可植入材料及其制备方法

专利名称：可植入材料及其制备方法
技术领域：
本发明大体上涉及可植入材料及其制备方法。该材料例如可用于替代、部分替 代、增强或修复损伤的关节软骨或膝半月板的纤维软骨、颞下颂关节、椎间盘和滑膜关节 (synovial joints)的关节软骨。
背景技术：
除非下文指明，术语丝心蛋白用于笼统表示茧丝的主要结构蛋白，无论它们是来自家 养桑蚕(Bombyx mori )或转基因蚕，还是来自任何野蚕，包括但不限于，生产蒙加丝、蓖麻蚕 丝或柞蚕丝的那些。此外，术语“丝”用于表示蚕分泌的天然细纤维，其包含两种主要蛋白 质，丝胶蛋白和丝心蛋白，丝心蛋白是丝中的结构纤维，丝胶蛋白是围绕丝心蛋白并在茧中 将这些纤维粘结在一起的材料。“蚕茧”用于表示蚕幼虫纺成的在蛹期起保护作用的丝壳。在哺乳动物体内发现三种类型的软骨白纤维软骨；黄弹性软骨；和透明软骨。下 面除非另行指明，术语软骨以其一般意义使用，包括这三种不同类型的软骨。白纤维软骨存在于膝盖半月板和颞下颂关节和椎间盘中。黄弹性软骨存在于耳 廓、会厌和耳道而周。透明软骨主要作为关节软骨存在于非滑膜关节(在此其提供平滑的关 节连接表面)和滑膜关节(在此其提供覆盖动关节滑膜关节的关节面的坚韧刚硬的结缔组 织)中。关节透明软骨提供耐久、润滑的、低摩擦关节面，使应力分配在宽面积的下方 骨骼上并有助于在动力载荷过程中耗散冲击(Mow VC, Ratcliffe A. Structure and function of articular cartilage and meniscus. In: Mow VC, Hayes WC, eds. Basic Orthopaedic Biomechanics. New York: Raven Press, 1991 ； 143-198)。软骨的 压缩刚度在其功能中极为重要。粘弹性材料，如软骨的刚度极大取决于该材料的载荷历 史及其测量方法，因此，使用几种模量描述关节软骨。例如，Spiller，K. L.、Laurencin, S. J.、Charlton D、Maher, S. A.、Lowman, A. M. (2008)在他们的论文 “Superporous hydrogels for cartilage repair: Evaluation of the morphological and mechanical properties” Acta Biomaterialia 4，17 - 25中陈述，成年人关节软骨的无侧限压缩弹性 模量为大约1兆帕(MPa)，而总压缩模量为大约0.33 MPa0 Treppo, S.等人在Comparison of biomechanical and biochemical properties of cartilage from human knee and ankle pairs, Journal of Orthopaedic Research 18，739-748 Q000)中陈述,健康成年 人关节软骨的平衡模量为0.2至1.5 MPa，平均为大约0.6 MPa，取决于该软骨取自哪个关 节、在关节上的位置和深度。Park, S.，Hung, C. Τ. & Ateshian, G. Α.在 Mechanical response of bovine articular cartilage under dynamic unconfined compression loading at physiological stress levels, Osteoarthritis and Cartilage 12, 65-73 (2004)中陈述，根据外加应力和载荷频率，牛胫节软骨的无侧限动态模量(imconfined dynamic modulus)为 15-65 MPa0膝关节的半月板是主要由白纤维软骨构成的月牙形的盘。它们位于股骨髁骨 (femoral condoyle)和胫骨平台(tibial plateau)之间并具有压缩载荷散布、冲击吸收、稳定化和分泌关节润滑用滑液的作用。S. M. Bahgia和M. Weinick, Y. Xing，和K. Gupta (2005) Meniscal Injury, Ε-medicine World Library, 2005年7月 27 日，http://www. emedicine. com/pmr/topic75. htm综述了半月板的结构、功能和病理学。外轮缘是脉管，而 中部是无血管的纤维软骨。半月板含有70% I型胶原(非关节软骨纤丝胶原)。半月板的胶 原纤维表现出主要周向取向以及一些径向的连接纤维。胶原取向对该结构的机械功能和固 定而言极为重要。半月板的压缩造成周向纤维的拉伸环形负荷和径向纤维的径向负荷，抵 抗半月板的延展和弯曲。因此，半月板的分散负荷和耗散能量的能力取决于胶原纤维层的 完整性。因此，这些纤维的损伤提高髁软骨的二次退化性关节炎(osteoarthrotic)损伤危 险，因为正常负荷分布和冲击吸收功能受损。半月板损伤在成年人中相当常见且常常与运动相关。它们在10岁以上儿童中较 不常见，在具有形态正常的半月板的10岁以下儿童中罕见(Iobst，C. A. *ManitSki， C. L.，2000，Acute knee injuries. Clin Sports Med. 2000 Oct ；19(4):621-35)0全膝关节置换术涉及插入高度复杂的金属和聚合物植入物且不能被视为简单半 月板损伤的治疗法。Dacron和Teflon半月板部件可能引发严重的滑液反应(Cook，J. L.， Tomlinson, J. L. , Kreeger, J. Μ.,禾口 Cook， C. R. 1999. The American Journal of Sports Medicine 27:658-665 Induction of meniscal regeneration in dogs using a novel biomaterial)，同时松弛和机械损伤构成问题(de Groot, J. H. 1995 Doctoral dissertation. University of Gronigen, Summary 第 153 页)。受损半月板的外科治疗通常是必需的，对其而言，存在不同的外科治疗选项。可以使用缝线、紧固件或箭头直接修复小半月板撕裂。但是，小撕裂占所有出现的 半月板损伤的小于<3%。尽管完全或部分置换半月板(半月板切除术)以除去受损半月板组织在约四十 年前是流行的，充分理解的是，该程序造成关节软骨退变(King，D. Clin. Orthop. 1990， 252, 4-7 ；Fairbank, Τ. J. Journal of Bone and Joint Surgery 1948, 30, 664-670), 这又造成骨关节病。由半月板切除术造成的继发性骨关节病的程度看似取决于已除去多 少半月板组织。因此，通常涉及除去大约25-40%半月板组织的部分半月板切除术是目前 最常用的程序。但是，即使在部分半月板切除术中，膝盖的冲击吸收和稳定性的降低在中 期至长期中会造成继发性骨关节病。部分半月板切除术的更好替代方案因此being sort。 同种异体移植物的移植仅部分成功地替代完全或部分半月板切除术，因此目前只有大约 0. 1%的半月板程序使用这种方法。没有证据表明，用同种异体移植物置换半月板可重建 一些重要的半月板功能，由此预防或降低半月板切除术继发的骨关节病的发展(Messner， K.禾口 Gao，J. 1998. The menisci of the knee joint. Anatomical and functional characteristics, and a rationale for clinical treatment. Journal of Anatomy, 193:161-178)。主要问题是缺乏移植物的重塑，以造成较差的结构、生物化学和机械性质以 及不足的与骨的固定(Messner和(iao 1998，在上述引文中)。另外的缺点包括缺乏合适的 供体、保存技术的困难、可能的疾病转移、难以将植入物成型以匹配供体和对植入物的可能 的免疫反应(Stone, K. R. Clinical Sports Medicine. 1996，15: 557-571)。除同种异体移植物程序外，已提出许多可植入材料作为外科移除的受损半月板组 织的替代物。这些包括用胃蛋白酶处理的胶原以使其基本非致免疫的并随后与戊二醛交联；由小肠的粘膜下层产生的材料；交联透明质酸、Teflon纤维；碳纤维；增强聚酯；和聚 氨酯涂布的Dacron。这些植入材料的机械性质与具有大约0. 4至0. 8 MPa的无侧限压缩 弹性模量的半月板纤维软骨的机械性质不匹配。这些材料具有差的耐磨性并且不是自修 复的。上述材料中的一些是不可再吸收的，并且不会体内被功能组织替代。因此由胶原、 Teflon纤维、碳纤维、增强聚酯或聚氨酯涂布的Dacron制成的部分或完全半月板替代物表 现出高机械损坏率不是令人惊讶的(de Groot 1995在上述引文中)。损坏也由差的固定和 严重的炎性反应造成(de Groot 1995在上述引文中)。基于两性氨基甲酸乙酯嵌段共聚物的弹性体已被提议用于半月板修复并在动 物模型中测试。(Heijkants, R. G. J. C. 2004 Polyurethane scaffolds as meniscus reconstruction materials, Ph.D. Thesis, University of Groningen, The Netherlands, MSC Ph.D.-thesis series 2004-09 ；ISSN: 1570-1530 ；ISBN: 90 367 2169 5，第10章，第167-184页)。这些材料可能产生毒性低于Dacron或1Tef Ion的降解产 物。但是，受试聚氨酯的机械性质不是非常匹配天生半月板(Heijkants 2004在上述引文 中)，这有助于解释为何在植入器材中的再生纤维软骨中仅发现差取向的胶原代替正常半 月板中的良好取向的胶原。另一潜在问题在于，该聚氨酯材料产生第I阶段炎性反应(巨细 胞和一些巨噬细胞XHeijkants 2004在上述引文中)。跟踪研究经2年期测试聚己内酯-聚 氨酯共聚物多孔半月板修复器材。在该测试期后，该器材没有表现出再吸收能力，不被功 能半月板组织替代并且没有表现出防软骨损伤性(prevention of cartilage damage) (ffelsing R. Τ. C, van Tienen, Τ. C. , Ramrattan, N., Heijkants, R., Schouten, A. J., Veth, R. P. H.禾口 Buma, P. 2008 ；Effect on tissue differentiation and articular cartilage degeneration of a polymer meniscal implant: a 2 year follow up study in dogs. Am. Jour. Sports Med. 36 1978 - 1989)。最近，已经提出半月板修复的组织工程学策略，包括使用生物相容性支架作 为再生基质，和细胞补充已促进重塑和愈合。但是，几乎不知道这些新型修复策略对 正常半月板功能复原的贡献(Setton，L. Α.，Guilak, F, Hsu, Ε. W. Vail, Τ. P. 1999 Biomechanical Factors in Tissue Engineered Meniscal Repair. Clinical Orthopaedics & Related Research. (367S)附录S254_S272, 1999 年 10 月)。椎间盘位于覆盖脊椎锥体末端的软骨端盖之间。它们由围绕内髓核的外纤维环构 成。纤维环由数层纤维软骨构成。髓核含有悬浮在粘蛋白凝胶中的松散胶原原纤维和软 骨细胞。椎间盘在椎体之间提供可变形空间，这有利于脊柱的挠性，同时充当减震器(M. D. Humzah禾口 R. W. Soames 1988 "Human Intervertebral Disc Structure and Function，，， The Anatomical Record 220:337-356)。在腰椎间盘突出症、腰区中的退变性椎间盘疾病 或椎板切除术后综合征的患者中使用假体椎间盘替代受损的椎间盘。它们也用于治疗保 守治疗多于六个月都难治愈的后背疼痛患者和目前被认为适合脊柱融合手术的患者(NICE 指南，http://www. nice. org. uk/guidance/index. jsp action=byID&r=true&o=11081)。存在与含金属和非金属的假体用于完全椎间盘置换术相关的显著问题。回弹性是天然半月板和关节软骨以及用于修复它们的材料的极重要性质。回弹 性可以被定义为是该材料在压缩后回复至其原始厚度的程度。更确切地，其可以被定义为 是一材料在其弹性变形时可逆存储能量的性质。在关节和半月板软骨的情况下，重要之处在于其是该材料从由站立、行走、跑步和其它运动产生的压缩负荷造成的变形恢复的能力 的衡量标准。半月板软骨的高回弹性的重要之处还在于这使其能够在行走和跑步的反复 加载周期中充当有效的减震器。可以以许多不同方式测量回弹性。最精确地，回弹性是可 弹性存储的每单位体积最大能量，因此通过测定应力-应变曲线的弹性部分下的面积来 测量。由此测得的人关节软骨的回弹性产生2. 9 JnT3的值(Park，S. S., Chi, D. H., Lee, Α. S. , Taylor, S. R. & Iezzoni 2002, J. C. "Biomechanical properties of tissue-engineered cartilage from human and rabbit chondrocytes" Otolaryngology and head and neck surgery 126，52-57)。但是，更简单的是，使用在一个或多个加载周 期后变形可恢复的程度的测量值。在骨关节病中发生关节面上的关节软骨的破坏，其造成与该关节软骨相邻的骨头 改变。这一般影响髋、膝、手、脚和脊椎关节。其造成慢性疼痛、运动性损失和通常僵直。原 发性骨关节病主要是老化过程的效应，而继发性骨关节病由关节中的应力分布变化(其由 损伤、肥胖症、韧带退化、软骨下骨的硬化或关节形态的遗传改变引起)造成。病状，如糖尿 病和痛风，以及包括激素改变在内的其它因素也是继发性骨关节病中的成因。原发性和继 发性骨关节病中的疾病过程相同。通常通过插入由一系列材料，包括合金钢、陶瓷和合成聚 合物制成的人工髋关节或膝关节假体治疗严重骨关节病。但是，这些程序是昂贵和有风险 的。此外，大约4%的全髋置换在10年内由于无菌性松动、深部感染、假体断裂和其它原因 而失效(failure)。通常使用的全膝关节假体具有每年大约1%的平均失效率，而较不常用 的那些类型的假体表现出快最多3倍的失效率。因此在接受全关节置换的年轻人的寿命中 可能需要多于一次复杂和昂贵的修正。聚合和金属佩戴产品(wear product)的毒性是另 一问题。因此，已进行大量研究以找出用于修复关节软骨和因此预防与治疗骨关节病的关 节置换术的可行的替代程序。提议的关节软骨修复法可分成两类细胞基和组织基方法。细胞基方法可根据细胞在并入还是不并入基质中的情况下植入和基质是可生物 降解还是不可生物降解来进一步区分。细胞基方法包括骨髓刺激技术、自体软骨细胞移 植、基质辅助的自体软骨细胞移植和使用扩大的间充质干细胞培养物的程序。对于小焦点 软骨病变，细胞基软骨修复策略与无治疗相比产生更好的临床后果。但是，细胞基策略不 能用于治疗严重骨关节病，该方法具有其它问题和限制(Richter，W. 2007. Cell - based cartilage repair: illusion or solution for osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology 19 (5) 451-456)。组织基关节软骨修复法包括自体软骨膜、骨膜或骨软骨移植物和异源骨软骨和软 骨移植物的移植。存在与组织基关节软骨修复法相关的显著问题和限制。例如，自体骨软骨 移植物涉及潜在破坏性的从关节中除去健康的骨软骨组织，而同种异体移植程序的问题包 括新鲜供体材料的不足、免疫攻击对移植物的破坏、在移植物操作和冷冻储存过程中软骨 细胞的机械劣化和死亡以及疾病传播风险。(Hunziker，Ε. B. 2001 Articular cartilage repair: basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects can be found in Osteoarthritis and Cartilage (2001) 10, 432 — 463)。如 S. Frenkel 禾口 P. D. Cesare, Scaffolds for cartilage repair, Annals of Biomedical Engineering 32 (1) (2004),第洸-34 页和 S. J. Hollister, Porousscaffold design for tissue engineering, Nature Materials (7) (2006),第 590 页 所述，关节软骨置换用的支架(无论是独自移植还是含有细胞)必须具有允许细胞迁移的 适当孔隙率以及与健康软骨类似的营养和机械性质以便能承载并提供坚韧、刚硬的低摩擦 关节面。此外，该支架应能快速重塑(Hunziker, E . B. (1999) cartilage repair: are the intrinsic biological constraints undermining this process insuperable Osteoarthritis and Cartilage 7，15 - 28)0修复关节软骨的现有方法具有差机械性质、 差组织迁移和从病灶边界损失软骨细胞的一般问题，其中第一种最严重(Hunziker 1999 在前面引用的书中)。由合成可生物降解聚合物，如聚(D，L-乳酸-共-羟基乙酸KPLGA^U 成的支架通常具有良好的机械性质，但太快再吸收以致没有足够时间供新组织形成。此外， 由于它们的疏水表面和缺乏细胞粘着信号，它们通常差地粘着细胞。相反，生物大分子通常 表现出更好的细胞粘着，但差的机械性质Janc(5r，J. Slovi kova, A. Amler, Ε.，Krupa, P.等人，Mechanical Response of Porous Scaffolds for Cartilage Engineering. Physiological. Research. 56 {Suppl. 1) : S17-S25, 2007。现有的可降解支架通常太脆 弱以致不能支撑承重软骨中存在的力。Spiller，K. L., Laurencin, S. J.，Charlton D, Maher, S. Α. , Lowman, Α. Μ. (2008) Superporous hydrogels for cartilage repair: Evaluation of the morphological and mechanical properties Acta Biomaterialia 4 ，17-25。这些作者教导了由并入聚(乳酸-共-羟基乙酸)可降解微粒中的不可降解聚合 物聚(乙烯醇)和聚(乙烯基吡咯烷酮)的混合物制成的不可降解的水凝胶支架的用途。 所得支架与成年人关节软骨的分别1 MI^a和0.33 MPa的相应值相比，明显较不刚硬(无侧 限压缩弹性模量最多0. 15 MPa;总压缩模量最多0. 14 MPa)。因此，这些支架既不可生物降 解，在压缩性质上又比不上关节软骨。美国专利6，306，169公开了具有用水合聚合凝胶浸润的多孔大结构的植入物。该 结构由可生物再吸收的聚合物(聚-L-乳酸、聚己内酯、聚羟基丁酸酯或聚酐)制成，且该凝 胶包含藻酸盐、琼脂、角叉菜胶、糖胺聚糖、蛋白多糖、聚环氧乙烷或胶原单体。美国专利6，514，515、美国专利6，867，247和美国专利7，268，205公开了用于一系 列可植入用途，包括半月板和关节软骨的修复的可生物再吸收和生物相容的聚合物聚羟基 链烷酸酯。De Groot, "Meniscal tissue regeneration in porous 50/50 copoly(L-lact ide (epsilon-caprolactone) implants, Biomaterials 18 (8) :613-22 (1997)公开了多 孔共聚(L-丙交酯(ε -己内酯))用于半月板组织再生的用途。美国专利6，747，121公开了由含有L-丙交酯、乙交酯和一种选自D-丙交酯、 D，L-丙交酯和ε -己内酯的其它类型的重复单元的三元共聚物构成的多孔可再吸收的可 植入材料的用途。美国专利6，103，255教导了生物相容和可生物降解的聚合物用作组织支架的组 分的用途。此类聚合物包括聚碳酸酯、多芳基化合物、聚碳酸酯与聚(环氧烷)的嵌段共聚 物、多芳基化合物与聚(环氧烷)的嵌段共聚物、α-羟基羧酸、聚(己内酯)、聚(羟基丁 酸酯)、聚酐、聚(原酸酯)、聚酯和双酚-A基聚(磷酸酯)。美国专利6，679，914公开了包含通过醛交联的多个叠加的动物心包膜片的半月 板假体。虽然该器材尽管使用醛交联却仍可能可再吸收和可能生物相容，但该专利没有公开该器材的机械性质，其可能明显不如正常半月板。CA 2，374，169公开了用于全置换或增强结缔组织的生物相容、可再吸收的可植入 材料。该材料包含挠性拉长带(flexible elongate tape)和许多对齐的纤维，该带包含两 层基本平行的网和水凝胶。该材料可以是聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)、聚二氧杂环己酮、聚 己内酯、聚羟基丁酸酯、聚(碳酸亚丙酯)或这些材料的混合物。除它们的压缩性质与软骨相比通常较差的匹配外，在合成聚合物支架中还已注意 到一些其它的问题和限制。含乳酸和/或羟基乙酸的聚合物已表明如iTayler MS, Daniels AU, Andriano KP, Heller J (1994) Six bioabsorbable polymers: In vitro acute toxicity of accumulated degradation products. Journal of Applied Biomaterials 5: 151-157所述可能由于酸性降解而产生有毒溶液。这对需要相对大量的合成聚合物 且其中差的血管分布减缓有毒废物清除的软骨修复而言特别有关系。除乳酸和羟基乙酸 外，许多其它可生物降解的合成聚合物含有酸性单元，包括丁酸、戊酸和己酸，这些的酸性 分解产物也可能有毒。对聚(乳酸)和聚(羟基乙酸)的另一担忧在于，在降解过程中 产生小粒子，这些如 Gibbons DF (1992) "Tissue response to resorbable synthetic polymers". In Degradation Phenomena on Polymeric Biomaterials, Plank H, Dauner M, Renardy M, eds. Springer Verlag, New York.第 97-104 页所报道可引发炎性反应， 如B5stman 0, Partio Ε, Hirvensalo Ε, Rokannen P (1992), Foreign-body reactions to polyglycolide screws, Acta Orthop Scand 63: 173-176 所报道，在聚羟基乙酸的 整形外科应用中报道了大量的外来体响应和溶骨反应。如Bergsma E. J., Brujn W, Rozema F. R. , Bos R. M. , Boering G. , Late tissue response to poly (L-Iactide) bone plates and screws, Biomaterials 1995; 16 (1) : 2 31 所报道，对聚(丙交酯)观 察到类似的响应。尽管可生物降解的聚氨酯在体外和体内试验中看似令人满意，但氨基甲 酸乙酯单元是致癌的，尚未清楚理解它们的降解产物的长期影响和如何从体内除去这些产 物 Gunatillake，P.Α.禾口 Adhikari，R. 2003，Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering, European Cells and Materials, 5. 1_160WO 2005/094911公开了在丙烯酸或交联蛋白质基质中包含一种或多种丝成分的 复合材料。该材料可用在多种可植入器材中并可以由天然用整联蛋白结合三肽RGD装饰的 某些野蚕丝制成。野蚕丝中的这种三肽可能有利于间充质细胞和其它细胞的结合。根据 例如 Chen, X. , Knight, D. P. , Shao, Ζ. Ζ·，禾口 Vollrath, F. (2001) "Regenerated Bombyx silk solutions studied with rheometry and FTIR，， Polymer, 42, 9969-9974 所述的标准程序制备该材料。该文献报道，该标准程序造成丝心蛋白的显著劣化，从而产生 具有降低的强度、刚度和回弹力的支架。制备再生丝心蛋白溶液的标准程序包括在热碱性溶液中脱胶和在热9M至9. 5M 溴化锂溶液中溶解。最近已经提出，如Hofmann S, Knecht S, Langer R, Kaplan DL, Vunjak-Novakovic G, Merkle HP, Meinel L: "Cartilage-like tissue engineering using silk scaffolds and mesenchymal stem cells，，· Tissue Engineering 2006, 12(10) :2729-2738 和 V印ari C, Kaplan DL: "Silk as a biomaterial". Progress in Polymer Science (Oxford) 2007, 32 (8_9) : 991-1007 所综述，通过培养由软骨细胞或间 充质干细胞接种的再生丝心蛋白制成的海绵而体外制成的软骨样材料可能具有软骨修复潜力。但是，几乎没有研究用于表征丝心蛋白支架的机械性质，其看起来明显不如成年人关 节软骨刚硬强韧并具有更高摩擦的表面。但是，Morita小组的三篇论文描述了确定培养时 间对通过用软骨细胞接种多孔丝心蛋白海绵而体外生长的潜在软骨替代材料的压缩性质 的影响的初步尝试。该小组表明，Morita Y, Ikeuchi K, Tomita N, Aoki H, Suguro T, Wakitani S, Tamada Y: , “Evaluation of dynamic visco-elastic properties during cartilage regenerating process in vitro". Bio-medical materials and engineering 2003，13(4) :345-353 和相同作者在“Visco-elastic properties of cartilage tissue regenerated with fibroin sponge，，， Bio-Medical Materials and Engineering 2002, 12(3) :291-298中所公开，该材料中的动态压缩模量随时间而降低，而培育越久，蠕变变形 越高。此外，通过用软骨细胞接种多孔丝心蛋白海绵而体外生长的潜在软骨替代材料的表 面的摩擦系数最初与天然软骨的一样低，但如Morita Y, Tomita N, Aoki H, Sonobe M, Suguro T, Wakitani S, Tamada Y, Ikeuchi K 在他们的名为"Frictional properties of regenerated cartilage in vitro"的论 JC, Journal of Biomechanics 2006, 39(1):103-109中所公开，随着滑动试验持续期的提高，由于间隙水从表面层中渗出而提 尚οWO 2007/020449公开了部分或全部由多孔丝心蛋白构成的可植入软骨半月板修 复器材。使用产生具有降低的强度、刚度和回弹力的支架的标准程序制备该再生丝心蛋白。WO 2004/US00255.US 20040107 和 US 2007/0187862 公开了制造多孔丝心蛋白支 架材料的方法。首先制备再生丝心蛋白，使用盐浸析或气体发泡转化成多孔丝心蛋白支架， 在这两种情况下都随后用甲醇或丙醇处理以硬化和增强该材料。该材料旨在用作体外生长 软骨样材料用的支架。US 2007/0187862中所述的用于制备丝心蛋白溶液的程序包括通过 将茧在0. 02M碳酸钠水溶液中煮20分钟来脱胶，接着在60°C下在9. 3M溴化锂中溶解丝心 蛋白。因此，它们使用的程序与文献中描述的标准程序和与Holland，C., Terry, Α. Ε.， Porter, D. & Vollrath, F在他们的论文"Natural and unnatural silks，，，Polymer 48， 3388-3392 (2007)中使用的非常相似。后一作者制备根据标准程序制成的再生丝心蛋白 溶液，并在相同蛋白质浓度下比较这种和直接取自蚕的丝腺的天然家养桑蚕丝心蛋白溶液 的流变学。他们推断，可通过由所用程序造成的丝心蛋白的分子量和折叠的退化来解释他 们在再生丝心蛋白中观察到的粘度和储能模量的大幅降低。因此，有强有力的证据表明US 2007/0187862中公开的制备丝心蛋白溶液的条件造成丝心蛋白的显著劣化。这可能对由该 丝心蛋白溶液制成的多孔材料的压缩强度、模量和回弹性具有显著不利的影响。WO 2007/020449教导了由三维仿生纤维层(fibrelay)和可生物再吸收的多孔水 凝胶构成的可植入软骨修复器材。该水凝胶可以至少部分由再生丝心蛋白构成。使用标准 程序制备用于制备该多孔水凝胶的丝心蛋白，该程序包括在热9. 3M溴化锂溶液中溶解脱 胶丝；对着去离子水彻底渗析所得溶液2天和在真空干燥器中将其浓缩的步骤。US 2005/(^81859描述了由能通过调节条件以使原料流动和随后调节条件以使原 料胶凝来发生溶胶-凝胶转化的原料，如丝心蛋白形成物体的方法。最近已表明，由标准程序制成的多孔丝心蛋白水凝胶是脆弱的并具有降低的回弹 力。因此，在用于置换、部分置换、或增强或修复受损软骨的可植入材料和移植物中仍有改 进的空间。
因此，本发明的目的是提供改进的再生丝心蛋白溶液和制备改进的再生丝心蛋白 溶液的方法。本发明的另一目的是提供具有改进的机械性质的可植入的丝心蛋白材料和制备 该丝心蛋白材料的方法。本发明的再一目的是提供用于完全或部分置换、增强或修复软骨的植入物。发明概述
根据本发明的第一方面，提供制备再生丝心蛋白溶液的方法，该方法包括步骤 -用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧，该阳离子和阴 离子具有至少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数；和 -随后将该处理过的丝或丝茧脱胶；或者 -将丝或丝茧脱胶；和
-随后用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理该脱胶的丝或丝茧， 该阳离子和阴离子具有至少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数。如本领域技术人员容易理解的那样，Jones-Dole方程的B系数(Jones，G.，和 Dole, Μ.，J. Am. Chem. Soc., 1929, 51，2950)与离子和水之间的相互作用相关，并被 视为电解质在溶液中的结构形成和结构破裂能力的衡量标准。该阳离子和阴离子优选具有在25°C下-0. 001至-0. 046的Jones-Dole B系数。该阳离子和阴离子更优选具有在25°C下-0.001至-0.007的Jones-Dole S系数。该方法特别优选包括在用该离子试剂处理丝或丝茧后干燥该丝或丝茧的进一步 步骤。该干燥步骤优选在用离子试剂处理步骤后连续进行。干燥步骤的目标是从该处理过的丝或丝茧中提取尽可能多的水。理想地，从该处 理过的丝或丝茧中除去基本所有水。干燥丝或丝茧的方法可通过任何合适的方式，例如风干、冻干或施热干燥进行。干燥丝或丝茧的步骤包括风干。该丝或丝茧可以在任何合适的温度下干燥。例如，通过在室温(21 °C )下干燥该丝 或丝茧，已观察到良好结果。该丝或丝茧可干燥任何合适的时间。通常，该丝或丝茧可干燥数小时，例如12-16 小时的时间。在一些实施方案中，该丝或丝茧可以在小于20%湿度的条件下风干。优选在干燥 剂——其可包括无水氯化钙或其它合适的干燥剂——存在下进行该丝或丝茧的干燥。其它 合适的干燥剂可包括硅胶、硫酸钙、氯化钙和蒙脱土。也可以使用分子筛作为干燥剂。该离子试剂可包含氢氧化物溶液。该氢氧化物溶液可以原位形成。例如，可以用 氨气或氨蒸气(ammonia gas or vapour)处理该丝或丝茧以与该丝或丝茧中已存在的水结 合形成氢氧化铵。此外，可以在氨气或氨蒸气之前、与氨气或氨蒸气一起、或在之后将水蒸 汽添加到该丝或丝茧中。合适的离子试剂包括氢氧化铵、氯化铵、溴化铵、硝酸铵、氢氧化钾、氯化钾、溴化 钾或硝酸钾的水溶液。该离子试剂用于通过提高蛋白质上的电荷密度来提高该丝中的蛋白质的溶解度(“盐溶(salting in)”)。根据本发明的第二方面，提供制备再生丝心蛋白溶液的方法，该方法包括步骤
-用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧，其中该阳离子 选自下列的任何一种或多种铵、钾、铷，且该阴离子选自下列的一种或多种氢氧根、氯离 子、溴离子、硝酸根；和
-将该处理过的丝或丝茧脱胶；或者 -将丝或丝茧脱胶；和
-用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理该脱胶的丝或丝茧，其中 该阳离子选自下列的任何一种或多种铵、钾、铷，且该阴离子选自下列的一种或多种氢 氧根、氯离子、溴离子、硝酸根。要认识到，关于本发明的第一方面描述的优选特征适用于本发明的第二方面。该方法可包括在离液剂(chaotropic agent)中溶解该脱胶的丝或丝茧的后继步 骤(C)。溶解该丝或丝茧的步骤可以在下列任一条件或下列条件的任何组合下进行 在小于60°C的温度下；
以最多9. 5M的离液剂浓度；和 进行小于M小时的时间。可以在合适的温度下，例如在大约10°C至大约60°C的温度范围内将该脱胶的丝 或丝茧溶解在离液剂中。例如，在大约15°C至大约40°C的温度范围内将该脱胶的丝或丝茧 溶解在离液剂中。例如，通过在大约37°C的温度下将该脱胶的丝或丝茧溶解在离液剂中，实 现良好的结果。该脱胶的丝或丝茧可以溶解在任何合适浓度的离液剂中，例如在9. 3M浓度的离 液剂中。例如，该脱胶的丝或丝茧可以溶解在小于9M浓度的离液剂中。该脱胶的丝或丝茧 可以溶解在大约7M至大约9M浓度范围内的离液剂中。该脱胶的丝或丝茧可以在离液剂中溶解适当的时间，例如小于M小时。在本发明的另一方面中，提供制备再生丝心蛋白溶液的方法，该方法包括步骤
(a)用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧，该阳离子和 阴离子具有至少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数；和
(b)随后将该丝或丝茧溶解在离液剂中，
其中溶解该丝或丝茧的步骤在下列任一条件或下列条件的任何组合下进行 在小于60°C的温度下； 以小于9M的离液剂浓度；和 进行小于M小时的时间。该方法可包括优选在将该丝或丝茧溶解在离液剂中之前将该丝或丝茧脱胶的进 一步步骤。该脱胶步骤可以在步骤(a)之前进行。或者，该脱胶步骤可以在步骤(a)之后进 行。再或者，该脱胶步骤可以与步骤(a)同时进行。可以在大约10°C至大约60°C的温度范围内将该脱胶的丝或丝茧溶解在离液剂 中。优选在大约15°C至大约40°C的温度范围内将该脱胶的丝或丝茧溶解在离液剂中。例如，当在大约37°C的温度下将该脱胶的丝或丝茧溶解在离液剂中时，实现特别好的结果。该脱胶的丝或丝茧优选在大约6M至大约9M范围内，例如大约7M的离液剂浓度下 溶解在离液剂中。该脱胶的丝或丝茧优选在离液剂中溶解小于12小时的时间。该脱胶的丝或丝茧 最优选在离液剂中溶解小于4小时的时间。该离液剂可包含一种合适的离液剂或合适的离液剂的组合。合适的离液剂包括溴 化锂、硫氰酸锂或硫氰酸胍傭(guanidinium thiocyanate)。优选的离液剂包含溴化锂水溶液。在一个优选实施方案中，该溶解步骤可以在大约60°C的温度下以大约9. 3 M溴化 锂溶液浓度进行大约2小时。或者，该溶解步骤可以在大约60°C的温度下以大约7 M溴化 锂溶液浓度进行大约6小时。再另外，该溶解步骤可以在大约20°C的温度下以大约9. 3 M 溴化锂溶液浓度进行大约M小时。最优选地，该溶解步骤在大约37°C的温度下用大约9. 3 M溴化锂溶液浓度进行大约4小时。将丝或丝茧脱胶可包括从该丝或丝茧中选择性除去丝胶蛋白并可以使用裂解丝 胶蛋白但几乎或完全不裂解丝心蛋白的蛋白水解酶。该蛋白水解酶可包含胰蛋白酶。或者， 该蛋白水解酶可包含脯氨酸内肽酶。脱胶可以使用在含氢氧化铵的缓冲剂中的酶溶液。可以在任何合适的温度，例如小于100°C的温度下进行脱胶。优选在大约20°C至 大约40°C的温度下进行脱胶。当在大约37°C的温度下进行脱胶时，观察到良好的结果。可通过渗析除去离液剂以提供再生丝心蛋白溶液。例如，可以使用高级去离子II 级水进行渗析并通常使用超纯级I级超纯水进行。可以在任何合适的温度下，例如在大约0°C至大约40°C的温度范围内，更优选在 大约2°C至大约10°C的温度范围内进行渗析。在大约4°C的温度下实现良好的结果。该方法可包括浓缩该再生丝心蛋白溶液的步骤。可通过使密封的渗析管暴露在真 空中来浓缩该溶液。可将该再生丝心蛋白溶液浓缩至大约5-25% w/v的浓度。优选将该再 生丝心蛋白溶液浓缩至大约8 - 22% w/v的浓度。更优选将该再生丝心蛋白溶液浓缩至大 约8 - 12%w/v的浓度。例如，在将该再生丝心蛋白溶液浓缩至大约10% w/v的浓度时， 实现特别好的结果。在本发明的另一方面中，提供可通过根据本文所述的本发明的方面的任何方法获 得的再生丝心蛋白溶液。本发明的另一方面提供制备丝心蛋白材料的方法，包括使本文所述的再生丝心蛋 白溶液胶凝。可例如通过使该溶液暴露在微波辐射、声、次声(infra-sound )或超声、激光辐射 或机械剪切或快速拉伸流中来使该再生丝心蛋白溶液胶凝。作为优选选项，通过用一种或多种胶凝剂例如酸的水溶液处理该丝心蛋白溶液， 使该再生丝心蛋白溶液胶凝。该酸可以是酸性溶液或酸性缓冲剂或酸性蒸气。例如，使用 包含乙酸溶液的胶凝剂实现特别好的结果。该乙酸溶液可包含冰乙酸蒸气。可以使该再生丝心蛋白溶液胶凝以形成水凝胶。胶凝可以在任何合适的温度下，例如，在大约0°C至大约30°C的温度范围内进行 例如大约4小时，其中在Visking管中用围绕该管的1%乙酸溶液在10毫米直径样品上进行胶凝。在一个优选实施方案中，胶凝在大约20°C的温度下使用1%乙酸溶液进行由所需 胶凝渗透深度(基于18微米/分钟或大约1毫米/小时的渗透速率计算)决定的时间。可以将该再生丝心蛋白溶液转移到胶凝用的模具中。该模具可具有抛光面。可以对该胶凝材料施以一个或多个冻结周期。可以在任何合适的温度下，例如， 在大约-1°C至大约-120°c的温度范围内进行冻结。优选在大约-10°c至大约-30°c的温度 范围内进行冻结。例如，当在大约_14°C的温度下进行冻结时，实现良好的结果。胶凝材料的冻结可包括区域冻结。本发明的再一方面提供可通过上述任一方法获得的丝心蛋白材料。本发明的一个方面提供基本包括丝心蛋白的可植入的软骨替代材料，该材料具有 与植入部位处的软骨大致匹配的负荷能力，该负荷能力包括压缩强度和压缩韧度，以使其 在受到由正常身体活动施加于其上的力时能保持其机械完整性而没有过度变形。根据本发明的另一方面，提供可植入的丝心蛋白材料，该材料包含下列性质在 5%应变下0. 3-5. 0 MPa的无侧限压缩切线模量；1_20 MPa的极限抗压强度(屈服点应力)； 在磷酸盐缓冲盐水中受到5%标称应变3百万个周期后小于10%的平均累积不可逆变形；和 在磷酸盐缓冲盐水中受到5%标称应变至少3百万个周期后至少1. 5 MPa的动态模量。该材料可包含在5%应变下大约IMPa至大约4. 0 MPa的无侧限压缩切线模量。该 材料优选包含在5%应变下大约1. 2MPa至大约1. SMPa的无侧限压缩切线模量。该材料可包含大约3MPa至大约9MPa的极限抗压强度(屈服点应力)。该材料优选 包含大约4MPa至大约6MPa的极限抗压强度(屈服点应力)。该材料可包含在磷酸盐缓冲盐水中受到5%标称应变3百万个周期后小于10%的 平均累积不可逆变形。该材料优选进一步包含连通孔。这些孔可覆盖该材料横截面的大约10%至大约80%。在一个优选实施方案中，这些 孔覆盖该材料横截面的大约75%。这些孔可以为大约10微米至大约1000微米直径。平均孔径可以为大约200微米 至大约400微米。该材料可以是生物相容和至少部分可生物再吸收的。在植入12个月后可观察到 材料损失。该材料可具有光滑关节面，通过压头测得的其局部刚度超过主体刚度至少10%至 大约100%。该表面可包含降低湿摩擦系数的物质，仅举例说明，包括润滑素(Iubricin)的 物质。该丝心蛋白优选在孔壁中径向取向。根据本发明的再一方面，提供用于置换、部分置换、增强或修复关节软骨或纤维软 骨的植入物，其包含本文所述的丝心蛋白材料，包括通过本文所述的任一方法制成的丝心 蛋白材料。根据本发明的另一方面，提供包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂 用于改进丝或丝茧在离液剂中的溶解度的用途，该阳离子和阴离子具有至少1.3埃的离子 半径和在 250CT -0. 05 至 +0. 1 的 Jones-Dole B 系数。
该离子试剂可选自下列任何一种或多种铵、钾、铷，该阴离子可选自下列一种或 多种氢氧根、氯离子、溴离子、硝酸根。也提供基本或完全由蛋白质构成的可植入材料，该可植入材料具有下列性质的组 合刚硬，具有在10%应变下0. 3-5. 0 MPa的无侧限压缩切线模量；强韧(strong)，具有最 多1 - 20 MPa的极限抗压强度(屈服点应力);回弹性(resilient)，其中该材料在最多1 应变的5个2分钟加载周期后表现出小于m的平均累积不可逆变形；多孔，含有平均粒度 为20至1000微米的连通孔；和可再吸收，在植入膝关节12个月后表现出如组织染色所示 的显著蛋白质损失。该蛋白质优选是丝心蛋白。还提供使用用于将丝或丝茧脱胶和将该丝心蛋白溶解在离液剂中的温和条件制 备优化的再生丝心蛋白溶液的方法。大约5-25% w/v浓度下的丝心蛋白溶液滴优选在暴露在冰乙酸蒸气中时在大约 20°C下具有小于5分钟的胶凝时间。该优化的再生丝心蛋白溶液优选能形成中间相。大约18-2 w/v浓度的该优化 的再生丝心蛋白溶液优选具有在0. Ι/s剪切速率下至少IO3 Pa. s的粘度和通过10毫米直 径锥板几何以1°斜度测得的在25°C下在10 rad/s角频率下至少IO2 1 的G素数模数 (prime modulus)。优选使该材料胶凝，随后冻结产生多孔材料。根据本发明的再一方面，提供制备部分或基本多孔的可再吸收材料的方法，包括 步骤用氨或含铵离子的水溶液处理该丝或丝茧；将该丝或丝茧酶促脱胶；在降低的温度 下和/或在降低的溴化锂浓度下将该丝或丝茧溶解在溴化锂水溶液中或溶解在其它离液 剂中；在冷却时通过对着超纯水渗析来除去该离液剂；浓缩该溶液；将该溶液转移到模具 中；将该溶液转化成水凝胶；对该水凝胶施以一个或多个冻结周期；和任选风干或冻干该 水凝胶。根据本发明的另一方面，提供由丝心蛋白形成刚硬强韧的多孔材料的方法，包括 以下步骤用氨或含铵离子的水溶液处理该丝或丝茧；在温和条件下用酶将该丝或丝茧脱 胶；在降低的温度下和/或在降低的溴化锂浓度下和/或较短时间将该丝或丝茧溶解在溴 化锂水溶液中或溶解在其它离液剂中；在冷却时通过对超纯水渗析来除去该离液剂；任选 浓缩该溶液；将该溶液转移到模具中；通过用酸，例如，酸性溶液或酸性缓冲剂或酸性蒸气 或其它方式处理该溶液，使其胶凝；和对该凝胶施以一个或多个冻结周期；任选用乙醇水 溶液处理所得支架；任选冻干该支架；和任选用交联剂交联该支架。通过上述方法，所得材料具有平均孔径为20微米至1毫米的高度多孔的连通孔结 构和0. 3至5 MPa的无侧限压缩弹性模量。可通过在抛光面上流延，为该材料提供刚硬光 滑的涂层。从联系附图作出的下列详细公开中可看出本发明的其它目的、特征和优点。附图简述


图1 本发明的多孔丝心蛋白材料的横截面的扫描电子显微(SEM)图； 图2本发明的丝心蛋白溶液样品的偏光显微镜图像，显示形成丝心蛋白的小球晶； 图3显示本发明的丝心蛋白材料样品在浸在细胞培养基中的无约束试验中在5个加载至标称20%应变的周期后的不可逆变形百分比的滞后图(hysteresis plot)；
图4显示本发明的再生丝心蛋白、根据标准程序的再生丝心蛋白和直接取自丝腺的天 然丝蛋白的储能模量的比较的图5显示剪切速率对本发明的再生丝心蛋白溶液、根据标准程序的再生丝心蛋白和直 接取自丝腺的天然丝蛋白的粘度的影响的比较的图6显示18个本发明的丝心蛋白材料样品的5%和15%切线模量的图； 图7显示在三百万个负荷周期中测得的两个受试丝心蛋白材料样品的样品厚度的图 (通过测量人工制品来产生在大约350，000个负荷周期中出现的曲线峰值)；
图8显示在三百万个外加负荷周期中测得的两个受试丝心蛋白材料样品的平衡模量 的图；和
图9显示在三百万个外加负荷周期中测得的两个受试丝心蛋白材料样品的动态模量 的图。发明详述
下面提到的术语“优化的再生丝心蛋白”用于表示包含由本发明的方法获得的丝心蛋 白的材料。根据本发明的一个示例性实施方案的可植入的优化丝心蛋白材料基本由再生丝 心蛋白构成。该材料除在长期压缩测试过程中与标准丝心蛋白材料相比改进的刚度、粘弹 性和回弹力外还表现出高开孔率。该材料包含光滑、刚硬和坚韧的表面，在被滑液润滑时提 供低摩擦表面。该材料还已表现出可再吸收性、生物相容性和对细胞的良好粘着性。如图1中所示，已看出该材料含有高密度的平均孔径为10微米至1毫米的连通孔 (最多75%)。测试表明，该可植入的优化丝心蛋白材料包含在5%应变下0. 3-5. 0 MI^a的无侧限 压缩切线模量(刚度)(显示在图6中)和0. 5至6 MPa的极限抗压强度(屈服点应力)。该可植入的优化丝心蛋白材料的进一步测试在长期压缩测试中显示大约0. 2至 4. 6 MPa的平衡模量和大约1. 5MPa至12MPa的动态模量。该优化的丝心蛋白材料表现出可通过样品的不可逆变形百分比测得的良好回弹 力。回弹力测试显示在浸在细胞培养基中的无约束试验中在5个加载至20%应变的周期后 6. 7%的变形(显示在图3中)和在采用5N应变的一百二十万个周期后8. 2%的变形。血液分析显示落在EU指导限(guideline limit)内的低致热性水平和无细胞毒 性。该材料也可缓慢再吸收，在12个月时表现出材料损失。该材料也表现出具有低摩擦系数的光滑关节面和比下方材料更刚硬的表面。使用下述程序由再生丝心蛋白溶液制造丝心蛋白材料。丝心蛋白材料制备方法的综述
由丝或丝茧制备该再生丝心蛋白材料。该丝是桑蚕丝、野蚕丝、重组丝或这些丝的组合。用氨或用含铵离子的水溶液处理该丝或丝茧。在这种步骤中，据信，铵离子充当盐 溶剂，这通过有助于除去围绕蛋白质链的内水壳和通过结合到该丝心蛋白的带电氨基酸侧 链上来提高蛋白质随后在离液试剂中的溶解度。
通过提取水来干燥该丝或丝茧。通过选择性除去丝胶蛋白来将该丝或丝茧脱胶。这通过使用裂解丝胶蛋白但几乎 或完全不裂解丝心蛋白的合适的酶酶促切割和除去丝胶蛋白来进行。在小于60°C的温度下和/或以小于9. 5M的离液剂浓度和/或小于M小时的时间 将该丝或丝茧溶解在一种或多种离液剂中。通过在大约4°C的温度下用超纯水渗析来除去该离液剂。将所得溶液浓缩以提供 优化的再生丝心蛋白溶液。将该溶液转移到胶凝用的模具中，或使该溶液留在渗析容器中。通过用酸，例如， 酸性溶液或酸性缓冲剂或酸性蒸气处理该溶液来使该溶液胶凝，尽管也可以使用本领域已 知的其它胶凝法。随后对胶凝材料施以一个或多个冻结周期以制造丝心蛋白材料或支架。通过冻结 该胶凝材料，水滴变成冰晶，其在该材料内形成穴或孔。可任选用乙醇水溶液处理该材料或支架以提高丝心蛋白的β折叠构象(beta sheet conformation)的浓度，由此改进其机械性质和降低其在水介质中的溶解度和溶胀。可以改变这些步骤中的几个的次序。特别地，可以在脱胶之前或之后用氨气或含 氨或铵离子的溶液处理该丝。类似地，可以在从茧上缫丝之前或之后进行脱胶。优化丝心蛋白材料的制备方法的扩展
在高度迭代的程序中优化制备多孔丝心蛋白材料的方法中的各步骤。这些迭代法追求 尽可能温和的脱胶和溶丝程序以降低由断链和该蛋白质的降低的再折叠成天然丝I样状 态造成的丝心蛋白劣化可能性。通过评估下列事项，进行单独和与其它步骤的改变一起使 用的各步骤的优化
1.改变对在20°c下在暴露在冰乙酸蒸气中时5-8%w/v丝心蛋白水溶液滴的胶凝时间 的降低的影响；和
2.最终多孔材料的刚度。用氨或铵离子处理
发现用氨气或氨或铵盐的稀溶液处理丝极大提高丝在溴化锂溶液或其它离液剂中的 易溶解性。用氨或铵离子处理被认为通过“盐溶”效应和离子键合到该蛋白质上来提高该 蛋白质的溶解度。据发现，在三个阶段之一或全部中直接用于未脱胶茧；用于生丝纤维、用于脱胶或 部分脱胶的丝(无论是通过传统工业脱胶法还是通过酶促脱胶法脱胶)时，这种处理有效。 氨或铵离子在作为用于酶促脱胶的缓冲剂的组分包含时也有效。因此，用氨或铵离子处理 丝的任何这些方法可用于降低溶解该丝所需的温度或时间或离液剂浓度，以致对丝心蛋白 的破坏降低和工艺成本的节省。用氨或铵离子处理家养桌查丝能将在60°C下在9. 3M溴化锂溶液中溶解该丝的时 间从几小时缩减至15分钟。或者，氨或铵离子处理能在60°C下使用7M溴化锂代替9. 3M。 也能在20°C下在M小时内将该丝完全溶解在9. 3M溴化锂溶液中。也能在37°C下在4小 时内将该丝完全溶解在9. 3M溴化锂中。因此，据发现，用氨或铵处理能实现一系列更温和的处理，其中可以单独或联合改 变温度、离液剂浓度或溶解所需的时间。这些更温和处理导致丝心蛋白溶液的更快速胶凝时间和在该方法结束时更强韧更刚硬的材料。目前认为，具有相同大小的另一对离子，例如氯化钾也具有相同作用并可代 替氨使用。这由两条证据证实(1)如电荷密度那样，钾和氯离子的Jones-Dole粘度 (chaotropicity的衡量标准)类似，以致这些离子能形成离子对和有助于除去该蛋白质的 内水壳(与氯化铵共有的性质)；和(2)氯化钾在通常50 mM至600 mM的盐浓度下用于“盐 溶”蛋白质。目前认为，包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的某些其它离子试剂可提供相 同作用。特别地，包含具有至少1. 3埃的离子半径和在25°C下-0. 05至+0. 1的Jones-Dole B系数的一价阳离子和一价阴离子的离子试剂被认为提供与关于铵离子所述的相同作用。合适的离子试剂可包括氢氧化铵、氯化铵、溴化铵、硝酸铵、氢氧化钾、氯化钾、溴 化钾和硝酸钾的水溶液。干燥
该丝或丝茧在室温下在小于20%湿度下和在无水氯化钙存在下风干整夜。通过干燥除去基本所有水提高了该溶液中的离子浓度，这被认为增强离子和所得 材料的作用。其它已知的干燥方法，如冻干和施热干燥实现相同效果。如果使用热干燥，小于 100°C的温度被认为产生改进的丝心蛋白材料。脱胶
脱胶方法的选择也被认为对丝心蛋白的胶凝时间以及最终材料的刚度和强度而言至 关重要。商业缫丝和脱胶法都使用大约10(TC的温度和使用碳酸钠和/或马赛皂，且据发 现，可能由于这种处理，缫出的生丝和脱胶丝没有茧丝容易溶解。用商业alcalase (细菌枯草杆菌蛋白酶)脱胶能将脱胶温度降至60°C。Alcalase 是丝氨酸S8 endoproteinase族的成员并可能差地使丝心蛋白劣化，因为其具有广泛特异 性，优先选择Pl位置中的大的不带电残基。对于这种酶，和/；^香重链丝心蛋白具 有许多预计裂解位点。通过由alcalase脱胶丝制成的再生丝心蛋白溶液的聚丙烯酰胺凝 胶电泳证实家养桌查丝心蛋白的易alcalase裂解性。在使用胰蛋白酶脱胶的情况下，可以将脱胶温度降至20- 40°C并与传统高温脱胶 程序相比产生具有降低的胶凝时间和具有改进的刚度和强度的凝胶。与alcalase相比，工 具P印tideCleaver显示在丝心蛋白重链丝心蛋白的重复结晶畴和亲水间隔基的 共有序列中有极少数预计胰蛋白酶裂解位点，在香重链丝心蛋白中的共有序列或亲水间 隔基中没有该裂解位点。这表明在胰蛋白酶中将丝脱胶可能有益于制备再生丝溶液。胰蛋 白酶确实被认为非常有利于将丝脱胶以形成改进的再生丝溶液。用胰蛋白酶脱胶的丝以较短胶凝时间产生再生丝溶液并能够形成比使用由 alcalase脱胶丝制成的再生丝获得的那些硬的水凝胶。用胰蛋白酶脱胶在暴露在冰乙酸蒸 气中时产生小于5分钟的胶凝时间，也产生最硬和最强韧的材料，表明胰蛋白酶在这些条 件下产生比alcalase处理少得多的链断裂。要理解的是，几乎或完全不裂解丝心蛋白的其它蛋白水解酶也可能有利于将丝脱 胶以制备改进的再生丝心蛋白溶液。观察到jr—i重链丝心蛋白含有极少脯氨酸，而这 种氨基酸在丝胶蛋白中相对丰富，这表明脯氨酸内肽酶是在几乎或完全不破坏丝心蛋白的同时选择性除去丝胶蛋白的理想候选物。渗析
在这些迭代法的过程中，据发现，对着I型milliQ 水(可获自Millipore ，290 Concord Road, Billerica, MA 01821, US)(或被称作超纯水)渗析再生丝心蛋白溶液以 从该丝溶液中除去离液剂是非常有益的。要指出，在用作渗析剂时，PIPES或Tris缓冲剂或去离子水中的杂质不利地影响 最终产物的刚度和强度。要指出，可能由于它们能够通过将丝心蛋白链粘结在一起来促进 其聚集，渗析剂中包含PIPES或Tris缓冲剂或杂质也会提高再生丝溶液的粘度，这在强韧 刚硬的丝心蛋白凝胶形成中被认为是不利的。认为可以进一步有利地使用在40°C下在碳酸铵缓冲剂中用胰蛋白酶脱胶的茧或生丝。胶凝
通过暴露在乙酸溶液或酸性缓冲剂或乙酸蒸气中，使该优化的再生丝心蛋白溶液胶 凝。该酸性缓冲剂的浓度和暴露在其中的时长对所得凝胶的孔径和强度和刚度是至关重要 的。太浓的乙酸溶液或长期暴露在酸性缓冲剂中会造成该丝心蛋白的过度胶凝。冻结未胶凝的丝心蛋白导致孔径降低和较弱的支架，而强过度胶凝产生含有低密 度的由大冰晶产生的大裂片的无孔凝胶。据发现，最佳胶凝所需的酸性缓冲剂或蒸气暴露 时长和浓度取决于该丝心蛋白铸成品(cast)的几何和尺寸。因此，与10毫米渗析管相比， 在由20毫米直径渗析管构成的模具中，最优地胶凝丝心蛋白所需的处理时间更长。在20°C下用1% w/v乙酸水溶液使包含在10毫米直径渗析管中的由胰蛋白酶脱胶 丝制成的8-10% w/v优化的再生丝心蛋白溶液胶凝2. 5小时至5小时被认为有利。相反，由 alcalase脱胶丝制成的类似溶液在相同条件下需要胶凝16小时。在alcalase的情况下， 与胰蛋白酶脱胶丝相比极大延长的处理时间可能归因于丝心蛋白链在alcalase中大得多 的劣化(见上文)。要理解的是，需要几种手段促进由改进的再生丝溶液形成水凝胶。仅举例说明，这 些包括乙酸溶液、乙酸蒸气、其它酸性溶液或缓冲剂或蒸气、含钙离子的溶液、表面活性剂、 加热、紫外线、激光辐射、微波辐射、超声、低频振动、丝心蛋白稀释到5% w/v以下、丝心蛋白 浓缩至超过10% w/v、机械应变、剪切力和拉伸流。这些手段可单独使用或两种或更多种手 段联合使用。要理解的是，与通过文献中公开的标准程序制成的再生丝心蛋白溶液相比，该优 化的再生丝心蛋白溶液的降低的劣化、其极大缩短的胶凝时间及其提高的对拉伸流和剪切 的灵敏度非常有利于挤出成强韧细丝。与通过标准程序制成的相比，该优化的再生丝心蛋白溶液也非常有利于涂布、形 成珠粒和微球、用于包囊、作为粘合剂、用于薄膜流延和用于掺入复合材料中。冻结
为了制备多孔可植入材料，可以通过冻结使胶凝后的该优化的再生丝心蛋白溶液多孔 化。冻结被认为造成富丝心蛋白相与贫丝心蛋白相的相分离和后者中的冰晶形成。这两种 机制被认为在凝胶中结合产生高密度的连通孔。由此形成的冰晶的树枝状分支型式体现在大致椭圆形孔的取向和孔之间的互连的分布中。这些孔的壁是强烈双折射的。双折射迹象表明，丝心蛋白分子链围绕孔壁高度 周向配向。这表明冻结使孔壁中的分子拉紧和定向。要理解的是，由此获得的丝心蛋白的 取向有益于该材料的机械性质。该冻结步骤也使孔壁中的丝心蛋白不溶于水和大多数其它水溶剂，表明其已部分 转化成不可溶的丝II状态，其中分子内和分子间键合的β折叠占主导。这种向丝II状态 的转化可能归因于从通过相分离与它们的配向及合并(两者都由于冰晶形成)的联合产生 的蛋白质链中除去水。因此，不可溶的丝II状态的形成相当接近地模拟天然挤丝过程，这 也取决于相分离、富丝心蛋白相的水损失以及应变依赖型取向和丝II形成。对于单冻结周期，冻结步骤的温度对孔径具有小影响，_12°C至-16°C之间的冻结 产生最大孔。改变温度和在再生蛋白质溶液中包含低浓度防冻剂或糖可用于改变冰晶粒度 和形态，因此改变该材料中的孔尺寸和形状。增加冻结周期数会由于被冰晶破坏而产生提高的孔径。这伴随着最终材料的刚度 和强度的一定损失。区域冻结有利地控制冰晶的形状和取向，因此孔的形状和取向。划定区域冻结的 引发点、位置或面提供了控制冰晶形成的分支型式和因此控制该丝心蛋白材料中椭圆形孔 的取向型式及孔间连接的分布的手段。要理解的是，这能够制造多孔丝心蛋白支架，其中孔 壁的排列模拟细胞外材料在组织中的排列。因此，例如，区域冻结置于单冷却台上的丝心蛋白水凝胶薄块(处于未来骨软骨表 面的平面中)产生在一定程度上类似软管深层中的胶原纤维排列的各向异性的分支状和放 射状型式。要理解的是，可由此制造模拟其它组织的组织平面图(tissue plan)的支架。要理解的是，胶凝和冻结以外的方法也可用于在该优化的再生丝心蛋白溶液中引 入连通孔。仅举例说明，这些包括盐浸析和气体发泡。用乙醇溶液处理
在冻结后用乙醇水溶液处理多孔丝心蛋白水凝胶被认为有利于形成β折叠分子间和 分子内氢键，其改进该水凝胶的机械稳定性和提高不溶性与耐酶攻击性。实施例1
由来自丝或丝茧的天然纤维制备再生丝心蛋白溶液的程序
1.在室温下用10 mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液处理新鲜形成的JT—Jt或缫出 的(reeled)生丝1小时。2.该丝茧或缫出的生丝随后在相同溶液中漂洗和用超纯水充分洗涤。3.丝随后在30-40°C下在含铵盐或氨的缓冲剂中用pH 8. 5-9. 3的胰蛋白酶溶液 脱胶。4.用超纯水充分洗涤该丝。5.挤出水，该丝茧或缫出的生丝在20°C下用含有铵离子的0. 1至0.001 M氯化铵 或氢氧化铵水溶液处理1小时。6.该丝茧或缫出的生丝在室温下在小于20%湿度和存在无水氯化钙的条件下干 燥整夜。7.在37°C下，在持续搅拌下，以1克丝/5毫升溴化锂溶液的比率，将该丝在9. 3M 溴化锂水溶液中溶解4-5小时。
8.将所得丝心蛋白溶液转移到Visking管中(分子量截留(cut off) 12-15 kDa) 并在加盖烧杯中在持续搅拌下在5°C下对着超纯水渗析最少5小时和最多3天。以均勻时 间间隔更换5次极大过量的超纯水。9.渗析后，通过重量分析法和/或折射法测得的该再生丝溶液中的丝心蛋白浓 度为8-10% w/v。通过将该未打开的渗析管留在真空中，提高丝心蛋白浓度以获得8-30% w/ ν的浓度。实施例2
由再生丝心蛋白溶液形成再生丝心蛋白材料的程序
1.在渗析后，在管中或在有机硅模具(silicone mould)中在20°C下用1% w/v乙酸水 溶液使再生丝管胶凝取决于渗析管或模具尺寸的最佳时间。2.在胶凝后，立即移除该渗析膜或模具以使胶凝的丝心蛋白在冻结过程中自由 膨胀。3.在-12和_16°C之间进行区域冻结以获得对细胞生长而言最佳的孔径(大约 300微米)。但是，为了获得较小的孔，该材料可以在较低温度下冻结，而通过对该材料施以 1至10个再冻结步骤，可获得较大的平均孔径。4.在冻结的同时，该材料任选在室温下用50% -70% ν/ν无甲醇的乙醇水溶液处 理至少30分钟。所得材料可安全储存在乙醇中或冻干。实施例3
测试丝心蛋白材料的程序孔率
通过用台式超薄切片机(microtome)切割20-30微米切片(section)，测定孔径。将切 片放在水中并用配有数码相机的光学显微镜检查。使用图像分析包测定来自该材料中心的 25个椭圆形孔各自的最大和最小孔，并平均计算结果。通过在拇指和食指之间对材料(其中已通过在真空下渗透来使孔完全被水填满) 施加压力，快速评估孔的互连性。水从该材料的整个切面快速流出表明高互连程度，通过释 放压力后的空气进入证实这一点。在立体显微镜下检查该材料的厚切片表明在此程序中基 本所有孔都被空气填满。通过材料切片的光学显微术和通过在液氮中断裂的或用刀片切割 的该材料的切割或冻裂表面的扫描电子显微术证实孔的高互连程度。该材料的孔隙率高， 通过被空隙占据的横截面积百分比测得为最多75%。图1显示根据本发明的方法的程序制 成的多孔支架的切片的扫描电子显微图。可以看出该材料具有高孔隙率。实施例4
测试丝心蛋白材料的程序平衡和动态模量测试A
此研究的目的是测定长期循环压缩试验对优化丝心蛋白材料的性能的影响。方法_
用锐利打孔器和Valentine刀从如上所述由优化丝心蛋白溶液制成的单块多孔的、醇 处理过的优化丝心蛋白材料上切割大约8毫米直径和3. 2毫米高的六个圆柱试样。为了获 得一致厚度，使隔开3毫米安置的刀片穿过该圆柱试样以获取六个均勻样品。用数字卡尺 验证这些柱的直径并检查柱面以确保与压板的齐平(flush)界面。力学-激活组织工程学(mechano-activetissue engineering ) (MATE)系统用于材料表征和循环刺激(cyclic stimulation)。将这些柱置于它们各自的MATE试验室的中心并浸在牛血清白蛋白中。测试程序由100个序列(sequence)构成。各序列包括三个步骤
1)测量材料性质；
2)施加10，000个周期(5N振幅，2 Hz, 0.1 N预负荷，产生标称5%应变振幅);和
3)在无负荷状态下松弛1小时。在大约7天20小时内施加总共一百万个周期。为测量材料性质，在样品在2N压缩下松弛1小时后施加10次正弦振荡(5 Hz, IN 振幅)。作为后3个周期中应力振幅/应变振幅的比率计算动态模量(Mdyn)。随后将样品压缩 附加的IN并松弛1分钟。使用这种松弛过程中的应力/应变增量比计算平衡模量(Mequil)。结果-
该样品柱的初始厚度为3. 20 士 0.15毫米。在四个样品中，厚度在一百万个周期后仅降低0.15 士 0.01毫米，总变形的超过 90%在前150,000个周期中发生。该样品的平均平衡模量在循环测试过程中稳定提高。在600，000个周期附近，平 均平衡模量的值开始降低。在更严格的检查中，这种普遍降低归因于仅两个样品的平衡模 量的剧烈降低。关于动态模量，观察到类似趋势。结论-
四个样品在整个测试过程中保持它们的结构和平衡模量。样品的平均平衡模量为0. 2 -0.46MPa，接近在人关节软骨中测得的平衡模量(0.2 - 0. 8 MPa)。动态模量对结构损坏较不敏感，在2MPa至12MPa之间，小于生理值(13-65 MPa)。在室温下进行研究，在测试过程中不补充牛血清。环境变化可能影响结果。实施例5
测试丝心蛋白材料的程序平衡和动态模量测试B 方法_
测试具有400·米孔的两个丝心蛋白材料样品。样品为大约3毫米高，8毫米直径。通过将它们置于PBS中并在600 rpm (=40g)下离心6分钟，将这些样品再水合。对样品施以三百万个正弦负荷周期。在这三百万个负荷周期中，在每10，000个周 期后中断试验以评测材料。插入短蠕变试验和动态试验以评测平衡模量和动态模量。使用循环正弦加载的下列参数
权利要求
1.制备再生丝心蛋白溶液的方法，该方法包括步骤-用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧，该阳离子和阴 离子具有至少1.05埃的离子半径和在25°C下-0.001至-0.05之间的Jones-Dole B系数； 和-随后将该处理过的丝或丝茧脱胶；或者-将丝或丝茧脱胶；和-随后用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理该脱胶的丝或丝茧， 该阳离子和阴离子具有至少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数。
2.根据权利要求1的方法，其中合适的离子试剂包括氢氧化铵、氯化铵、溴化铵、硝酸 铵、氢氧化钾、氯化钾、溴化钾或硝酸钾的水溶液。
3.制备再生丝心蛋白溶液的方法，该方法包括步骤-用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧，其中该阳离 子选自下列的任何一种或多种铵、钾、铷，且该阴离子选自下列一种或多种氢氧根、氯离 子、溴离子、硝酸根；和-将该处理过的丝或丝茧脱胶；或者-将丝或丝茧脱胶；和-用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理该脱胶的丝或丝茧，其中 该阳离子选自下列任何一种或多种铵、钾、铷，且该阴离子选自下列一种或多种氢氧根、 氯离子、溴离子、硝酸根。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中该方法包括在离液剂中溶解该脱胶的丝或 丝茧的后继步骤(C)。
5.根据权利要求4的方法，其中溶解该丝或丝茧的步骤在小于60°C的温度下进行。
6.根据权利要求4或5中任一项的方法，其中溶解该丝或丝茧的步骤进行小于M小时 的时间。
7.制备再生丝心蛋白溶液的方法，该方法包括步骤(a)用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝，该阳离子和阴 离子具有至少1. 05埃的离子半径和在25°C下-0. 001至-0. 05的Jones-Dole B系数；和(b)随后将该丝或丝茧溶解在离液剂中，其中溶解该丝或丝茧的步骤在下列任一条件或下列条件的任何组合下进行在小于60°C的温度下；以小于9M的离液剂浓度；和进行小于M小时的时间。
8.根据权利要求7的方法，其中该方法包括将该丝或丝茧脱胶的进一步步骤。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中该方法包括在用离子试剂处理丝或丝茧 后干燥该丝或丝茧的进一步步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中该干燥步骤在用离子试剂处理的步骤后连续进行。
11.根据权利要求8或10的方法，其中从该处理过的丝或丝茧中除去基本所有水。
12.根据权利要求9至11任一项的方法，其中干燥丝或丝茧的步骤包括风干。
13.根据权利要求8至12任一项的方法，其中该方法包括在将该丝或丝茧溶解在离液 剂中之前将该丝或丝茧脱胶的步骤。
14.根据权利要求4至6和8至13任一项的方法，其中在大约10°C至大约60°C的温度 范围内将该脱胶的丝或丝茧溶解在离液剂中。
15.根据权利要求4至14中任一项的方法，其中合适的离液剂包括溴化锂、硫氰酸锂或 硫氰酸胍傭。
16.根据权利要求1至6和8至15中任一项的方法，其中将丝或丝茧脱胶包括从该丝 或丝茧中选择性除去丝胶蛋白并使用裂解丝胶蛋白但几乎或完全不裂解丝心蛋白的蛋白 水解酶。
17.根据权利要求16的方法，其中该蛋白水解酶包含胰蛋白酶。
18.根据权利要求4至17中任一项的方法，其中通过渗析除去离液剂以提供再生丝心 蛋白溶液。
19.根据权利要求18的方法，其中该方法包括浓缩该再生丝心蛋白溶液的步骤。
20.根据权利要求19的方法，其中将该再生丝心蛋白溶液浓缩至大约5-25%w/v的浓度。
21.可通过根据权利要求1至20的任何方法获得的再生丝心蛋白溶液。
22.制备丝心蛋白材料的方法，包括使根据权利要求21的再生丝心蛋白溶液胶凝。
23.根据权利要求22的方法，其中通过用胶凝剂的水溶液处理该丝心蛋白溶液或通过 胶凝剂例如酸的组合，使该再生丝心蛋白溶液胶凝。
24.根据权利要求23的方法，其中该胶凝剂包含冰乙酸蒸气。
25.根据权利要求22至对中任一项的方法，其中使该再生丝心蛋白溶液胶凝形成水凝胶。
26.根据权利要求22至25中任一项的方法，其中对该胶凝材料施以一个或多个冻结周期。
27.根据权利要求沈的方法，其中该胶凝材料的冻结包括区域冻结。
28.可通过根据权利要求22至27中任一项的方法获得的丝心蛋白材料。
29.可植入的丝心蛋白材料，该材料包含下列性质 -在5%应变下0. 3-5MPa的无侧限压缩切线模量； -1-20 MPa的极限抗压强度(屈服点应力)；-在磷酸盐缓冲盐水中受到5%标称应变3百万个周期后小于10%的平均累积不可恢 复变形；和-在磷酸盐缓冲盐水中受到5%标称应变至少3百万个周期后至少1.5 MPa的动态模量。
30.根据权利要求四的材料，其中该材料进一步包含连通孔。
31.根据权利要求30的方法，其中这些孔覆盖该材料横截面的大约10%至大约80%。
32.根据权利要求30或31的方法，其中这些孔为大约10微米至大约1000微米直径。
33.根据权利要求四至32任一项的方法，其中该材料具有光滑关节面，通过压头测得 的其局部刚度超过主体刚度至少10%至大约100%。
34.根据权利要求30至33中任一项的方法，其中该丝心蛋白在孔壁中径向取向。
35.用于置换、部分置换、增强或修复关节软骨或纤维软骨的植入物，其包含由根据权 利要求21的丝心蛋白溶液制成的丝心蛋白材料或根据权利要求观至34中任一项的丝心 蛋白材料。
36.包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂用于改进丝或丝茧在离液剂中 的溶解度的用途，该阳离子和阴离子具有至少1. 3埃的离子半径和在25°C下-0. 05至+0. 1 的 Jones-Dole B 系数。
37.其中该离子试剂包含铵离子的用途。
全文摘要
再生丝心蛋白溶液的制备方法，其包括步骤用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理丝或丝茧，该阳离子和阴离子具有至少1.05埃的离子半径和在25℃下-0.001至-0.05的Jones-DoleB系数；和随后将该处理过的丝或丝茧脱胶；或者，将丝或丝茧脱胶；和随后用包含一价阳离子和一价阴离子的水溶液的离子试剂处理该脱胶的丝或丝茧，该阳离子和阴离子具有至少1.05埃的离子半径和在25℃下-0.001至-0.05的Jones-DoleB系数。本发明还涉及丝心蛋白溶液、丝心蛋白材料和可用于软骨修复的植入物。
文档编号A61L27/22GK102083477SQ200980125230
公开日2011年6月1日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者M. 科林斯 A., 霍兰 C., J. V. 斯卡尔 N., L. D. 盖森斯 T., 大卫·菲利普·奈特 申请人:奥索克斯有限公司