椎间盘的修复和/或重建的制作方法

专利名称：椎间盘的修复和/或重建的制作方法
技术领域：
本发明涉及个体中椎间盘修复和重建的方法，本发明的方法在治疗特征为椎间盘 退变的脊柱疾病状况中是有用的。
背景技术：
椎间盘(IVD)是人体内最大的主要无血管、无神经并且无淋巴的结构。椎间盘对 于脊柱的正常功能至关重要，因为其在轴向压缩、弯曲和伸展中提供柔韧性和机械稳定性。 IVD由数种特定的结缔组织组成(i)软骨终板(CEPs)的透明软骨，所述软骨终板覆盖位于 椎间盘上方和下方的脊椎骨(体)的表面；(ii)封装髓核(NP)的纤维软骨纤维环(AF)；和 (iii)中央胶状的髓核(NP)，尽管其含有软骨样细胞，但其不是透明软骨。已经鉴定出移行 区(TZ)，正如其名称所指，其位于AF和NP之间。纤维软骨AF由同心胶原层(骨板)组成， 所述同心胶原层与椎体的骨边缘连接。蛋白聚糖(PGs)和I型、II型、III型、V型、VI型、IX型、X型、XI型胶原蛋白是所 有这些椎间盘组织的主要基质成分，但它们的相对丰度和分布取决于它们的解剖学定位。 具有对于水分子的高亲和力的P(is在“健康椎间盘”的NP中最丰富。P(}S所吸收的水在NP 内产生流体静力压，所述流体静力压使封装的纤维软骨AF“膨胀”。这些特定的结缔组织及 其各自的生理化学性质的联合有助于IVD的水动力学性质和粘弹性性质，所述水动力学性 质和粘弹性性质是脊柱的正常生物机械功能所必需的。在衰老和退变中，IVD发生显著的基质改变。对于人类尸体和脊柱手术时获得的椎 间盘样本的研究表明，来自中年至老年群体中的个体的椎间盘通常具有大范围的病变(1， 2)。从这些样本中已鉴定出三种主要类型的椎间盘病变(i)边缘病变，即靠近于AF 与椎体边缘的骨的连接横截面缺损；(ii)同心(圆周)撕裂，其中环状骨板彼此分离；和 (iii)辐射状撕裂，其来自始于NP内的裂口的扩展(1，2，3)。边缘病变尤其受到关注，因为 其较常见出现于青春期和成年早期，AF前部内，AF前部靠近于AF在椎骨边缘的骨中的插 入，这提示所述边缘病变可能是机械上介导的。边缘病变的存在提示AF的早期衰竭并且是 椎间盘退变的首要原因，但对尸体样本的研究还表明其他病理学特征(同心撕裂、囊性环 状退变、NP脱水、椎骨边缘韧带骨赘和后椎间关节的骨关节炎)也在某种程度上始终存在 (1，2)。尽管这些各自的椎间盘病变的时间历史仍然是争论的主题，但公认的是来源于P^ 及其相关的水从NP的丢失是椎间盘退变的早期病因学决定因素G)。如已经所讨论的，椎间盘作为柔韧的水弹性垫发挥功能，其很大程度上受NP中水 分子的吸取所调节。NP水含量的减少并由此的膨胀压的减少将导致强加于AF的超生理机 械压迫，导致局部衰竭。90%的人口在他们生活的某些时间会发生起因于椎间盘退变的背部和颈部疼痛 相关的医学问题(5，6)。在人类中，足够的严重程度而需要医疗介入的背部或颈部疼痛的发 生率在30多岁和40多岁时增加，在50多岁时达到高峰并在此后下降(5)。在美国，背部疼痛是就诊的第二位最常见原因，并且背部和颈部疼痛相关的医学
3状况造成多于任何其他肌肉骨骼病症的住院治疗。背部疼痛是损失工作时间的首要原因。 例如，在英国，据估计每年由于该疾病损失超过一千一百万的工作天数。此外，由于在接下 来的几十年人口的长寿增加，所以预计背部和颈部疼痛问题会相应增加。尽管在当今社会中，颈部和背部疼痛具有高发生率和经济负担，但是原因仍了解 很少。然而，达成共识的是，IVD的退变和/或衰竭是疼痛的首要原因，该疼痛或者直接来 自于外部AF中存在的神经或者来自由于椎间盘水弹性功能的丢失而变为机械上受损的邻 近的脊柱结构(7，8，9，10)。椎间盘疾病是所有下背部疼痛病例中23%-40%的原因(11， 12)。外部AF受神经支配并且神经纤维可以延伸到其内部三分之一的深度，因此外部AF的 任何病理学改变可能引起疼痛(13，14，15)。用于治疗椎间盘来源的背部或颈部疼痛的已有模式是以经验为依据的，其致力于 生活方式的改变或者使用抗炎药/镇痛药缓解症状或者可能需要切除退变组织或用于限 制运动的脊柱关节融合术的手术介入。尽管用于缓解颈部或下背部疼痛的脊柱融合术被广 泛使用，但是已知这并不是无害的手术，因为通过越过椎间盘间隙引入刚性节段而强加于 邻近椎间盘的机械压迫加速邻近椎间盘中的退变改变，这在稍后的阶段可能变为有症状的 (16)。显然需要治疗的备选方法。据报道，在通过实验产生退变后，蛋白，即成骨蛋白-I(OP-I)(骨形态形成蛋 白-7)的椎间盘内给药可以刺激椎间盘基质修复。通过将去聚合酶软骨素酶ABC预先注射 入椎间盘NP中在兔中产生椎间盘退变，该步骤被称为化学髓核溶解术(17)。化学髓核溶解 术后，发现NP和AF细胞在重建功能性基质中更加高效。发现嵌在正常密度的细胞外基质 中的椎间盘细胞很大程度上对于OP-I对PG合成的刺激效应没有反应(17)。使用自体软骨细胞，检测潜在细胞治疗以实现退变的犬和人IVD的修复的研究已 有报道(18，19)。所用的细胞是从相同物种的健康NP收获的软骨细胞并且随后再植入到缺 损的椎间盘中。所述方法的缺点在于用于该用途的细胞需要从邻近的健康椎间盘或从相同 物种的其他供体收获。AF的违背需要获得这些细胞并且该过程不仅损伤AF结构而且从NP 中移除活细胞会加速该组织中的退行性改变。显然，该方法具有受限的人类应用。发明概述本申请首次描述了体内应用STRO-Γ专能细胞以促进退变椎间盘的髓核和纤维环 重建。STRO-Γ专能细胞来源于同种异体来源并且在本研究使用的动物模型中良好耐受。这 提示来自供体的STRO-Γ专能细胞可以大量生长并且开发为用于治疗退变椎间盘的“现成”产品。因此，本发明提供了修复和/或重建个体中椎间盘的方法，所述方法包括将间充 质前体细胞(STRO-r专能细胞)和/或其后代细胞给予椎间盘。在本发明的实施方案中，将STRO-Γ专能细胞和/或其后代细胞给予椎间盘的髓 核中。优选地，STRO-Γ专能细胞也是 TNAP+、VCAM-r、THY-r、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任意组合。STRO-I+专能细胞和/或其后代细胞可以来源于自体来源、同种异体或异种来源。 在一个实施方案中，所述细胞来源于同种异体来源。本发明方法还包括将糖胺聚糖(GAG)给予椎间盘，所述糖胺聚糖例如透明质酸(hyaluronic acid)(透明质酸(hyaluronan)) (HA)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、 肝素、硫酸肝素。GAG可以与STRO-Γ专能细胞和/或其后代细胞在相同或不同的组合物中 进行给药。应当理解，本发明方法可以在任何脊椎动物上实施。例如，个体可以为哺乳动物， 诸如人、狗、猫、马、牛、或绵羊。本发明方法可以用于特征为椎间盘退变的脊柱疾病状况的治疗或预防，所述脊柱 疾病状况例如下背部疼痛，年龄相关的椎间盘改变或椎骨脱离。在本说明书各处，词语“包括(comprise)”或诸如“包括”(comprises)或“包 括”(comprising)的变体应理解为是指，包括所阐明的元件、整体或步骤、或元件组、整体组 或步骤组，但不排除任何其它的元件、整体或步骤、或元件组、整体组或步骤组。在下文中，通过以下非限制性实施例并参照附图描述本发明。附图简要说明

图1.所有绵羊组中用STR0-1细胞治疗的腰椎脊柱节段的示意图。图2.放射学测定的椎间盘高度指数(DHI)。基线时和软骨素酶ABC诱导退变3个 月后(3个月，STR0-1细胞前)，接受低剂量㈧和高剂量⑶的STR0-1细胞的绵羊组的X 射线测定的椎间盘高度指数OHI)的平均值士标准误差。图3. MRI测定的注射软骨素酶ABC的椎间盘的总椎间盘退变评分。注射软骨素酶 ABC后，用低剂量STR0-1细胞+HA或单独HA治疗3个月㈧或6个月⑶之前，MRI测定 的总椎间盘退变评分的平均值士标准误差。图4. MRI测定的注射软骨素酶ABC的椎间盘的总椎间盘退变评分。注射软骨素酶 ABC后，用低剂量STR0-1细胞+HA或单独HA治疗3个月㈧或6个月⑶之前，MRI测定 的总椎间盘退变评分的平均值士标准误差。图5.总组织病理学椎间盘退变评分。对于低剂量STR0-1细胞，3个月㈧和6 个月(B)时的总组织病理学椎间盘退变评分的平均值。#表示与对照存在显著性差异ρ
<0. 001，Ω表示与STRO-Γ细胞存在显著性差异ρ < 0. 01。图6.总组织病理学椎间盘退变评分。对于高剂量STR0-1细胞，3个月(A)和6 个月(B)时的总组织病理学椎间盘退变评分的平均值。#表示与对照存在显著性差异ρ
<0. 001，Ω表示与STRO-Γ细胞存在显著性差异ρ < 0. 01。图7.总MRI椎间盘退变评分。对于低剂量STR0-1细胞，3个月(A)和6个月(B) 时的总MRI椎间盘退变评分。#表示与对照存在显著性差异ρ < 0. 05，Ω表示与STRO-Γ 细胞存在显著性差异P < 0. 05。图8.总MRI椎间盘退变评分。对于高剂量STR0-1细胞，3个月㈧和6个月⑶ 时的总MRI椎间盘退变评分。#表示与对照存在显著性差异ρ < 0. 05，Ω表示与STRO-Γ 细胞存在显著性差异P < 0. 05。图9.髓核(NP)组织病理学退变评分。对于低剂量STR0-1细胞，3个月㈧和6 个月(B)时的NP组织病理学退变评分的平均值。图10.髓核(NP)组织病理学退变评分。对于高剂量STR0-1细胞，3个月(A)和6 个月(B)时的NP组织病理学退变评分的平均值。图11.生化测定的髓核的糖胺聚糖(GAG)含量。生化测定的用低剂量或高剂量STR0-1细胞注射3个月(A)或6个月(B)的椎间盘的髓核的糖胺聚糖(GAG)含量的平均值 士标准差。#表示与对照存在显著性差异(P < 0. 05)。图12.放射学测定的椎间盘高度指数(DHI)。A 软骨素酶ABC诱导的退变椎间 盘在HA或HA+低剂量STR0-1细胞注射后3个月和6个月时X射线测定的椎间盘高度指 数(DHI)的平均值士标准误差。B 软骨素酶ABC诱导的退变椎间盘在HA或HA+高剂量 STR0-1细胞注射后3个月和6个月时X射线测定的椎间盘高度指数(DHI)的平均值士标
准误差。发明优选实施方案的详细描述通用技术和所诜择的定义除非另外特别定义，本文所用的所有技术和科学术语应当认为具有与本领域技术 人员通常理解的相同的含义。(例如，在细胞培养、干细胞生物学、分子遗传学、免疫学、免疫 组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。除非另外表明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域技术 人员公知的标准操作。下述资源中的文献中描述和解释了这些技术，例如J.Pertal， A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆操作指南)，John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual ( ^ ^ 隆实验手册)，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)，T. A. Brown (编辑)， Essential Molecular Biology :A Practical Approach (基础分子生物学操作方法)， Volumes 1 and 2，IRL Press (1991)，D. Μ. Glover and B. D. Hames (编辑)，DNA Cloning A Practical Approach (DNA 克隆操作方法)，Volumes 1-4, IRL Press (1995 禾Π 1996)，以 R F. Μ. Ausubel et al.(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology (现代分子 生物实验方法)，Greene Pub. Associates and WileyHnterscience (1988，包括至今的所 有更新)，Ed Harlow and David Lane (编辑)Antibodies :A Laboratory Manual (抗体 实验手册)，Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)，和 J. E. Coligan et al.(编辑) Current Protocols in Immunology (3'^ ' ), John Wiley & Sons ( 今的所有更新)。如本文使用的术语“治疗(treating) ”、“治疗(treat) ”或“治疗(treatment) ”包 括给予足以减少或消除所规定的疾病状况的至少一种症状的治疗有效量的STRO-Γ专能细 胞和/或其后代细胞。如本文使用的术语“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“预防 (prevention)”包括给予足以停止或阻碍所规定的疾病状况的至少一种症状的发展的治疗 有效量的STRO-Γ专能细胞和/或其后代细胞。STRO-Ii专能细胞或后代细胞如本文所使用的短语“STRO-Γ专能细胞”应当认为表示能形成专能细胞克隆的 STRO-I+和/或TNAP+祖细胞。STRO-Γ专能细胞是见于骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾、 肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中中的细 胞；并且能分化为生殖系，例如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO-Γ专能细 胞能分化为大量细胞类型，所述细胞类型包括，但不限于，脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自 机械影响和/或诸如生长因子、细胞因子的内源生物活性因子和/或宿主组织建立的局部 微环境条件的各种影响。在一个实施方案中，STRO-Γ专能细胞为非造血祖细胞，其分裂产 生后代细胞，所述后代细胞为干细胞或最终会不可逆地分化产生表型细胞的前体细胞。在另一个实施方案中，获自个体的样品中的STRO-Γ专能细胞是富集的，所述个体 例如待治疗的个体或相关个体或不相关个体(无论是相同物种还是不同物种)。本文中使 用的术语“富集的(enriched)”、“富集(enrichment) ”或其变体描述这样的细胞群体，其中 与未治疗的群体相比，一种特定细胞类型的比例或多个特定细胞类型的比例增加。在另一个实施方案中，本发明中使用的细胞表达一种或多种标志物，所述标志物 分别地或共同地选自 TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任意组合。“分别地”表示本发明单独地包括列举的标志物或标志物组，并且尽管分别的标志 物或标志物组在本文中可能未单独地列出，但是附加权利要求可以单独地并且彼此可分开 地定义这些标志物或标志物组。“共同地”表示本发明包括任意数量或组合的列举的标志物或肽组，并且尽管这些 数量或组合的标志物或标志物组在本文中可能未具体列出，但是附加权利要求可以单独地 并且与任意其他组合的标志物或标志物组可分开地定义这些组合或亚组合。优选地，STRO-I+细胞为 STR0-1 亮(STRO-Ibright)(同 STRO-Ibri)。优选地，STRO-1 亮 细胞另外为TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+和/或CD146+中的一种或多种。在一个实施方案中，STRO-Γ专能细胞是WO 2004/85630中定义的外周血间充质前 体细胞。被称为对于给定的标志物是“阳性”的细胞，其根据细胞表面上所述标志物存在的 程度可以表达低(Io或暗(dim))或高水平(亮，bri)的该标志物，其中该术语涉及细胞分 选过程中使用的荧光或其它标志物的强度。lo(或暗(dim)或暗(dull))和bri的区别应 当理解为在所分选的特定细胞群体上使用的标志物的背景中。被称为对于给定的标志物是 “阴性”的细胞未必完全不存在于该细胞。该术语表示该细胞以相对非常低的水平表达所述 标志物，并且当可检测地标记所述标志物时，其产生非常低的信号或者在背景水平以上无 法检测。本文中使用的术语“亮”是指当可检测地标记标志物时，细胞表面上产生相对高信 号的标志物。不希望受到理论限制的同时，被提出的是，“亮”细胞比样品中其他细胞表达更 多的靶标志物蛋白(例如，STR0-1识别的抗原)。例如，当用FITC结合的STR0-1抗体进行 标记时，按照荧光激活细胞分选(FACQ分析所测定的，STRO-Itoi细胞比非亮细胞(STR0-1
(STRO-Idull7diffl))产生更强的荧光信号。优选地，“亮”细胞构成起始样品中含有的最亮 标记的骨髓单核细胞的至少约0. 1%。在其它的实施方案中，“亮”细胞构成起始样品中含 有的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0. 1%、至少约0. 5%、至少约1%、至少约1. 5%或 至少约2%。在优选实施方案中，STRO-Is细胞相对于“背景”即STRO-Γ的细胞，具有2对 数幅度O log magnitude)的更高表达的的STR0-1表面表达。通过比较，STR0-1 和/或 STR0-1 具有比“背景”少于2对数幅度O log magnitude)的更高于表达的的STR0-1表 面表达，通常约1对数或少于“背景”。本文中使用的术语“TNAP”意图包括组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例
7如，该术语包括肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在优选实施方案中， TNAP是BAP。在特别优选的实施方案中，本文使用的TNAP是指由杂交瘤细胞系产生的能与 STR0-3抗体结合的分子，所述杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约的规定于2005年12月19日 保藏于ATCC，保藏登录号为PTA-7^2。在一个实施方案中，STRO-I+专能细胞能产生克隆生成的CFU-F。相当比例的STRO-Γ专能细胞能分化为至少两种不同的生殖系是优选的。专能细 胞可以定型为的系的非限制性实例，包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其对于胆管上皮细胞 和肝细胞是专能的；神经限制性细胞，其能产生发展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的神 经胶质前体细胞；发展为神经元的神经元前体细胞；心肌和心肌细胞、葡萄糖响应的胰岛 素分泌胰腺β细胞系的前体。其它系包括但并不限于，成齿质细胞、牙质产生细胞和软骨 细胞、和下列的前体细胞视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、诸如角质化细胞的皮肤细胞、 树突状细胞、毛囊细胞、肾管上皮细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细 胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周皮细胞、脉 管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在另一个实施方案中，STRO-I+专能细胞不能通过培养成为造血细胞。在一个实施方案中，细胞取自待治疗的个体，用标准技术体外培养，并且用于获得 上清或者可溶因子或者扩增的细胞作为自体或同种异体组合物给予个体。在可选的实施方 案中，使用了一种或多种建立的人细胞系的细胞。在本发明的另一个有用的实施方案中，使 用了非人的动物细胞(或者如果患者不是人，则来自另一个物种)。本发明还考虑使用获自或源自STRO-Γ专能细胞和/或其体外培养产生的后代细 胞(后者也被称为扩增的细胞)的上清或可溶因子。本发明扩增的细胞根据培养条件(包 括培养基中刺激因子的数量和/或种类)、传代次数等可能具有多种表型。在某些实施方案 中，从母代群体传代约2代、约3代、约4代、约5代、约6代、约7代、约8代、约9代或者约 10代后获得所述后代细胞。然而，可以从母代群体传代任意代数后获得后代细胞。可以通过在任何合适的培养基中培养获得后代细胞。关于细胞培养使用的术语 “培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气体或者相态和材料的混合 物。培养基包括液体生长培养基以及不支持细胞生长的液体培养基。培养基还包括胶状培 养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性的气体培养基包括生长于陪替氏培 养皿或其它固体或半固体载体上的细胞所暴露于的气相。术语“培养基”还指意图用于细 胞培养的材料，即使其未与细胞接触。换言之，为细菌培养制备的营养富集液体是培养基。 当粉末混合物与水或其它液体混合时变为适合培养细胞时，所述粉末混合物可以称为“粉 末培养基”。在实施方案中，通过使用磁珠标记的STR0-3抗体从骨髓中分离TNAP+STRO-Γ专能 细胞，并且随后培养扩增该分离的细胞获得对本发明方法有用的后代细胞。(对于合适培养 条件的实例，参见 Gronthos et al. Blood 85 :929-940,1995) 在一个实施方案中，这种扩增的细胞(后代)(优选地，至少5代以后)可以是 TNAP\ CC9+、I+ 类 HLA、ΙΓ 类 HLA、CD14\ CD19\ CD3\ CDlla^T、CD31\ CD86\ CD34"和 / 或 CD80—。然而，在不同于本文描述的那些培养条件的培养条件下，不同标志物的表达可以变 化是可能的。此外，在这些表型的细胞在扩增的细胞群体中可能占优势的同时，并不表示少数比例的细胞没有该表型(例如，少量百分比的扩增的细胞可以是CC9_)。在一个优选实施 方案中，扩增的细胞仍然有分化为不同细胞类型的能力。在一个实施方案中，用于获得上清或可溶因子或细胞本身的扩增的细胞群体包括 这样的细胞，其中细胞的至少25%，更优选为至少50%为CC9+。在另一个实施方案中，用于获得上清或可溶因子或细胞本身的扩增的细胞群体包 括这样的细胞，其中细胞的至少40%，更优选为至少45%为STR0-1+。在另一个实施方案中，扩增的细胞可以表达一种或多种标志物，所述标志物共同 地或分别地选自LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、 CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白 β 6-19、血 栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、TOF-R、瘦素-R(STR0_2 =瘦 素-R)、RANKL, STR0-1胃和⑶146或这些标志物的任意组合。在一个实施方案中，后代细胞是如WO 2006/032092定义和/或描述的专能扩增 STRO-Γ 专能细胞后代(MEMPs)。WO 01/04268 和 WO 2004/085630 中描述了制备 STRO-Γ 专 能细胞的富集群体的方法，后代可以来源于所述STRO-Γ专能细胞。在体外背景下，STRO-Γ 专能细胞很少以绝对纯的制备物存在，并且通常与其它细胞一起存在，所述其它细胞为组 织特异性定型细胞(TSCCs)。WO 01/04268涉及以约0. 到90%的纯度水平从骨髓中收 获这样的细胞。包括后代所源自的STRO-Γ专能细胞的群体可以直接从组织来源中收获， 或者可选择地，其可以是已经离体扩增的群体。例如，可以从收获的、未扩增的、基本上纯化的STRO-Γ专能细胞的群体中获得后 代，所述基本上纯化的STRO-Γ专能细胞构成其存在的群体的总细胞的至少约0. 1%、1%、 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 95%。例如，通过选择对于至少一种标 志物是阳性的细胞可以达到该水平，所述标志物分别地或共同地选自TNAP、STR0-1气3G5+、 VCAM-I、THY-I、CD146 和 STR0-2。MEMPs与新鲜收获的STRO-Γ专能细胞的区别在于MEMPS对于标志物STRO-Itoi为 阳性并且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)为阴性。相比之下，新鲜分离的STRO-Γ专能细胞 对STRO-Itoi和ALP都是阳性的。在本发明的优选实施方案中，至少15 %、20 %、30 %、40 %、 50 %、60%、70%、80%、90%或95%的给药细胞具有表型STRO-Itoi，ALP_。在另一个优选实 施方案中，MEMPs对于标志物Ki67、⑶44和/或⑶49c/tD^、VLA-3、α 3 β 1中的一种或多 种为阳性。在仍然另一个优选实施方案中，MEMPs不表现TERT活性和/或对于标志物CD18 是阴性的。STRO-I+专能细胞初始群体可以源于任意一种或多种WO 01/04268或WO 2004/085630中所示的组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤；或可能更广泛地源 于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、 骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。应当理解，在实施本发明中，通过很多不同的方法可以实现携带任何给定细胞表 面标志物的细胞的分离，然而，优选方法依赖于结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与关 心的标志物的结合，然后分离表现出结合的那些，所述结合为高水平结合或低水平结合或 未结合。最方便的结合剂是抗体或基于抗体的分子，优选为单克隆抗体或由于这些后述试 剂的特异性而基于单克隆抗体。抗体可以用于两个步骤，然而也可以使用其他试剂，从而这
9些标记物的配体也可以用于富集携带所述标记物或缺少所述标记物的细胞。可以将抗体或配体连接于固体载体以允许粗分离。优选地，分离技术最大化保留 待收集的组分的活力。可以使用具有不同效率的各种技术以获得相对粗的分离。使用的具 体技术取决于分离效率、相关细胞毒性、实施的简易性和速度以及对于先进设备和/或技 术技能的需要。分离操作可以包括，但并不限于，使用抗体包被的磁珠的磁分离、亲和色谱 法和用连接于固体基质的抗体的“淘洗(panning)”。提供准确分离的技术包括但并不限于 FACS。实施FACS的方法是本领域技术人员公知的。针对每一本文描述的标志物的抗体都是商业可获得的(例如，针对STR0-1的单克 隆抗体可以购自R&D Systems, USA)，可获自ATCC或其他保藏机构和/或可以用本领域公 认的技术制备。优选地，分离STRO-Γ专能细胞的方法，例如，包括固相分选步骤的第一步骤，该步 骤使用例如识别STR0-1高表达的磁性活化细胞分选(MACS)。如果需要，接着进行第二分选 步骤，从而产生如专利说明书WO 01/14268所描述的更高水平的前体细胞表达。该第二分 选步骤可以涉及使用两种或更多种标志物。获得STRO-Γ专能细胞的方法还可以包括在第一富集步骤之前使用已知技术收获 细胞来源。从而手术去除组织。包含该来源组织的细胞随后被分离至所谓的单细胞悬液。 通过物理手段和/或酶学手段可以实现该分离。一旦获得合适的STRO-Γ专能细胞群体，可以通过任何合适的方法进行培养或扩 增以获得MEMI3S。在一个实施方案中，细胞取自待治疗的个体，使用标准技术进行体外培养并且用 于获得上清或者可溶因子或者扩增的细胞，用于作为自体的或同种异体的组合物给予个 体。在可选的实施方案中，一种或多种建立的人细胞系的细胞被用于获得上清或者可溶因 子。在本发明的另一个有用的实施方案中，非人的动物细胞(或者如果患者不是人，则来自 另一个物种)被用于获得上清或者可溶因子。使用来自任何非人的动物物种的细胞可以实施本发明，所述细胞包括但并不限 于，非人的灵长类细胞、有蹄动物、犬类、猫类、兔类、啮齿类、鸟类和鱼类细胞。可以用于实 施本发明的灵长类细胞包括但并不限于，猩猩、狒狒、食蟹猴和任意其它的新大陆猴或旧大 陆猴。可以用于实施本发明的有蹄动物细胞包括但并不限于牛细胞、猪细胞、绵羊细胞、山 羊细胞、马细胞、水牛细胞和野牛细胞。可以用于实施本发明的啮齿类动物细胞包括但并不 限于小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞、仓鼠细胞和沙鼠细胞。可以用于实施本发明的兔类物 种的实例包括家兔、长腿野兔、野兔、棉尾兔，雪地兔和鼠兔。鸡(Gallus gallus)是可以用 于实施本发明的鸟类物种的实例。在使用前或获得上清或可溶因子前，可以保存对本发明方法有用的细胞。保 留或保存真核细胞并且特别是哺乳动物细胞的方法和流程是本领域已知的(参照，例 如，Pollard，J. W. and Walker, J. Μ. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition (基本细胞培养方案，第二版)，Humana Press, Totowa, N. J. ；Freshney, R. I. (2000)Culture of Animal Cells, Fourth Edition(动物细胞培养，第四版)， ffiley-Liss,Hoboken,N. J.)。保持诸如间充质干细胞/祖细胞的分离的干细胞或其后代的 生物活性的任何方法都可以结合本发明使用。在一个优选实施方案中，通过冷冻保存来保
10持和保存细胞。给药和组合物给予的STRO-Γ专能细胞或其后代的剂量可以根据例如疾病状态、年龄、性别和个 体体重的因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以给予单一大丸 剂、可以随时间给予数个分开的剂量或根据治疗状况的紧急程度相应地减少或增加剂量。 为了给药的方便和剂量的均一性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是有利的。本文所用 的“剂量单位形式”是指适于作为用于待治疗个体的单位剂量的物理上分离的单位；每个单 位含有计算出的预定量的活性化合物，从而与需要的药学载体联合产生所需的治疗效果。在一个实例中，给予的STRO-Γ专能细胞的剂量范围为0. IX IO6至4. OX IO6个细 胞。例如，剂量可以为0.5X IO6个细胞。应当理解，在被添加到椎间盘间隙之前，可以将STRO-Γ专能细胞和/或其后代加 工成各种形式(例如溶液悬液、固体、多孔的、编织的、非编织的、颗粒、凝胶、膏剂等)。考虑将许多生物材料和合成材料用于与STRO-Γ专能细胞和/或其后代共注 射入髓核，以对于受损椎间盘修复正常机械和/或生理性质。例如，可以向髓核中直接 注射一种或多种天然的或合成的糖胺聚糖(GAGs)或者粘多糖中的，例如透明质酸(HA)、 硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、硫酸半乳糖胺葡萄糖醛酸聚糖 (galactosaminoglycuronglycan sulfate) (GGGS)，参见之前的改变和其它，包括它们的生 理盐。已有提示，HA在刺激滑膜细胞的内源HA合成和软骨细胞的蛋白聚糖合成中起作用、 抑制软骨降解酶的释放并作为氧自由基的清除剂，所述氧自由基在软骨退化中起作用。硫 酸软骨素和氨基葡萄糖注射剂相似地表现出阻断关节软骨退变的进展。可论证地，其它GAG 可以提供相似的具有治疗价值的保护或修复性质，该治疗价值使它们成为用于注射入经历 退行性椎间盘疾病的椎间盘中的理想的候选者。GAG的另一个有价值的性质是其强吸引和 保留水的能力。因此，将GAG与水或其它水性材料混合以形成的粘稠凝胶是合适的，然后， 所述粘稠凝胶可以被注射入由髓核的抽吸产生的间隙中，或者可选择地，作为补充物被添 加到已有髓核。从而形成天然“水凝胶”，其能够三维填充间隙并且起到类似于抵抗挤压并 且使椎间盘能够吸收活动相关的震动的填塞材料的作用。诸 如 Euflexxa ， (Ferring Pharmaceuticals)或 Restylane ⑧.(Q-Med Aktiebolag Co. , Sweden)的合成的透明质酸凝胶适于用在本发明中。可以用于共同给药的其它可注射的合成材料的实例包括医学级硅树脂， Bioplastique φ.(悬浮于聚乙烯吡咯烷酮载体中的固体硅树脂颗粒Wroplasty BV, Netherlands)、Art印last (悬浮于明胶载体中的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球；Artcs Medical,USA) ,Artecoll (悬浮于牛软骨载体中的光滑 PMMA 球；Artepharma Pharmazeu Tische, GMBH Co.，Germany)。此外，合成的水凝胶组合物可以用作填充材料来对椎间盘修 复正常形状，从而修复正常的生物机械功能。具有已知的软骨保护能力的抗氧化剂也是用于注射入髓核的候选者。这些抗氧 化剂的实例包括生育酚(维生素E)、超氧化物岐化酶(SOD)、抗坏血酸(维生素C)、过氧 化氢酶及其它。此外，本文也考虑用于注射的藻酸钠的两性衍生物等。此外，重组成骨蛋 白-I(OP-I)，由于其促进髓核和纤维环细胞的蛋白聚糖富集基质的形成，因此是良好的用 于注射的候选者。
还考虑到合成注射剂的使用。这些合成注射剂特别适合于主要目的为修复椎间盘 生物机械功能的情况。透明质酸单独或与其他糖胺聚糖的组合可以被用作载体来递送生物活性材料。在 优选实施方案中，透明质酸和/或其它GAGs被用作用于STRO-Γ专能细胞或其后代细胞的 载体。将透明质酸/GAG组合物的浓度和粘性常规调整为适合给定的用途。在另一个实例中，可以递送STRO-Γ专能细胞或其后代细胞和纤维蛋白胶的混合 物。本文使用的术语“纤维蛋白胶”是指在钙离子存在下，纤维蛋白聚合物的交联而形成的 不溶基质。纤维蛋白胶可以从以下形成来源于形成纤维蛋白基质的生物组织或液体的纤 维蛋白原或其衍生物或代谢物、纤维蛋白(可溶的单体或聚合物)和/或其复合物。可选 择地，纤维蛋白胶可以从以下形成重组DNA技术产生的纤维蛋白原或其衍生物或代谢物 或纤维蛋白。通过纤维蛋白原和纤维蛋白胶形成的催化剂(例如凝血酶和/或因子XIII)的相 互作用也可以形成纤维蛋白胶。本领域技术人员应当理解，在催化剂(例如凝血酶)的存 在下纤维蛋白原被蛋白水解切割并转变为纤维蛋白单体。随后纤维蛋白单体可以形成聚合 物，该聚合物可以交联形成纤维蛋白胶基质。诸如因子XIII的催化剂的存在可以增强纤维 蛋白聚合物的交联。纤维蛋白胶形成的催化剂可以来自血浆、冷凝沉淀物或含有纤维蛋白 原或凝血酶的其它血浆组分。可选择地，可以通过重组DNA技术产生催化剂。凝块形成速率取决于与纤维蛋白原混合的凝血酶的浓度。作为酶依赖性反应，温 度越高(直至37°C)，凝块形成速率越快。凝块的抗张强度取决于所用的纤维蛋白原的浓 度。当纤维蛋白凝块是在透明质酸的存在下产生的时，其经历相互作用并且变为与交 联基质相互交错。已知该基质在组织再生中起主要作用并且在组织修复中执行细胞调节 功能[Weigel PH, Fuller GM, LeBoeuf RD. (1986)A model for the role of hyaluronic acid and fibrin in the early events during the inflammatory response and wound healing(透明质酸和纤维蛋白在炎症反应和创伤愈合的早期事件中的作用模型).J Theor Biol. 119 :219-34]。在HA-纤维蛋白基质中，透明质酸的溶解速率也会延长，这在延长该 GAG的治疗效果中是有益的(Wadstrom J and Tengblad A(1993)Fibrin glue reduces the dissolution rate of sodium hyaluronate (纤维蛋白胶降低透明质酸钠的溶解速率)， Upsala J Med Sci. 98 :159-167)。数个出版物描述了将纤维蛋白胶用于治疗剂的递送。例如，美国专利第4，983，393 号公开了用作阴道内插入物的组合物，其包含琼脂糖、琼脂、盐溶液糖胺聚糖、胶原蛋白、纤 维蛋白和酶。此外，美国专利第3，089，815号公开了由纤维蛋白原和凝血酶组成的可注射 药物制剂，并且美国专利第6，468，527号公开了促进各种生物和非生物试剂到体内特定部 位的递送的纤维蛋白胶。然而，应用纤维蛋白+透明质酸+促进STRO-Γ同种异体细胞的 软骨形成分化至今还没有描述。包含STRO-Γ专能细胞和/或其后代细胞的组合物被“手术添加”到椎间盘间隙。 即，通过医务人员介入添加所述材料，这与通过机体自然生长或再生过程的“添加”不同。手 术操作优选包括通过皮下注射针的注射，但也可以使用将基于胶原蛋白的材料引入椎间盘 的其它手术方法。例如，可以通过以下将所述材料引入椎间盘通过扩大的环状开口的挤出、通过导管的输注、通过创伤或手术切开产生的开口的插入或通过将所述材料侵入性或 低侵入性安放入椎间盘间隙的其他手段。在本发明的一些实施方案中，使用细胞组合物治疗开始前，抑制患者的免疫反应 可能不是必需的或不是所期望的。的确，本文提供的结果显示，绵羊中同种异体的STRO-Γ 专能细胞的移植在不存在免疫抑制的情况下是良好耐受的。然而，在其它情况下，在开始细胞治疗前，用药物抑制患者的免疫反应是可取的或 适合的。可以通过使用系统或局部免疫抑制剂来实现这点，或可以通过递送在封装的装置 中的细胞来实现这点。可以将细胞封装入胶囊，所述胶囊对细胞所需的营养和氧气以及治 疗因子是可通透的，细胞对免疫体液因子和细胞是不可通透的。优选地，密封剂是低变应原 的，容易并稳定地位于靶组织中并且对植入结构提供更多的保护。用于降低或消除对于移 植细胞的免疫应答的这些手段和其它手段是本领域已知的。作为选择，可以对细胞进行遗 传修饰以降低其免疫原性。应当理解，STRO-I+专能细胞或其后代可以和其它有益药物或生物分子(生长因 子、营养因子)一起给药。当和其它试剂一起给药时，它们可以在单一药物组合物中共同 给药，或在分别的药物组合物中与其他试剂同时或按顺序给药(在其它试剂给药之前或之 后)。可以共同给药的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如，ΕΡ0、ΕΡ0模拟体、TPO、IGF-I 和IGF-II、HGF、半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂)；抗炎剂(例如，p38 MAI3K抑制剂、 TGF-β抑制剂、他汀类药物、IL-6和IL-I抑制剂、哌罗来斯、曲尼司特、类克、西罗莫司和 NSAIDs (非留类抗炎药，例如，替泊沙林、托美汀、舒洛芬)；免疫抑制/免疫调节剂(例如， 钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢霉素、他克莫司)；mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)； 抗增殖剂(例如，硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；皮质留类(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体， 例如单克隆抗IL-2Ra受体抗体(例如，巴利昔单抗、达珠单抗)，多克隆抗T细胞抗体(例 如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体0KT3))；抗血栓 形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、 抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达 莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如，普罗布考、维 生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)和局部麻 醉剂。遗传修饰细胞在一个实施方案中，STRO-Γ专能细胞和/或其后代细胞是遗传修饰的，例如，用于 表达和/或分泌目的蛋白，所述目的蛋白例如是提供治疗和/或预防益处的蛋白，例如胰岛 素、胰高血糖素、生长激素抑制素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂 肪酶或淀粉酶或增强的血管发生相关的或是增强的血管发生的原因的多肽或细胞分化为 胰腺细胞或血管细胞的相关的多肽。遗传修饰细胞的方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，将细胞中待表达 的核酸与启动子可操作地连接用于在所述细胞中诱导表达。例如，将核酸连接至在多种个 体细胞中可操作的启动子，所述启动子例如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启 动子)或SV-40启动子。其它合适的启动子是本领域已知的并且应当进行必要的改动来应 用在本发明的实施方案上。
优选地，以表达构建体的形式提供核酸。本文中使用的术语“表达构建体”是指具 有赋予细胞内核酸(例如，报告基因和/或相反选择报告基因)的表达的能力的核酸，该核 酸被可操作地连接到所述被赋予表达的核酸。在本发明的背景中，应当理解，表达构建体可 以包括或可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达 的方式保持和/或复制异源DNA的其它核酸。构建用于实施本发明的合适的表达构建体的方法对于本领域技术人员是显而易 见的并且描述于，例如，Ausubel et al (In ；Current Protocols in Molecular Biology (现 代分子生物学实验方法).Wiley Interscience, ISBN 047 150338,1987)或 Sambrook et al (In :Molecular Cloning :Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验 手册)，Cold Spring Harbor Laboratories,New York，第三版 2001)。例如，使用例如 PCR 从合适的模板核酸扩增表达构建体的每个组分并随后克隆至诸如质粒或噬菌粒的合适的 表达构建体中。适于该表达构建体的载体是本领域已知的和/或本文中描述的。例如，哺乳动物 细胞中适合本发明方法的表达载体为，例如，hvitrogen提供的pcDNA载体套装的载体、 pCI载体套装的载体(Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、 pSI 载体(Promega)、VP16 载体(Clontecti)或 pcDNA 载体套装的载体 Qnvitrogen)。本领域技术人员应当知道其他载体和这些载体的来源，例如^witrogen Corporation、Clontech 或 Promega0将分离的核酸分子或包含其的基因构建体引入细胞用于表达的手段是本领技术 人员已知的。用于给定生物的技术依赖于已知的成功技术。将重组DNA引入细胞内的手段 包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、诸如通过使用lipofectamine(GibCO，MD，USA)和 /或cellfectin (Gibco, MD, USA)的脂质体介导的转染、PEG-介导的DNA摄取、电穿孔和诸 如通过使用DNA包被的钨颗粒或金颗粒(Agracetus Inc. ,WI, USA)等的微颗粒轰击。可选择地，本发明的表达构建体是病毒载体。合适的病毒载体是本领域已知的并 且可以商业购买。用于递送核酸并将所述核酸整合入宿主细胞基因组的常规基于病毒的系 统包括，例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。可选择地，腺病毒载体对于 将保持游离的核酸引入宿主细胞是有用的。病毒载体是靶细胞和组织中基因转移的有效且 多功能的方法。此外，在很多不同细胞类型和靶组织中观察到了高转导效率。例如，逆转录病毒载体通常包含顺式作用长末端重复(LTRs)，其包装能力高达 6-10kb的外源序列。最小的顺式作用LTRs对于载体的复制和包装是足够的，随后，所述载 体被用于将表达构建体整合入靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包 括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(feLV)、类人猿免疫缺陷病毒(SrV)、人 免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些载体(参见，例如Buchscher et al.，J Virol. 56 2731-2739(1992) ；Johann et al, J.Virol. 65 :1635-1640(1992) ；Sommerfelt et al, Virol. 76 :58-59(1990) ；Wilson et al, J. Virol. 63 :274-2318(1989) ；Miller et al.， J.Virol. 65 :2220-2224(1991) ；PCT/US94/05700 ；MiIler and Rosman BioTechniques 7 980-990,1989 ；Miller, A. D. Human Gene Therapy 7 :5-14,1990 ；Scarpa et al Virology 75 :849-852,1991 ；Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 :8033-8037,1993)。已经开发出了用于核酸递送的各种腺相关病毒(AAV)载体系统。使用本领域已知技术可以容易地构建AAV载体。参见，例如，美国专利第5，173，414号和第5，139，941号； 国际公布第 WO 92/01070 号和第 WO 93/03769 号；Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5 3988-3996,1988 ；Vincent et al. (1990)Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter Current Opinion in Biotechnology 5 :533-539,1992 ；Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158 :97-129,1992 ；Kotin, Human Gene Therapy 5 :793-801,1994 ；Shelling and Smith Gene Therapy 7 :165-169，1994 ；以及 Zhou et al. J Exp. Med. 179 :1867-1875，1994。对于递送本发明的表达构建体有用的其他病毒载体包括，例如，来源于诸如牛痘 病毒和鸟痘病毒的病毒的痘家族或甲病毒属或接合病毒载体(例如，描述于Fisher-Hoch et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA 56 :317-321,1989)的那些载体。
实施例实施例1 实验设计24 只绵羊接受了将 1. OIU 软骨素酶 ABC(cABC) (Seikagaku Corporation, Japan) 注射入3个相邻的腰椎间盘内(名称为L3-L4、L4-L5和L5-L6)以起始进行性椎间盘退变。 剩余的腰椎间盘(名称为L1-L2和L2-L3)未注射cABC并作为正常对照。给予cABC 15周 后(士3周)，将混合了等体积的Euflexxa 透明质酸(Ferring Pharmaceuticals)的高或 低剂量(分别为4 X IO6或0. 5 X IO6个细胞)的STRO-Γ专能细胞或ProFreeze NOA冻存 培养基(Lonza Walkersville Md.)的注射直接给予椎间盘的髓核内(表1)。注射后3个 月或6个月对动物进行尸体剖检。图1为用于研究的脊柱节段和治疗方案的示意图。表1:研究设计摘要
权利要求
1.重建和/或修复个体中椎间盘的方法，所述方法包括将STRO-Γ专能细胞和/或其 后代细胞给予椎间盘。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述STRO-Γ专能细胞和/或其后代细胞给予至 椎间盘的髓核中。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述STRO-Γ专能细胞对于TNAP+(STR0-3)、VCAM_1+、 ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+或其任意组合也是阳性的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述STRO-Γ专能细胞衍生自同种异体来源。
5.如权利要求1所述的方法，还包括将糖胺聚糖(GAG)给予椎间盘。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述GAG选自透明质酸(HA)、硫酸软骨素、硫酸皮肤 素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素和硫酸半乳糖胺葡萄糖醛酸聚糖(GGGS)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述个体具有特征为椎间盘退变的脊柱疾病状况。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述脊柱疾病状况是下背部疼痛、椎间盘的年龄相 关改变或椎骨脱离。
全文摘要
本发明涉及个体中椎间盘的修复和重建的方法，所述方法包括给予STRO-1+专能细胞。本发明的方法在治疗特征为椎间盘退变的脊柱疾病状况中是有用的。
文档编号A61P19/02GK102099043SQ200980124157
公开日2011年6月15日 申请日期2009年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者彼得·高希 申请人:成血管细胞系统公司