抗丙型肝炎病毒组合物的制作方法

专利名称：抗丙型肝炎病毒组合物的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及对丙型肝炎病毒(以下也称为“HCV”)的感染预防或增殖抑制有 用的医药组合物。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)具有正单链RNA作为基因。由HCV的RNA翻译的约3000个 氨基酸构成巨大的前体蛋白质，通过来自宿主细胞和来自病毒的蛋白分解酶切断为构成病 毒颗粒的核心蛋白、包膜蛋白和其它的非结构蛋白。已知上述核心蛋白不仅构成病毒颗粒，而且向宿主细胞的核内移行。近年，报告了 核心蛋白对宿主细胞的功能进行多种调节，与肝癌的发病密切相关。在非专利文献1中，例 如，公开了表达HCV的核心蛋白的转基因小鼠历经脂肪肝以很高的发病率发生肝癌。此后， 出于阐明核心蛋白引起肝癌发病的分子机理，广泛进行鉴定与核心蛋白相互作用的宿主内 蛋白质并分析其功能的方法。迄今为止，作为与核心蛋白相互作用的宿主内蛋白质，报告了 p53(非专利文献 2)、RNA解旋酶(非专利文献3)、STAT3 (非专利文献4)、PA28 y (非专利文献5)等多个。在非专利文献5中，公开了核心蛋白与PA^ γ相互作用，定位于细胞核内。其中， ΡΑ28 γ定位于细胞核内，作为与20S蛋白酶体相互作用而提高其肽酶活性的蛋白酶体调节 蛋白质已知。上述文献还报告了核心蛋白的44 71位氨基酸区域参与与PA^ γ的结合 和核内定位二者，核心蛋白受到PA^y依赖性的分解。但是，在这些文献中，核心蛋白参与 肝癌发病的具体机理并未充分阐明。另外，在专利文献1中，公开了包括评价丙型肝炎病毒核心蛋白与PA^Y的蛋白 质之间相互作用的阻碍活性的工序的丙型肝炎病毒相关疾病的预防和/或治疗中有用药 剂的筛选方法，以及由该方法可以得到的丙型肝炎病毒相关疾病的预防和/或治疗药。但 是，该文献是关于由PA^ γ诱导的来自丙型肝炎病毒的核心蛋白所致发病的抑制，即，是 关于从肝炎状态向脂肪肝、肝硬化、肝癌进展的抑制，并没有阐明对丙型肝炎病毒的感染预 防或增殖抑制的功能。因此，该文献的丙型肝炎病毒相关疾病的预防和/或治疗药与抗病 毒药不同，其目的不在于抑制或减少病毒量，而只具有作为对症疗法的功能，因此，不仅给 药方法为长期使用，而且由于从持续感染到肝硬化和肝癌等丙型肝炎病毒相关疾病发病为 10 15年，所以存在预想的临床开发期长期化等问题。但是，如果能够通过抗病毒药排除HCV，就能够治愈HCV感染症。此外，迄今为止的抗病毒药的主流是以病毒复制作为标的药物，但是如果通过新 的机理提供一种预防病毒感染或抑制增殖的抗病毒药，则可以认为能够进一步提高抗病毒 效果。现有技术文献专利文献专利文献1 :W0 2008/041665
非专利文献非专利文献1 =Nature Medicine 4. 1065-1067(1998)非专利文献2 J. Biol. Chem.，275 :34122-34130 (2000)非专利文献3 J.Virol· ,73 :2841-2853(1999)非专利文献4 J. Exp. Med.，196 :641-653 (2002)非专利文献5 J. Virol.，77，19. 10237-10249 (2003)

发明内容
发明要解决的课题本发明的主要目的在于提供一种对HCV的感染预防或增殖抑制有用的组合物、使 用该组合物的HCV感染预防或增殖抑制方法、以及能够高效选定作为上述组合物的有效成 分有用的物质的方法。解决课题的方法本发明的发明人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现HCV的感染与 PA28Y相关，进一步反复进行了深入研究，结果完成了本发明。S卩，本发明关于以下事项。项1. 一种抗丙型肝炎病毒组合物，其包含抑制PA^ Y基因的表达或功能的物质。项2.如项1所述的组合物，其中，抑制PA^ Y基因的表达或功能的物质是以下 (a) (c)中的任一种，(a)抑制PA^ γ基因的表达或功能的核酸、(b)修饰(a)中记载的核酸而成的修饰核酸、(c)能够表达(a)中记载的核酸的表达载体。项3.如项2所述的组合物，其中，上述(a)中记载的核酸是RNA。项4.如项3所述的组合物，其中，RNA是siRNA(small interfering RNA 小干扰 RNA)或 shRNA (short hairpin RNA 短发夹 RNA)。项5.如项1 4中任一项所述的组合物，其是丙型肝炎病毒感染预防用或增殖抑 制用的组合物。特别是，包含抑制PA^ Y基因的表达或功能的物质作为有效成分的用于丙型肝 炎病毒感染预防或增殖抑制的组合物。或者，抑制PA^Y基因的表达或功能的物质在制造 丙型肝炎病毒感染预防或增殖抑制用医药中的使用。项6. —种丙型肝炎病毒感染预防或增殖抑制方法，其包括向被检测体投与项1 5中任一项所述的组合物的工序。另外，抑制PA^ γ基因的表达或功能的物质在丙型肝炎 病毒感染预防或增殖抑制方法中的使用。项7. —种抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分的筛选方法，包括使试验物质接触PA^ Y基因的表达细胞或具有表达能力的细胞的工序、比较试验物质所接触的细胞和对照细胞中的PA^ Y基因的表达水平的工序、和通过上述比较，选择评价为阻碍PA^ Y基因表达的试验物质的工序。特别是一种抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分的筛选方法，包括使试验物质接触PA^ Y基因的表达细胞或具有表达能力的细胞的工序、
比较试验物质所接触的细胞和对照细胞中的PA^ Y基因的表达水平的工序、和通过上述比较，选择与对照相比使PA^ Y基因的表达水平降低的实验物质的工序。项8. —种抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分的筛选方法，包括在包含PA^ Y、胰蛋白酶样底物和20S蛋白酶体的反应体系中投与试验物质的工 序、比较投与了试验物质的体系和对照中的蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的工序、和选择在上述比较中与对照相比抑制胰蛋白酶样活性的试验物质的工序。以下，对本发明进行详细说明。在本说明书中，所谓抗HCV，指的是阻碍HCV向细胞表面吸附、向细胞内侵入、脱 壳、翻译、复制、集合、向细胞膜输送、从细胞释放这一生命周期中的至少1个步骤的作用。 另外，所谓HCV感染预防或增殖抑制，意指通过上述作用防御抑制HCV感染细胞或增殖。例 如，在本发明的HCV感染预防或增殖抑制中，包括抑制病毒的增殖，抑制或减少病毒量，由 此防止或抑制HCV持续感染。特别是在抗HCV作用中，包括阻碍病毒向细胞内侵入、阻碍脱壳、阻碍病毒颗粒的 集合、阻碍向细胞膜输送或阻碍病毒颗粒从细胞释放中的任意一个作用。PA28Y是作为蛋白酶体调节蛋白质公知的定位于细胞核的蛋白质。PA^Y的氨 基酸序列和编码该蛋白质的碱基序列是公知的，例如，作为氨基酸序列，已知Swiss-Prot accession number P61289所示序列的来自人的PA^ γ等。在PA^ γ中，除了人以外，已 知猴、小鼠、猪等同源物的存在，这些氨基酸序列在Swiss-Prot中公开，都可以作为本发明 中的PA^y利用。作为本发明中所述的ΡΑ^γ，不限定于由上述序列构成的野生型蛋白 质，例如，也可以使用由野生型蛋白质的氨基酸的一部分缺失、取代或添加了其它氨基酸序 列而成的序列构成的突变型蛋白质。作为这样的突变型蛋白质，例如，也可以使用至少具有 蛋白酶体调节活性或核内转移活性的突变型蛋白质。1.抗HCV组合物本发明的抗HCV组合物包含抑制PA^ γ基因的表达或功能的物质作为有效成分。在本说明书中，所谓“表达”，指的是蛋白质产生且以具有功能的状态定位于作用 部位。因此，“抑制表达的物质”可以是在基因转录、转录后调节、蛋白质翻译、翻译后修饰、 定位、核内移动和蛋白质折叠等中的任意阶段中发挥作用而抑制表达的物质。另外，所谓“功能”，指的是通过PA^ Y作用而发挥的效果。因此，“抑制功能的物 质”指的是抑制PA^ Y的作用的物质。作为PA^ γ的作用之一，可以列举20S蛋白酶体的 胰蛋白酶样活性的活化作用。因此，在“在抑制功能的物质”中，包含阻碍由PA^y产生的 20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的化合物。具体而言，作为抑制基因的表达或功能的物质，可以列举转录抑制因子、RNA聚合 酶阻碍剂、蛋白质合成阻碍剂、蛋白质分解酶、蛋白质变性因子、能够阻碍剪接或阻碍mRNA 向细胞质移动的因子、mRNA分解因子、与mRNA结合而使之失活的因子等。其中，优选避免 对其它基因或蛋白质的不良影响而对标的分子产生特异性作用的物质。作为对标的分子特异性作用的物质，可以列举核酸、抗体和肽等。作为抗体，例如，可以列举具有阻碍PA^ Y与蛋白酶体结合的作用的抗体。特别优选用于特异性作用的单克隆抗体。另外，作为肽，例如，可以列举具有阻碍PA^ Y与蛋白酶体结合的作用的肽。肽既 可以是只由肽结构所构成的肽，也可以是结合有糖链或脂肪酸的复合肽。另外，也可以是氨 基酸残基侧链的一部分被修饰的肽或被保护基保护的肽。特别是在本发明中，适合使用核酸。核酸包括DNA和RNA。另外，RNA包括双链(dsRNA)、单链(ssRNA)或具有单链悬 端的双链结构的RNA。具体而言，作为抑制基因的表达或功能的核酸，可以列举核酶、反义核酸、适体 (aptamer)、诱饵(decoy)核酸、低分子RNA等。在低分子RNA中，包括低分子干扰RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)和小发卡 RNA(shRNA)、DsiRNA (Dicer Substrate Small Interfering RNAs :Dicer 底物小干扰 RNA)寸。以下，更详细地说明由RNA干扰引起mRNA分解的siRNA或shRNA，但并非将本发明 限定于此。siRNA是由与标的基因的mRNA或者初期转录产物的核苷酸序列或其部分序列具 有相同序列的RNA及其互补链构成的双链寡RNA。另夕卜，shRNA (small hairpin RNA (小发 夹RNA) =ShRNA)是通过发夹环部分将与标的核苷酸序列相同的序列(第1序列)及其互补 序列(第2序列)连接而成的单链RNA，是通过形成发夹环型结构而形成第1序列和第2序 列的双链结构的RNA。siRNA和shRNA中所包含的与标的核苷酸序列相同部分的长度，只要能够引起RNA 干扰，则没有特别限定。另外，siRNA或shRNA的全长，只要能够引起RNA干扰，则也没有特别限定，但通常 是20 25左右，特别是21 23左右。另外，shRNA的核酸全长是作为形成双链结构时的双链部分的长度所示的长度。优选标的核苷酸序列与siRNA或shRNA所包含的与其相同的序列具有90%以上、 优选95 %以上、更优选98 %或99 %以上的序列同一性。siRNA或shRNA可以在5’或3’末端具有不形成碱对的添加的碱基。该添加的碱 基可以是DNA或RNA，但如果使用DNA，就可以使siRNA的稳定性提高。shRNA的发夹环的环部分长度，只要能够引起RNA干扰，则没有特别限定，但通常 是3 23个碱基左右，特别是6 9个碱基左右。该环部分的核苷酸序列只要能够形成环， 并且shRNA能够引起RNA干扰，则没有特别限定。siRNA和shRNA既可以按照公知的方法化学合成，也可以通过使用启动子和RNA聚 合酶的转录体系在体外合成。通过化学合成进行的合成，合成具有彼此互补的序列作为反向序列的RNA，并使自 身互补性部分结合即可。另外，使用启动子和RNA聚合酶的合成，可以在1个启动子的下游 合成具有以环连接正义链和反义链的结构的模板DNA，由RNA聚合酶转录RNA来合成。
作为siRNA和shRNA的具体例子，可以例示选自GenBank :XM032767所示的 PA28 y mRNA的338 401位部分的任意序列等。但是，该例示不是对本发明的限定性解释。
由这些RNA弓丨起的PA^ γ基因表达的抑制既可以是暂时的，也可以是稳定的。
上述核酸也可以被修饰。只要能够与标的特异性结合，而且对酶分解具有耐性，则 可以在核酸分子的任意位置上进行修饰。例如，在SiRNA中的修饰可以在核苷酸碱基，即嘌呤或嘧啶、核糖或磷酸中的至少 1个中进行。另外，上述核酸可以以表达载体的形态包含，使其能够稳定地到达细胞。作为表达 载体，可以使用质粒载体、病毒载体等。本发明的组合物，在抑制上述PA^ Y基因的表达或功能的物质以外，可以包含医 药上可接受的载体。另外，在本发明的组合物中，在达到本发明目的的范围内，例如，也可以添加干扰 素、聚乙二醇干扰素和利巴韦林等以与本发明不同的机理发挥作用的抗HCV药效成分，还 可以添加其它药效成分和医药上可接受的公知的添加剂。本发明的组合物通过按照公知的方法制剂化，能够作为抗HCV药或抗HCV剂使用。抗HCV药或抗HCV剂的剂型没有特别限定，可以根据目的适当设定。例如，可以作 为液剂或固体制剂等使用。作为液剂，例如，可以列举在水、生理食盐水等稀释液或分散介 质中使有效量的抑制PA^ Y基因的表达或功能的物质溶解、分散、乳化的而得到液剂等。 另外，作为固体制剂，可以列举将有效量的抑制PA^ Y基因的表达或功能的物质作为固体 或颗粒包含的胶囊剂、囊剂、片剂等。抗HCV药或抗HCV剂优选基于DDS (Drug Delivery System 药物传递系统)进行 设计，以使抑制PA^ γ基因的表达或功能的物质稳定到达肝脏或其附近的细胞。例如，为 了使siRNA送达肝脏或其附近的细胞中，可以列举将胆留醇或其衍生物附着在siRNA分子 的5’末端和/或3’末端等。本发明的组合物特别是作为HCV感染预防用或增殖抑制用的医药或药剂有用。例如，本发明的组合物能够适用于在感染前和感染后初期阶段投与等。另外，本发明的组合物能够作为对未感染者的感染预防用的医药使用。另外，本发明的组合物能够作为对HCV刚感染后者、处于HCV潜伏期者或感染HCV 但肝脏未见异常者等的HCV增殖抑制用或HCV排除用的医药使用。另外，本发明的组合物也能够在有感染可能性者、已经感染而必须阻止或延迟感 染的进展者、或不适应于其它抗HCV疗法者等中使用。通过在感染前或感染后初期阶段投与，进行HCV的感染预防或增殖抑制，能够防 止丙型肝炎发病和向肝炎活动期的进展，例如，能够防止进展为GPT值上升2 3倍的状态 持续的状态等肝功能异常。2. HCV感染预防或增殖抑制方法通过向被检验体投与本发明的抗HCV组合物或将其制剂化而得到的制剂，能够进 行HCV感染预防或增殖抑制。所谓被检验体，是包括具有HCV感染或增殖可能性的人或人以外的动物个体整 体、器官、组织或细胞的概念，也包括被检验者、实验动物等。细胞既可以是分离细胞，也可以是培养细胞。另夕卜，作为人以外的动物，例如，可以列举小鼠、大鼠、猪、猴、树駒等除人以外的哺
乳动物。
投与量可以根据投与方法、症状、投与对象的种类、大小、药物特性等适当设定。投与方法也可以适当设定，既可以是口服投与，也可以是非口服投与。作为非口服 投与，例如，可以利用以静脉、动脉、肌肉、腹腔、气管等为途径的全身投与或者向肝脏或其 附近的局部投与，但不限定于这些投与方法。特别是当抑制PA^ γ基因的表达或功能的物质是低分子RNA时，可以根据公知的 低分子RNA的投与方法，特别是以肝脏为标的的方法投与。本发明特别是作为以有感染可能性者、急性肝炎患者或慢性肝炎的非活动期患者 作为对象的方法是适合的。另外，特别是作为在感染前、急性肝炎或慢性肝炎的非活动期阶 段投与组合物的方法是适合的。通过在这些阶段投与，抑制或减少病毒量，能够进行HCV的感染预防或增殖抑制， 能够进行HCV感染症的治愈或用于HCV排除的治疗。3.筛诜方法本发明的抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分，可以通过以PA^Y基因的表达或 功能的抑制作为指标的筛选方法进行选择。例如，作为筛选方法，可以列举具备下述工序的方法使试验物质接触PA^ Y基 因的表达细胞或具有表达能力的细胞的工序、比较试验物质所接触的细胞和对照细胞中的PA^ Y基因的表达水平的工序、和通过上述比较，选择评价为阻碍PA^ Y基因表达的试验物质的工序。试验物质可以是公知或新化合物中的任意一种，例如，可以列举核酸、蛋白质、肽、 有机低分子化合物等的合成或来自天然的化合物等。PA28 γ基因的表达细胞或具有表达能力的细胞的来源没有特别限定，可以使用小 鼠细胞、人细胞等。另外，只要是具备PA^Y基因的表达能力的细胞，则既可以是建立的细 胞株、从动物肝脏采取的活细胞，也可以是基因导入细胞或siRNA导入细胞。试验物质与细胞的接触方法也没有特别限定，可以按照公知的方法进行，例如，可 以通过在细胞培养基中添加试验物质进行。PA28Y基因的表达水平的测定也可以按照公知的方法进行，例如，可以使用扩增 将mRNA进行逆转录而得到的cDNA并由定量的RT-PCR测定的方法、使用探针直接定量mRNA 的RNA印迹法(Northern Blot)、使用搭载了标记基因群的DNA微阵列分析其表达量的方法等。比较接触试验物质的细胞和除了不接触试验物质以外在同样条件下的对照细胞 中的PA^ γ基因的表达水平，当接触了试验物质的细胞中的PA^ γ基因的表达量比对照 细胞中的表达量低时，该试验物质评价为阻碍PA^ Y基因的表达。评价为阻碍PA^ γ基 因表达的试验物质被选定为本发明的抗HCV组合物的有效成分的候补物质。另外，作为其它筛选方法，可以列举具备下述工序的方法在包含PA^ Y、胰蛋白酶样底物和20S蛋白酶体的反应体系中投与试验物质的工 序、比较投与了试验物质的体系和对照中的蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的工序、和选择在上述比较中与对照相比抑制胰蛋白酶样活性的试验物质的工序。作为胰蛋白酶样底物，可以使用作为用于测定胰蛋白酶样活性的底物所使用的公知的底物。例如，可以使用 Bz-VGR-AMC (benzoyl-Val-Gly-Arg-7-amido-4-methylcoumari η)、Boc-LRR-AMC(tert-butoxycarbonyl-Leu-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin)等。试验物质可以是公知或新化合物中的任意一种，例如，可以列举核酸、蛋白质、肽、 有机低分子化合物等合成或来自天然的化合物等。另外，反应系统可以包含缓冲液、标准物质、定量试剂等其它物质。作为对照，可以列举除了不投与试验物质以外，与投与了试验物质的系统相同条 件的反应系统、和除了投与作为比较基准的物质代替试验物质以外，与投与了试验物质的 系统相同条件的反应系统等。蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的比较方法也可以按照公知的方法进行，没有特别限 定，例如，可以在胰蛋白酶样底物中附加荧光标记，测定由底物分解产生的荧光，通过比较 荧光水平来进行。另外，上述筛选方法也可以使用市售的试剂盒进行。例如，在市售的20S蛋白酶体 试剂盒中，使用胰蛋白酶样底物作为底物，在添加了 PA^Y的体系中添加试验物质，进行 蛋白酶体的胰蛋白酶样活性测定和比较，由此能够进行筛选。比较投与了试验物质的体系与对照中的蛋白酶体的胰蛋白酶样活性，与对照相比 使胰蛋白酶样活性抑制的试验物质被评价为阻碍由PA^Y诱导的蛋白酶体中的胰蛋白酶 样活性的物质。该物质被选定为本发明的抗HCV组合物有效成分的候补物质。如上所述，如果根据本发明的筛选方法，则即使在体外或无细胞体系中，也能够高 效且简便地筛选对HCV的感染预防或增殖抑制有效的物质。发明的效果通过本发明，可以提供一种在HCV的感染预防或增殖抑制中有用的医药组合物和 方法。如果根据本发明，就能够进行HCV的感染阻碍或HCV产生量的抑制或减少，能够实 现HCV感染预防、用于HCV感染症的治愈或排除HCV的治疗。迄今为止，也报告了含有通过筛选方法得到的物质作为有效成分包含的丙型肝 炎病毒相关疾病的预防和/或治疗药，其中，该筛选方法包括评价丙型肝炎病毒核心蛋白 与PA^Y的蛋白质之间相互作用的阻碍活性的工序(专利文献1)。但是，如在该文献的
段和W011]段等中所示，只不过是以选自丙型肝炎伴随的脂肪肝、肝硬化和肝癌中 的至少一种疾病的预防和/或治疗为目的的治疗药。另一方面，本发明是以HCV的感染预防、HCV感染症的治愈或HCV排除为目的的发 明。由于肝脏是储备能力高的脏器，所以，即使感染上HCV，多数情况下也不会立刻出现症 状。但是，从丙型肝炎的症状变得明显后，病情发展，完全治愈变得困难。而且，感染状态还 是导致将来发病的危险状态。因此，在HCV感染前或感染后的早期阶段，进行适当处置是重 要的。如果根据本发明，就能够防御抑制HCV的感染或增殖，所以就能够排除HCV，治愈 HCV感染症。另外，由于本发明将抑制PA^ Y基因表达或功能的物质制作为有效成分，所以能 够特异性地作用，此外副作用也小。如果根据本发明，还能够提供一种高效且简便地筛选对HCV的感染预防或增殖抑制有用的物质的方法。这样，本发明提供一种对HCV的感染预防或增殖抑制有用的技术。


图1表示在Huh70kl细胞、对照细胞及PA^ γ敲除细胞C5和C7细胞中，由蛋白 质印迹法(Western Blot)检出的PA^ γ和β -actin的结果。图2表示在对照细胞(control shRNA) ,PA28 γ敲除细胞C5和C7细胞中，测定转 染了 空质粒(pEFFLAGGspGBK)或 shRNA 耐性 PA^ γ 表达质粒(pEFFLAGGsPA28gammaSI)的 细胞中的病毒效价的结果。图3表示测定在转染了阴性对照SiRNA的样品(阴极对照)、转染了针对PA^ γ 的siRNA的样品(PA^ γ 138669)和未转染siRNA的样品(未处理)中的病毒感染细胞的 细胞上清和细胞内的核心蛋白质量的结果。图4表示测定在转染了阴性对照siRNA的样品(阴极对照)、转染了针对PA^ γ 的siRNA的样品(PA^ γ 138669)和未转染siRNA的样品(未处理)中的病毒效价的结果。图5表示通过蛋白质印迹法测定转染了阴性对照siRNA的细胞(阴极对照)和转 染了针对PA^ γ的siRNA的细胞(PA^ γ 138669)中的PA^ γ表达量的结果。图6表示使用导入了 HCV复制子RNA的对照shRNA细胞(复制子/Cntr 15)、导入 了 HCV复制子RNA的PA^ γ敲除细胞C5 (复制子/KD5)、导入了 RNA聚合酶活性失活HCV 复制子GND RNA的PA^ γ敲除细胞C5 (复制子GND/Cntrl5)和导入了 RNA聚合酶活性失 活HCV复制子GND RNA的PA^ γ敲除细胞C5 (复制子GND/KM)，通过荧光素酶活性测定对 病毒复制影响的结果。图7表示在PA^ γ敲除细胞中，导入重组入PA^ y (Native form)或PA^ γ突 变体(G150S、m51Y、P245Y或Κ188Ε)基因的质粒或空质粒，测定感染病毒后的病毒产生量 的结果。
具体实施例方式以下，表示实施例和比较例，更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。1. PA28 γ敲除细胞的建立由以下程序设计用于编码通过RNA干扰敲除人PA^ γ基因的短发夹RNA的DNA 片段。作为靶序列，从PA^ γ基因的开放阅读框架(Open reading frame)中选择以下 4个序列。序列序号1 :AAGTGAAGCTCAAGGTTGATT序列序号2 :AAGGTTGGATGAGTGTGAAGA序列序号3 :AAGTGAGGCAGAAGACTTGGT序列序号4 :AAGGTGGATCAGGAAGTGAAG其中，选择了表达抑制效果显著的序列序号4的序列。序列序号4的序列相当于 在序列序号5中表示的PA^ γ编码区域的第16-36。
使用 Insert Design Tool for the pSilencer (注册商标)Vectors (Ambion 公 司,http //www. ambion. com/ jp/techlib/misc/psilencer_converter. html),设计编石马该 序列的短发夹RNA的DNA片段。将设计得到的片段的序列以序列表的序列序号6表示。在pSilencer 2. lU6-hygro vector (Ambion. Austin, TX)的 BamH I 禾口HindIII的位 点之间重组入上述DNA片段，以转染法导入对丙型肝炎病毒Ji7Hl株具有感受性的Huh70kl 细胞中，以含有0. lmg/mL潮霉素的10%胎牛血清Dulbecco，s modified Eagle' s培养基 培养1周。此后，通过有限稀释法将细胞化，通过蛋白质印迹法选择PA^ γ的表达低的2 个克隆，将其命名为C5和C7。另外，上述Huh70kl细胞按照在J. Virol. ,82 =3480-3489,2008中记载的方法得 到。具体而言，将HCV复制子细胞9-13株进行干扰素α处理，排除病毒复制子RNA，通过有 限稀释法将细胞克隆化，从克隆化的细胞中选择JFHl感染效率高的克隆而得到。另外，与人PA^ γ基因不具有互补性的市售pSilencer 2. l-U6hygro negative control vector (Ambion)也进行同样的操作，建立与亲株的PA^ γ表达量相同的单一克 隆，作为对照细胞(以下也称为对照shRNA)。溶解Huh70kl细胞、对照细胞和作为PA^ γ敲除细胞的C5和C7，在SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳中加入其溶解液，通过使用抗PA^ Y抗体(Affiniti公司)和抗actin抗体 (Sigma Aldrich Japan株式会社)的蛋白质印迹法检出PA^ γ和β-actin。结果示于图1。如在图1中所示，相比于Huh70kl细胞和对照细胞(对照shRNA)，转染了针对 PA28 γ的shRNA而建立的细胞C5和C7的PA^ γ的表达水平下降。2. RNA干扰耐性ΡΑ28 γ表达质粒的制作在作为上述1.的shRNA的PA^ γ标的区域的PA^ γ编码区域的第16_36位内， 使第18位的G突变为Α，使第M位的T突变为C，使第30位的A突变为G，将该突变的PA^ γ 基因重组入基于 Huang et al. Oncogene 14 :405_414，1997 制得的质粒 pEFFLAGGspGBK 中， 制作了用于表达对shRNA具有耐性的PA^ γ的质粒(pEFFLAGGsPA^gammaSI)。3. PA28 γ的稳定敲除对HCV感染的影响将pEFFLAGGspGBK 或 pEFFLAGGsPA28gammaSI 质粒转染对照细胞(对照 shRNA)、 PA28 Y敲除细胞C5和C27，次日，更换为包含3 μ g/mL嘌呤霉素的10 %胎牛血清 Dulbecco's modified Eagle's 培养基，再培养24小时，在 12 孔板上以 2. 5X 104cell/well 直接接种残存的细胞。以M. 0. I为0. 024的比例使之感染丙型肝炎病毒JFHl。另外，JFHl使用根据在 Nature Protocols，1 (5)，2334-2339，2006 中记载的方法 制作的制品。以Xba I酶切断含有JFHl基因的质粒ρJFHl，由绿豆核酸酶(Mung Bean nuclease)使其平滑，利用MEGAscript T7试剂盒(Ambion)合成了病毒RNA。以260V、 960 μ F的条件，由电穿孔将该病毒RNA导入Huh70Kl细胞中，将1周后的包含病毒的细胞上 清再次感染Huh70Kl，将10日后的细胞上清作为病毒液使用。在感染次日，更换为10%胎牛血清Dulbecco，s modified Eagle' s培养基，培养 10日。使用Huh70Kl，按照Wakita等的方法(Nat. Med. 11 :791-796. 2005)如下地测定该培 养上清的病毒效价(ffu/mL)。使测定对象的培养上清在37度下感染Huh70Kl细胞3小时，以10% FBS-DMEM清洗1次后，加入含有0. 8%甲基纤维素的10% FBS-DMEM，培养96小时。 接着，除去培养基，加入100%的甲醇固定细胞。使根据J. Virol. 79 :13473-13482,2005中记载的方法免疫NS5A的氨基酸残基第 409位至第422位的肽而制得的兔抗NS5A抗体与AlexaFluor (注册商标)488-抗兔IgG抗 体(Molecular Probe公司)反应，计数呈现荧光的细胞foci，算出病毒效价。结果示于图2。图2中，作为空质粒所示的值，表示转染了 pEFFLAGGspGBK质粒(以下记作“空质 粒”)后，使病毒感染时的结果。另外，作为shRNA耐性PA^Y表达质粒所示的值，表示转染了 PEFFLAGGsPA28gammaSl质粒(以下记作“RNA干扰耐性质粒”)后，使病毒感染时的结果。如在图2中所示，在转染了空质粒的情况下，在PA^ Y敲除细胞中，病毒产生量与 对照细胞相比显著减少。此外，与在对照细胞中转染了空质粒的情况相对，转染了 RNA干扰耐性质粒时，病 毒产生量稍微上升。另一方面，在PA^Y敲除细胞C5和C7中转染了 RNA干扰耐性质粒时， 病毒产生与转染了空质粒的对照细胞同等水平。由此暗示，在PA^ Y敲除细胞中观察到的病毒产生减少，不是由非特异性的 PA28Y以外的宿主蛋白质减少所导致的病毒产生减少，而是由PA^y的减少而导致的病
毒产生量减少。4. PA28 γ的暂时性敲除对HCV感染的影响混合以PA^ γ基因编码区域的162-180位为标的序列的siRNA (Ambion, Cat No. 138669)禾 Π 0. ImL 的 Opti-MEN(Invitrogen)，力卩入 IyL 的 Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen)，再充分混合，室温静置20分钟。由胰蛋白酶剥离生长汇合的 Huh70Kl细胞，加入10%胎牛血清Dulbecco's modified Eagle，s培养基，混合成为IO5个 ZmL的浓度。将0. ImL先前制备的siRNA混合液移入M孔板中的1个孔，再加入0. 5mL的 细胞混合液，充分混合。M小时后，以MOI = 0.03使JFHl病毒感染，在4日后测定核心蛋白的量和病毒效 价。另外，使用Stealth RNAi Negative Control Low GC duplex (12935-200) anvitrogen公司)制作阴性对照，和上述同样地测定了核心蛋白的量和病毒效价。核心蛋白的量，分别对细胞内和细胞上清，由Ortho HCV抗原ELISA试验(荣研 化学株式会社)测定。病毒效价和上述3.同样地按照Wakita等的方法(Nat. Med. 11: 791-796,2005)测定。再由蛋白质印迹法测定转染了阴性对照siRNA的细胞和转染了针对PA^ γ的 siRNA的细胞中的PA^ γ的表达量。结果示于图3 5。如在图3中所示，相比于转染了阴性对照SiRNA的样品(阴性对照)和未转染 siRNA的样品(未处理)，在转染了针对上述PA^ γ的siRNA的样品(PA^ γ 138669)中， 细胞上清和细胞内核心蛋白的量下降。另外，如在图4中所示，病毒量也在PA^ γ 138669中下降。
另外，如在图5中所示，以蛋白质印迹法确认细胞内的PA^ Y量，相比于阴性对 照，在PA^ γ 138669中PA^ γ的表达下降，确认了由siRNA产生的敲除的效果。由此确认，导入以将PA^ γ基因的其它区域作为标的的siRNA，虽然暂时抑制 PA28 γ的表达，但HCV病毒增殖也被抑制。5.复制子对病毒复制的影响按照Krieger 等的方法(Krieger et al.，J. Virol. ,75 :4614_4624，2001)，除了 使用在上述1制作的对照细胞以及敲除细胞以外，同样操作，如下地评价由复制子产生的
病毒复制。在质粒pFK-1389neo/NS3-3，/NK5.1 的 Asc I 和 Pme I 之间，取代neo 基因，导入编 码海肾荧光素(Renilla luciferase)的cDNA。用ka I切开所得到的质粒pH(-1389hRL/ NS3-3，/NK5. 1，使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)在体外进行翻译。将Huh7细 胞配制为每ImllOX IO6Cell的悬浮液，将400 μ 1所得到的悬浮液与10 μ g的体外转录RNA 混合。接着，以270V和960 μ F的条件，由Gene Pulser (Bio-Rad)进行电穿孔。以25ml 培养基悬浮电穿孔后的细胞，以每1孔Iml接种在12孔培养板中。感染后，由Renilla Luciferase assay system(Promega公司)测定4、24、48和96小时后的荧光素酶活性。将合成的HCV复制子RNA和将RNA聚合酶活性失活的HCV复制子GND RNA分别导 入对照shRNA细胞和PA^ γ敲除细胞C5中，测定荧光素酶活性。在各自的组合中，将M、48和96小时后的值除以4小时后的值，进行标准化。结果示于图6。将复制子RNA转染入对照细胞(Cntrl5)和PA^ γ敲除细胞(KD5)中时，荧光素 酶的值随着时间上升，提示进行了复制。但是，在两种细胞中，不能确认荧光素酶值的差异。 另一方面，作为阴性对照，将复制子GND RNA转染入这些细胞时，荧光素酶值随着时间减少， 提示没有进行复制。这样，通过导入复制子RNA，观察其复制，评价由PA^ γ敲除产生的对病毒复制的 影响，但不能确认由PA^ γ敲除产生的对病毒复制子的影响。从此可以认为，PA^ γ在病 毒侵入、脱壳、病毒颗粒集合、向细胞膜的输送、病毒颗粒释放中的任意一个过程中阻碍病 毒感染或抑制增殖。6. ΡΑ28 γ的胰蛋白酶样蛋白酶体活性给予HCV感染的影响将上述1.中记载的Huh70kl细胞以0. 25X IO5/孔接种在M孔板中。接着，将0. 25 μ g重组入PA^ γ或PA^ γ突变体基因的pEF FLAG Gs pGKpuro 质粒和空质粒由Lipofectamine LTX和Plus试剂(Invitrogen)转染到各孔的细胞中。作为PA^ γ突变体，使用G150S、N151Y、PM5Y或K188E。61505是使？々沘^的氨 基酸序列中第150位氨基酸残基Gly突变为kr的突变体。另外，N151Y是使PA^ γ的氨 基酸序列中第151位氨基酸残基Asn突变为Tyr的突变体。另外，ΡΜ5Υ是使PA^ γ的氨 基酸序列中第245位氨基酸残基Pro突变为Tyr的突变体。另外，K188E是使PA^ γ的氨 基酸序列中第188位氨基酸残基Lys突变为Glu的突变体。ΡΑ28 γ活化20S蛋白酶体的胰 蛋白酶活性。但是，G150S不能活化20S蛋白酶体。另外，Ν151Υ也不能活化20S蛋白酶体。 而ΡΜ5Υ不能与20S蛋白酶体结合。另外，Κ188Ε能够活化20S蛋白酶体的糜蛋白酶活性， 但不能活化胰蛋白酶活性(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,2807-2811,1998)。
以m. ο. i = 0. 03使JFHl病毒感染转染后的各细胞。通过滴定(Titration)定量感染后第4日的病毒产生量。结果示于图7。如在图7中所示，在PA^ γ敲除细胞中导入重组入PA^ γ基因的质粒时，使病毒 感染时，与导入空质粒时相比，病毒产生量上升。但是，在导入重组入不能活化蛋白酶体活性的PA^ γ突变体G150S、N151Y或 P245Y的基因的质粒时，不能确认病毒产生量的上升。另外，在导入包含对蛋白酶体不能活 化胰蛋白酶样活性，但具有糜蛋白酶活性的PA^ Y突变体K188E的基因的质粒时，也不能 确认病毒产生量的上升。该结果暗示，PA^ γ对20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的活化在病毒产生中是必 须的。序列表自由文本序列序号1 γ基因RNA干扰标的序列的1例序列序号2 :ΡΑ28 γ基因RNA干扰标的序列的1例序列序号3 :ΡΑ28 γ基因RNA干扰标的序列的1例序列序号4 :ΡΑ28 γ基因RNA干扰标的序列的1例序列序号5 :ΡΑ28 γ编码区域序列序号6 编码针对序列序号4的序列的短发夹RNA的DNA片段
权利要求
1.一种抗丙型肝炎病毒组合物，其特征在于 包含抑制PA^ Y基因的表达或功能的物质。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于抑制PA^ γ基因的表达或功能的物质是以下(a) (c)中的任一种，(a)抑制PA^γ基因的表达或功能的核酸、(b)修饰(a)中记载的核酸而成的修饰核酸、(c)能够表达(a)中记载的核酸的表达载体。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于 所述(a)中记载的核酸是RNA。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于RNA是siRNA (小干扰RNA)或shRNA (短发夹RNA)。
5.如权利要求1 4中任一项所述的组合物，其特征在于 其是丙型肝炎病毒感染预防用或增殖抑制用的组合物。
6.一种丙型肝炎病毒感染预防或增殖抑制方法，其特征在于 包括向动物投与权利要求1 5中任一项所述的组合物的工序。
7.一种抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分的筛选方法，其特征在于，包括 使试验物质接触PA^ γ基因的表达细胞或具有表达能力的细胞的工序、比较试验物质所接触的细胞和对照细胞中的PA^ γ基因的表达水平的工序、和 通过所述比较，选择评价为阻碍PA^ γ基因表达的试验物质的工序。
8.一种抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分的筛选方法，其特征在于，包括 在包含PA^ γ、胰蛋白酶样底物和20S蛋白酶体的反应体系中投与试验物质的工序、 比较投与了试验物质的体系和对照中的蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的工序、和选择在所述比较中与对照相比抑制胰蛋白酶样活性的试验物质的工序。
全文摘要
本发明提供一种抗丙型肝炎病毒组合物，其包含抑制PA28γ基因的表达或功能的物质；本发明还提供一种丙型肝炎病毒感染预防或增殖抑制方法，其包括向被检验体中投与上述组合物的工序；并且，本发明还提供一种抗丙型肝炎病毒组合物的有效成分的筛选方法，其具备选择阻碍PA28γ基因表达或功能的物质的工序。
文档编号A61K31/7105GK102137682SQ200980133919
公开日2011年7月27日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年8月29日
发明者松浦善治, 森石恒司 申请人:国立大学法人大阪大学