通常为0.1-5.0mg/mL,比如0.1-4.0mg/mL、0.1-3.0mg/mL>0.1-2.0mg/mL或0.5-2.0mg/mL。其它组分所述液体、水性药物组合物除了包括上述组分之外，还可以包括对于所述组合物制备、制剂(formulation)或给药有利的其它组分。在某些实施方案中，所述组合物进一步包括张力调节剂(tonicitymodifyingagent)(ν)。如本文使用的术语“张力调节剂”包括有助于所述溶液重量克分子渗透浓度(osmolality)的试剂。所述张力调节剂(ν)包括至少一种选自下述的试剂中性盐、氨基酸、2-5个氨基酸残基的肽、单糖、二糖、多糖和糖醇。在某些实施方案中，所述组合物包括两种或多种这样的试剂的组合。“中性盐”指当溶于水溶液中时既不是酸性也不是碱性的盐。在一个实施方案中，至少一种张力调节剂(V)为选自下述的中性盐钠盐、钾盐、钙盐和镁盐，比如氯化钠、氯化钾、氯化钙、醋酸钙、葡糖酸钙、乙酰丙酸钙(calciumlaevulate)、氯化镁、乙酸镁、葡糖酸镁和乙酰丙酸镁。在一个进一步的实施方案中，所述张力调节剂(V)包括氯化钠与选自氯化钙、乙酸钙、氯化镁和乙酸镁的至少一种的组合。在一个更进一步的实施方案中，所述张力调节剂(V)为选自氯化钠、氯化钙、蔗糖、葡萄糖和甘露醇的至少一种。在不同的实施方案中，所述张力调节剂(ν)的存在浓度为至少ImM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM、至少100mM、至少200mM、至少400mM、至少800mM、至少lOOOmM、至少1200mM、至少1500mM、至少1800mM、至少2000mM或至少2200mM。在一系列的实施方案中，所述张力调节剂(ν)的存在浓度为5_2200mM，比如25-2200mM,50-2200mMU00-2200mM,200-2200mM,400-2200mM,600-2200mM,800-2200mM,1000-2200mM、1200-2200mM、1400-2200mM、1600-2200mM、1800-2200mM或2000_2200mM；5-1800mM、25-1800mM、50-1800mM、100-1800mM、200-1800mM、400-1800mM、600-1800mM、800-1800mM、1000-1800mM、1200-1800mM、1400-1800mM、1600-1800mM；5_1500mM、25-1400mM、50-1500mM、100-1500mM、200-1500mM、400-1500mM、600-1500mM、800-1500mM、1000-1500mM、1200-1500mM；5-1200mM、25-1200mM、50-1200mM、100-1200mM、200-1200mM、400-1200mM、600-1200mM或800_1200mM.在本发明的一个优选的实施方案中，至少一种张力调节剂(ν)为离子强度调节剂(ionicstrengthmodifyingagent)(v/a)0如本文使用的术语“离子强度调节剂”包括有助于溶液离子强度的试剂。所述试剂包括，但不限于中性盐、氨基酸、2至5个氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，所述组合物包括两种或多种这样的试剂的组合。离子强度调节剂(v/a)的优选的实例是中性盐，比如氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁。优选的试剂(v/a)是氯化钠。术语“离子强度”是溶液的离子强度(μ)，其由如下等式定义μ=1/2Σ([i](Zi2)),其中μ是离子强度，[i]是离子的毫摩尔浓度，&是所述离子的电荷(+或_)(参见，例如，Solomon，JournalofChemicalEducation,78(12):1691—92，2001JamesFritzandGeorgeSchenkQuantitativeAnalyticalChemistry,1979)0在本发明的不同的实施方案中，所述组合物的离子强度为至少50mM，比如至少75mM、至少lOOmM、至少150mM、至少200mM、至少邪臓、至少400mM、至少500mM、至少650mM、至少800mM、至少lOOOmM、至少1200mM、至少1600mM、至少2000mM、至少2400mM、至少^OOmM或至少3200mM。在某些特定的实施方案中，张力调节剂(ν)和离子强度调节剂(v/a)的总浓度为l-500mM的范围，比如l-300mM、或10_200mM或20_150mM，取决于任何其他成分可能对张力和离子强度的影响。在一个实施方案中，所述组合物为等渗的；在另一个实施方案中，其为高渗的。术语“等渗的”指“与血清等渗”，S卩，约300士50毫渗透分子/kg。张力指在给药前溶液的重量克分子渗透浓度的测量值。术语“高渗的”指高于血清生理性水平的重量克分子渗透浓度的指定水平，比如高于300士50毫渗透分子/kg的水平。本发明的特定实施方案还涉及芳香族防腐剂(iii)和抗氧剂(iv)与相当高浓度的选自钠盐、钙盐和镁盐的离子强度调节剂(v/a)的组合。在该实施方案中，所述离子强度调节剂(v/a)(即所述钠盐、钙盐和/或镁盐)以15-1000mM,比如25-1000mM、50-1000mM、100-1000mM、200-1000mM、300-1000mM、400-1000mM、500-1000mM、600-1000mM、700-1000mM；15-800mM、25-800mM、50_800mM、100_800mM、200_800mM、300_800mM、400_800mM、500_800mM；15-600mM、25-600mM、50-600mM、100-600mM、200-600mM、300-600mM；15-400mM、25_400mM、50-400mM或100_400mM的浓度存在。在这些实施方案之内，所述钠盐可以是氯化钠，所述钙盐可选自氯化钙、乙酸钙、葡糖酸钙和乙酰丙酸钙，所述镁盐可选自氯化镁、乙酸镁、葡糖酸镁、乙酰丙酸镁和强酸的镁盐。在一个更具体的实施方案中，钙盐和/或镁盐与氯化钠组合使用。在一个目前优选的实施方案中，所述组合物包括一种或多种选自钙(Ca2+)盐和镁(Mg2+)盐的离子强度调节剂，例如一种或多种选自下述的盐氯化钙、乙酸钙、葡糖酸钙、乙酰丙酸钙、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、葡糖酸镁、乙酰丙酸镁、强酸的镁盐。在一个其实施方案中，钙(Ca2+)盐和镁(Mg2+)盐的浓度为至少2mM，比如至少5mM或约10mM。在可以与前述合并的进一步的实施方案中，所述药物组合物还可包括非离子表面活性剂(Vi)。表面活性剂(也称为洗涤剂)通常包括保护所述蛋白质避免空气/溶液界面诱导应力和溶液/表面诱导应力(例如引起蛋白质聚集)的那些试剂。典型类型的非离子表面活性剂为聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamers)、聚氧乙烯烷基醚、聚乙烯/聚丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯硬脂酸酯和聚氧乙烯蓖麻油。非离子表面活性剂的说明性的实例为Tween、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Brij-35(聚氧乙烯十二烷基醚)、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、PEG8000、PlurOniC多元醇、聚氧23月桂基醚、Myrj49和CremophorA，特别是泊洛沙姆188。在一个实施方案中，所述非离子表面活性剂的存在量为0.005-2.0%重量。尽管认为防腐剂和抗氧剂的组合显著地减少了任何其它稳定剂的需要，但是如果期望，原则上可以加入这样的试剂。这样的其它稳定剂的实例为选自下述那些(a)含金属试剂，其中所述金属选自除了锌之外的氧化态+Π的第一族过渡金属；和(b)稳定剂，包括-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2基序的稳定剂关于(a)型稳定剂，这些在WO2005/002615中描述和定义。关于(b)型稳定剂，这些在WO2005/016365中描述和定义(关于Z1、Z2、R1和R2的具体含义是一般明确的)。为了方便起见，尽管还需提及，Z1和Z2独立地选自O、-S-、NRh-和单键，其中Rh选自氢、Ch-烷基、芳基和芳甲基，R1和R2独立的选自氢、任选取代的Cu-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基(heterocyclyl)，或Z2和R2为如上定义的，和C=N-Z1-R1形成杂环环的一部分，或Z1和R1为如上定义和-C-NH-Z2-R2形成杂环环的一部分，或-C(=N-Z1-RO-NH-Z2-R2形成杂环环，其中-Z1-R1-R2-Z2-是双基。然而，在目前优选的实施方案中，所述组合物的所述其它组分中没有一个是因子VII多肽稳定剂。优选的实施方案本发明人目前已经鉴定了特别有利的下述实施方案，S卩，如本文定义的液体、水性药物组合物，其包括(i)l-90mg/mL的用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的因子VII多肽，所述PEG部分具有的分子量为500-60，OOODa；(ii)适于保持pH在约5.0至约9.0的范围内的缓冲剂；(iii)至少一种芳香族防腐剂，浓度为至少0.l-20mg/mL；和(iv)至少一种浓度为至少0.1-5.Omg/mL的抗氧剂。在另一个优选的实施方案中，所述液体、水性药物组合物包括(i)40K-PEG-rFVIIa,(ii)保持pH在约5至约6范围内的缓冲剂，和(iii)浓度为1.0-10.Omg/mL的苯酚或浓度为1.0-5.Omg/mL的间甲酚。在第三个优选的实施方案中，所述液体、水性组合物包括(i)40K-PEG-rFVIIa,(ii)保持pH在约5至约6范围内的缓冲剂，和(iii)苯酚和间甲酚的组合。稳定性在一个实施方案中，根据本发明的组合物用作因子VII多肽的稳定的即用型液体组合物。当在2°C至8°C的温度范围内贮存时，所述即用型液体组合物通常稳定至少6个月，优选地至多36个月。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物用作在使用前用水性液体重构的干燥组合物(drycomposition)，所述液体包含芳香族防腐剂。当在25°C下贮存时，所述冷冻干燥的组合物通常稳定至少6个月，优选地至多36个月。当在2°C至8°C的温度范围内贮存时，通过混合所述干燥组合物与重构液体得到的液体组合物通常稳定至少一周，优选地至多4周或更长。术语“稳定”意味着表示，⑴在2°C到8°C贮存6个月后，如按照一阶段凝血测定(测定4)来测量，组合物保留其初始生物活性的至少50%，或(ii)在2°C到8°C贮存6个月后，重链降解产物(heavychaindegradationproducts)的含量为至多40%(w/w)，假定初始样品不包含重链降解产物的话(即，仅仅因子VII多肽进入百分数的计算)。优选地，在2至8°C贮存6个月之后，所述组合物保持至少70%、比如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的其初始活性。还优选地，所述组合物中重链降解产物的含量为至多30%(w/w)、至多25%(w/w)、至多20%(w/w)、至多15%(w/w)、至多10%(w/w)、至多5%(w/w)或至多3%(w/w)ο优选地，在2°C至8°C贮存6个月后，所述稳定的组合物保持至少70%，比如至少80%，或至少85%，或至少90%，或至少95%的其初始活性。优选地，在多个实施方案中，稳定的组合物中的重链降解产物的含量为至多30%(w/w)、至多25%(w/w)、至多20%(w/w)、至多15%(w/w)、至多10%(w/w)、至多5%(w/w)或至多3%(w/w)。使用方法如应当理解的，本文定义的液体、水性药物组合物可用于药物领域。因此，本发明提供用作药物、特别地用作治疗因子VII(a)-应答性病症的药物的本文定义的液体、水性药物组合物。因此，本发明还提供如本文定义的液体、水性药物组合物用于制备用于治疗因子VIKa)应答性病症的药物的用途，以及用于治疗因子VII(a)应答性病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给药有效量的如本文定义的液体、水性药物组合物。本发明的制剂可用于治疗任何因子VII应答性病症，比如例如出血病症(bleedingdisorders),包括由于凝血因子缺乏(clottingfactordeficiencies)弓|起的那些(例如，血友病A、血友病B、凝血因子XI不足、凝血因子VII缺乏(coagulationFactorXIdeficiency))；血小板减少症或维勒布兰德病或者由凝血因子抑制剂(clottingFactorinhibitors)弓丨起的那些；以及脑内出血(intracerebralhaemorrhage),或任何原因的大量出血。所述制剂也可以给药外科手术或其它创伤相关联的人或接受抗凝治疗疗(anticoagulanttherapy)StJ^Ao术语“有效量”是由有资格的执业医师确定的剂量，该医师可以调节剂量以获得期望的应答。关于剂量需要考虑的因素包括功效(potency)、生物利用度、期望的药物代谢动力学/药效学特征、治疗的病症(conditionoftreatment)、患者相关因素(体重、健康、年龄等)、共同给药的药物(例如，抗凝剂)的存在、给药时间或执业医生已知的其他因素。术语“治疗”被定义为为了抗击疾病、病症或障碍(disorder)，对受试者(例如哺乳动物，特别是人)的处置和护理，并包括给药因子VII多肽以预防症状或并发症的发作，或减轻症状或并发症，或消除疾病、病症或障碍。包含因子VII多肽的根据本发明的药物组合物可以肠胃外给药至需要这样的治疗的受试者。肠胃外给药的非排他性实例是皮下、肌肉或静脉注射进行，任选地利用笔样装置或输液泵(infusionpump)。在重要的实施方案中，所述药物组合物适合于根据已知的方法皮下、肌肉或静脉注射。气密容器因此，本发明还提供包含如本文定义的液体、水性药物组合物及任选的惰性气体的气密容器(例如小瓶或药筒(cartridge)(比如用于笔样施用器的药筒))。惰性气体可以选自氮气、氩气等。所述容器(例如小瓶或药筒)通常由玻璃或塑料特别是玻璃制成，任选的用橡胶隔片(s印turn)或允许针穿透的其它密闭装置密封，以维护药物组合物的完整性。在进一步的实施方案中，所述容器是封入密封袋的小瓶或药筒，所述密封袋为例如密封的塑料袋，比如层压的(例如金属(比如铝)层压塑料袋)。包括冷冻干燥的因子VII多肽的试剂盒上述定义的液体、水性药物组合物主要预期用于直接使用，通常用于肠胃外给药，例如通过注射。但是，还期望该液体、水性药物组合物可以由执业医师或最终用户在实际肠胃外使用前的一段时间由相应的冻干制剂制备，所述时间例如使用前1-小时，或甚至数周，例如使用前2-4周，例如以多次剂量批次的形式使用。在这种情况下，对执业医师或最终用户而言，接受冷冻干燥形式的因子VII多肽与合适量的水性重构液体是方便的。因此，本发明的进一步的方面涉及用于制备如本文定义的组合物的试剂盒，所述试剂盒包括(a)第一容器，包括至少冷冻干燥形式的用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的因子VII多肽(i)；(b)第二容器，包括水性重构液体，所述液体至少包括缓冲剂(ii)和至少一种芳香族防腐剂(iii)。在某些实施方案中，第一容器和第二容器可以安排为装置的分离隔室，例如用于注射器装置的安瓿(ampoule)，例如笔。实施例一般方法当提及溶于溶液中的固体和混合到溶液中的液体时，百分数为(重量/重量)。例如，泊洛沙姆188指100%储备溶液(stock)的重量/溶液的重量。适于测定因子VII多肽的生物活性的测定通过合适的测定选择根据本发明有用的因子VII多肽，所述测定可以作为简单的初步体外试验进行，所述初步体外试验即为第一生成凝固测定(1stgenerationclotassay)、体外水解测定、凝血酶生成测定、一阶段凝固测定(one-stagecoagulationassay)和因子X生成测定。测定值可以与野生型FVIIa的那些比较。体外水解测定(测定1)使用体外水解测定评价因子VIIa多肽切割另一种肽或蛋白的能力。可以测定天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(两者以下都称为“因子Vila")的特异活性。也可平行测定它们以直接比较它们的特异活性。所述分析在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行。将最终浓度ImM的显色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺(S-2288,Chromogenix,Sweden)加入到在包含0.IMNaCl、5mMCaCl2和lmg/mL牛血清白蛋白的50mMHEPES,pH7.4中的因子Vila(最终浓度IOOnM)中。在SpectraMax340平板阅读器(platereader)(MolecularDevices,USA)中连续地测量在405nm的吸收率。在20分钟培养期间发展的吸收率，在减去不含酶的空白孔的吸收率后，用于计算因子VII多肽和野生型因子VIIa的活性之间的比例比例=(A405nm因子VII多肽)/(A405nm野生型因子Vila)基于此，可以鉴定出与天然因子Vila相比活性更低、相当或更高的因子VII多肽，比如，例如，其中因子VII多肽的活性与天然因子VII(野生型FVII)的活性之间的比例为约1.0对高于1.O的因子VII多肽。在该测定中测量的活性有时称为“酰氨水解活性(amidolyticactivity)”。因子VII多肽的活性还可以使用生理底物比如因子X来测量(“体外蛋白水解测定”)，合适地以IOO-IOOOnM的浓度，其中在加入合适的显色底物(例如S-276Q之后测量产生的因子fe。此外，可以在生理温度下进行所述活性测定。体外蛋白水解测定(测定2)对天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(两者以下都称为“因子Vila”)进行平行测定以直接比较它们的特异活性。所述测定在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行。将在包含0.IMNaCl、5mMCaCl2禾口lmg/mL牛血清白蛋白的100μL50mMHEPES，pH7.4中的因子VIIa(IOnM)和因子X(0.8μΜ)培养15分钟。然后通过加入包含0.IMNaCl，20mMEDTA和lmg/mL牛血清白蛋白的50μL50mMHEPES,pH7.4来终止因子X切割。通过加入最终浓度0.5mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix,Sweden)来测量产生的因子Xa的量。在SpectraMax340平板阅读器(MolecularDevices,USA)中连续地测量在405nm的吸收率。在10分钟期间发展的吸收率，在减去不含FVIIa的空白孔的吸收率后，用于计算因子VII多肽和野生型因子VIIa的蛋白水解活性之间的比例比例=(A405nm因子VII多肽)/(A405nm野生型因子Vila)基于此，可以鉴定出与天然因子Vila相比活性更低、相当或更高的因子VII多肽，比如，例如，其中因子VII多肽的活性与天然因子VII(野生型FVII)的活性之间的比例为约1.0对高于1.0的因子VII多肽。一阶段凝固测定(凝固测定)(测定4)使用该凝固测定评价因子VIIa多肽使血液凝固的能力。还可以使用一阶段凝结测定来测定因子VII多肽的特异活性。为此目的，将待测样品稀释在50mMPIPES-缓冲液(pH7.2),1%BSA中，并将其40μ1与40μ1的因子VII不足的血浆及80μ1的包含IOmMCa2+和合成磷脂的的人重组组织因子(humanrecombinanttissuefactor)培养。测量凝固时间(凝血时间)，并且与在平行线测定中使用参考标准的标准曲线进行比较。因子X的活化(测定5)可以通过使用活化测定(测定5)来测定因子VII多肽活化凝固因子X的能力。为此目的，将脂质化(Iipidated)的TF(IOpM)和待测样品在BSA缓冲液(参见测定4)中稀释至IOOpM的浓度，并且在室温下培养60分钟，之后加入因子X(50nM)。在另外10分钟之后，通过加入1/2体积的终止缓冲液(50mMH印es，pH7.4,IOOmMNaCI,20mMEDTA)终止反应。通过加入底物S2765(0.6mM，Chromogenix))))测量产生的因子)(a的量，并且在405nm连续地测定吸收率10分钟。高分子量蛋白(HMWP)的含量使用尺寸排阻(size-exclusion)HPLC方法确定在40K-PEG_rFVIIa制剂中高分子量蛋白(HMWP)的相对含量。HMWP含量的测定-HMWPGPC方法在非分离条件下，使用SE-HPLC尺寸排阻色谱法方法分析样品的HMWP含量。使用的柱是iTosohBioscienceTSKgelG4000SWXL或具有类似规格的柱。通过在21-25°C下等度洗脱，接着在215nmUV-检测来进行分析试验。所述洗脱缓冲液包含25mMBis-Tris丙烷、IOmM乙酸钙、20%异丙醇，缓冲至pH6.8。样品的正常运行时间是40分钟。色谱通常由两个小峰和接着的两个主峰组成。显示出最短保留(retention)的两个小峰-具有最低保留的聚合物峰，接着是对应于二PEG化(di-pegylated)的FVIIa单体和单-PEG化的FVIIa的二聚物的峰。这些接着是主峰单-PEG化的FVIIa的单体和盐的峰。重链裂解(fragmentation)泖丨定为了测定重链裂解产物的含量的目的，在ACE3μmC4，300人，4.6XIOOmm柱上进行反相HPLC(AdvancedChromatographyTechnologies,part.no.ACE-213-1046)。柱温60°C。A-缓冲液0.05%v/v三氟乙酸。B-缓冲液0.06%v/v三氟乙酸，80%v/v乙腈。变性缓冲液(denaturationbuffer):6M盐酸胍，50mMTris，5mM氯化钙，pH7.5。由50μ1分析试样+50μ1变性缓冲液+5μ1DTT+1μ1乙酸制备样品，并且在60°C下培养15分钟。在30分钟内，从35%到80%B的线性梯度洗脱柱。流速0.7mL/min。检测214nm。填充量25μgFVIIa0从重链降解产物的测量含量中减去重链降解产物的初始含量，即，重链降解产物的初始含量被设为0%。则在时间χ的重链降解产物的含量按如下计算%=(HCDP(X)-HCDP(0))/(HCDP(x)-HCDP(0)+FVII(χ))X100%=(HCDP(χ)-HCDP(0))/(FVI1(0))X100%其中HCDP(x)是在时间χ测量的重链降解产物的含量，HCDP(O)是测量的重链降解产物的初始含量，和FVII(X)是在时间χ的完整因子(intactfactor)VII多肽的含量。因子VII多肽的制备和纯化适用于本发明的纯化的人因子VIIa优选地通过DNA重组技术制备，例如描述在Hagen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2412-2416,1986，或描述在欧洲专利No.0200421(ZymoGenetics,Inc.)中。因子VII还可以按照以下描述的方法产生=Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)1242-1247，1980以及Hedner和Kisiel,J.Clin.Invest.71:1836-1841,1983。这些方法产生因子VII而没有可检测数量的其它凝血因子。可以通过包括另外的凝胶过滤作为最终纯化步骤获得甚至进一步纯化的因子VII制品(pr印aration)。然后通过已知的方法，例如通过几种不同的血浆蛋白，比如因子XIIa、I)(a或Xa，将因子VII转化为活化的因子Vila。可选地，如Bjoern等人所述(ResearchDisclosure，洸9，1986年9月，第564-565页)，可以通过将因子VII穿过离子交换色谱柱，比如如MonoQ(PharmaciafineChemicals)等，或通过在溶液中的自体活化来活化因子VII。可以通过野生型因子VII的修饰或通过重组技术产生因子VII相关多肽。通过已知的方法，例如通过位点特异性诱变(mutagenesis)，通过在编码天然因子VII的核酸中改变氨基酸密码子或者去除一些氨基酸密码子来修饰(modify)编码野生型因子VII的核酸序列，可以产生与野生型因子VII相比具有改变的氨基酸序列的因子VII相关多肽。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在对因子VIIa分子的功能关键的区域以外进行取代，并仍然得到活性多肽。可以根据本领域已知的方法，比如定点诱变(site-directedmutagenesis)或丙氨酸扫描诱变(参见，例如，CunninghamandWells,1989，Science244:1081-1085)，鉴定对因子VII多肽活性所必需的并因此优选不进行取代的氨基酸残基。在后一技术中，对分子中每个带正电荷的残基引入突变(mutation)，然后对得到的突变分子进行凝结、分别交联活性检测(testedforcoagulant,respectivelycross-linkingactivity)以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。利用核磁共振分析、结晶学或光亲和标记(photoaffinitylabelling)(参见，例如，deVos等人，1992，Science255:306-312；Smith等人，1992，JournalofMolecularBiology224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBSLetters309:59-64)的这样的技术测定，通过分析三维结构还可以确定底物-酶相互作用的位点。可以使用本领域已知的任何方法，通过定向诱变实现将突变引入核酸序列以将一种核苷酸替换成另一种核苷酸。特别有用的是以下方法，利用具有所需的插入物的超螺旋双链DNA载体和两条包含期望的突变的合成引物。所述寡核苷酸引物，每条与载体的相反链(oppositestrand)互补，利用PfuDNA聚合酶在温度循环期间延伸。在结合引物时，产生包含交错切口(staggerednick)的突变质粒。在温度循环之后，用DpnI(其对于甲基化和半甲基化的DNA是特异的)处理产物以消化亲代DNA模板，并选择包含突变的合成DNA。还可以使用本领域已知用于产生、鉴定和分离变体的其它方法，比如，例如，基因改组(geneshuffling)或UMlii体展示技术(phagedisplaytechniques)。从多肽的细胞来源分离多肽可以通过本领域已知的任何方法实现，所述方法包括，但不限于从粘附的(adherent)细胞培养物中除去包含期望的产物的细胞培养基；离心或过滤以除去非粘附细胞；等。任选地，因子VII多肽可以被进一步纯化。纯化可以使用本领域已知的任何方法实现，所述方法包括，但不限于亲和色谱法，比如例如，在抗因子VII抗体柱上(参见，例如，Wakabayashi等人，J.Biol.Chem.261:11097,1986；和Thim等人，Biochem.27:7785,1988)；疏水性相互作用色谱法；离子交换色谱法；尺寸排阻色谱法；电泳方法(例如，制备式等电聚焦(IEF))、差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀)或萃取等。一般地参见，Scopes,ProteinPurification，Springer-Verlag,NewYork，1982；禾口ProteinPurification，J.C.JansonandLarsRyden，editors，VCHPublishers,NewYork，1989。纯化后，按重量计，所述制品包含的源自宿主细胞的非因子VII多肽优选地低于10%，更优选的低于5%和最优选的低于1%。因子VII多肽可以通过蛋白水解切割活化，使用具有胰蛋白酶样特异性的因子XIIa或其它蛋白酶，比如，例如，因子IXa、激肽释放酶、因子fci和凝血酶。参见，例如，Osterud等人，Biochem.11:2853(1972)；Thomas，美国专利No4,456，591；和Hedner等人，J.Clin.Invest.71:1836(1983)。可选地，可以通过将其穿过离子交换色谱柱，比如MonoQ(Pharmacia)等，或通过在溶液中的自体活化，来活化因子VII多肽。然后，可以如在本申请中描述制剂和给药得到的活化的因子VII多肽。下列实施例阐述本发明的实施。包括这些实施例只是用于示例性目的，而不意味着以任何方式限制本发明所要求的范围。工作实施例实施例1在NAPlO柱上缓冲交换rFVIIa和10K_PEG_rFVIIa的溶液，得到在pH6.O下包含6.25mMCaCl2和6.25mM组氨酸的缓冲液。然后，制备包含20μ1的rFVIIa或ΙΟΚ-PEG-rFVIIa溶液和5μ1的5mg/mL间甲酚、10mg/mL间甲酚、15mg/mL间甲酚或30mg/mL苯酚的样品。最终浓度为约2.6mg/mLrFVIIa或2.6mg/mL10K-PEG_rFVIIa、5mMCaCl2、5mM组氨酸和1、2或;3mg/mL间甲酚或6mg/mL苯酚。简单地振荡(涡旋)样品，并转移到具有1.5mm光程的15μ1试管(cuvette)中。然后，测量在400nm浊度作为吸收率。高浊度为FVII多肽的大的聚集体沉淀的显示。从该试验可以看出，在防腐剂的存在下，rFVIIa的溶液显示出显著的浊度，表明间甲酚和苯酚诱导样品的沉淀(参见图1)。在另一方面，在防腐剂的存在下，ΙΟΚ-PEG-rFVIIa的溶液显示低的浊度，表明该分子保持可溶(参见图1)。该实施例证实用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化增加了FVIIa在包含芳香族防腐剂的液体制剂中的溶解性。实施例2用IOmMHis、pH5.5、20mMCaCl2、6%蔗糖和0.5mg/mL蛋氨酸配制Mmg/mL的40K-PEG-rFVIIa。将200μ1的样品冷冻干燥，并在:3mg/mL间甲酚或15mg/mL苯甲醇中重构。在重构之后，立即抽出20μ1样品，并在IOmMHis、pH5.5、20mMCaCl2、6%蔗糖中稀释至lmg/mL。然后，将具有低防腐剂含量的这些参比试样贮存在4°C下。也将包含:3mg/mL间甲酚和15mg/mL苯甲醇的样品贮存在4°C下。5周以后，抽出另外20μ1，并稀释至lmg/mL。然后，通过尺寸排阻色谱、凝固活性(clotactivity)和FX活化测定这些样品与参比试样。表1显示了分析结果，凝固活性和FX活化为相对于参比试样获得的值所给出的。这些结果显示出高浓度防腐剂的存在几乎没有引起样品降解。表1在5周之后的凝固活性(参比的％)在5周之后的FX活化(参比的％)二聚物/2-PEG+HMWP(参比)二聚物/2-PEG+HMWP在5周以后实施例3制备一系列糖PET化的40K-PEG-rFVIIa的不同制剂。所有的制剂包含20mg/mL40K-PEG-rFVIIa、IOmM组氨酸、10mg/mL蔗糖、25mg/mL甘露醇、0.07mg/mL吐温80和0.5mg/mL蛋氨酸。在该实施例中，将40K-PEG-rFVIIa的浓度规定为蛋白含量，而没有考虑PEG基。另外，所述制剂具有在表2中规定的条件和组分，如下表23mg/ml间甲酚15mg/ml笨甲醇102%98%100%95%3.3%3.5%3.1%3.5%权利要求1.液体、水性药物组合物，其包括(i)用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的因子VII(a)多肽，所述PEG部分具有的分子量为5，000-50，OOODa；()适于保持PH在约5.0至约9.0的范围内的缓冲剂；和(iii)至少一种浓度为至少0.lmg/mL的芳香族防腐剂。2.根据权利要求1的组合物，其中所述PEG部分具有的分子量在35，000-45，OOODa的范围内。3.根据权利要求1-2中任一项的组合物，其中所述PEG部分为糖基PEG化的。4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述至少一种芳香族防腐剂(iii)为间甲酚和/或苯酚和/或苯甲醇和/或氯甲酚。5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中包括的所述至少一种芳香族防腐剂(iii)的浓度为0.1-30.Omg/mL,比如0.1-20.Omg/mL。6.根据权利要求5的组合物，其中所述芳香族防腐剂(iii)为1.0-5.Omg/mL的间甲酚、或1.0-10.Omg/mL的苯酚、或5.0-30.Omg/mL的苯甲醇或1.0-5.Omg/mL的氯甲酚。7.根据项权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述因子VII(a)多肽的存在浓度为0.l-90mg/mLo8.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其具有的pH值在从约5.0至约8.0的范围内，比如从约5.0至约7.5；从约5.0至约7.0；从约5.0至约6.5、从约5.0至约6.0、从约5.5至约7.0；从约5.5至约6.5、从约6.0至约7.0、从约6.4至约6.6、或从约5.2至约5.7。9.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述缓冲剂(ii)包括至少一种选自下述的组分MES、PIPES、ACES、BES,TES,HEPES,TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸的酸和盐。10.根据项权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述缓冲剂(ii)的浓度为1-lOOmM。11.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其中⑴为40K-PEG-rFVIIa，和其中(ii)保持PH在约5至约6的范围内，和(iii)为浓度1.0-10.Omg/mL的苯酚或浓度1.0-5.Omg/mL的间甲酚。12.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其中⑴为40K-PEG-rFVIIa，和其中(ii)保持PH在约5至约6的范围内，和(iii)为苯酚和间甲酚的组合。13.如权利要求1-11中任一项限定的液体、水性药物组合物，用作药物。14.如权利要求1-12中任一项限定的液体、水性药物组合物在制备用于治疗因子VII(a)-应答性病症的药物中的用途。15.用于治疗因子VII(a)_应答性病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给药有效量的如在权利要求1-13的任一项中定义的液体、水性药物组合物。全文摘要本发明涉及液体、水性药物组合物，其包括用一个或多个聚乙二醇(PEG)部分官能化的因子VII多肽(i)，所述PEG部分具有的分子量为5,000-50,000Da；适于保持pH在约5.0至约9.0的范围内的缓冲剂(ii)；和至少一种浓度为至少0.1mg/mL的芳香族防腐剂(iii)。文档编号A61P7/04GK102065899SQ200980118802公开日2011年5月18日申请日期2009年5月22日优先权日2008年5月23日发明者A·D·尼尔森,C·里舍尔,M·B·詹森申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司