用作精神刺激剂的Opiorphin的制作方法

专利名称：用作精神刺激剂的Opiorphin的制作方法
用作精神刺激剂的Opiorphin本发明涉及用作精神刺激剂的衍生自由Proll基因编码的人BPLP(碱性富脯氨酸 泪蛋白，Basic Proline-rich Lacrimal Protein)蛋白的肽，特别是 opiorphin。本发明还 涉及这种肽用于制备精神刺激剂的用途。精神刺激剂是被认为是精神性刺激剂的精神治疗性物质，其促进神经系统的活性 并刺激动机(motivation)和幸福感(well-being)。根据由Delay和Deniker建立的精神 治疗剂的分类，精神刺激剂特别包括智能兴奋剂(nooanal印tics)，如警觉度(alertness) 刺激剂(安非他明)，抗抑郁剂情感兴奋剂(thymoanal印tics)，以及各种刺激剂如阿拉伯 茶(Wiat)和咖啡因。精神刺激剂通过刺激神经传递而起作用。它们被用于治疗各种症状，包括警觉下 降、发作性睡病、肥胖症、儿童中的注意缺陷和/或活动过度、强迫性障碍(0⑶)、抑郁，躁狂 和双极疾病(bipolar disease)。但是，精神刺激剂经常与副作用相关联，如依赖、耐受、突然撤药(sudden withdrawal)后抑郁以及焦虑。因此，需要具有有限和/或最小副作用的精神刺激剂。在1988年鉴定了由雄激素调节的主要在成年大鼠下颂下腺和前列腺中表达 的基因(Rosinski-Chupin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 ；85 (22) :8553-7 ； EP O 394 424) 0这个基因编码前体，“下颂下大鼠1蛋白”(SMRl)。此前体于体内在多 基位点(multibasic sites)被剪切，产生3个结构上接近的肽(Rougeot et al.，Eur. J. Biochem. 1994 ；219 (3) :765-73)。已经确定序列为QHNPR (SEQ ID NO 6)的衍生自SMRl的称作sialorphin的 肽是细胞通讯的激素信使。因此，sialorphin是外分泌和内分泌激素肽，其表达由雄 激素以及由肾上腺素能信号介导的环境紧张下引起的分泌来调节(Rougeot et al., Am.J. Physiol. 1997 ；273 (4Pt2) :R1309_20)。sialorphin在成年雄性大鼠中是应对环境紧张而分泌的这个事实导致如下假说， 这个肽可能在与生殖相关的生理学和行为信号的整合中起作用。评估了 sialorphin在性 行为中所起的作用，实验数据显示sialorphin具有根据环境背景调节雄性大鼠性行为的 能力。国际专利申请WO 01/00221描述了 SMRl的成熟产物在治疗精神和/或行为障碍包 括性障碍中的用途。另外，发现SMRl成熟产物识别器官中的特定位点，所述位点涉及矿物质的浓缩。 国际专利申请WO 98/37100描述了 SMRl成熟产物用于治疗或预防与矿物质失衡相关的疾 病的治疗用途。Rougeot et al. , Proc. Natl. Aca. Sci. USA 2003 ； 100 (14) :8549-54)已证 实sialorphin在体内所结合的表面受体是NEP内肽酶(中性溶酶^prilysin ；EC 3.4.M.11)。另外，已证实sialorphin是NEP活性的配体及生理学拮抗剂。因此， sialorphin是在哺乳动物中鉴定出且在大鼠疼痛模型中展示强止痛作用的第一个NEP脑 啡肽酶生理学抑制剂(欧洲专利申请EP 1 216 707)。欧洲专利申请EP 1 577 320描述了 sialorphin的人功能性同系物。序列为SEQID NO :2的这种肽称为opiorphin。计算机上的基因组分析已揭示其对应序列SEQ ID NO: 5的BPLP蛋白的成熟片段。该BPLP蛋白也称为“碱性富脯氨酸泪蛋白”、“富脯氨酸蛋白1” 或“PRL1”，并且由人基因Proll编码。已示出opiorphin抑制生理学NEP和APN底物即P 物质和甲硫氨酸脑啡肽的降解。欧洲专利申请EP 1 577 320表明opiorphin具有止痛性 质并且其可以特别用于治疗或预防疼痛。opiorphin 的止痛作用随后由 Rougeot 和Messaoudi 确认(Med. Sci. (Paris) 2007 ； 23(1) :37-9)。还显示出这种止痛作用不伴随抗蠕动作用，不像用吗啡时发生的那样，吗 啡是目前使用的最强的止痛剂(Rougeot C, Proceedings of the 4th International Peptide Symposium ； J. Wilce (Editor)onbehalf of the Australian Peptide Society, 2007)。本发明人发现，opiorphin令人惊奇地不仅具有止痛性质，而且具有精神刺激作 用。另外，这种精神刺激作用不与健忘、镇静、活动过度或成瘾性类型的任何副作用相关联。 最后，发现opiorphin的止痛能力与吗啡一样强，以及其精神刺激能力与丙米嗪一样强。因此，opiorphin及衍生肽可以有利地用作精神刺激剂用于治疗或预防疾病，如发 作性睡病、睡眠过度、警觉下降、成人和儿童的注意缺陷、成人和儿童的活动过度、注意缺陷 /活动过度障碍(ADHD)、强迫性障碍(0⑶)及心境障碍如抑郁、双极疾病、心境恶劣障碍和 循环型情感障碍(cyclothymic disorder)。本发明的肽本发明涉及肽的治疗应用，所述肽包含或者由称为参照肽或序列的序列SEQ ID NO :5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物或者所述成熟产物的衍生物组成。这种肽 在本申请文字中被称为“本发明的肽”。在本发明范围内，“肽”是指包含通过肽键互相结合的氨基酸线性链的分子。所 述链可以是环状，即线性肽两端或者氨基酸侧链基团通过化学键结合。本发明的肽具有少 于 100 个氨基酸。优选地，所述肽由 4-40、4-:35、4-30、4-20、4-10、5-40、5-35、5-30、5-20、 5-10、5-8或5-6个氨基酸组成。“成熟产物”是指通过前体蛋白质在成熟共有位点经激素原转变酶的选择性蛋白 酶剪切而获得的肽。激素原转变酶将无活性前体转化为活性肽并且包括例如弗林蛋白酶 (fUrin)、PC转变酶或者PACE 4。所述成熟共有位点的序列优选符合下述共有区[H/R/ K]-X3_[R/K]-[R/K]，其中[H/R/K]是指该氨基酸是H、R或者KJ3代表三个氨基酸的链，[R/ K]是指该氨基酸是R或者K。激素原转变酶剪切二元残基(dibasicresidUes)[R/K]-[R/ K]之间的共有区单元。激素原转变酶是本领域技术人员所公知的并且特别经kamuffa et al. (2006FASEB J. 20(12) :1954-63)描述。序列SEQ ID NO 5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的一个成熟产物是序列SEQ ID NO 2的QRFSR肽。前蛋白原BPLP的序列含有信号肽的切口共有位点，其剪切产生蛋白原 QRFSRRX (η)。此蛋白原QRFSSSXfe)含有二元位点ES和在2R之间的切口位点的_4位的碱 性氨基酸。所述QRFSR肽在激素原转变酶的作用后产生。本发明的肽还包括包含或由序列SEQ ID NO :5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的 成熟产物组成的肽的衍生物。“肽衍生物”是指具有相对于参照肽包含一或多个突变(取代、插入或者缺失)的氨基酸序列的肽。优选地，所述肽仅包含取代类型的突变。所述取代可以是保守或者非 保守的。优选地，所述肽相对于参照肽包含最多1、2、3、4或5个突变或取代。“肽衍生物” 还指包含或由序列SEQ ID NO :5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物组成的肽的 拟妝(peptidomimetics)(参见例如 Abell, 1997, Advances in Amino AcidMimetics and Peptidomimetics, London :JAI Press ；Gante,1994, Peptidmimetica, massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106 :1780-1802 ；and Olson et al. , 1993, J.Med. Chem. 36 :3039-3049)。本发明优选的拟肽包括2008年4月7日提交的美国临时申请US 61/042922及2009年4月7日提交的国际申请PCT/EP2009/0M171中描述的那些。在优选的实施方案中，本发明的肽与参照序列的不同仅在于存在保守取代。保守 取代是相同类别氨基酸的取代，如氨基酸不带电侧链上的取代(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝 氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)，氨基酸碱性侧链上的取代(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、氨基酸 酸性侧链上的取代(如天冬氨酸和谷氨酸)、氨基酸非极性侧链上的取代(如丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)。优选地，本发明的肽是分离的肽。“分离的”肽此处是指从人体或从非人哺乳动物 的生物体分离的肽，优选是纯化的形式。但是，所述分离的肽可以例如存在于药物组合物中 或试剂盒中。优选地，所述肽存在于下述药物组合物之一中。本发明的肽发挥精神刺激活性。“发挥精神刺激活性的肽”是指这样的肽-其在行为绝望测试(behavioraldespair test)(例如大鼠中的强迫游泳测试) 中发挥针对顺从(resignation)的保护作用；和/或-其抑制金属外肽酶如NEP(中性溶酶；中性内肽酶；EC3.4. 24. 11)和/或APN(氨 肽酶N;EC 3.4.11.2)的活性。优选地，所述肽抑制NEP和APN活性。不受特定理论限制， 本发明人相信本发明的肽通过抑制脑啡肽被这两个金属外肽酶的降解而强化它们在作用 幅度和作用时间方面的生理学作用，并由此激活阿片样物质途径，更具体是脑啡肽依赖性 μ -和δ -阿片样物质受体(opiod receptor)。针对顺从的保护作用可以通过在大鼠中的强迫游泳测试确定。在这个测试中，当 肽发挥针对顺从的保护作用时，施用所述肽的大鼠的不动时间(immobility time)相对于 对照大鼠的不动时间降低了。这个测试包括如下测试-测试前时段，在此期间将大鼠置于水中一段确定的时间(10-20分钟之间，例如 15分钟)，然后将它们从水中取出，干燥并放回其笼子。-若干小时后Q0-25小时后，例如M小时后)，测试时段，期间将大鼠再次置于水 中一段确定时间(5-8分钟之间，例如5分钟)，然后从水中取出，干燥并放回其笼子。在测试前时段之后及测试之前施用待测试的肽。在测试前期间和测试期间记录大 鼠不动时间5分钟。将施用肽的大鼠不动时间与对照大鼠的不动时间以及与相同大鼠在测 试前时段中的不动时间相比较。实施例3更详细描述了大鼠中强迫游泳测试的方案。金属外肽酶如NEP和/或APN的活性的抑制可以通过本领域技术人员公知的任何 技术测量。可以例如使用欧洲专利申请EP 1 577 320的实施例2所描述的一种方法。例 如，可以通过测量LNCaP细胞的膜制备物中P物质的降解的抑制来测量NEP的抑制活性。此 方案在 Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003 ； 100 (14) :8549-54)中及在 2009 年1月19日提交的国际申请PCT/EP2009/050567中有详细描述。
在特定实施方案中，本发明的肽包含或由序列SEQ ID NO :5的片段组成，或者包含 或由衍生自序列SEQ ID NO 5的所述片段的肽组成。优选地，本发明的肽包含或由序列A-X2-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ IDNO 1)组成，其 中-X1代表氢原子、酪氨酸或半胱氨酸；-当&是氢原子时，X2代表谷氨酰胺或焦谷氨酸；-当&是酪氨酸或半胱氨酸时，X2代表谷氨酰胺；及-所述序列A-X2-Arg-Phe-Ser-Arg是所述肽的C末端。优选地，本发明的肽由序列A-X2-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO 1)组成。本发明 的肽可以例如由 QRFSR 序列(SEQ ID NO 2)、YQRFSR (SEQ ID NO 3)或 CQRFSR (SEQ ID NO: 4)组成。或者，本发明的肽可以因保守取代与序列SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4不同。在另一个特定实施方案中，本发明的肽包含或由序列SEQ ID NO 5的碱性富脯氨 酸泪蛋白(BPLP)的等位基因变体的成熟产生组成。为清楚起见，规定序列SEQ ID NO 6的sialorphin排除在本发明的肽之外。本发明的肽可以进一步包括一或多种改善其稳定性和/或其生物利用率的化学 修饰。此修饰可以例如是目的在于获得比初始肽更稳定和更亲脂的肽。包括一或多种改善 其稳定性和/或其生物利用率的化学修饰的所述肽是本发明的肽的一部分。这种化学或酶修饰是本领域技术人员公知的。以非限制性的方式，可提及例如下 述修饰-所述肽的C末端或N末端的修饰，如N末端脱氨或酰化(优选乙酰化)，或者如 C末端酰胺化或酯化；-两个氨基酸之间酰胺键的修饰，如酰化(优选乙酰化)或者在α氮或碳的烷基 化；-手性变化，如用相应D-对映异构体取代天然氨基酸(L对映异构体)。这种修饰 可以伴随侧链的反转(inversion)(从C末端到N末端)；-改变为重氮肽(azap印tides)，其中一或多个α碳由氮原子替换；和/或-改变为β肽(betap印tides)，其中一或多个碳被加到主链的N-α侧或者C- α 侧。由此，肽的一或多个氨基酸，丝氨酸(kr)和/或苏氨酸(Thr)，可以被修饰，特别 是通过在丝氨酸和/或苏氨酸的侧链的OH基团引入酯基、醚基或者C8辛酰基。可以用羧 酸、酐、经桥连(bridge)等进行简单的操作酯化，以形成例如乙酸酯或苯甲酸酯。提供更稳 定化合物的醚化，可以用醇、卤化物等进行，以形成例如甲醚或0-糖苷。另外，肽的一或多个氨基酸赖氨酸(Lys)可以也同时或者另外被修饰，特别是通 过-酰胺化此修饰易于完成，赖氨酸的正电荷被疏水性基团(例如乙酰基或苯乙酰 基)取代；-氨基化通过从伯胺R= (CH2) 4-NH3+形成仲酰胺，例如通过形成N-甲基、N-烯 丙基或者N-苄基基团；及
-通过形成N-氧化物、N-亚硝基、N- 二烷基磷酰基、N-亚氧硫基或N-糖苷基团。另外，一或多个氨基酸谷氨酰胺(Gln)可以也同时或者另外被修饰，例如通过酰 胺化，通过形成仲胺或叔胺，特别是用官能化(functionalized)或未官能化的甲基、乙基 类型的基团。另外，一或多个氨基酸谷氨酸(Glu)和/或天冬氨酸(Asp)可以也同时或者另外 被修饰，例如-通过酯化，以形成取代或未取代的甲酯、乙酯、苄基酯、硫醇(活化的酯)；及-通过酰胺化，特别是为了形成N，N-二甲基、硝基酰苯胺、吡咯烷基团。另一方面，优选不修饰脯氨酸，其参与所述肽的二级结构，另外注意氨基酸Gly、 Ala和Met通常不提供修饰可能性，其显然是感兴趣的。包括一或多个化学修饰以改善其稳定性和/或其生物利用率的这种肽的例子在 2008年4月7日提交的美国临时申请US 61/0似922和2009年4月7日提交的国际申请 PCT/EP2009/054171中有描述。这些包括下式(I)的肽ζ -AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-Oh (I)，其中- ζ是氢原子、酪氨酸、Υ-[接头]-或者Si螯合基团，如半胱氨酸、C-[接头]_、 N-乙酰-半胱氨酸、N-巯基乙酰基(HS-CH2-CO-)，异羟肟酸(H0-NH-C0-)或任选取代的羟 基喹啉，-AA1 是 Q 或 Glp,-AA2 是 K、R 或 H，优选 R，-AA3 是 Y、G、N、F 或 F (X)，优选 F 或 F (X)，-AA4 是 P、S 或 S (OAlk)，优选 S 或 S (OAlk)，-AA5 是 K 或 R，优选 R，-C-[接头]-是指 Cys-[NH-(CH2)n-C0]-，其中 η 是 1-20 之间的整数，-Υ-[接头]-是指 Tyr-[NH-(CH2)n, -C0]-，其中 η，是 1-20 之间的整数，-F⑴是指苯丙氨酸，其苯基由一或多个卤原子取代，-S(OAlk)是指丝氨酸，其羟基由具有1-20个碳原子的线性或分支烷基取代，-所述AA1,AA2, AA3, AA4和AA5可以独立地为L-构型或D-构型，并且AA1, AA2, AA3, AA4和AA5之任一个可以任选地是b氨基酸、重氮氨基酸或者b-重氮氨基酸；其中如果肽衍生物包含半胱氨酸，则所述肽衍生物任选是二聚体，条件是该肽不 是 QRFSR，QHNPR, QRGPR, YQRFSR 或 GlpRFSR。在式(I)的肽中，优选的肽包括那些抑制NEP和APN的肽。这种肽可具有下式 (IV)ζ ""-Q-R-AAm3-AAm4-R-OH (IV)，其中- ζ-是氢原子、或Si螯合基团，如半胱氨酸、C-[接头]-、Ν_乙酰-半胱氨酸、N-巯 基乙酰基(HS-CH2-CO-),异羟肟酸(H0-NH-C0-)或任选取代的羟基喹啉，-AAn3 是 F 或 F (X)，优选 F (X)，-AAm4 是 S 或 S (OAlk)，优选 S 或 S (OAlk)，
-C-[接头]_、F(X)和S(OAlk)如上述对式(I)肽的定义，-所述Q、R、AA3、AA4和R可以独立地是L-构型或D-构型，并且Q、R、AA3、AA4和R 之任一个可以任选地是β氨基酸、重氮氨基酸、或者β-重氮氨基酸；其中如果肽衍生物包含半胱氨酸，则所述肽衍生物任选是二聚体，条件是该肽不 是 QRFSR 或 YQRFSR。式(I)和/或式(IV)的这种肽的具体例子包括-QRFSR-NH2 ；-QR-F[4Br]_SR，其中-打4Br]_是苯丙氨酸，其苯基在对位由溴原子取代；-QRFPR ；_(乙酰)-QRFSR ；-C- (-HN- (CH2) 8_C0_) -QRFSR ；-生物素(biotine)- (_HN_ (CH2) 6-C0_) -QRFSR ；-dR-dS-dF-dR-dQ ；-Y- (-HN- (CH2) 6-C0_) -QRFSR ；-Y- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFSR ；
-QRF-S (0-辛酰基)-R ；-CQRFSR ；-CQRF-S (0_ 辛酰基)-R ；-CQRF-S (0_ 十二酰基)-R ；-C- (-HN- (CH2) 8_C0_) -QRFSR ；-C- (-HN- (CH2) 12_C0_) -QRFSR ；-C- (-HN- (CH2) 8_C0_) -QRF-S (0-辛酰基)-R ；- [C β 2] QRF-S (0-辛酰基)-R;-C- (-ΗΝ- (CH2) 8_C0_) -QRFS- [ β 3R]；-C- [dQ] -RF-S (0-辛酰基)-[dR]；-C-(-HN-(CH2)8-CO-)-QRFS-[dR]；- [dC] -QRF-S (0-辛酰基)-[dR]；- [C β 2] -QRF-S (0_ 辛酰基)_ [ β 3R]；-[Cqrfsri2 ；-QRYSR ；-QR-打4F]_SR，其中-打4F]-是苯丙氨酸，其苯基在对位由氟原子取代；-QR-F[4Br]_SR，其中-打4Br]_是苯丙氨酸，其苯基在对位由溴原子取代；-QKFSR ；-QRFSK ；-C- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRFSR ；-C- (-HN- (CH2) 6-C0-) -QRF-S (0_ 辛酰基)-R ；-C (-HN- (CH2) 12-C0-) QRF-S (0_ 辛酰基)-R ；-C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRFS-dR ；-C- (-HN- (CH2) 12-C0-) -QRF-S (0-辛酰基)-β 3R ；
-C- (-HN- (CH2) 8-C0") -QRF-S (0-辛酰基)β 3R ；其中-C β 2 是 H2N (-CH2-SH) -CH2-CO-；- β 3R 是-NH-CH2-C [- (CH2) 3-NH_C (NH) (NH2) ] -COOH ；-S(-0-辛酰基)是指丝氨酸，其羟基由辛酰基取代，-S(-0-十二酰基)是指丝氨酸，其羟基由十二酰基取代。在2008年4月7日提交的美国临时申请US 61/0似922和2009年4月7日提交 的国际申请PCT/EP2009/0M171中描述的包括一或多个化学修饰以改善其稳定性和/或其 生物利用率的肽进一步包括-NH2-QRFSR-C0NH2 ；-NH2-QRGPR-C00H ；-NH2-QHNPR-C00H ；-NH2-QR (4 溴基 F) SR-COOH ；-NH2-QRFPR-C00H ；-N-(乙酰)QRFSR-C00H ；-N- (C8-聚乙烯)QRFSR-C00H ；-N-(生物素-C6) QRFSR-C00H ；-NH2-dRdSdFdRdQ-C00H(D-对映异构体逆反转(retroinversion))；-NH2-YQRFSR-C00H ；-NH2-Y- (C6-聚乙烯)QRFSR-C00H ；-NH2-Y- (C12-聚乙烯)QRFSR-C00H ；-NH2-QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；-NH2-CQRFSR-C00H ；-NH2-CQRF [S-0-C8-聚乙烯]R-C00H ；-NH2-CQRF [S-0-C12-聚乙烯]R-C00H ；-NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFSR-C00H ；-NH2-C- (C12-聚乙烯)QRFSR-C00H ；-NH2-C- (C8-聚乙烯)QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-COOH ；
-NH2- [C β 2] QRF [S-0-C8-聚乙烯]R-COOH ；-NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFS [ β 3R] -COOH ；-NH2-C [dQ] RF [S-0-C8-聚乙烯][dR] -COOH ；-NH2-C- (C8-聚乙烯)QRFS [dR]；-NH2- [dC] QRF [S-0-C8-聚乙烯][dR] -COOH ；-NH2- [C β 2] QRF [S-0-C8-聚乙烯][β 3R] -COOH ；禾口_[CQRFSR]2，即N-端半胱氨酸和胱氨酸键(二硫键)的SH基团的氧化后形成的 二肽；其中-C β 2用包含与该半胱氨酸的羰基旁边的碳相邻的甲基残基的半胱氨酸- β 2来 替换天然半胱氨酸残基；
-β 3R用包含与该精氨酸的胺基团旁边的碳相邻的甲基残基的精氨酸- β 3来替 换天然精氨酸； - [S-0-C8-聚乙烯]是[S-0-辛酰基]；及-C6、C8或C12聚乙烯相应于由6、8或12个碳的乙烯链组成的间隔区基团。当肽含有但是不是由序列SEQ ID NO 5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产 物组成时，或者含有但是不是由所述成熟产物的衍生物组成时，所述肽在其N末端或C末端 含有额外的氨基酸。这些额外的氨基酸可以例如相应于BPLP序列的一部分，或者改善其稳 定性和/或其生物利用率的氨基酸序列。但是，该肽的大小应优选不超过30-40个氨基酸。本发明的肽可以通过本领域技术人员公知的任何方法合成。这种方法特别包括 常规的化学合成(以固相或者同质液相)、从组成性氨基酸或其衍生物进行酶合成、以及 通过重组宿主细胞的生物学产生方法。经化学途径的合成是特别有利的，这是由于纯度、 抗原特异性、不存在不希望的次生物的原因以及由于生产的简易。经化学途径的合成在其 它方法之外包括Merrifield型合成以及在Fmoc固相中的肽合成方法学(参见例如“Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach", publishedby W. C. Chan and P. D. White, Oxford University Press，2000)。本发明多肽的治疗用途已示出opiorphin在大鼠中行为绝望分析的模型中发挥抗抑郁作用及精神刺激 作用。另外，已示出opiorphin的抗抑郁作用及精神刺激作用依赖于内源μ-和δ -阿片 样物质受体的活化，但是不依赖于内源κ -阿片样物质受体的活化。因此，本发明涉及上段中描述的本发明的肽，用作精神刺激剂。本发明的这种肽可 以用于激活依赖于μ -和/或S -阿片样物质受体的阿片样物质能的(opioidergic)途径。 另外，本发明的肽不激活依赖于κ-阿片样物质受体的阿片样物质能的途径。这些肽特别可以用于治疗或预防发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷(在 成人中和在儿童中)、活动过度(在成人中和在儿童中)，注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)， 强迫性障碍(0⑶)和心境障碍如抑郁状况(cbpressive conditions)和抑郁(“重度抑郁 症(Major D印ressiveDisorder)”)，后者包括原发性(primary)抑郁(“重度抑郁症，单次 发作”)和抵抗性抑郁(“重度抑郁症，复发”)，双极疾病(I型和/或II型的)，情绪恶劣 障碍(dysthymic disorder)和循环型情感障碍。在治疗这些疾病之一的范围内，本发明的肽优选施用给需要精神刺激剂和/或需 要依赖于或S-阿片样物质受体的阿片样物质能途径活化的患者亚群。本发明的肽还可以与为了治疗或预防相同疾病的第二种活性成分联合(即同时 或相继施用)。此第二种活性成分也可以具有精神刺激作用或者抗抑郁作用，或者甚至具有 抗焦虑作用。所述肽可以例如与选自如下的至少一种第二种活性成分联合使用-抗抑郁剂如imao(异丙烟胼(iproniazide)，吗氯贝胺等)、米帕明 (imipraminic)抗抑郁剂(米帕明、氯米帕明、阿米替林、阿莫沙平、度硫平、多塞平、马普替 林、曲米帕明等)，5_羟色胺的重俘获的选择性抑制性抗抑郁剂(西酞普兰、氟伏沙明、氟西 汀、帕罗西汀、舍曲林、依地普仑等)或5-羟色胺及肾上腺素的重俘获的抑制性抗抑郁剂 (米那普仑、文拉法辛、米氮平等)；-抗焦虑剂如苯并二氮(阿普唑仑、氯巴占、安定、劳拉西泮、普拉西泮等)、甲丙氨酯、羟嗪、丁螺环酮、卡普托胺或依替福嗪；及-精神刺激剂如吗啡、莫达非尼、哌甲酯、地阿诺衍生物(acti5、乙谷氨乙醇 (cleregil)，debrumyl等)、酮戊二酸(ketoglutarate)、阿屈非尼或舒布硫胺。大多数这些已知活性成分在有效剂量具有显著副作用。与已知的活性成分不同， 本发明的肽作用于生理调节系统而非直接作用于转移系统或受体。因此本发明的肽的作用 不偏离调节系统范围，并且不会使所述系统饱和。因此，它们没有或仅有非常小的副作用。本发明的肽通过强化第二种活性成分的作用使得可以以低于第二种活性成分单 独施用时的有效剂量的浓度来施用。因此，本发明的优选实施方案涉及本发明的肽与至少 一种第二种活性成分联合使用，所述第二种活性成分的以低于有效剂量的浓度进行施用， 特别是在副作用被限制、降低、最小化或消除的剂量。本发明的肽及第二种活性成分可以存在于相同药物组合物中或者在两个分离的 药物组合物中。在第二种情况中，所述药物组合物可以基本上同时或者相继施用于患者。此处所提及的疾病可以在任何疾病阶段进行治疗。“治疗”是指治愈性的治疗 (curative treatment)(意在至少缓解、减缓或者终止病理的进程)。“预防”是指预防性治 疗(意在降低病理发生的风险)。“精神刺激剂” (“psychostimulant” 和 “psychostimulant agent”)是指引起多 巴胺能和去甲肾上腺素能神经传递增加的化合物。更具体地，精神刺激剂刺激负责控制注 意力、动机、警觉和集中(concentration)的神经递质。多巴胺和肾上腺素是负责控制注意 力、动机、警觉和集中的两种主要神经递质。术语“依赖于和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径”是本领域技 术人员公知的。这些途径特别包括Henriksen和Willoct^2008Brain. 131 (Pt 5) :1171-96) 描述的那些。本领域技术人员具有一些测试可用于评价化合物是否激活依赖于μ-和/或 δ -阿片样物质受体的阿片样物质能途径，如实施例2所述的那些。例如，可以在存在和不 存在μ-和/或δ-阿片样物质受体的特定阿片样物质拮抗剂的条件下比较化合物的作 用。在所述拮抗剂存在时该化合物作用的消除表明所述化合物激活所研究的阿片样物质能 途径。本发明涉及本发明的肽用于激活依赖于和/或δ-阿片样物质受体的阿片样 物质能途径的体外用途和体内用途。本发明还涉及本发明的肽用于制备如下物质的用途-精神刺激剂；-能激活依赖于和/或δ-阿片样物质受体的阿片样物质能途径的药物；和/ 或-用于预防或治疗选自如下的疾病的药物发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、成 人和儿童的注意缺陷、成人和儿童的活动过度、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、强迫性障 碍(OCD)，和心境障碍如抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍。另外，本发明涉 及用于如下的方法-治疗或预防选自由如下所组成的组的疾病发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、 成人和儿童的注意缺陷、成人和儿童的活动过度、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、强迫性 障碍(OCD)、和心境障碍如抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍；和/或
-激活依赖于μ-和/或δ -阿片样物质受体的阿片样物质能途径；其包括将本 发明的肽施用于个体的步骤。优选地，所述个体是需要其的个体和/或患者。优选地，使用 有效量的所述肽。所述个体和/或患者优选需要精神刺激剂和/或需要激活依赖于μ-和 /或S-阿片样物质受体的阿片样物质能途径。药物组合物和剂量本发明的肽优先用作药物组合物，其包含至少一种本发明的肽作为活性成分，及 一或多种药物学可接受的赋形剂。“赋形剂”或“药物学可接受载体”是指任何溶剂、分散介质、吸收延迟剂 (absorption-delaying agent)等，其在人或动物中不产生任何副作用例如变态反应。本发明的肽可以相应于上述任何肽。例如，本发明的药物组合物每药物组合物单位剂量包含3-100、5-50或者10_25mg 的本发明的肽。药物组合物可以伴有涉及治疗应用(例如上述那些)和剂量(例如符合前 面段落所提及的剂量)的说明书。剂量特别依赖于相关活性成分、施用模式、治疗适应症、患者的年龄、体重、和状 况。初始剂量一般经选择以尽可能的低(最低有效剂量)。如有必要，根据患者反应逐 渐增加剂量。鉴于在活性成分作用发生之前可能有延迟，优选在增加剂量之前必需等待若 干天至几周。在本发明的肽的情况中，成人的初始剂量可以例如是小于或等于75mg/天，分三 次施用。如有必要，此剂量可以逐渐增加至150mg每天。不推荐高于每天200mg的剂量。但 是，当患者状况严重被送到医院时，剂量可以达到每天250或300mg。在老年患者中，初始剂 量是例如小于或等于每天30mg，并且优选不应超过每天lOOmg。在儿童中，初始剂量可以是 例如小于或等于每天10-25mg，优选不应超过每天75mg。本发明的药物组合物可进一步含有至少一种选自精神刺激剂、抗抑郁剂和/或抗 焦虑剂的第二种活性成分。本发明的药物组合物可以进行配制以便经单一途径或经不同途径施用于患者。药物组合物可以例如经口服、舌下、经鼻、含服、经皮、静脉内、皮下、肌肉内和/或 经直肠途径来施用。在经口服或舌下途径施用的情况中，本发明的组合物例如是作为明胶胶囊、泡腾 片剂、无包衣或有包衣片剂、囊剂(sachet)、“锭剂(dragSes)”、可饮用安瓿或溶液、微粒或 延长释放的形式。在经鼻或含服途径施用的情况中，本发明的组合物以例如喷雾剂的形式存在。在经皮途径施用的情况中，本发明的组合物以例如贴剂的形式存在。当打算经肠胃外途径施用时，更特别是经注射施用时，包含活性成分的本发明的 组合物以包装在安瓿或瓶中用于缓慢灌注的可注射溶液和悬浮液存在。注射可特别经皮 下、肌肉内或静脉内途径进行。用于肠胃外施用的形式通过将活性成分与缓冲液、稳定剂、 防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂混合而常规获得。根据已知技术，这些混合物然后被灭菌 (例如经过滤)，并随后包装成静脉内注射剂。作为缓冲液，本领域技术人员可以使用基于有机磷酸盐来源的缓冲液。
13
悬浮剂的例子包括甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、阿拉伯胶和羧甲基 纤维素钠。另外，本发明有用的稳定剂是亚硫酸钠和焦亚硫酸钠，而作为防腐剂可提及的有 对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚或者氯甲酚。为制备口服溶液或悬液，将活性成分溶于或者 悬浮于具有分散剂、湿润剂、悬浮剂(例如聚乙烯比咯烷酮)、防腐剂(如对羟苯甲酸甲酯或 对羟苯甲酸丙酯)、调味剂(taste-correcting agent)或着色剂的合适载体液(vehicle) 中。为制备微囊，将活性成分与合适的稀释剂、合适的稳定剂、促进活性物质延长释放 的物质或者其它任何添加剂作何以形成中央核心(central core)，然后用合适聚合物(例 如水溶性树脂或水不溶性树脂)包衣。本领域技术人员已知的技术将用于此目的。由此获得的微囊然后任选地配制在合适的剂量单位中。尽管有不同的含义，但是术语“包含”、“含有”、“包括”和“由...组成”在本发明 描述中可互换使用，它们可以互相代替。下述实施例和


本发明，但不限制其范围。附图描述Ml说明opiorphin在强迫游泳测试中的精神刺激和抗抑郁作用，这通过在测试 前(n = 40)和测试期间(干燥，η = 8大鼠/组)测量不动持续时间(平均值士SEM)。 Man-Whitney 检验(vs.载体液)的结果如下:Tp < 0. 10 ；*ρ < 0. 05 ；***ρ < 0. 001。在测试 期间，施用了 opiorphin的大鼠不顺从(resign)，不像施用了载体液的大鼠那样。这证实 opiorphin具有抗抑郁作用。另外，在测试期间，施用了 opiorphin的大鼠不动时间比在测 试前期间相同大鼠的不动时间短。这证实opiorphin具有精神刺激作用。图2示出在甩尾疼痛(tail-flick pain)模型中opiorphin发挥止痛活性。在施 用人Opiorphin或吗啡后以时间针对有害热刺激的函数来评价疼痛应答。在4个不同时 间点评估甩尾潜伏期参照吗啡在施用Opiorphin或载体液后5、15、25和60分钟。在注 射Opiorphin、吗啡或载体液之前进行30秒间隔分隔的两个连续测量，以评估基线甩尾潜 伏期。与载体液(空心圆)和吗啡(空心三角；lmg/kg i. v.)相比的Opiorphin(黑色圆； 2mg/kg i. v.)对甩尾潜伏期的作用。结果表示为6只大鼠的均值士 SEM。星号表示通过 Mann-Whitney U 检验的 < 0. Olvs 载体液。图3示出人Opiorphin在甩尾疼痛模型中显示止痛作用。在急性和慢性施用人 Opiorphin或吗啡后以针对有害热刺激的函数来评价疼痛应答。在急性(第1天)或在 7天期间每天(第7天)i. v.施用Opiorphin、载体液或吗啡后评估甩尾潜伏期。在注射 Opiorphin、吗啡或载体液之前进行30秒间隔分隔的两个连续测量，以评估基线甩尾潜伏 期。与载体液(空心圆)和吗啡(空心方块；lmg/kg i. v.)相比的Opiorphin(空心三角； 2mg/kg i. v.)对甩尾潜伏期的作用。结果以6只大鼠的均值士 SEM表示。星号表示通过 Mann-Whitney U 检验的 *P < 0. 05，**P < 0. Olvs 载体液。序列表序列的描述SEQ ID NO 1，2，3和4相应于本发明的肽。更特别地，SEQ ID N0:2相应于 opiorphin。SEQ ID NO :5相应于人碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的序列。
SEQ ID NO 6 相应于 Sialorphin0 实施例实施仿Il 1 由 Genosphere Biotechnologies (F) & Almac Sciences(UK)合成 opiorphin(艮口 QRFSR 肽)Opiorphin批次由 Genosphere Biotechnologies (F) & Almac Sciences (UK)合成。 经确认这些合成批次以剂量依赖方式在体外保护-P物质(NEP的生理学底物)及合成的荧光底物[Abz]-dRGL-[EDDnp]、 [Abz]-RGFK-[DnpOH] (Thermo-Fisher Scientific)免于由重组人 NEP 的内切蛋白酶解 (endoproteolysis) (QRFSR 肽的抑制浓度，包含 5-50 μ Μ)；及-Ala-AMC的合成底物免于由重组人APN的氨基蛋白酶解(aminoproteolysis)。实施例2 :oDiorphin对伤害感警传递(nociceptive transmission)涂径的作用在雄性大鼠的急性疼痛行为应答分析模型中，即Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 ； 100 (14) :8549-54)所述的 “Pin Pain Test”(机械刺激)，已示出 opiorphin 以 lmg/kg i. v.发挥强抗伤害感受(antinociceptive)的活性(p = 0.0002， Mann-Whitney U-检验，η = 8-12只大鼠/组)，等价于以6mg/kg i. p.的吗啡的该活性 (Rougeot and Messaoudi, Med. Sci. (Paris). 2007 ；23(1) :37-9)。以引人注目地方式，在主要副作用中，吗啡的抗蠕动作用(与对照大鼠相比在用 吗啡治疗的大鼠中蠕动80-90%抑制)在用opiorphin治疗的大鼠中未观察到。然后在与皮下慢性炎症(在后爪的化学刺激)相关的慢性疼痛行为应答分析模 型中研究了 opiorphin 的止痛作用，即 Rougeot et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 ； 100(14) :8549-54)所述的“福尔马林测试(formalin test)”。参照物质是吗啡，剂量为 2mg/kg。在所谓的“福尔马林”疼痛测试中的两个最重要变量舔爪持续时间和痉挛数的基 础上，opiorphin显示出延长的止痛特性(analgesic profile)(记录并在动力学中分析 行为应答60分钟)，其具有显著剂量依赖作用(p ^ 0. 002，Kruskal-Wallis方差分析，η =8只大鼠/组)及以1-ang/kg i. v.的最大抗伤害感受能力(Marm-Whitney检验ρ = 0. 036-0. 003vs.载体液)。下个步骤是解释opiorphin的抗伤害感受作用机制的特异性及特别是内源阿片 样物质受体的牵连。分析了下述配体的拮抗作用广谱阿片样物质拮抗剂(纳洛酮，3mg/ kg)，和阿片样物质 μ -受体(CT0P, 0. 8mg/kg)、δ -受体(Naltrindole, 10mg/kg)和 κ -受 体(Nor-Binaltorphimine，5mg/kg)的选择性拮抗剂。表权利要求
1.用作精神刺激剂的肽，其中所述肽一包含序列SEQ ID NO :5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物或者所述成熟产 物的衍生物；和-发挥精神刺激活性。
2.激活依赖于和/或S-阿片样物质受体的阿片样物质能(opioidergic)途径的 肽，其中所述肽-包含序列SEQ ID NO :5的碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的成熟产物或者所述成熟产 物的衍生物；和-发挥精神刺激活性。
3.权利要求1或2的肽，其中所述肽包含序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg(SEQ ID NO 1), 其中-X1代表氢原子、酪氨酸或半胱氨酸；-当&是氢原子时，X2代表谷氨酰胺或焦谷氨酸；-当&是酪氨酸或半胱氨酸时，X2代表谷氨酰胺；和-所述肽的C端最末端序列由A-X2-Arg-Phe-Ser-Arg组成。
4.权利要求3的肽，其中所述肽由序列A-X2-Arg-Phe-Ser-Arg组成。
5.权利要求1-4任一项的肽，其中所述肽由选自序列QRFSR(SEQIDNO 2)、YQRFSR(SEQ ID NO 3) ^P CQRFSR(SEQ ID NO 4)的序列组成。
6.权利要求1-4任一项的肽，其序列由于保守取代而与选自序列SEQID N0:2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的序列不同。
7.权利要求1-6任一项的肽，其中所述肽包括改善其稳定性和/或生物利用率的化学 修饰。
8.权利要求1-7任一项的肽，用于治疗或预防选自由强迫性障碍(0CD)、发作性睡病、 睡眠过度、警觉下降、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、在成人中和在儿童中的注意缺陷和 /或活动过度、抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感精神障碍组成的组的疾病。
9.权利要求8的肽，其中所述疾病选自由强迫性障碍、发作性睡病、睡眠过度、警觉下 降、儿童中的注意缺陷和/或活动过度、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍组成的 组。
10.权利要求9的肽，其中所述疾病选自由强迫性障碍、发作性睡病、睡眠过度和警觉 下降组成的组。
11.权利要求1-10任一项的肽，以小于或等于75mg/天的剂量施用于成人。
12.权利要求1-10任一项的肽，以小于或等于25mg每天的剂量施用于儿童。
13.权利要求11或12的肽，每天施用三次。
14.权利要求1-13任一项的肽，经选自口服、经皮、经鼻、舌下和静脉内途径的途径来 施用。
15.权利要求1-14任一项的肽，与选自由精神刺激剂、抗抑郁剂和抗焦虑剂组成的组 的第二种活性成分联合施用。
16.治疗或预防选自由强迫性障碍、发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷/活动 过度障碍、在成人中和在儿童中的注意缺陷和/或活动过度、抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍组成的组的疾病的方法，包括将有效量的权利要求1-15任一项的肽 施用于需要其的个体的步骤。
全文摘要
本发明涉及用作精神刺激剂的衍生自人碱性富脯氨酸泪蛋白(BPLP)的肽，特别是opiorphin。这些肽用于治疗或预防疾病如强迫性障碍(OCD)、发作性睡病、睡眠过度、警觉下降、注意缺陷/活动过度障碍(ADHD)、在成人中和在儿童中的注意缺陷和/或活动过度、抑郁、双极疾病、情绪恶劣障碍和循环型情感障碍的疾病。
文档编号A61P25/26GK102123725SQ200980128153
公开日2011年7月13日 申请日期2009年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者C·鲁诺 申请人:巴斯德研究院