作为人上皮细胞免疫刺激活性增强剂的抑瘤素m的制作方法

专利名称：作为人上皮细胞免疫刺激活性增强剂的抑瘤素m的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域为免疫学。
背景技术：
抑瘤素M(oncostatin Μ, 0SM)为分子量大约为观，000的糖蛋白，它是主要由T细胞、单核细胞/巨噬细胞(Malik，1989)和树突状细胞(Suda等，200 产生的IL-6类型的多效性细胞因子(IL-6是白细胞介素-6的缩写)。最初它从人白血病细胞中分离并通过其体外抑制黑色素瘤细胞生长的能力(Zarling等，1986 ；Brown等，1987)来鉴定。OSM促进宿主防御系统重要调节剂IL-6的产生(Brown等，1991)，以及急性期蛋白的表达(Heinrich， 1998)。目前OSM被认为是涉及若干细胞类型诸如肝细胞、成骨细胞或肺上皮细胞的活化、 增殖和分化(Grant等，1999 ；Tanaka等，2003)的多功能细胞因子，以及在炎症反应中发挥作用。除了它对人A375黑色素瘤和小鼠Ml髓样白血病细胞及作用于其他的实体肿瘤细胞的生长抑制活性之外(Grant等，1999 ；Gibbs等，1998)，OSM还具有对正常成纤维细胞、 艾滋病-卡波西肉瘤(AIDS-Kaposi，s sarcoma)细胞和人红白血病细胞系TF-1 (Nair等， 1992 ;Miles等，1992)的生长刺激活性。结合OSM受体β亚基(OSMRii)的抗体用于抑制癌细胞生长的用途已被要求保护(W02006084092)。还已知与α -干扰素组合的OSM具有抗病毒活性，特别是在抑制丙型肝炎病毒复制方面(ΕΡ1905447)。在Zarling，et al.，1986中已确认了 OSM作为炎症介质的角色。然而，它对免疫系统和其他的细胞因子的确切作用仍未清楚理解。而且，1997年前OSM受体信号系统在小鼠和人类间的差异(Ichihara等，1997)是未知的，这增加了表征OSM生物学活性的困惑。在一方面，在Brown，et al.，1991中描述了 OSM对内皮细胞的促炎性特性。在Yao et al.，1996中还报道了用人OSM刺激原代内皮培养物(人脐静脉内皮细胞HUVEC)导致 P-选择素延迟但延长的上调，这促进白细胞迁入慢性或过敏性炎症区内。在另一方面，发现OSM降低抗体诱导的类风湿性关节炎模型中关节破坏的程度，这表明没有一致的免疫抑制的抗炎活性(Wallace等，1999)。在Hams，et al.，2008中推断OSMR β信号传导在急性炎症期间限制单核细胞募集。然而最近的这两项研究都是在鼠科模型中进行的。OSM在人体中通过两种不同的受体复合物进行信号传导a)LIF/0SM共享的受体 (LIF是白血病抑制因子的缩写)，其共享与LIF的高亲和力的结合，LIF是一种与OSM结构相似的进化相关蛋白；和b)独特地结合OSM的OSM特异性受体。然而，在小鼠中，OSM只通过该OSM-特异性受体的鼠科同源物传导信号。另外，已传统地用于小鼠体外和体内研究的人OSM只与鼠科的LIF受体结合，因此只显示了属于LIF而不是OSM的生物学活性(Bruce 等，2000)。因此出于揭示在人体中具有临床应用的OSM的生物学活性的目的，正确设计的研究应该使用人细胞。在EP422186中，描述了 OSM在抑制内皮组织对辅助性T淋巴细胞和效应性T淋巴细胞免疫原性的作用，具有在器官移植和自身免疫性疾病治疗中的应用。
在Durda，et al.，2003中，OSM显示为黑色素细胞抗原表达的下调因子。然而，没有提供关于这种减弱的抗原表达对黑色素瘤细胞免疫反应作用的结论性数据。
在试图进一步地表征OSM在人体模型中的免疫学特性中，令人惊讶地发现OSM增强人肝细胞肝癌0fepG2)细胞刺激细胞毒性T细胞(CTL)产生干扰素-Y (IFN-y)的能力， 这比当仅使用干扰素(IFNci2)时更有效。在细胞介导的免疫中，干扰素_ Y是常用的抗原识别后T淋巴细胞激活的标志物(BroSterhuS，et al.，1999)。本发现特别地揭示了 OSM增加感染的或肿瘤上皮细胞的抗原性，即通过在这些细胞中增加抗原加工和呈递，而使得这些细胞更为明显且以导致同一细胞选择性破坏的自杀型机制应答免疫反应。I型干扰素是具有细胞因子活性的多肽家族，其最初是借助于它们对体外细胞系病毒感染的抑制活性被发现的(Pestka等，2004)。取决于它们序列的同源性，I型干扰素分类为干扰素-α (IFN-α)、干扰素-β (IFN-β)和干扰素-ω (IFN-Q)0这些细胞因子的功能在抗多种类型的病毒感染的免疫反应中非常重要，因为它们启动了促进感染的细胞的凋亡诱导的死亡机制和病毒复制抑制，同时有利于抗原呈递。最近已通过实验证明了它们也通过在免疫反应中直接激活自然杀伤(NK)细胞、B细胞和T细胞及树突状细胞的活性实现它们的功能(Le Bon A等，2006 ； Le Bon A 等，2006 ；Le Bon 等，2003)。已在各种临床疾病状态中测试了 I型干扰素。IFN- α在治疗慢性病毒性肝炎中作为处方药，并且用于治疗几种恶性疾病诸如黑色素瘤和慢性髓样白血病。例如，在Murata et al.，2006中描述了干扰素α和β对肝细胞癌细胞系的抗肿瘤作用，诸如抗增殖效应、 细胞周期变化和细胞凋亡。IFN-α的抗肿瘤作用由对肿瘤细胞的直接促细胞凋亡作用、对血管肿瘤细胞的抗血管生成作用和对抗肿瘤免疫反应的增强作用所介导。然而，临床试验显示IFN-α在肿瘤治疗中的功效是非常有限的，从而使得与副作用相比临床益处不是非常有利，因此目前它在肿瘤学中的用途是非常有限的。人干扰素β的用途在多发性硬化的治疗中被确立。除了进行的OSM的免疫学特性表征之外，还令人惊讶地发现OSM与IFN- α 2在增强人肝细胞肝癌0fepG2)细胞刺激细胞毒性T细胞产生IFN-γ的能力方面有协同作用。因此单独的或与I型IFNs组合的OSM在癌症和感染性疾病的免疫疗法中是有用的而且是强效剂。发明概述本发明涉及抑瘤素M (OSM)、OSM受体(OSMR)激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I 型干扰素的组合在制备用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性的药物中的用途。同样地，本发明涉及OSM、OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合，其用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。还提供了增强人上皮细胞免疫刺激活性的方法，其包括给药于所述人有效量的OSM、OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合。本发明还涉及包含编码OSM或OSMR激动剂的核酸和任选地编码I型干扰素的核酸的重组表达载体，所述核酸可操作地连接于一个或多个指导OSM或OSMR激动剂和任选地 I型IFN在合适的表达宿主中产生的调控序列。还提供了用上文所提及的表达载体转染或转化的宿主细胞。载体和转染或转化的宿主细胞都可以用于基因疗法、用于制备增强人上皮细胞免疫刺激活性的药物中。
本发明还涉及制备用于过继性免疫治疗的刺激的CD8+淋巴细胞的体外方法，所述方法包括a)用有效剂量的本发明所提供的0SM、0SM激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型 IFN的组合、或重组表达载体处理人源性上皮细胞或组织；b)照射从步骤a)获得的经处理的细胞或组织；c)将从步骤b)获得的经照射的细胞或组织与以下细胞共培养·外周血单核细胞(PBMCs)，或·富集的⑶8+淋巴细胞和任选地抗原呈递细胞；和d)任选地将从步骤C)获得的刺激的⑶8+淋巴细胞与从步骤b)获得的经处理和照照的细胞或组织共培养；其中PBMCs、⑶8+淋巴细胞以及上皮细胞或组织来源于相同的人个体。还描述了通过体外方法可获得的刺激的⑶8+淋巴细胞、处理方法和这些刺激的⑶8+淋巴细胞作为药物以及在制备用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。


图1.在用IFN α 2,OSM或这两者的组合处理所示时间段的Huh7细胞中Jak/STAT 信号传导途径和P38MAPK激活。㈧在单独培养基中或在IFN α 2或OSM或者IFN α 2加上 OSM存在的情况下的培养基中培养的Huh7细胞中STAT1、STAT2、STAT3、Tyk2和Jakl磷酸化和总蛋白水平在1、3、M、48和7 代表性的蛋白质印迹(Western blot)分析。(B)未经处理的或用IFN α 2或OSM或者IFN α 2加上OSM处理的Huh7细胞中p38MAPK磷酸化和总蛋白水平在1、3、24、48和7 代表性的蛋白质印迹分析。肌动蛋白水平显示为上样对照。图2. OSM上调参与自然防御感染的基因。用IFNa 2、OSM或这两种细胞因子组合处理所示时间段或未经处理的Huh7细胞中MYD88 (TLR衔接分子)(A)、S100A9 (TLR功能调节子)(B)、ULBP2 (激活NK细胞的NKG2D配体)(C)、IL-32 (激活巨噬细胞的促炎症分子) (D)、IRFl (E)，GBP2 (F)和趋化因子基因CXCL1/2和CXCL3 (G和H)的转录表达由定量RT-PCR 测定。数值为以一式五份进行的三次实验的平均值士SD*p < 0. 05相对未处理的、IFNa 2 和OSM。**p < 0. 05相对未处理的和IFNa 2。图3. OSM与IFNa在诱导Huh7细胞中参与抗原加工和呈递的基因方面具有协同作用。通过定量RT-PCR测定Huh7细胞中泛素结合酶UBE216(A)、免疫蛋白酶体亚基 PSMB8 (B)和 PSMB9 (C)、抗原加工相关转运子 TAPl (D)和 TAP2 (E)、HLA I 类 A、B 和 C(F、 G、H)、TAP结合蛋白TAPBP (I)和β 2微球蛋白(β 2Μ) (J)的mRNA水平，所述Huh7细胞用 IFNa 2, OSM或这两者处理所示时间段或未经处理。数值为以一式五份进行的三次实验的平均值士SD。未经处理的或用IFNa2、0SM或这两种细胞因子组合处理3天和4天的Huh7 细胞中TAPl、PSMB9、HLA-ABC和β 2Μ的蛋白质印迹。肌动蛋白水平显示为上样对照(K)。 *ρ < 0. 05相对未处理的、IFN a 2和OSM。**p < 0. 05相对未处理的和IFN a 2。数值为以一式五份进行的三次实验的平均值士SD。图4. OSM上调刺激适应性免疫的基因以及增强IL-15反式呈递和肝脏上皮细胞的免疫刺激活性。未经处理的或用IFNa 2、OSM或这两者处理的Huh7细胞中ICAM-I (A)、 IL-15Ra (B)和IL-7(C)的转录表达。未经处理的或用IFNa 2、OSM或这两者处理的Huh7细胞中ICAM-I的蛋白质印迹(D)。流式细胞术研究以测定用IFNa 2、OSM或这两种细胞因子组合处理4天的Huh7细胞表面的ICAM-I (E)。数值表示相对于未经处理的细胞的倍数。与未经处理的或用IFN a 2、OSM或这两者处理3天的Huh7细胞一起孵育的CTLL-2细胞(具有IL-15生长依赖性的⑶8+T细胞系)的增殖活性(F)。在呈递肽的!fepG2细胞存在的情况下孵育的对流感病毒肽GILGFVFTL(SEQ ID NO :46)敏感的CTLs所产生的IFN γ。 H印G2细胞预先已被IFN a 2,OSM或这两者处理4天或未经处理(G)。HLA-A、HLA-B、HLA-C、 IL-15R α和ICAM-I (H-L)的mRNA水平由定量RT-PCR测定且在用IFN a 2,OSM或这两种细胞因子的组合处理所示时间段或未经处理的IfepG2细胞中ICAM-I和HLA-ABC(M)的蛋白质印迹。流式细胞术研究以测定用IFNa 2、OSM或这两种细胞因子组合处理4天的H印G2 细胞表面的ICAM-I (N)。数值为以一式五份或一式六份进行的三次实验的平均值士 SD。Y
<0. 05相对未处理的、IFN a 2和OSM。**p < 0. 05相对未处理的和IFN a 2。***p < 0. 05相对未处理的。图5. OSM增强IFNii -诱导的参与抗原加工和呈递的基因(PSMB9、TAP1)和涉及适应性免疫激活的基因(IL-7)上调。mRNA丰度通过在Huh7细胞中进行定量RT-PCR来确定， 所述Huh7细胞未经处理的或用IFNi3、OSM或这两种细胞因子组合处理所示时间段。数值为以一式六份进行地两次实验的平均值士SD。< 0. 05相对未处理的、IFNi3和0SM。、
<0. 05相对未处理的和IFN β。本发明的公开内容本发明涉及抑瘤素M (OSM)、OSM受体(OSMR)激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I 型干扰素(I型IFN)的组合在制备用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性的药物中的用途。 类似地，本发明涉及0SM、0SMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合，其用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。还提供了增强人上皮细胞免疫刺激活性的方法，其包括给药于所述人有效量的0SM、0SMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合。本文所用的术语“单独的或与I型IFN组合的0SM”包含抑瘤素M(OSM)、OSM受体(OSMR)激动剂或OSM与I型干扰素的组合、或OSMR激动剂与I型干扰素的组合。本文所用的术语“抑瘤素M”或“0SM”指一种细胞因子，该细胞因子最初基于其抑制A375黑色素瘤细胞生长的能力从通过PMA-处理的U-937人组织细胞白血病细胞调节的培养基分离。人OSM cDNA编码252个氨基酸的pre-pro-OSM多肽，带有25个疏水残基的信号肽和亲水C末端结构域，经蛋白酶处理后产生196个残基的成熟形式的0SM。所列出的这一蛋白登录号能够在公众可获得的蛋白数据库http://WWW. expasy. org/uniprot/P13725 中发现。人OSM的氨基酸序列是下列的SEQ ID NO. 1所代表的MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQGLDVPK LREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERS GLNIEDLEKLQMARPNILG LRNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHSVGRVFSKWGESPNRSRRH SPHQALRKGVRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR典型的合适的OSMs包括但不限于天然来源的人OSM或例如可自R&D系统(R&D Systems)获得的重组人OSM。根据“受体命名与药物分类国际药理学联合会委员会(International Union of Pharmacology Committee on Receptor Nomenclature and Drug Classification)，，，激动剂是结合受体的配体并改变受体状态而导致生物学反应。常规的激动剂增强受体活性，而反向激动剂使其减弱。这样，反向激动剂被定义为通过结合受体而减弱它们在活性构象中部分的配体。反向激动剂表现出对受体失活构象优先的结合亲和力。在其中受体的组成型活性可被见到的系统中，反向激动剂诱导激动剂所诱导的作用的相反的作用。术语“0SMR激动剂”指常规的激动剂，即结合OSM受体使其活性增加的配体。专利出版物 JP 2004026768 (Kanagawa Kagaku Gijutsu Akad)提供了 OSMR 激动剂的实例。术语“配体”指任一能够特异性结合OSMR的分子。它包括肽、多肽、膜相关或膜结合的分子，或其复合物，以及小分子。“小分子”被定义为分子量小于10KD，通常小于2KD和优选小于IKD的分子。小分
子包括但不限于无机分子、有机分子、包含无机成分的有机分子、包含放射性原子的分子、 合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。术语“I型干扰素”、“I型IFN”或等价的命名指蛋白干扰素-α (IFN-α)和干扰素-β (IFN-β)，和抑制病毒复制和细胞增殖及调节免疫反应的高度同源的种特异性蛋白家族。本文所用的术语“干扰素-α ”包括天然来源的IFN-α以及重组蛋白。IFN-α 的实例包括诸如购自Schering Corporation的内含子-A干扰素的干扰素α _2b、诸如购自Hoffmann-La Roche的Roferon干扰素的重组干扰素α _2a、诸如购自Boehringer Ingelheim的Berofor α 2干扰素的重组干扰素α -2c、诸如购自Sumitomo的Sumiferon 或购自Glaxo-Wellcome的Wellferon干扰素α-nl (INS)的天然α干扰素的纯化混合物α -nl干扰素、或诸如第4897471和4695623号(特别是其实施例7、8或9)美国专利中所描述的那些复合干扰素α、购自Amgen的特定产品、干扰素α_5、或干扰素α-η3、由 Interferon Sciences 生产并购自 Purdue Frederick Co.商标名为 Alferon 的天然 α 干扰素混合物。优选使用干扰素α-加或α-2b。因为在所有的干扰素中，干扰素α 2b在世界范围内得到了最广泛的批准，因此它是最优选的。第4530901号美国专利描述了 α 2b干扰素的制备。术语“干扰素-β ”包括天然来源的IFN-β以及重组蛋白。IFN-β的实例包括但不限于干扰素-β-Ia和干扰素-β-lb。干扰素-β-Ia由Biogen以商标Avonex和由 Serono以商标Rebif出售。其他形式的干扰素-β-Ib由Berlex以商标Betaseron出售。 Avonex 干扰素-β -Ia是糖基化的天然人类序列而Betaseron 干扰素-β -Ib是非糖基化的丝氨酸17-取代的天然人类序列。OSM和I型IFN蛋白可以从合成生物活性的OSM或I型IFN蛋白的各种细胞来源获得，例如包括天然产生这些蛋白的细胞、或用能够指导这些蛋白合成或分泌的重组DNA 分子转染或转化的细胞。可选地，OSM和I型IFN蛋白可由化学合成方法合成，其包括但不限于固相多肽合成。本发明中所用的与OSM和I型IFN相关的术语“重组蛋白”指通过DNA重组技术从原核或真核宿主细胞获得的这些蛋白以及它的盐、功能衍生物、变体、类似物和片段。通常，重组0SM、重组IFN-α和重组IFN-β -Ib都可以在基因工程改造的大肠杆菌(Escherichia coli)细菌中获得，随后在合适的营养培养基中发酵，该细菌包含为人类蛋白编码的DNA。使用重组DNA技术在中国仓鼠卵巢细胞中产生Avonex 干扰素- β -la。
本文所用的术语“盐”指羧基盐和OSM、OSMR激动剂和I型IFN分子或其类似物的氨基的酸加成盐这两者。羧基盐可利用本领域中已知的方法合成而且包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等等和含有有机碱的盐，例如如胺类所形成的那些盐，诸如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等等。酸加成盐包括，例如含有无机酸的盐，诸如， 例如盐酸或硫酸，和含有有机酸的盐，诸如，例如乙酸或草酸。当然，任一此类的盐必须保留 OSM或I型IFN的生物学活性。出于治疗用途，OSM或I型IFN的盐是那些其中平衡离子是药学上可接受的。因为非药学上可接受的盐可以用于生产药学上可接受的终产物，它们也包括在本发明的范围内。本文所用的“功能衍生物”包括从以残基上侧链的形式出现的官能团或N-或C-末端基团通过本领域中已知的方法制备的衍生物，而且只要它们保留药学上可接受性，就包括在本发明内，即它们不破坏上文所述的蛋白的生物学活性(即结合相应的受体和启动受体信号传导的能力)，并且不会赋予包含它的组合物毒害性。衍生物可以具有化学部分，诸如碳水化合物或磷酸盐残基，只要此类衍生物保留蛋白的生物学活性并且仍然是药学上可接受的。例如，衍生物可以包括羧基基团的脂肪族酯、羧基基团通过与氨或一级或二级胺反应而生成的酰胺、或氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基或碳环芳酰基)所形成的N-酰基衍生物、或游离羟基基团(例如丝氨酰基或苏氨酰基残基的游离羟基基团) 与酰基部分所形成的0-酰基衍生物。此类衍生物也可包括，例如聚乙二醇侧链，其可以掩饰抗原部位并延长分子在体液内的存留。特别重要的是，衍生的或与络合剂结合的蛋白是长效的。例如，在体内显示出长效活性的聚乙二醇形式或基因工程改造的蛋白都能够用于本发明。本发明所用的“变体”指基本上与上文所定义的整个蛋白或其片段相似的分子。使用本领域中熟知的方法通过变体肽的直接化学合成可方便地制备所述的变体肽。当然此类变体具有与相应的天然存在的蛋白相似的受体结合和信号启动活性。蛋白一级结构中的变化，以及在结构组织更高水平中的变化，例如连接氨基酸残基的共价键类型或添加基团至蛋白的末端残基类型的变化都在本发明的范围内。另外，蛋白分子可包括氨基酸序列中保守的或非保守的改变，这些改变导致保留分子功能性的沉默变化，例如缺失、添加和取代。此类改变的分子可以是理想的，其中它们提供了在它们用途中的某一优势。如本文所用的，保守取代可涉及相应蛋白序列内一个或多个氨基酸被另一个具有相似的极性和疏水性/亲水性特征的氨基酸取代，从而导致形成功能性等同分子。 此类保守取代包括但不限于在下列氨基酸基团内的取代甘氨酸、丙氨酸，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，天冬氨酸、谷氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺，丝氨酸、苏氨酸，赖氨酸、精氨酸，苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸、正亮氨酸。早先定义的蛋白氨基酸序列变体能够通过编码合成衍生物的DNAs突变制备。此类变体包括，例如氨基酸序列内残基缺失或插入或取代。还可使用缺失、插入和取代的任一组合以实现最终的构建体，只要最终的构建体具有期望的活性。明显地，在编码变体肽的DNA中产生的突变不可以改变读码框，并且优选不产生能够产生二级mRNA结构的互补区域。在基因水平上，这些变体通常通过编码肽分子的DNA中核苷酸的定点诱变来制备，由此产生编码变体的DNA，其后在重组细胞培养中表达DNA。变体通常显示与非变体肽相同的定性的生物学活性。本发明所用的上文所定义的蛋白“类似物”指非天然的分子，其基本上与整个分子或其活性片段相似。此类类似物显示与相应的天然存在的蛋白相同的活性。本发明所用的“片段”指任一分子子集，即较短的肽，其保留期望的生物学活性。片段可以容易地通过从分子任一末端移除氨基酸并测试生成物作为受体激动剂的特性制备。 用于从多肽的N-末端或C-末端一次移除一个氨基酸的蛋白酶是本领域中已知的。术语“上皮细胞的免疫刺激活性”指由上皮细胞实现的细胞免疫反应的发展。“细胞免疫反应”指T淋巴细胞、其他的白血细胞或这两者的组合介导的免疫反应。 细胞免疫一个重要的方面涉及细胞毒性T细胞(CTL)抗原特异性反应。CTLs具有肽抗原的特异性，所述肽抗原与主要组织相容性复合物(MHC)所编码的相关蛋白联合呈递并表达在细胞表面。CTLs辅助诱导和促进细胞内病原体的细胞内破坏或此类病原体所感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面涉及辅助T细胞的抗原特异反应。辅助T细胞用于辅助刺激功能，并将非特异性效应细胞的活性集中于抗显示肽抗原的细胞，所述肽抗原与它们表面的MHC分子相关。“细胞免疫反应”也指细胞因子、趋化因子和其他由激活的T细胞和其他的白血细胞，包括来源自CD4+和CD8+T细胞的那些细胞所产生的此类分子。单独的OSM或与I型IFN结合的OSM赋予上皮细胞免疫原特性，因为它在所述细胞中刺激抗原加工和呈递过程。术语“免疫原性”指特定的被称为抗原的物质引发免疫反应的能力(例如见 Roitt =Essential Immunology (基础免疫学)(第11版，Blackwell)以获得免疫原性更进一步的定义)。当用于单独的OSM或结合I型IFN的OSM时，提示这些蛋白具有通过激活上皮细胞内的抗原加工和呈递机构诱导免疫系统反应的能力。单独的OSM或与I型IFN结合的OSM也可被认为是增加上皮细胞免疫原性的物质，因为它激活抗原产生并显示在细胞膜上，在此处抗原最终引发免疫反应。上皮细胞内的抗原加工和呈递过程涉及抗原在所述细胞中的产生，即已感染上皮细胞的病原体所表达的蛋白片段化(蛋白水解)、以及突变基因，像癌细胞中突变的基因所编码的异常蛋白。然后这些在细胞内降解成片段(例如肽)的内源性抗原与MHC分子相关， 并最终显示或表达-呈递在安置在I类组织相容性分子内的细胞表面，在此处它们能够被T 细胞上T细胞受体识别，特别是CD8+细胞，这种T细胞具有破坏感染的或肿瘤细胞的机构。同样地，单独的OSM或与I型IFN结合的OSM增加感染的或肿瘤上皮细胞的抗原性，使得这些细胞在他们的表面加工并呈递更多的抗原，因此变得更明显而应答免疫反应， 最终导致相同细胞的选择性破坏。因此，单独的OSM或与I型IFN结合的OSM代表癌症和感染性病原体如病毒、细菌、 真菌和寄生虫所导致的疾病的免疫疗法中的有用药剂，因为所述蛋白能够选择性地激活仅破坏那些被病原体感染的或肿瘤上皮细胞的过程。本文所用的“免疫疗法”指基于细胞免疫反应激活的治疗性或预防性治疗。在本发明的一个实施方案中，细胞免疫反应可以是先天免疫反应或适应性免疫反应。优选地，细胞免疫反应是适应性免疫反应。在本发明的一个实施方案中，上皮细胞的免疫刺激活性包括T淋巴细胞的增殖、白细胞介素15(IL-15)至NK或CD8+细胞的反式呈递(transpresentation)或干扰素 Y (IFN-γ)的产生。本发明的另一个实施方案涉及0SM、0SMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素的组合在制备用于增强人上皮细胞免疫刺激活性的药物中的用途，其中所述上皮细胞被细胞病原体或肿瘤上皮细胞所感染。感染上皮细胞的细胞病原体意在包括病原性病毒、细菌、真菌和寄生虫，特别是逆转录病毒、腺病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺相关病毒、肝炎病毒、肺病毒、诺罗病毒(noroviruses)、轮状病毒、星状病毒、副粘液病毒、腮腺炎病毒、病毒蛋白、类病毒等等，脑膜炎球菌、肺炎球菌、分枝杆菌、沙门氏菌(Salmonella sp.)、志贺氏菌Shigella sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、梭菌 (Clostridium sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、耳口尔森菌(Yersinia sp.)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、密螺旋体(Ti^ponema sp.)等等；寄生虫诸如利什曼原虫 (Leishmania sp.)、弓形虫(Toxoplasma sp.)、血吸虫(Schistosoma sp·)、华支睾吸虫 (Clonorchis sp)、或疟原虫(Plasmodium sp.)；或真菌像组织胞浆菌(Histoplasma sp.)、 曲霉菌(Aspergillus sp.)、酵母菌(Candida sp.)、隐球菌(Cryptococcus sp.)、肺孢子虫 (Pneumocystis sp.)等等。肿瘤上皮细胞可以选自癌症诸如腺癌(支气管-肺泡腺癌、透明细胞腺癌、滤泡腺癌、粘液性腺癌、乳头状腺癌、硬癌腺癌、皮脂腺癌、肾上腺皮质癌、类癌肿瘤、腺泡细胞癌、 腺样囊性癌、导管癌、子宫内膜样癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、非侵润性导管内癌、胰岛细胞癌、小叶癌、粘液表皮样癌、神经内分泌癌、肾细胞癌、印戒细胞癌、皮肤附属器癌、胆管癌、绒毛膜癌、囊腺癌、Klatskin’ s瘤、乳腺外佩吉特病O^aget’ s disease)、腺鳞状癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、埃利希(Hrrlich)肿瘤癌、巨细胞癌、原位癌(子宫颈上皮内瘤变和前列腺上皮内瘤变)、克雷布斯(Krebs) 2癌、大细胞癌、路易斯(Lewis)肺癌、 非小细胞肺癌、乳头状癌、鳞状细胞癌(Bowen’ s病)、移行细胞癌、疣状癌。肿瘤上皮细胞也可以选自附件和皮肤附属器肿瘤诸如皮脂腺癌、皮肤附件癌，基底细胞肿瘤诸如基底细胞癌(基底细胞痣综合征)、基底鳞状细胞癌和甲床细胞瘤，囊状、 粘液性和浆液性肿瘤诸如粘液腺癌、粘液表皮样癌、印戒细胞癌(库肯勃氏瘤)，囊腺癌(粘液性囊腺癌、乳头状囊腺癌、浆液性囊腺癌)，囊腺瘤(粘液性囊腺瘤、乳头状囊腺瘤、浆液性囊腺瘤)，粘液上皮样瘤和腹膜假黏液瘤，导管、小叶和髓质瘤诸如导管癌(导管乳腺癌、 胰腺导管癌)，非浸润性导管内癌(乳腺佩吉特疾病)、小叶癌、髓质癌、乳腺外佩吉特疾病、 导管内乳头状瘤，纤维上皮肿瘤诸如腺纤维瘤、布伦纳(brermer)瘤，间皮肿瘤诸如腺瘤样瘤、间皮瘤(囊状间皮瘤)和鳞状细胞肿瘤诸如棘皮瘤、乳头状癌、鳞状细胞癌(Bowen’ s 病)、疣状癌、乳头状瘤(内生性乳头状瘤)。0SM,OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素的组合可以作为单独的药物制剂或作为同一单位剂型的一部分一起给药。可选地，0SM、0SMR激动剂或者OSM或OSMR 激动剂与I型干扰素的组合可以分别给药但是作为相同治疗方案的一部分。这两种组分， 如果分别给药，不一定基本上同时给药，尽管如果需要的话它们是可以同时给药的。因此， 0SM,OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素的组合可以作为分别的剂量或剂型但同时给药。任选地，0SM、OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素的组合的分别给药可以在不同时间和以任何顺序进行。在本发明的一个实施方案中，提供了包含OSM或OSMR激动剂和I型IFN的产品， 所述OSM或OSMR激动剂和I型IFN作为同时、分别或相继使用的组合制剂用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。在另一个实施方案中，提供了含有OSM或OSMR激动剂和I型IFN的产品，所述OSM或OSMR激动剂和I型IFN作为同时、分别或相继使用的组合制剂用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。同样地，本发明还涉及在试剂盒的形式中组合分别的药物制剂。例如，试剂盒可以包含两种分别的药物制剂，其包括1) OSM或OSMR激动剂，和2) I型IFN。试剂盒也包含用于分别的制剂的容器，诸如分割瓶或分割的铝箔包。容器的另外实例包括注射器、盒子、包袋等等。通常，试剂盒包含分别的组分给药的用法说明书。试剂盒形式是特别有利的，当分别的的组分优选以不同的剂型(例如口服的和肠胃外的)给药、在不同用药间隔给药时，或当组合的单独组分的滴定为开处方的医师所期望时。本发明的产品或试剂盒特别适用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。在本发明的一个实施方案中，包含OSM、OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素的组合的产品或试剂盒用于癌症和由感染性病原体像病毒、细菌、真菌和寄生虫所引起的疾病的免疫疗法。在另一个实施方案中，本发明涉及单独的OSM或与I型IFN组合的OSM在制备用于增强人上皮细胞免疫刺激活性的药物中的上文所提及的用途，其中单独的OSM或与I型 IFN组合的OSM被配制成包含治疗有效量的单独的OSM或与I型IFN组合的OSM的药物组合物和药学上可接受的载体。本文中的治疗有效量是足以以临床上显著的方式增强人上皮细胞免疫刺激活性的量。出于给药的目的，单独的OSM或与I型IFN组合的OSM可以配制成各种药物形式。 作为适当的组合物，可能会有所引用的通常用作系统给药药物的所有组合物。为制备本发明的药物组合物，有效量的单独的OSM或与I型IFN组合的OSM作为活性成分组合在与药学上可接受的载体的密切混合物种，该载体可采取多种形式，这取决于期望给药的制备方式。这些药物组合物在特别适用于口服给药、直肠给药、经皮给药、吸入或肠胃外途径(即皮下的、静脉内的、肌肉内的或腹膜内的)给药的单位剂型中是理想的。单独的OSM或与I 型IFN组合的OSM可以固体剂型形式口服给药，诸如片剂、胶囊和粉末，或以液体剂型形式口服给药，诸如酏剂、糖浆和悬浮剂。本发明的药物组合物也可以以无菌液体剂型经肠胃外给药。优选的给药途径是那些肠胃外途径，特别是肌肉内、静脉内或皮下注射。肠胃外给药的制剂可以是水性或非水性无菌等渗注射水溶液或悬浮液的形式。例如，可以制备其中载体包含盐溶液、葡萄糖溶液或盐和葡萄糖溶液的混合的注射液。还可以制备注射悬浮液，其中可使用适当的液体载体、悬浮剂等。还包括固体形式的制剂，计划在使用前不久将其转换成液体形式制剂。在适用于经皮给药的组合物中，载体任选地包括渗透增强剂和/或合适的湿润剂，任选地与合适的任一性质占次要比例的添加剂组合，该添加剂不会引入显著的对皮肤的有害作用。后者合适的添加剂可以是抗氧化剂、防腐剂、稳定齐U、乳化剂、影响渗透压的盐和/或缓冲物质。可选地，单独的OSM或与I型IFN组合的OSM可配制在脂质体中递送至上皮细胞。 能够利用常规的技术，包括超声处理、螯合透析、均化作用、溶剂输注加上挤压、冻融挤压、微滴乳化作用以及其他的技术制备所述的脂质体。用于将脂质体或其他的含脂质剂交联到本发明蛋白的试剂包含锚定脂质层中交联一端的磷脂衍生物和位于另一端提供靶标生物分子附着点的反应基团。也可以使用聚合脂质体或包被聚合物的脂质体。此类聚合物可以稳定脂质体，减少它从体内的清除和/或降低它的免疫原性。在脂质体形成期间或形成后， 它可以加载有功能性部分，诸如诊断或治疗药剂。所述药剂可以包含在脂质体的水性核中或可以合并入或附着于它的周围膜。将上述药物组合物以单位剂型配制对于方便给药和剂量一致是特别有利的。如本文所用的单位剂型指物理上离散适合作为单位剂量的单元，每个单元包含经计算产生期望治疗效果的预定量的活性成分以及所需的药物载体。此类单位剂型的实例是片剂(包括刻痕片或包衣片)、胶囊、丸剂、栓剂、粉末包、晶片、注射液或悬浮液等等和其被隔离的多份。本发明所述化合物的每日剂量应随给药模式、期望的治疗和病症的严重程度而改变。通常考虑的是，OSM有效的每日量为约0.05至约5.0mg/患者。在I型IFN 的情况下，有效的每日量为1-1000 μ g/mL。通常IFN α加给药量为11. 1 μ g/0. 5mL、 22. 2 μ g/0. 5mL、33. 3μ g/0. 5mL，每日或一周三次。通常 IFNa 2b 给药量为 0. 038mg/lmL、 0. 069mg/lmL、0. 087mg/l. 5mL、0. 144mg/l. 5mL、0. 192mg/lmL、0. 288mg/l. 5mL, 一周注射 3 或5次。通常IFN β Ia给药量为8. 8 μ g/0. 5mL、22 μ g/0. 5mL或44 μ g/0. 5mL每周皮下注射3次。通常IFN β Ib给药量为0. 0625mg/0. 25mL及增加至0. 25mg/lmL每隔一天皮下注射。将所需的剂量在全天以适当的时间间隔以1个、2个、3个、4个或更多个亚剂量给药是适当的。而且，明显的是，所述有效每日量可以降低或增加，这取决于治疗个体的反应和/或取决于医师对开具本发明的化合物处方的评价。因此上文所提及的有效的每日量只是指导方针。单独的OSM或与I型IFN组合的OSM可作为多肽被提供，例如作为重组蛋白，或可选地，所述组分的一个或两个可作为包含编码所述组分的核苷酸序列的多核苷酸被提供。在一优选的实施方案中，编码所述组分的多核苷酸被包括在载体内。在本发明的一个实施方案中，提供了重组表达载体，所述载体包含编码OSM或OSMR激动剂的核酸以及任选地编码I型干扰素的核酸，其可操作地连接于一个或多个指导OSM或OSMR激动剂以及任选的I型IFN在合适表达宿主中产生的调控序列。在某些情况下，编码OSM或OSMR激动剂以及I型IFN不同多肽链的核酸可以在相同的表达载体中被提供。如本领域中技术人员应理解的，代替包含编码OSM或OSMR激动剂的核苷酸序列的多核苷酸和包含编码I型IFN的核苷酸序列的多核苷酸联合给药用于增强人上皮细胞免疫刺激活性，另一实施本发明的方式由包含所述的两种多核苷酸的重组表达载体的给药组成，所述重组表达载体即包含编码OSM或OSMR激动剂的核苷酸序列和编码I型IFN的核苷酸序列的载体。当所述载体表达在受体宿主中时，它从而产生相应的实现上述治疗效果的蛋白。适合容纳形成本发明的组合物和试剂盒的多核苷酸的载体包括当被引入至宿主细胞中时，其与所述细胞基因组整合或不整合的质粒或载体。所述载体能够通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并且例如能够在Sambrook等，2001中找到。然而，在本发明的范围内，本发明的载体优选用于基因治疗的病毒或非病毒载体； 作为非限制性示例，所述载体可以是基于逆转录病毒、腺病毒、α病毒(alphaviruses)等的病毒载体，或就非病毒载体而言，所述载体可以是DNA-脂质体、DNA-聚合物、DNA-聚合物-脂质体复合物等(Hung，1999)。所述包含编码单独的OSM或与I型IFN组合的OSM的核苷酸序列的病毒或非病毒载体可通过常规方法直接给药于人体。在一具体实施方案中，载体是病毒载体，其在另一个具体实施方案中是α病毒， 诸如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛德毕斯(Sindbis)病毒和委内瑞拉马脑炎(Venezuelan Equine encephalitis (VEE))病毒，大容量的腺病毒，条件复制型腺病毒，或腺相关病毒。在一优选具体实施方案中，α病毒是塞姆利基森林病毒。所述载体可选择性地用于转化、转染或感染细胞，优选哺乳动物细胞，包括人细胞，例如离体，并且随后将它们植入人体内以获得期望的治疗效果。对于它们给药于个体， 所述细胞将被配制在合适的不会不利地影响它们存活力的介质中。同样，如本领域中技术人员应理解的，所述载体可能包含多克隆位点、表达调节序列、对于载体被引入的宿主细胞的合适复制起始点、选择标记等。本发明的载体包含一个或多个在多核苷酸之前的调控序列或表达调节序列，其可操作地连接于所述多核苷酸以指导OSM或OSMR激动剂和任选地I型IFN在合适表达宿主中的的产生。如本说明中所用的，表述“可操作地连接，，指的是编码OSM或OSMR激动剂的多核苷酸和编码I型IFN的多核苷酸都在用于它们表达的正确的读码框架内，受所述调控序列或表达调节序列的调控。本发明所用的调节序列可以是核启动序列或可选地增强子序列和/或其他的增加异源核酸序列表达的调节序列。启动子可以是组成型的或诱导型的。如果期望异源核酸序列的恒定表达，那就使用组成型启动子。熟知的组成型启动子的实例包括巨细胞病毒 (cytomegalovirus (CMV))立即早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子等等。许多其他的组成型启动子的实例是本领域中熟知的，并且可用于实施本发明。如果期望异源核酸序列的受控表达，那就必须使用诱导型启动子。在非诱导状态下，诱导型启动子必须是“沉默的”。“沉默的”被理解为意指诱导子不存在时，几乎没有或没有异源核酸序列的表达被检测到；然而在诱导子存在时，就会发生异源核酸序列的表达。经常通过改变诱导子的浓度可调控表达水平。通过调控表达，例如通过改变诱导子的浓度使诱导型启动子被更强或更弱的刺激，可以影响异源核酸序列的转录产物的浓度。在异源核酸序列编码基因的情况下，可以调控蛋白的合成量。因此改变治疗产物的浓度是可能的。熟知的诱导型启动子的实例是雄激素或雌激素响应启动子、强力霉素(doxycycline)响应启动子、金属硫蛋白启动子或响应蜕皮激素的启动子。其他多种实例是本领域熟知并能够用于实施本发明。除了组成型和诱导型启动子(其通常作用于各种各样的细胞或组织类型)之外，组织特异性启动子也可以用于实现细胞或组织中特异性异源核酸序列的表达。熟知的组织特异性启动子的实例包括肝特异性启动子，像白蛋白、α-1抗胰蛋白酶或血红素结合蛋白启动子(Kramer，et al.，200 ，若干肌肉特异性启动子包括骨骼肌α-肌动蛋白启动子、心肌肌动蛋白启动子、骨骼肌肌钙蛋白C启动子、慢收缩心肌肌钙蛋白C启动子和肌酸激酶启动子/增强子或肿瘤特异性启动子，像针对人肝细胞性肝癌的α -胎蛋白启动子或针对前列腺癌的前列腺特异抗原启动子。有许多本领域中熟知的肌肉特异性启动子并且能够用于实施本发明(关于肌肉特异性启动子的综述见Miller等，1993)。本文所使用的“异源的”指“不同天然来源的”或代表非天然状态。例如，异源的指衍生自和插入到相同的天然原始细胞类型的核苷酸序列，但是其以非天然状态存在，例如不同的拷贝数或受不同调节元件的调控。类似地，如果用衍生自其他的生物体，特别是来自其他的物种的DNA或基因转化宿主细胞，该基因相对于宿主细胞而言就是异源的，并且相对于携带该基因的宿主细胞的子代而言也是异源的。本发明的载体可通过转染被递送至宿主细胞。常规的转染技术包括多种本领域公认的用于将外来的核酸(例如DNA或RNA)引入到宿主细胞中的技术，其包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、(微)注射或电穿孔。本发明的另一实施方案涉及包含如上文所定义的重组表达载体的宿主细胞。“宿主细胞”指包含异源DNA的原核或真核细胞，所述异源DNA通过任一方式例如电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、转化、病毒感染等等被引入到细胞中。因此本发明的重组表达载体和宿主细胞在制备用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性的药物中是有用的。同样，用一种或多种药学上可接受的赋形剂使它们处于适当的状态，因此组成药物制剂。在另一实施方案中，本发明涉及制备用于过继免疫治疗的刺激的CD8+淋巴细胞的体外方法，所述方法包括a)用有效剂量的本发明提供的OSM、OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型 IFN的组合，或者重组表达载体处理人源性上皮细胞或组织；b)照射从步骤a)获得的处理过的细胞或组织；c)将从步骤b)获得的照射过的细胞或组织与下述细胞共培养·外周血单核细胞(PBMCs)，或·富集的⑶8+淋巴细胞和任选地抗原呈递细胞；和d)任选地，共培养从步骤C)所获得的刺激的CD8+淋巴细胞与从步骤b)所获得的经处理和照射的细胞或组织；其中PBMCs、⑶8+淋巴细胞和上皮细胞或组织来源于相同的人个体。使用CD8+淋巴细胞用于人个体治疗中过继免疫治疗的方法是本领域临床医师已知的。根据本文所述的和本领域中已知的方法制备的CD8+淋巴细胞能够用于此类方法中。 例如，使用抗肿瘤细胞毒性T细胞系的过继细胞治疗已在临床患有实体瘤的患者中进行了测试(Turin 等，2007)。本发明提供了增强过继免疫治疗的方法，该方法通过离体刺激细胞，然后再将它们重输回到患者体内以提供给患者一定程度的增强免疫力。细胞与个体是组织相容的，且可以是同种异体的或自体的。它们优选来源于待被治疗的同一个体。制备刺激的⑶8+淋巴细胞的体外方法包括自患者分离外周血单核细胞(PBMCs)； 自同一患者分离上皮细胞并用有效剂量的本发明的0SM、0SMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合，或重组表达载体处理上皮细胞；照射处理过的细胞；并在培养基中将培养中的细胞扩增至非常高的数量。然后可将这些包含刺激的⑶8+淋巴细胞的扩增细胞重新引回至患者以达到免疫治疗的目的。
在另一实施方案中，一旦分离出PBMCs，这些细胞就可以被进一步地分离以提供更同质或富集的CD8+淋巴细胞培养物，然后将这些细胞重输回至患者。可选地，从上文所述的方法的步骤c)所获得的刺激的CD8+淋巴细胞可与以上步骤b)所获得的经处理和照射的细胞或组织尽方便地多次共培养以便获得足够高数量的刺激的⑶8+淋巴细胞用于在上述患者的免疫治疗。本发明提供了制备用于过继免疫治疗的刺激的CD8+淋巴细胞的体外方法，其包括从患者分离上皮细胞并用有效剂量的本发明的0SM、0SMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合，或重组表达载体处理它们；照射处理过的细胞；将经处理和照射的来自患者的物质与富集的⑶8+淋巴细胞和任选地抗原呈递细胞(APCs)共培养，所述抗原呈递细胞诸如自体树突状细胞、单核细胞、B细胞、EBV-转化的B细胞系、同种异体的表达共享限制等位基因的EBV转化的B细胞系、人工抗原呈递细胞；以及在培养中扩增这些细胞。然后可以将这些包含刺激的⑶8+淋巴细胞的扩增的细胞重新引回至患者。本发明还涉及通过本文所述的方法获得的刺激的⑶8+淋巴细胞以及这些刺激的 CD8+淋巴细胞作为药物，或在制备用于癌症或感染性疾病治疗的药物中的用途。对等地，本发明提供了治疗人癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括有效量的根据本文所述方法获得的刺激的CD8+淋巴细胞的给药。因此，OSM、OSMR激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合被用作人上皮细胞免疫刺激活性的体外增强剂。在本发明具体实施方案中，I型干扰素是IFN-α，而另一具体实施方案中是IFN-β。现通过下述的实施例以非限制性方式示例本发明。 实施例为了分析OSM对靶细胞的免疫刺激特性，用肽抗原冲击的细胞因子处理的人肝细胞瘤细胞(Hih7和H印G2)用于刺激抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞。通过分析它们的 IFN- γ产量来测量淋巴细胞的激活，IFN- γ是常用的T淋巴细胞触发的标志物。T细胞抗原识别后这种Thl细胞因子的产生传统上被认为是读出，其与用于病毒感染和癌症的免疫治疗策略的淋巴细胞的效应器特性相互关联(Brosterhus等，1999)。材料和方法RNA提取和实时RT-PCR使用核酸纯化裂解液(Applied Biosystems)和半自动化系统ABI PRISM 6100核酸ft^pMation(Applied Biosystems)进行总RNA提取。使用针对每一基因的特异引物 (表1)如所述的进行实时RT-PCR(Larrea等，2006)。蛋白印迹(Western blot)对于蛋白印迹分析，将1. 5xl(rtluh7或H印G2细胞接种于6孔板上。24小时后， 细胞不处理，或者用 50IU/ml IFNa 2 (Sicor)或用 20ng/ml OSM (R&D Systems)或用 50IU/ ml IFNa2Wi20ng/ml OSM处理。在不同的时间点后，细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并收集在150 μ 1蛋白上样缓冲液(62. 5mM Tris-HCl pH 6. 8，10 %甘油，5 % 2-ME O-巯基乙醇)，2% SDS(十二烷基硫酸钠)，0. 006%溴酚蓝)中。使用以下特异性抗体进行蛋白质印迹(Larrea等，2006)抗磷酸化-STAT1 tyr701、抗磷酸化_STAT3tyr705、抗磷酸化 _JAKltyrl022/1023、抗磷酸化 _Tyk2tyrl054/1055、抗磷酸化-p38thrl80/tyrl82 MAPK 抗体和抗兔IgG过氧化物酶(HRP)-连接抗体购自细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)。抗-STAT3、抗 _Tyk2、抗-STAT2、抗磷酸化 _STAT2tyr689 抗体来自 Upstate Biotechnology。抗STATl和抗p38 MAPK抗体来自圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。抗 Tapl、抗 ICAM-1、抗-PSMB9、抗 B2M 和抗-I 类 HLA 抗体来自 Abeam。抗肌动蛋白和抗小鼠IgG HRP-连接抗体来自Sigma-Aldrich。微阵列分析将Huh7细胞以IxlO6细胞/平板接种于DMEM加上10%胎牛血清(FBS)中。18 小时后，细胞不处理或用 IFNa 2(50IU/ml) ^ 0SM(20ng/ml)或者 IFNa 2 (50IU/ml)与 0SM(20ng/ml)组合处理细胞。3天后，在Iml的TRIzol试剂(Invitrogen)中收获细胞。实验以一式四份地进行。然后根据Affymetrix推荐在ftOgenika Biopharma S. A处理样品， 并将 cRNA 与 Affymetrix 人 U133A 2. O 阵列杂交。使用 Robust Multichip Average 算法进行背景修正和标准化。计算所有微阵列中每一探针组的表达后，进行过滤处理以去除低表达探针组。应用表达值在17%的样品中大于16的标准，选择17927个探针组用于统计学分析。微阵列数据的线性模型用于找出显示实验条件间显著差异表达的探针组。使用B统计临界值(B > 0)将受IFN α 2或OSM或者IFN α 2加上OSM组合处理影响的基因鉴定为有意义的。基于倍数变化标准和功能类别富集选择所述的基因，通过hgenuity (MMiZZm^ ingenuity, com/)禾口 Webgestalt (http//bioinfo. vanderbilt. edu/webgestalt)软件进行研究。抗原呈递测定从HLA-A2+健康供体获得的PBMC在37 °C下用1 μ g/ml HLA-A2-限制性流感A病毒基体58-66肽(GILGFVFTL) [SEQ ID NO :46]冲击2小时，洗涤并以3X IO6个细胞/平板的密度培养在M孔板中。3天后，加入IL-2(10U/ml)，并进行另外5天的细胞培养。在第8天，在1 μ g/ml GILGFVFTL (SEQ ID NO :46)肽存在或不存在的情况下，将回收的细胞与H印G2细胞(5xl04/孔)共培养(105/孔)在96孔圆底培养板，所述H印G2细胞预先用 50IU/ml IFN α 2 或 20ng/ml OSM 或 50IU/ml IFN α 2 加上 OSM 20ng/ml 处理 4 天或未经处理。M小时后，收集上清液通过酶联免疫吸附测定(ELISA) (BD Biosciences)测量IFN-γ 的产生。IL-15Ra 活性测定评价Huh7细胞上表达的IL-15Ra反式呈递IL-15至CTLL-2细胞的功能。出于此目的，接种Huh7细胞并用50IU/ml的IFN a 2、20ng/ml的OSM或这两种处理剂的组合处理Huh7细胞3天。然后，收获Huh7细胞并与或不与50ng/ml的外源IL-15孵育1小时，洗涤3次，在Gammacell 3000 Elan中以15000cGys照射。然后在96孔板中将3xl04个经照射的Huh7细胞与IxlO4个CTLL-2细胞共培养。在第2天，用0. 5 μ Ci/孔的氚标记胸苷冲击细胞8小时，将其收获并在闪烁计数器(Topcoimt，I^ackard)中测量胸苷的掺入。流式细胞术分析在Huh7和!fepG2细胞中，研究表面分子细胞间粘附分子I(ICAMl)的表达，细胞未经处理或者用 50IU/ml IFNa 2 或 20ng/ml OSM 或 50IU/ml IFNa 2 加上 20ng/ml OSM 处理4天。然后，细胞用PBS-EDTA回收并用PE-标记的抗人ICAMl或IgG-PE同种型对照(BD Biosciences)染色。30分钟后，洗涤细胞并利用FACSCalibur细胞计数仪(Becton Dickinson)进行分析。统计学分析所用的统计学方法如先前所述(Larrea，et al.，2006)。数据为平均值士标准差 (SD)，ρ值< 0. 05被认为是显著的。表1.本研究中所用的引物
权利要求
1.抑瘤素M(OSM)、OSM受体(OSMR)激动剂、或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素(I 型IFN)的组合在制备用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述免疫反应是适应性免疫反应。
3.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其中所述上皮细胞的免疫刺激活性包括 T淋巴细胞的增殖、白细胞介素15(IL-15)至NK或CD8+细胞的反式呈递，或者干扰素 Y (IFN-γ)的产生。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述上皮细胞被细胞病原体感染或是肿瘤上皮细胞。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述细胞病原体选自病毒、细菌、真菌和寄生虫。
6.0SM,OSMR激动剂、或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合，其用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。
7.增强人上皮细胞的免疫刺激活性的方法，包括将有效量的OSM、OSMR激动剂、或者 OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合给予所述人。
8.包含OSM或OSMR激动剂以及I型IFN的产品，所述OSM或OSMR激动剂以及I型IFN 作为同时、分别或相继使用的组合制剂用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性。
9.重组表达载体，其包含编码OSM或OSMR激动剂的核酸以及任选地编码I型干扰素的核酸，所述核酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述OSM或OSMR 激动剂以及任选地I型IFN在合适的表达宿主中的产生。
10.宿主细胞，其包含权利要求9所述的重组表达载体。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核或真核细胞。
12.权利要求9所述的重组表达载体、或权利要求10-11中任一项所述的宿主细胞在制备用于增强人上皮细胞的免疫刺激活性的药物中的用途。
13.包含权利要求9所述的重组表达载体或权利要求10-11中任一项所述的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
14.制备用于过继性免疫治疗的刺激的CD8+淋巴细胞的体外方法，所述方法包括a)用有效剂量的0SM、0SM激动剂、或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合、或如权利要求9所述的重组表达载体处理人源性上皮细胞或组织；b)照射从步骤a)获得的经处理的细胞或组织；c)将从步骤b)获得的经照射的细胞或组织与以下细胞共培养 外周血单核细胞(PBMCs)，或 富集的CD8+淋巴细胞和任选的抗原呈递细胞；d)任选地将从步骤c)获得的刺激的CD8+淋巴细胞与从步骤b)获得的经处理和照射的细胞或组织共培养；其中所述PBMCs、CD8+淋巴细胞和上皮细胞或组织来源于相同的人个体。
15.如权利要求14所述的体外方法，其中步骤c)中的所述抗原递呈细胞是树突状细胞。
16.通过权利要求14-15中任一项所述的方法获得的刺激的⑶8+淋巴细胞。
17.权利要求16所述的刺激的CD8+淋巴细胞作为药物的用途。
18.权利要求16所述的刺激的CD8+淋巴细胞在制备用于治疗癌症或感染性疾病的药物中的用途。
19.权利要求16所述的刺激的CD8+淋巴细胞，其用于治疗癌症或感染性疾病。
20.治疗人癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括给予有效量的如权利要求16所述的刺激的⑶8+淋巴细胞。
21.0SM,OSMR激动剂、或者OSM或OSMR激动剂与I型IFN的组合作为人上皮细胞免疫刺激活性的增强剂的体外用途。
全文摘要
本发明涉及抑瘤素M(OSM)、OSM受体(OSMR)激动剂或者OSM或OSMR激动剂与I型干扰素的组合在制备用于增强人上皮细胞免疫刺激活性的药物中的用途。
文档编号A61K39/39GK102202690SQ200980144338
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月6日 优先权日2008年10月7日
发明者伊兰祖·宫扎莱兹德拉塔贾德, 帕布鲁·萨罗韦乌加里萨, 拉斐尔·阿尔达比阿里奎, 玛利亚·埃丝特·拉瑞莱欧兹, 赫苏斯·玛利亚·普列托巴尔图埃纳 申请人:西玛生物医学信息公司