调节hsf-i的方法

专利名称：调节hsf-i的方法
调节HSF-I的方法相关申请本申请要求享有2008年12月8日提交的第61/120，542号美国临时申请以及2009年6月四日提交的美国临时申请的权益，上述申请的所有内容均作为引用并入本发明。政府支持本发明在美国国立卫生研究院授予的AG026647和AG026647项目的政府资助支持下完成，政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
细胞通常利用传感器和网络的途径在蛋白质的合成、折叠、转运、聚集和降解间保持平衡，称为蛋白质的动态平衡[Sitia等，Nature 426 =891-894,2003 ；Ron等，Nat RevMoI Cell Biol 8 :519-5 ，2007]。细胞蛋白的动态平衡的维护，即蛋白质内稳态，是指控制构成蛋白质组的单个蛋白的构象、结合的相互作用、定位和浓度。体内蛋白质折叠是通过可折叠多肽链和大分子细胞成分之间的相互作用实现的，包括多个类型的受体和可折叠酶，从而最大限度地减少聚集[Wiseman等，Cell 131 :809_821，2007]。代谢酶也影响细胞内蛋白质折叠效率，因为有机和无机溶质是利用给定的区室效应多肽链途径通过包括影响折叠物理化学的疏水作用的非供价力产生的。代谢途径产生的小分子配体，可以结合和稳定折叠态特异性蛋白，通过移动可折叠平衡强化折叠[Fan等，Nature Med. ,5,112 (Jan1999) ；Hammarstrom等，Science 299, 713 (2003) ] 无论某种细胞型中的给定蛋白折叠是否依赖于受体、折叠酶、代谢产物等的分布、浓度和亚细胞定位、[Wiseman等.]。人类功能损伤性疾病通常是正常蛋白体内平衡遭到破坏的结果，这通常是由一种给定蛋白质内，危及其细胞折叠，导致高效降解的突变造成的[Cohen等，Nature 426 =905-909, 2003] 0人类功能获得性疾病同样经常是蛋白质平衡遭到破坏导致蛋白质聚集的结果[Balch等(2008)，Science 319:916—919]。在细胞水平上，热休克反应保护细胞防止一系列急性和慢性应激病症[Westerheide 等，J Biol. Chem. 280(39) :33097 (2005) ] 热休克反应(HSR)是一种对环境和生理紧张性刺激的反应，可导致正常细胞代谢的抑制，以及表达分子受体、蛋白酶和有利于保护和修复由错误折叠和聚集造成的细胞损伤的其他蛋白质的热休克蛋白(HSP)基因的快速诱导[Westerheide等]。热休克反应由转录因子、热休克因子_1 (HSF-I)介导。尽管HSR保护细胞防止各种紧张性刺激导致的损害，大量HSP的积累对细胞的生长和分裂不利[Morimoto 等· (1998)，Genes Dev.12,3788]。蛋白内稳态功能障碍和热休克反应都显示与各种各样的疾病相关，例如包括癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、炎症性疾病和心血管疾病。在本领域仍然需要治疗与蛋白内稳态功能障碍和/或改变热休克蛋白的诱导作用相关的疾病的治疗方法。发明概述本发明基于细胞DNA结合域的乙酰化状态调节细胞HSFl活性的发现。例如，例1中显示通过维持HSFl在一种脱乙酰化状态，SIRTl (可抑制HSFl的乙酰化作用)的活化作用延长HSF1DNA与hsp70促进因子的结合，而SIRTl的下调作用加速HSFl活性的衰减。在一个实施例中，本发明涉及一种调节细胞中热休克转录因子I(HSFl)活性的方法，包括修饰HSFl的DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化作用。在另一个实施例中，所述HSFl的活性通过抑制赖氨酸残基的乙酰化作用提高。在其他实施例中，所述HSFl的活性通过促进赖氨酸残基的乙酰化作用降低。所述赖氨酸残基可以是人源HSFl的赖氨酸80(HSF1K80)或相应的非人源HSFl的保守氨基酸。在另一个实施例中，所述HSFl的乙酰化作用通过供给细胞一种抑制HSFl的DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化作用的试剂抑制。在某些方面，这种抑制赖氨酸残基乙酰化作用的试剂是一种单离沉默调节蛋白、一种沉默调节蛋白激活剂或一种蛋白乙酰转移(HAT)抑制剂。在某些方面，所述HSFl的乙酰化作用通过供给细胞有效剂量的单离沉默调节蛋白或沉默调节蛋白激活剂抑制。所述单离SIRTl或SIRTl激活剂可以被供给。在另一个实施例中，所述HSFl的乙酰化作用通过供给细胞一种HAT抑制剂提高。在一个实施例中，所述HSFl乙酰化通过供给细胞一种沉默调节蛋白抑制剂促进，如SIRTl抑制剂或HAY激活剂。在另一个实施例中，本发明涉及一种提高对其有需要的主体中HSFl活性的方法，包括抑制主体中HSFl的乙酰化作用。在一个实施例中，所述主体是人类。在另一个实施例中，本发明涉及一种降低对其有需要的主体中HSFl活性的方法，包括促进主体中HSFl的乙酰化作用。在一个实施例中，所述主体是人类。在又一实施例中，本发明涉及一种治疗罹患与蛋白质内稳态功能障碍症有关的患者的方法，包括在治疗上供给所述患者有效剂量的抑制HSFl乙酰化作用的药剂。在一个实施例中，所述病症是损伤性功能失调。在另一个实施例中，所述病症是获得性功能失调。在另一个实施例中，所述抑制HSFl乙酰化作用的药剂是一种单离沉默调节蛋白、沉默调节蛋白活化剂或SIRTl活化剂。在其他实施例中，所述药剂是HAT抑制剂。在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗罹患与提高热休克蛋白质表达症有关的患者的方法，包括供给所述患者治疗有效剂量的促进HSFl乙酰化作用的药剂。在一个实施例中，所述病症是癌症或肿瘤。在另一个实施例中，所述病症是一种病毒感染。在另一个实施，所述促进HSFl乙酰化作用的药剂是一种沉默调节蛋白抑制剂或一种HAT活化剂。在又一实施例中，所述药剂是SIRTl抑制剂。此外本发明还包括提高对其有需要的患者的热休克反应以及治疗该患者蛋白质内稳态功能障碍症的方法，包括供给所述患者有效剂量的热休克激活剂和抑制HSFl乙酰化作用的药剂。在另一个实施例中，本发明涉及一种药物成分，包括热休克激活剂和抑制HSFl乙酰化作用的药剂。本发明还涉及鉴定细胞中调节HSFl活性的药剂的方法，包括供给细胞一种试验药剂；并控制HSFl的DNA结合域内赖氨酸残基的乙酰化作用；其中相对于没有试剂存在时DNA结合域的乙酰化作用的变化显示该试剂调节细胞内HSFl的活性。在又一实施例中，HSFl K80或相应的保守氨基酸的乙酰化作用被控制。在另一个实施例中，本发明涉及一种鉴定细胞中调节HSFl活性的一种药剂的方法，包括供给细胞或细胞裂解液一种试验试剂并测定沉默调节蛋白培养基的乙酰化作用；其中相对于没有试剂存在时的乙酰化作用，培养基的乙酰化作用的变化显示该试剂对细胞中HSFl活性的调节。在一个实施例中，所述沉默调节蛋白是SIRT1。在又一实施例中，本发明涉及鉴定细胞中调节HSFl活性的一种试剂的方法，包括供给细胞或细胞裂解液一种试剂并测定一种组蛋白乙酰转移酶(HAT)培养基的乙酰化作用；其中相对于没有试剂存在时的乙酰化作用，培养基的乙酰化作用的变化显示该试剂对细胞中HSFl活性的调节。附图简述本发明中，上述和其他目的、特点及优势将从以下本发明优选实施例中的更具体的描述中明确显示，如在所附图表中的从不同角度说明相同部分而引用的字符所显示的。这些图并不一定按照规定的比例，而是根据本发明的原理进行强调说明。图IA 沉默调节蛋白抑制剂烟酰胺对受体基因表达的影响。在暴露热休克(HS)之前HeLa细胞用烟酰胺(NAM)处理，用标示性引物进行了雷公藤红素、氯化镉、或MG 132和RT-PCR 分析。图 IB =SIRTl siRNA 抑制 HSP70 的转录。经 siRNA 对照 SIRTl 或一个对照 siRNA转染的HeLa细胞用热休克进行处理用以表示时间。进行了 RT-PCR分析并用密度分析法确定hsp70mRNA丰度的提高倍率，并将结果标准化到18S rRNA。图IC =SIRTl siRNA抑制HSFl与HSP70启动子的结合。HeLa细胞处理如上所述(2B)。使用HSFl抗体和qPCR进行ChIP分析，并将结果标准化为1 %的输入时进行反应的
结果。实验按一式三份进行，误差棒表示为士SD。图2A =HSFl乙酰化作用对HSR诱导剂的响应。用标识性HSFl和P300转染的
细胞，用HS、雷公藤红素、CdCl2 or MG 132进行处理。采用免疫沉淀反应和蛋白质印迹法通过乙酰化测试对细胞裂解液进行分析。由于增加了磷酸化而发生缓慢迁移的HSFl用星号表不。图2B 烟酰胺和曲古抑菌A对HSFl乙酰化影响。标示性HSFl和P300转染的
细胞经曲古菌素A(TSA)烟酰胺(NAM)，或两者处理、暴露于热休克，并且用乙酰化检测对细胞裂解液进行分析。图2C 野生型SIRTl但不是催化突变对HSFl乙酰化作用的抑制。在用HS处理和乙酰检测分析之前，用标识性HSF1、P300、以及SIRTl WT或SIRTl H363Y突变转染细胞。图2D =HSFl乙酰化作用对HS的反应。对经Myc-HSFl转染的C0S7细胞进行热休克处理以表示时间，并用乙酰化检测方法进行分析。用SIRTl抗体或Myc抗体检测SIRTl和HSFl。HSC70是装载对照。图2Ε:白藜芦醇的影响。在用热休克处理指示时间之前，用溶剂(乙醇)或白藜芦醇对HeLa处理。细胞提取物用寡核苷酸的下拉法和蛋白质印迹法分析。HSFl磷酸化的增加用星号表示。图2F :SIRT1过度表达对HSFl DNA结合的影响。细胞用SIRTl WT转染，然后接受热休克处理以指示时间。使用HSFl抗体和qPCR进行ChIP分析。从A到G的实验
都按一式三份进行，误差棒表示士 SD。图3A =HSFl在K80的突变破坏DNA结合的活性。用源自以标示HSFl构造转染以及用或不用HS处理的HSFl细胞的提取物进行EMSA反应。EMSA探针包含源自人类HSP70 启动子近端的HSE。对同一样品进行蛋白质印迹分析以显示HSFl和HSC70的水平。图;3B 在K80重组的HSFl突变破坏DNA结合的能力。图中显示了 EMSA反应与WT HSFl或HSFl K80Q重组量增加(5，20，40，80 or 120ng)的关系，以及含有的HSE探针(上图)。不含(-)HSFl的蛋白质是对照样。对同一样品进行蛋白质印迹分析以显示HSFl表达的水平。图3C 在K80的突变的HSFl修复细胞内的HSFl-I失败。hsfl_l细胞用标示型人源HSFl转染并，然后用或不用HS处理。RNA用PCR及用于标识基因的引物定量。数据标准化获得的值用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶，并与在没有使用HS处理(数值设置为1)的WT HSFl细胞中的mRNA的丰度成比例。A-C的实验按一式三份进行，误差棒表示士SD。图4A 保护细胞免于SIRTl过度表达的严重应激。细胞用转染空白样(模拟)及SIRTl转染并在45°C下HS处理以表示时间，接着在37°C下进行恢复。M小时后，由台盼蓝摄取率测定细胞死亡。该实验按照一式三份进行三次，误差棒表示士SD。图4B 在HSR中年龄依赖性下降与SIRTl丰度降低的相关性。源自早期通道(通道21)和衰老(44通道)WI-38成纤维细胞的细胞提取物均采用HS或HS处理后再在37°C 下进行三小时的恢复(R)并用含HSE (上图)的探针进行EMSA分析。对同一样品进行蛋白质印迹分析以显示HSP70，HSFl和SIRTl的表达水平(下图)。图5A :p300和CBP，而不是PCAF引起HSFl乙酰化。293T细胞用标识性HSFl和 P300、CBP或PCAF转染，用HS处理并进行乙酰检测分析。图5B :P300在体内与hsp70启动子结合。染色质免疫沉淀反应实验在指定的42°C 热休克的时间点进行，有或没有在37°C指定的恢复时间点，显示P300与HSP70启动子结合。 染色质交联，取样，并采用P300或HSFl的特定的抗体进行免疫沉淀反应。然后用HSP70. 1 启动子的特定的引物对样品进行PCR分析。反应也在使用的输入和不使用抗体情况下的进行。热休克后，HSFl和P300都在一分钟之内吸收到HSP70启动子，在恢复时间点结合逐渐衰减。图5C:SIRT1在体内与HSP70启动子结合。染色质免疫沉淀反应实验在指定的 42°C的热休克时间点显示SIRTl与HSP70启动子结合。染色质交联、取样、并采用HSFl或 SIRTl特定的抗体进行免疫沉淀反应。然后用HSP70启动子特定的引物对样品进行PCR分析。对比反应也在没有抗体的情况下进行。在基准和热休克条件SIRTl与HSP70启动子结合。图6 大部分HSFl磷酸化不是乙酰化的先决条件。用HSFl MYC WT或HSFl的10 个丝氨酸含磷突变体与P300 —起共同转染细胞。经过二十四小时转染，细胞在42°C 下接受一小时的热休克处理。细胞裂解液接受免疫沉淀反应并且用蛋白质印迹法检测乙酰化的HSFl。Myc抗体用于检测总HSFl。图7A =HSFl能在9个赖氨酸上乙酰化。其中被表达并从细胞中分离纯化的标示性HSF1，用Ρ300转染，并或是接受热休克(42°C，1小时)或是接受雷公藤红素(5微米，1小时)处理，并用LC-MS/MS进行分析。图中显示出在小鼠HSFl内所确定的乙酰化赖氨酸残基的位置。DBD，DNA结合域；L，连接器区域；HR-A/B和-C、七个重复结构域；RD，调控结构域，N,核定位序列；ADL和AD2，激活结构域。
图7B 乙酰化赖氨酸是保守的。用5. 13版T-COFFEE对涉及多个物种的乙酰化赖氨酸进行序列比对。以红色显示乙酰化赖氨酸，氨基酸数显示在右侧。Hs，Homo sapiens(NP_005517) ；Mm, Mus musculus(NP_032322) ；Dr, Danio rerio(NP 571675)； XI, Xenopus laevis(NP 001084036.1) ；Dm, Drosophila melanogaster(P22813) ；Ce, Caenorhabditis elegans(NM_060630) ；Sc, Saccharomyces cerevisiae(P10961)。图7C-7K =HSFl内9个乙酰化位点的质谱数据。假设用胰蛋白酶消化的条件下， 用Mascot和kaffold程序提取MS/MS谱并进行分析。为识别每一个乙酰化胰蛋白酶肽， HSFl衍生前体离子的碎片所产生的质谱显示在上图中，相应的碎片离子覆盖范围显示在下图中。通过42道尔顿附加质量表示乙酰化。一个在m/zU6的低质量离子代表失去NH3W 乙酰化赖氨酸胺离子在大多数MS/MS谱图被确定(标有星号)并用于乙酰化(12)的进一步验证。图8 使用K.球菌HSF与HSE(13)复合物的DNA结合域的晶体结构提供的坐标， 我们用瑞士模型贯穿人源HSFl的对比序列。K80的侧链和到DNA磷酸盐骨架的距离以绿色显示。在上图中方框中的区域以更高的放大倍率显示在下图中。图9 =HSFl K80Q突变是没有三聚能力缺陷。HSF稳定结合到DNA的先决条件是三聚体HSF复合物的形成。因此，可以想象，K80突变破坏了正常的HSFl折叠或应激诱导的 HSF三聚体的形成。为了研究这种可能性，用一种交联法来确定基于热休克的高度有序复合物的形成。K562 细胞用 WT Myc HSFl、Myc-HSFl K80Q 或 Myc-HSFl M391K、L395P、一个组成三聚体的预先表征的HSFl突变体转染(14)。细胞经过或不经过热休克(HS 42°C，20分钟)处理，接着用EGS交联剂处理。蛋白提取物经SDS-PAGE分离并用指定的抗体进行蛋白质印迹分析。箭头指示单体HSF1，而箭头的头部标记三聚体HSF1。作为响应热休克反应， WT和K80Q HSFl都经历由单体到三聚体的转变，表明该突变不影响HSFl的三聚。

图10 =HSFl DNA结合需要残基80上的一个赖氨酸。图中显示了在用指定的HSFl 构造转染，并进行或不进行热休克(HS，42°C 20min)处理的hsf I-/细胞中的EMSA反应。用作探针的寡核苷酸包含源自人源HSP70启动子的近端HSE。对同一样品进行蛋白质印迹分析以显示HSFl和HSC70的表达水平。HSC70显示相同的加载量。K80到A、H、N和T的所有突变都会损害HSFl结合到热休克依赖性DNA的能力。图11 核应激体的形成需要HSFl的残基80上的一个赖氨酸。图中显示了用指定版本的Myc-HSFl转染并进行或不进行42°C—小时热休克0B)处理的HeLa细胞的共聚焦显微图像。用α-Myc抗体(红色)染色外感HSF1，并用DAPI (蓝色)染色DNA。标尺= 5 μ m。HSFl K80到R、Q、A、H、N和T的所有突变都会损害HSFl重定位到典型热休克依赖性核应激体的能力。图12 =HSFl K80Q表现为负面作用。稳定的HSFl结合到HSE需要与属于三个重复的nGAAn的三个DNA结合域同时接触。由于一个或两个单体的乙酰化可能会破坏相关的非修饰单体的结合，少数乙酰化的HSFl DNA结合域可能具有主导性的负面作用。为了研究这个问题，我们用WT或者Myc-HSFl的K80突变体转染HeLa细胞，并用HSFl或Myc的抗体对细胞进行双重染色以便分析内源性HSFl形成nSBs的能力。图中显示的是用指定版本的 Myc-HSFl转染并经过或不经过热休克(HS，42°C，1小时)处理的HeLa细胞的共聚焦显微图像。用HSFl (绿色)和Myc (红色)抗体对HSFl蛋白染色。用DAPI (蓝色)对DNA染色。 标尺=5 μ m。因此，很有可能K80乙酰化对生物的影响可能会大于K80-乙酰化HSFl分子的实际水平。图13 =HSFl激活周期模型。步骤1 处于静止状态的HSFl是一种惰性的单体，可以是细胞质或核。步骤2 应激后，HSFl形成结合到HSh的DNA结合均三聚体。步骤3 =HSFl 获得转录活性。步骤4 :HSF1转录活性在衰减过程中终止。衰减有两个调控步骤，包括源自抑制DNA结合的HSFl (未显示)的反式激活功能的HSP表达的负反馈和通过HSFl的DNA 结合域的乙酰化抑制DNA结合。通过预防HSFl的乙酰化SIRTl调节HSR衰减阶段。图14 :HSF1-SIRT1调节网络的模型。通过老化和细胞代谢状态的SIRTl调节一个转录因子网络活性的影响，包括导致寿命延长和应激抗逆的HSF1。图15是一个描绘HSP70启动子报告的图；hsp70. Ipr-LUC HeLa稳定细胞系包含从-188至+150的hsp70. 1启动子序列，包括近端热休克元素(HSE)。图16是显示使用或没有使用白藜芦醇处理过的并经过41°C或42°C热休克处理的 HeLa hsp70. lpr-luc细胞折叠活性的条形图，如前述荧光素酶分析所示图17是显示用雷公藤红素和/或白藜芦醇处理过的HeLa hsp70. Ipr-Iuc细胞折叠活性的条形图，如前述荧光素酶分析所示。发明详述根据本发明的一个优选实施例详细说明如下。本发明所用单词"a"和"an"是指包括一个或多个，除非另有说明。例如，术语 "a cell”，包括一个单细胞以及两个或多个细胞的组合体。术语“热休克因子”，“热休克转录因子”和“HSF”是指涉及应激诱导基因表达的转录因子系。至少有四个HSF系的个体已经在脊椎动物和植物中描述。果蝇和线虫 (C. Elegans)的表达只有一个 HSF。ffu, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1995 ；11 :441-469)。在人类细胞中，已有三个 HSFS(HSF1，HSF2, HSF4)被表征(Morimoto 等人，Genes Dev. 1998 ； 12 :3788-3796)。HSFl广泛表达，在热休克蛋白的应激诱导表达中起着主要作用。物种之间的HSFl序列是高度保守的。HSFl的DNA结合域大于100个氨基酸的长度，并位于N-端附近。人类HSFl和果蝇HSF的DNA结合域之间的同源性大约是70%左右， 而人类HSFl和酿酒酵母HSF之间的同源性大约是55%。在人类HSFl中，DNA结合域从氨基酸残基13扩展到氨基酸残基121。本发明所用术语“HSF1”包括来自任何物种或细胞类型的HSF1，还包括来自果蝇和线虫(C.elegans)的HSF。这种HSF和HSFl蛋白质具有一种用于与HSFl K80对应的DNA结合域内乙酰化作用的赖氨酸。术语“非人类HSFl ”是指来自非人类物种的HSFl。术语HSFl包括但不仅限于具有GenBank Ace.第.NP_005517, NP_032322, NP_571675, NP 00 1084036. 1，P22813, NM 060630 和 P10961 氨基酸序列的肽。在一个实施例中，所述HSFl是哺乳动物的HSF1。在另一个实施例中，所述HSFl 是人源HSFl。在一个实施例中，所述HSFl存在一个氨基酸序列，与GenBank Ace. No. NP 005517 (SEQ ID NO 1)至少存在大约85%、90%、95%、98%和99%的序列一致性。在另一个实施例中，所述HSFl存在GenBank Ace No. NP 005517的氨基酸序列。术语“序列一致性”或与一个序列的“一致性”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列一致性。一致性可以分别通过比较每个序列中为便于比较而比对的位置来确定。术语“序列的同源性”或与一个序列的“同源性”是指两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的序列同源性。当相比较的序列中的等同位置是由同样的碱基或氨基酸占占据，那么分子在该位置相同；当等同位置是由同样的或类似的氨基酸残基(例如，在空间位阻和/或类似占领电子性质)占据，那么这些分子可认为是在那个位置同源(类似的)。作为同源性、相似性，或一致性百分率的表达，是指在相比较的序列共有的那个位置具有一致性或相似性的氨基酸的数量的功能。作为同源性、相似性、或一致性百分率的表达，是指在相对比的氨基酸在共有的位置具有相同或相似的氨基酸的数量的功能。可以使用的各种比对算法和/或程序包括FASTA、BLAST、或ENTREZ。FASTA和BLAST可以作为GCG序列分析包的一部分获得(University of Wisconsin, Madison, Wis.)，并可以用作，例如，默认设置。 ENTREZ可以通过国家生物技术信息中心，美国国立医学图书馆，马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院获得。在一个实施例中，两个序列一致性的百分率可以通过GCG程序和为1的差重确定，例如对每一个氨基酸间距测重就像它是两个序列之间的单一的氨基酸或核苷酸错配。本发明基于HSFl活性通过在DNA结合域内氨基酸残基的乙酰化和脱乙酰化介导的发现。已经发现，HSFl的乙酰化导致降低与DNA的结合，而HSFl维持在脱乙酰化状态能延长DNA的结合。在一个实施例中，细胞中HSFl的活性通过抑制HSFl的DNA结合域内的一个或多个碱性氨基酸的乙酰化得到提高。HSFl的DNA结合域的乙酰化可通过供给一种抑制一个或多个DNA结合域内的碱性氨基酸残基的乙酰化的试剂进行抑制。容易理解当乙酰化降低或脱乙酰化提高时，氨基酸的乙酰化得到抑制。在另一个实施例中，所述HSFl活性通过抑制HSFl的DNA结合域内的赖氨酸残基的乙酰化得到提高。在又一实施例中，细胞内 HSFl的活性通过抑制人源HSFl (HSF1 K80)赖氨酸残基80乙酰化或通过抑制非人源HSFl 中相对应的保守氨基酸的乙酰化得到提高。术语“HSF1 K80”是指人源HSFl的赖氨酸80。“相对应的保守氨基酸”是指非人类物种的HSFl中的一个赖氨酸残基是保守的，并对应于人类HSFl K80o本发明中所用术语 “保守氨基酸”或“保守残基”是指通常在两个蛋白质之间发现的共有的和/或在肽基序内占据特定位置(如在衍生自不同物种的同源蛋白中)的一个氨基酸残基。如本发明所用的关于HSFl K80的“对应的保守氨基酸”或“对应的保守残基”是指在一个同源HSFl序列或非人源HSFl序列内的保守氨基酸的氨基酸位置。对本领域的技术人员显而易见，在其它同源的HSFl中氨基酸的编号可以不同于人源HSF1。在其它同源HSFl中对应的保守氨基酸可以通过比较氨基酸的序列确定，例如，使用市售的同源建模软件包或传统的序列比对软件包。在另一个实施例中，细胞中HSFl的活性通过促进HSFl的DNA结合域内的一个或多个碱性氨基酸乙酰化抑制。在一个实施例中，一种促进DNA结合域内乙酰化的试剂可供给细胞。可以理解，当氨基酸的乙酰化提高或当脱乙酰化降低时，氨基酸的乙酰化被促进。 在另一个实施例中，HSFl活性通过促进HSFl的DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化提高。 在又一实施例中，人体细胞中的HSFl活性通过促进人源HSFl K80的乙酰化或促进非人源 HSFl相应的保守氨基酸的乙酰化降低。本发明中所使用术语“抑制”或“减少”，包括因直接或间接的手段造成的净减少。 “增加”是指直接或间接手段导致净增益。HSFl的活性是指作为具有热休克反应元件(HSE)序列的基因组的转录因子的HSFl的活性。由拥有HSE序列的基因组转录得到的蛋白质称为热休克(HS)蛋白。热休克首次发现作为导致增强某些蛋白质的转录的热休克反应的触发因素[Snoecx等(2001)， Physiol. Rev. 81 :1461-1497]。具有这种转录活性的产物称为热休克蛋白[Snoeckx等]。 大多数热休克蛋白(Hsps)根据分子量的特征命名，例如Hsp27。各种Hsp系的分类基于其相关的功能和尺寸。热休克蛋白的尺寸范围为10 170kDa。族系名称通常以大写方式。 例如，“HSP70”是指HSP70系。HSP70系的质量范围在70 78kDa之间。一个HSP70系个体的例子是Hsp72(通常统称为Hsp70)。热休克反应包括一种基因编码热休克蛋白的诱导。 根据本发明方法，热休克蛋白能够诱导包括，但不限于，源于选自HSPlO系、HSP40系、HSP60 系、HSP70系、HSP90系、HSP100系、HSP27系、α A-晶状体球蛋白系、蛋白质的α B-晶状体球蛋白系的一种基因编码蛋白。HSFl的乙酰化可以通过导致HSFl乙酰化提高或HSFl脱乙酰化降低或维持HSFl 在乙酰化形式的任何方法(直接或间接的)提高。在一些实施例中，细胞中HSFl的乙酰化通过供给一种能提高HSFl乙酰化的试剂提高。类似地，HSFl的乙酰化可通过导致乙酰化降低或脱乙酰化提高或在维持HSFl脱乙酰化形式下的任何方法降低或抑制。本发明使用的术语“试剂”表示一种化合物、一种化合物的混合物、一种生物大分子(包括，例如，一种核酸、一种抗体、一种蛋白质或其一部分，例如，一种肽)，或一种从生物材料如细菌、植物、真菌、或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制取的提取物。在一个实施例中，一种调节HSFl 的DNA结合域乙酰化的试剂可通过使含有HSFl的细胞与试验试剂接触，以及确定在试验化合物存在或不存在情况下DNA结合域的乙酰化水平来鉴定，其特征在于，乙酰化提高表明该试剂使HSFl的乙酰化提高，而乙酰化降低表明该试剂抑制HSFl的乙酰化。抑制HSFl乙酰化的典型方法包括但不限于，供给一种单离沉默调节蛋白、以提高细胞中沉默蛋白的活性，抑制组蛋白乙酰转移酶的活性。组蛋白乙酰转移酶是催化特异性蛋白中赖氨酸残基乙酰化的酶，包括组蛋白、Hsp40/Dna J热休克蛋白和各种转录因子。[Saha 等(2006). HATs and HDACs in neurodegeneration -.a tale of disconcerted acetylation homeostasis. Cell Death and Differentiation 13 :539-550 ；WO 2009/134131 Al]。几种乙酰转移酶系已被鉴定，包括，例如，GNAT超系(有关Gcn5的N-乙酰转移酶)，如包括 prGcn5、PCAF，MYST 系包括，例如，M0Z、Ybf2/Sas3、&is2 和 Tip60，p300/ CBP HAT系包括，例如，p300和CBP蛋白(Lau等(2000), Cell 5(3) :589-95 ；美国专利申请公开，No. 20080227752)，如下文中的例1所示:p300和CBP诱导HSFl乙酰化。组蛋白脱乙酰基转移酶(HDACs)催化在其培养基内的赖氨酸残基的脱乙酰化。脱乙酰化酶分为三个系，I类和II HDAC系是由曲古抑菌素A抑制的，而NAD+依赖性III类沉默调节蛋白系是由烟碱抑制。在一个实施例中，HSFl的乙酰化可以通过供给细胞一种单离沉默调节蛋白或提高细胞中沉默调节蛋白的活性水平抑制。沉默调节蛋白是属于沉默调节蛋白脱乙酰基酶蛋白系的蛋白质。在一个实施例中，所述沉默调节蛋白属于Sir2系，其中包括但不限于，酵母Sir2 (例如，GenBank登录号P53685)、C.线虫SIR-2. 1 (例如，GenBank登录号 501912 NP)、人源 SIRTl (例如 GenBank登录号012238 和 NP 036370 (或AF083106))和人源 SIRT2(例如，GenBank 登录号NM_012237，NM_030593、NP_036369、NP_085096 和 AF083107) 蛋白质。本发明中所使用术语“SIR2蛋白”是指属于Sir2系的一个沉默调节蛋白。在一个实施例中，所述Sir2蛋白SIRTl。在另一个实施例中，所述SIRTl是人源SIRTl。如上所述，本发明的一个方面涉及一种提高细胞中HSFl活性的方法，包括供给细胞足以抑制HSFl的DNA结合域的氨基酸乙酰化的剂量的一个单离沉默调节蛋白或一个生物活性片段或其变异体。如本发明所使用的，供给细胞或一个主体的单离沉默调节蛋白或片段或其变变异体是非常纯的，或非常纯的和单离的以从其天然伴随的成分中分离出的多肽。容易理解，术语“单离沉默调节蛋白”或“单离SIRT1”不排除包括药学上可接受的载体或赋形剂，简单地说，沉默调节蛋白是从细胞或其他本来伴随其同时存在的成分中分离出来的。单离沉默调节蛋白、片段或其变异体可以是一个具有相同或大致相同的氨基酸序列经重组产生的多肽，如上述的天然存在的沉默调节蛋白。沉默调节蛋白的一种生物活性片段是一种具有脱乙酰化活性或另一种完整长度的生物活性沉默调节蛋白的活性的片段。例如，通过保守氨基酸在沉默调节蛋白序列中的取代可以制备沉默调节蛋白的变异体。一个生物活性变异体具有脱乙酰化活性或天然沉默调节蛋白的另一种生物活性。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的相互交换。保守取代氨基酸可以根据其侧链的化学性质进行分组。例如，一种氨基酸的分组包括那些具有中性或疏水性侧链(a、V、l、i、p、w、f和m)的氨基酸；另一种氨基酸的分组是那些具有中性或极性侧链的氨基酸(g、s、t、y、C、n和q)；另一种氨基酸的分组是那些具有碱性侧链的氨基酸(k、r和h)；另一种氨基酸的分组是那些具有酸性侧链的氨基酸(d和e)；另一种氨基酸的分组是那些具有酸性阿尔法链的氨基酸(g、a、v、l和i)；另一种氨基酸的分组是那些具有酸性阿尔法羟基侧链的氨基酸(s和t)；另一种氨基酸的分组是那些具有含胺侧链的氨基酸(n、q、k、r和h)；另一种氨基酸的分组是那些具有芳香基侧链的氨基酸(f、y和w)； 以及另一种氨基酸的分组是那些具有含硫侧链的氨基酸(c和m)；典型的保守氨基酸取代组是r-k、e-d、y-f、l_m、vi和q_h。上述氨基酸用指定给它们的一个字母表示a表示丙氨酸、c表示半胱氨酸、d表示天门冬氨酸、e表示谷氨酸，f表示苯丙氨酸、g表示甘氨酸，h 表示组氨酸、i表示异亮氨酸、k表示赖氨酸，1表示亮氨酸；m表示蛋氨酸、η表示天门冬、ρ 表示脯氨酸、q表示谷氨酰胺、r表示精氨酸、s表示丝氨酸、t表示苏氨酸、ν表示缬氨酸、w 表示色氨酸以及y表示酪氨酸。在一个实施例中，沉默调节蛋白是一种Sir2蛋白或一种生物活性片段或其变异体。在另一个实施例中，沉默调节蛋白是与天然存在的Sir2蛋白或其片段至少具有约 80%、85%、90%、95%、98%和99%的序列同源性的肽。在另一个实施例中，Sir2蛋白是是与天然存在的Sir2蛋白或其片段至少具有约80%、85%、90%、95%、98%和99%的序列一致性的肽。在另一个实施例中，Sir2蛋白是是与哺乳动物SIRTl至少具有约80^^85%, 90^^95^^98%和99%的序列一致性的肽。在另一个实施例中，Sir2蛋白是与人源SIRTl 至少具有约80 %、85 %、90 %、95 %、98 %和99 %的的序列一致性的肽。在又一实施例中， Sir2蛋白是与SEQ ID No. 2序列至少具有约80%、85%、90%、95%、98%和99%的序列一致性的肽。在另一个实施例中，Sir2蛋白至少具有约80%的250氨基酸保守SIRTl催化结构域、SEQ ID No. 2的258到451的氨基酸残基的序列一致性。SEQ ID NO 2显示出人类 SIRTl的氨基酸序列。在优选实施例中，Sir2蛋白包括与SEQ ID NO 2的氨基酸残基258 和451之间氨基酸序列具有至少约80%、85%、90%、99%的序列一致性。
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在其他实施例中，Sir2蛋白是一个具有完整长度的Sir2蛋白的生物活性片段。例如，能脱乙酰化的SIRTl片段。Sir2蛋白也包括包含一个或多个取代基的序列或变异体，例如，1个和10个取代基之间的天然存在的Sir2系个体。沉默调节蛋白的水平或活性还可以通过供给一种提高细胞中的沉默调节蛋白的水平或活性的试剂(沉默调节蛋白激活剂)来提高。沉默调节蛋白的活性是指蛋白质对于一种培养基的脱乙酰基能力或脱乙酰基转移酶的活性，或沉默调节蛋白的其他生物活性。沉默调节蛋白激活剂是一种一种提高个细胞SIRTl活性的试剂。沉默调节蛋白及SIRTl激活化合物已有描述，例如，在美国专利No. 7345178，美国专利申请公开 No.20080249103,20080194803,200070037865,20070014833,20060229265 和 20060025337 和国际申请号 WO 2005/002672、WO 2005/002555、WO 2009015180、WO 2009015179、 WO 2006094248、WO 2006004722, WO 2006094235、WO 2006094233、WO 2006094209, WO 2006105440,WO 200607894UW0 2006094236、WO 2006/094210 和 Milne 等 0007)，Nature 450 :712-716, and Szczepankiewicz 等(2008), Current Topics in Medical Chemistry 8 :1533-巧44，这些内容各自作为参考文献纳入本发明。具体的SIRTl激活化合物包括但不限于，黄酮、厢类、黄烷酮、异黄烷酮、儿茶素，查耳酮，鞣质和anthocyadins (anthocyanin花青苷)，喹恶瞅(例如，吡咯并喹恶啉)，SRT-1460, SRT-2183, SRT-1720，SRT-2104 草酰乙酸、白藜芦醇、恶唑并[4，5_b] 吡啶、氮杂苯并咪唑、苯并咪唑、咪唑并噻唑、(例如，SRT1460, SRT2183和SRT 1720)
印ankiewicz等)。典型的类二苯乙烯包括但不仅限于，羟基二苯乙烯、如三羟基二苯乙烯，例如，3，5，4'-三羟基二苯乙烯(“白藜芦醇”)。白藜芦醇也被称为3，4'， 5-二苯乙烯三。某些白藜芦醇酯类似物也被描述为沉默调节蛋白激活及(见，例如，WO 2005069998)。四羟基芪，如白皮杉醇，也包括其中。羟基抑素包括，三羟基抑素，如异甘草素，四羟基抑素，如紫铆查尔酮羟基抑素，也被描述为SIRTl激活化合物。羟基黄酮包括四羟基黄酮，如黄颜木素，以及五羟基黄酮，如槲皮素羟基黄酮也可以使用。典型的SIRTl激活剂的羟基黄酮包括但不限于异甘草素(isoquiritigenin)，黄颜木素，紫铆查尔酮和槲皮
ο在另一个实施例中，HSFl的乙酰化可以通过供给细胞一种抑制组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性的试剂即一种组蛋白乙酰转移酶抑制剂抑制。典型的HAT抑制剂包括鸡腰果酸(6-十五基水杨酸酸)和其所描述的衍生物，例如在公开的美国专利No. 20090076155 中，其内容作为参考文献明确纳入本发明。姜黄素类化合物(包括，例如，姜黄素)， epigallogatechin-3-没食子酸和山竹子素也被描述为HAT抑制剂(见，例如，美国公开的专利申请 No. 20060020027、癌症研究，69，583 (2009)和 JBC 279 :33716-337 ，其内容分别作为参考文献明确纳入本发明)。其他抑制HAT的化合物或方法已在公开的美国专利申请 No. 200822775、No. 6369030和No. 6747005中有描述。每一专利的内容作为参考文献明确地纳入本发明。P300抑制剂已被描述，例如在美国公开的专利申请No. 20050069986和生物有机和药物化学快报19 ) :1132-35,其各自的内容作为参考文献明确地纳入本发明本发明也着眼于一种在一个细胞中通过降低沉默调节蛋白的活性，促进HSFl的 DNA结合域的乙酰化而降低HSFl活性方法。在一个实施例中，所述沉默调节蛋白是一个 Sir2蛋白。在另一个实施例中，所述沉默调节蛋白是SIRT1。在一个实施例中，一种抑制沉默调节蛋白活性的试剂(“沉默调节蛋白抑制剂”)可以供给细胞。在一个实施例中，一种 SIRTl抑制剂是供给的。如本领域专业人员所明确的，沉默调节蛋白抑制剂可以是一种小分子、一种蛋白质、一种肽、一种肽类、一种抗体或一种核酸。核酸包括但不限于DNA、RNA、RNA干扰剂和 PNA。沉默调节蛋白抑制剂已在美国专利No. 7345178，美国专利申请公开号20080287653、 20060229265、20060084135、20050136537 和 20070197459,国际申请号 No. WO 2008155390、 WO 2008011476、WO 2008082646、WO 2008156866、WO 2008086400、WO 2007047604、 W02007084162、WO 2006099245、WO 2006094209、WO 2006/094210、WO 2005026112 和 WO 2005060711，其各自的内容作为参考文献纳入本发明。典型的小分子沉默调节蛋白抑制剂是烟酰胺、去乙酰化酶(sirtinol)、去对-乙酰化酶(para-sirtinol), HR_73、2，3，4， 9-四-IH-咔唑-1-羰氨、splitomicin、SEN_196、2_ 苯氨苯甲酰胺、苏拉明、NSC-112546, cambinol、tenovin-l、藤黄酮、hyperforin、artisoforin 和蛋白激酶 C 抑制剂 Ro31_8220、 粗糠柴毒素、ZM449829和靛玉红-单肟(&cz印ankiewicz等)。在另一个实施例中，所述沉默调节蛋白抑制剂是抗沉默调节蛋白抗体。长期抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、人性化的抗体、嵌合抗体、单链Fv(SCFV)、Fab片段、F(AB) 片段、内抗体和合成抗体。在一个实施例中，所述沉默调节蛋白抑制剂是抗Sir2蛋白抗体。在又一实施例中，所述沉默调节蛋白抑制剂是抗SIRTl抗体。反沉默调节蛋白抗体可以培养用来对抗适当的免疫原，包括沉默调节蛋白或多肽或其片段碎片(包括合成的分子，如合成肽)。可以使用任何合适的技术，其中包括，例如，噬菌体展示免疫抗原，制备多克隆和单克隆抗体的生产。多种方法已被描述(see e.g.，Kohler et al.，Nature, 256 :495-497(1975))and Eur.J. Immunol. 6 :511-519(1976)) ；Milstein et al. , Nature 266 :550-552(1977)) ；U. S.Pat. No. 4，172，124 ；Harlow, Ε. and D. Lane,1988，Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory :CoId Spring Harbor, N. Y.)； and Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2(Supplement 27, Summer' 94), Ausubel, F. M. et al.，Eds.，(John Wiley & Sons :New York, N. Y.), Chapter 11，1991)； 其中的讨论部分作为参考纳入本发明)。抗体的片段，也可以根据本发明的使用。采用传统技术和实用筛选在相同的方式作为一个整体的抗体片段抗体可以分散。Fab片段的免疫球蛋白分子是一个多聚蛋白，含有的免疫活性的免疫球蛋白重链和共价键耦合在一起，并专门与抗原结合的免疫球蛋白轻链部分的免疫球蛋白分子的部分组成。Fab片段，可以大幅完整的免疫球蛋白，使用方法，以及在艺术与木瓜蛋白酶分子的蛋白水解消化准备。不过， Fab片段也可能准备在一个合适的宿主细胞表达免疫球蛋白重链和使用在艺术中的任何方法称为免疫球蛋白轻链所需的部分。反沉默调节蛋白的抗体，也可以是一种胞内抗体。胞内抗体是一种细胞内表达的抗体，单链抗体分子，细胞内的靶分子特异性结合和灭活。内抗体已经用于细胞实验和整个生物体。[Chen et al. , Hum. Gen. Ther. (1994)5 :595-601 ；Hassanzadeh et al. , Febs Lett. (1998) 16(1,2) :75-80 and 81-86]。诱导表达载体可以构建内抗体沉默调节蛋白特别反应。在又一实施例中，所述沉默调节蛋白抑制剂是一种核酸。在一个实施例中，所述核酸是一种反义核酸。反义核酸可以是RNA、DNA、PNA或任何其他合适的核酸分子。一种二倍体可在反义序列及其互补序列之间形成，导致该基因失活。反义核酸可以抑制基因表达，通过与基因转录的RNA形成一个二倍体、与二倍体DNA形成三倍体等抑制基因的表达。反义核酸可以生成，例如，对与任何编码序列已知的或者可以通过已建立的技术(例如，化学合成的反义RNA或寡核苷酸(可选包括修饰核苷酸和/或联系，增加抵抗力下降或提高细胞吸收)或体外转录)可确定的基因。形成了与双链DNA等，从基因转录与RNA的双工可以由一个行之有效的技术。反义核酸和其使用已有描述，例如，在公开的美国专利No. 6242258、 No. 6500615、No. 6498035、No. 6395544和No. 5563050，其中的内容作为参考文献纳入本发明。在另一个实施例中，所述沉默调节蛋白抑制剂是一种RNA干扰剂。“RNA干扰剂”， 如此处使用的，被定义为任何一种通过RNA干扰物(RNAi)干扰或抑制目标基因或基因组序列的试剂。这样的RNA干扰剂包括但不限于，核酸分子、包括与目标基因或因组序列同源的 RNA分子、或其中的一个片段、短干扰RNA(siRNA)、短发夹或小发夹RNA(shRNA)和通过RNA 干扰物(RNAi)干扰或抑制目标基因表达的小分子。本发明的目标基因是一个基因编码沉默调节蛋白。在一个实施例中，所述该基因编码一种Sir2的蛋白质。在另一个实施例中， 所述该基因编码人源SIRT1。本发明所使用的“目标基因表达的抑制”，包括任何表达或蛋白质的活性或目标基因或目标基因编码的蛋白质水平的下降。在一个实施例中，所述RNA干扰剂是一个SiRNA。可以通过化学方法合成的siRNA， 可以通过体外转录产生，或可在宿主细胞内产生。在一个实施例中，所述siRNA是一个双链 RNA(dsRNA)的约15至约40个核苷酸长度约15至约28个核苷酸，或约19至约25个核苷酸长度约19，20，21或22个核苷酸分子在长度，并可能包含在每个长度约0，1，2，3，4，5或6 个核苷酸链的3'和/或5'悬。悬的长度是独立的两股之间，也就是说，悬在一个链的长度是不依赖于悬在第二链的长度。RNAi还包括小发夹(也称为茎环)RNA (shRNA)。在一个实施例中，所述这些shRNAs 由短(例如，约19至约25核苷酸)反义链后接一个由约5至约9个核苷酸核构成的苷酸环和类似的正义链组成。另外，正义链可以先开始核苷酸循环结构而反义链可能会跟进。这些的shRNA可以包含于质粒、逆转录病毒、慢病毒，以及由，例如，pol III TO启动子、或其他启动子表达而来(见，e. g.，Stewart，等(2003) RNA Apr ；9 (4) :493_501，作为参考文献纳入本发明)。除了 RNA，RNA干扰剂也可以是含有化学修饰的核苷酸和非核苷酸组成，还包一个核糖分子被另一种糖分子取代的分子或具有类似功能的分子。此外，也可能在核苷酸残基之间使用非天然的连接物，如硫代连接物。RNA链可以衍生报告组的反应性官能团，如荧光官能团。典型的衍生物在一个RNA链的末端被修饰，一般在正义链的3'末端。其他典型的衍生物包含已经修饰了碳水化合物基团的核苷酸，如2' 0-烷基化的残留物或2' -0-甲基核糖衍生物和2' -0-氟核糖衍生物。RNA的碱基也可能被修饰，例如，他们可能被烷基化或卤化。例如，卤化碱基，如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶可以被包含。这些碱基也可能被烷基化，例如，7-烷基鸟苷可能包含在一个鸟尿环核甙残基中。此外，成功产生抑制作用的非天然碱基也能包括其中。在另一个实施例中，所述核酸是一种核酶或一种脱氧核酶。已被证实核酶和脱氧催化序列特异性的核酸分子裂解。分裂位点是由RNA或DNA酶中核苷酸与目标核酸中的核苷酸互补配对确定的。因此可以设计成切割核酸分子，从而增加其降解速度[Cotten et al, EMB0J.8 :3861-3866,1989 ；Usman 等，Nucl. Acids MoL Biol. 10 :243,1996 ；Usman，等， Curr. Opin. Struct. Biol. 1 :527,1996 ；Sun,等，Pharmacol. Rev.，52 :325, 2000]。沉默调节蛋白抑制化合物还包括肽适体。肽适体是肽或小分子多肽，是占主导地位的蛋白质功能抑制剂。肽适体特异性结合的靶蛋白，阻止它们的功能(Kolonin and Finley, PNAS(1998)95 :14266-14271)。利用多种本领域已知的技术可对与沉默调节蛋白具有高亲和力和特异性结合的肽适体分离。肽适体可以通过酵母双杂交筛选从随机肽库中分离(Xu et al，PNAS(1997)94 :12473-12478)。它们也可从噬菌体库分离出(Hoogenboom 等。Immunotechnology (1998)4 :1-20)或化学生成的肽/ 库。在某些方面，HSFl的活性可以通过供给一种能够提高HAT活性的试剂抑制(此处也称为HAT激活剂)。一个能够激活HAT的小分子化合物的一个例子是Λ /- (4-氯-3-三氟甲基苯基)-2-乙氧基-6-十五烷基-苯甲酰(CTPB) (Balasubrmanyam et al. (2003). Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry,278，19134-19140)。根据本发明的方法，HSFl的活性在细胞中可通过改变HSFl的DNA结合域的碱性氨基酸残基的乙酰化进行调节。细胞包括原核细胞、真核细胞中、脊椎动物和无脊椎动物的细胞。在一个实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施例中，所述细胞是人源细胞。典型细胞包括但不限于，肌肉细胞(如骨骼肌细胞和起搏细胞，心房细胞，房室结细胞， 左心室细胞，右心室肌细胞，乳头肌细胞如心肌细胞，并浦肯野纤维细胞和平滑肌细胞)，血细胞，肾细胞，上皮细胞，肠细胞，淋巴结细胞，脾细胞，肝细胞，胸腺细胞，唾液腺细胞，垂体细胞，膀胱细胞，骨细胞，乳腺细胞，宫颈细胞，直肠癌症细胞，肾细胞，喉癌症细胞，肺细胞， 淋巴细胞，皮肤细胞和造血细胞(如实例T淋巴细胞，B淋巴细胞，巨噬细胞，树突状细胞和祖细胞及其)。在某些方面，本发明是一种调节一个主体的HSFl的活性，其中包括供给主体有效剂量的改变HSFl的DNA结合域的碱性氨基酸残基的乙酰化的一种试剂。在一个实施例中， 本发明涉及在一种提高主体的HSFl活性的方法，其中包括供给主体有效剂量的抑制HSFl 的DNA结合域的碱性氨基酸残基的乙酰化的试剂。在进一步的实施例中，所述抑制HSFl的 DNA结合域的碱性氨基酸残基的乙酰化的试剂是一种单离沉默调节蛋白、一种沉默调节蛋白活化剂、或一种HAT抑制剂。在另一个实施例中，本发明涉及在一种降低主体的HSFl活性的方法，其中包括供给主体有效剂量的促进HSFl的DNA结合域的碱性氨基酸残基的乙酰化的试剂。在进一步的实施例中，所述促进HSFl的DNA结合域乙酰化的试剂是沉默调节蛋白抑制剂或HAT激活剂。本发明也包括一种治疗与患者蛋白体内动态平衡和/或热休克蛋白的功能障碍相关的病症的方法，包括在治疗上供给所述患者有效剂量的抑制HSFl的DNA结合域的基本残基乙酰化的试剂。在另一种实施例，该试剂抑制DNA结合域的一个赖氨酸残基乙酰化。在进一步的实施例，该试剂抑制HSFl K80的乙酰化。在又一实施例中，所述该方法包括在治疗上供给患者有效剂量的选自构成HAT抑制剂、一个单离沉默调节蛋白和沉默调节蛋白激活剂组成的组中的试剂。在一个实施例中，所述试剂是一种HAT抑制剂。在另一个实施例中， 所述试剂是一种单离沉默调节蛋白。在另一个实施例中，所述沉默调节蛋白是一个Sir2蛋
17白。在进一步实施例，沉默调节蛋白是SIRT1。在一个附加的实施例中，所述沉默调节蛋白是人源SIRT1。在又一实施例中，所述试剂是一个沉默调节蛋白活化剂或SIRTl活化剂。沉默调节蛋白激活剂在上文中已被定义和描述。如上所述，沉默调节蛋白激活剂和SIRTl激活剂包括，例如，黄酮、厢类、黄烷酮，异构黄烷酮、儿茶素、查耳酮、鞣质和花色素苷、啦咯哇嗯琳、SRT-1460、SRT-2183、SRT-1720、草酰乙酸、白藜芦醇其他多酚类物质。单离沉默调节蛋白或或沉默调节蛋白激活剂可以以含有一个药用载体或赋形剂的药物组成的性质给药。“治疗”或“治疗”包括防止或延缓发病的病症、发症、或某种疾病的生化特征、减轻或缓解病症或阻止或抑制的疾病、病症或紊乱的进一步发展。一个“患者”是一个需要治疗的人的主体，一个“治疗上的有效剂量”是指治疗剂的量足以改善一种紊乱的一个或多个病症和/或阻止紊乱的发展，导致紊乱的恢复。本发明包括与蛋白质内稳态功能障碍相关的疾病治疗。典型的蛋白质包括葡糖脑苷脂酶、己糖胺A、囊性纤维化跨膜传导调节剂、天冬氨酰葡萄胺酶、α -半乳糖苷酶Α、 半胱氨酸转运体、酸性神经鞘氨醇酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、保护蛋白、组织蛋白酶Α、酸性β -葡糖甘酶、酸性β -半乳糖甘酶、汗酸2-硫酸酯酶、α -L-汗酸酶、半乳糖脑甘酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶Α、Ν_乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、N-乙酰葡萄胺-1-磷酸转移酶、酸性鞘磷脂酶、NPC-I、酸性α-葡萄糖苷酶，β-氨基己糖B，肝素N-硫酸、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、α-氨基葡萄苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、α 抗胰蛋白酶、 α -N-乙酰基半乳糖胺、α -神经醇胺酶、β -葡萄糖醛酸酶、β -氨基己糖A和酸性脂肪酶、 多聚谷氨酰胺、α -突触核蛋白、Ab肽、tau蛋白、HERG钾离子通道、胰岛淀粉样多肽、以及甲状腺素转运蛋白。在一个实施例中，与蛋白的动态平衡功能障碍相关的疾病是一种功能紊乱的增益。术语“功能紊乱增益”、“功能疾病增益”、“有毒功能紊乱增益”和“有毒功能疾病增益” 可以互换使用。功能紊乱增益是一种以提高的与聚集相关的变形毒性为特征的疾病。在这些疾病中，汇聚超过细胞内和/或外的间隙。功能增益疾病包括但不限于与多聚聚合相关的神经退行性疾病、路易体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、甲状腺素相关的聚集性疾病、 老年痴呆症、II型糖尿病、肝病及朊病毒疾病。与多聚聚集相关的神经退行性疾病包括， 但不限于，亨廷顿氏病，齿状红核束和苍白球吕伊斯体萎缩，脊髓小脑性共济失调，脊髓和延髓肌萎缩症的几种形式。阿尔茨海默氏症的特点是外聚集的Αβ肽和细胞内的微管相关蛋白tau的聚合形成了两种类型的集合体。甲状腺素相关的聚集性疾病，例如老年性全身淀粉样变性和家族amyloidotic病变。路易体疾病的特点是聚合的α -synuclein蛋白质，其中包括，例如，帕金森氏病。朊病毒疾病(又称传染性海绵状脑病或海绵状脑病)的特点是朊蛋白的聚合。模范人类朊病毒疾病是克雅氏病(CJD)，变异型克雅氏病，杰斯特曼 Straussler-Scheinker综合症，致死性家族性失眠症，库鲁。在一个进一步的实施例中，与蛋白的动态平衡功能障碍相关的疾病是一种功能紊乱的损失。术语“疾病功能损失”和“功能紊乱损失”可互换使用。疾病功能损失是以干扰蛋白质折叠导致蛋白质多余降解为特征的一组疾病。例如，囊肿性纤维化，肺气肿和溶酶体贮积病。在囊肿性纤维化中，突变的或有缺陷的酶是囊性纤维化跨膜传导调节器(CFTR)。 这种蛋白质的一个最常见的基因突变是ΔΡ508这是在第508(508)位置上的蛋白质的氨基酸苯丙氨酸(F)的损失造成的三个核苷酸缺失(△)。溶酶体贮积病是一组以可能发生在的各种组织中的特定的溶酶体酶缺乏症导致通常是被这种酶降解的分子的形成为特征的一组疾病。溶酶体酶的缺乏，可在溶酶体水解酶，或在与溶酶体输送有关的蛋白质中发生。 溶酶体贮积病包括，但不限于，天冬氨酰葡萄糖胺尿症、Fabry' s病、Batten病、胱氨酸病、 法伯氏病、岩藻糖苷贮积症、Galactasidosialidosis、高雪氏病(包括类型1，2和3)，GmI 神经节苷脂、Hunter' s病，Hurler-Scheie' s病，Krabbe‘ s病、A-甘露糖苷贮积症， B-甘露糖苷酶缺乏症，Maroteaux-Lamy' s病、异染性脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、莫基奥A综合征、莫基奥B综合征、粘脂病II、粘脂病IIKNeimarm-Pick病(包括类型 A，B 禾口 C)、Pompe ‘ s 病，Sandhoff 疾病，Sanfilippo综合症(包括类型 A, B, C 和 D)、 Schindler 病、Schindler-Kanzaki 病、涎酸贮积症、Sly 综合症，Tay-Sach' s 病和 Wolman 病。在另一个实施例中，所述与蛋白体内动态平衡和/或热休克蛋白的功能障碍相关的疾病是心血管疾病。心血管疾病包括但不限于冠心病、心肌梗死、中风、再狭窄和动脉硬化。与蛋白体内动态平衡功能障碍相关的病症还包括缺血症如缺血/再灌注损伤、心肌缺血、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、中风、缺血性心脏病和脑缺血。本发明也包括一种治疗患有与蛋白质内稳态功能障碍有关的病症的患者的方法，包括在治疗上供给患者有效剂量的抑制HSFl的DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化作用的试剂结合供给一种药物分子伴侣。药物分子伴侣或动力学稳定剂是指与折叠突变蛋白存在的稳定状态有关的和通过稳定折叠以化学方式增强折叠平衡的化合物[Bouvier， Chem Biol 14:241-242,2007 ；Fan et al, Nat Med 5 :112-115,1999 ；Sawkar et al, Proc Natl Acad Sci USA 99 :15428-15433,2002 Johnson and Kelly, Accounts of Chemical Research 38 :911-921,2005].。药物分子伴侣与沉默调节蛋白激活化合物结合在一起的供给量足以治疗患有与蛋白质内稳态功能障碍有关的病症的患者。典型的药物分子伴侣在已公开的美国专利 No. 20080056994、No. 20080009516、No. 20070281975、No. 20050130972， No. 20050137223,No. 20050203019,No. 20060264467 和 No. 20060287358,中已于描述。这些内容作为参考文献纳入本发明。在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗患有与蛋白质内稳态功能障碍有关的病症的患者的方法包括供给一种抑制HSFl的DNA结合域的乙酰化的试剂结合供给一种机制不同的蛋白质内稳态调节剂。术语“蛋白质内稳态调节剂”是指强化细胞蛋白质动态平衡的小分子物质、siRNA和生物制品(包括，例如，蛋白质)。例如，蛋白质内稳态调节剂可以是影响蛋白质合成、折叠、输送和降解路径的试剂。蛋白质内稳态调节剂包括刺激HSR信号活性的药物制剂。蛋白质内稳态调节剂通过复制信号路径发挥作用，包括但不限于热休克反应或未折叠蛋白反应，或两者。导致蛋白质平衡网络组件的转录和翻译。蛋白质内稳态调节剂能强化折叠、输送和蛋白质(例如，突变蛋白质)的功能。蛋白质内稳态调节剂也能通过上调转录调控蛋白质伴侣或蛋白质伴侣的翻译，或抑制蛋白质伴侣的降解。蛋白质内稳态调节剂能影响生物折叠，经常是通过协调提高伴侣、折叠酶的水平及结合到部分折叠的构象集群的大分子。从而能够使更多的天然结构形成中间体并最终提高供输出的折叠突变蛋白质的浓度。一方面，蛋白质内稳态调节剂区别于伴侣的不同之处在于蛋白质内稳态调节剂能增强突变蛋白质的动态平衡但不能与突变蛋白质结合。此外，蛋白质内稳
19态调节剂能上调一种聚合路径或一种解聚活性。一种机制不同的蛋白质内稳态调节剂是一种通过一种机理而不是通过调控HSFl的乙酰化增强细胞动态平衡的蛋白质内稳态调节剂。典型的蛋白质内稳态调节剂是雷公藤红素、MG-132和L-类型的Ca2+通道受体阻滞剂 (如dilitiazem和维拉帕米)。术语“雷公藤红素”是指^festerheide等J Biol Chem, 2004. 279(53) :p. 56053-60描述的雷公藤红素及其衍生物。这些内容明确地作为参考文献纳入本发明。雷公藤红素衍生物包括，例如，雷公藤红素甲酯、二氢化雷公藤红素双乙酸钠、 雷公藤红素丁酯、二氢化雷公藤红素、雷公藤红素苯基酯、primesterol, primesterol双乙酸钠和公藤红素的三乙酸钠。在某些方面，一种治疗患有与蛋白质内稳态功能障碍有关的病症的患者的方法包括供给一种抑制HSFl的DNA结合域的乙酰化的试剂结合供给一种机制不同的蛋白质内稳态调节剂。其中蛋白质内稳态调节剂是热休克反应激活剂。热休克反应激活剂是一种间接或直接激活或降低热休克反应的试剂，例如，通过直接或见解激活热休克转录因子 1 (HSFl)，提高Hsp70的转录或蛋白质表达、抑制Hsp90和/或激活或提高伴侣mRNA或蛋白质表达(Westerheide 等.，J Biol Chem, 2004. 279(53) :pp. 56053-60，这些内容明确地作为参考文献纳入本发明。)。容易理解，热休克反应激活剂包括间接或直接提高一个基准热休克反应。术语“热休克反应激活剂”、“热休克激活剂”和“热休克诱发剂”在此互换使用。非限制性的热休克反应激活剂的例子是雷公藤红素、非留体抗炎药、ansamycin, geldenamyciruradiciol、葡萄糖醛酸和tributylin。对热休克反应活化剂也已有描述，例如在美国专利申请公开的 NO. 20070259820、20070207992、20070179087、20060148767，每一个申请的内容都明确地作为参考文献纳入本发明。在一些实施例中，所述热休克反应激活剂是小分子的热休克反应激活剂。每个抑制HSFl的DNA结合域的乙酰化作用的试剂和热休克反应激活剂可以按一种剂量给药，其特征是，这种热休克反应活化剂和抑制乙酰化的试剂一起足以提高热休克反应。把热休克活化剂和抑制HSFl乙酰化的试剂结合比一种试剂单独给药导致热休克反应的产生更大的提高。在一些实施例中，尽管所提供的热休克活化剂的剂量单独不能足以诱导热休克反应，但与抑制HSFl的DNA结合域的乙酰化的试剂结合时，该剂量足以激活热休克反应。在本发明的一些实施例中，所述热休克反应活化剂与抑制HSFl的DNA结合域的乙酰化的试剂结合具有比一种试剂更大诱导热休克反应的作用。在其他方面，导热休克反应提高用测定Hsp70转录或蛋白质表达的提高来确定。一个测试提高热休克反应的示范方法为Westerheide等(2004年)所描述。雷公藤红素作为热休克反应和细胞保护作用的诱导剂。J，2004年，279 (53) :pp :56053_60，其中的内容作为参考文献纳入本发明。在其他方面，在热休克反应激活剂和抑制HSFl乙酰化试剂复合给药后热休克反应的提高包括在HSP70转录或蛋白质表达的提高大于在没有试剂复合给药时的热休克反应至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍或至少20倍。如例2所示，已发现，当同时供给抑制HSFl的DNA结合域赖氨酸残基的乙酰化的试剂时，供给低剂量的热休克反应激活剂可以诱发热休克反应。低剂量的热休克反应激活剂EC50是有利的，因为存在热休克反应激活剂所需要的诱发热休克反应的剂量也导致毒性。因此，在一些实施例中，本发明着眼于一种激活或提高热休克反应的方法，包括结合抑制HSFl的DNA结合域赖氨酸残基的乙酰化的试剂供给热休克反应激活剂，其中这种热休克反应激活剂和抑制HSFl的DNA结合域赖氨酸残基的乙酰化的试剂结合在一起的剂量足以激活或提高热休克反应。在其他实施例中，本发明涉及一种是降低热休克反应激活剂足以诱发热休克反应时患者所需的剂量的方法，包括供给一种抑制HSFl的DNA结合域赖氨酸残基的乙酰化的试剂和热休克反应激活剂。容易理解，当两种试剂具有部分组成相同和/或当两种试剂同时给药和/或两种试剂在不同时间或顺序给药时，一种抑制HSFl的DNA结合域赖氨酸残基的乙酰化的试剂可以与其他试剂结合在一起给药。在一个实施例中，所述抑制HSFl的DNA结合域赖氨酸残基的乙酰化的试剂在热休克反应激活剂之前给药。在某些其他的实施例中，发明是一家制药组成，包括一个热休克反应激因子和抑制HSFl乙酰化的一种试剂。在其他实施例中，所述药物组成包括热休克激活因子和抑制 HSFl乙酰化的一种选自包括HAT抑制剂、单离沉默调节蛋白和沉默调节蛋白激活剂组中的试剂。在其他实施例中，本发明涉及一种药物组成，包括一个热休克反应激活剂和SIRTl激活剂。在一个额外的实施例中，本发明涉及一种药物的组成包括一个热休克反应活性剂和一种HAT抑制剂。在另一方面，本发明是一种治疗患有与提高热休克蛋白表达有关的病症的患者的方法，需要包括在治疗上供给所述患者有效剂量的促进HSFl的DNA结合域的乙酰化作用的试剂。在一个实施例中，所述促进HSFl乙酰化的试剂是沉默调节蛋白抑制剂。在另一个实施例中，所述促进HSFl乙酰和试剂是HAT活化剂。沉默调节蛋白抑制剂在上文中已有描述。 在另一个实施例中，所述与提高热休克蛋白的表达相关的病症是癌症或肿瘤。在又一实施例中，所述与提高热休克蛋白的表达相关的病症是一种病毒感染。促进HSFl乙酰化的试剂可以药物成分，包括一个药用载体或赋形剂的方式供给。与提高热休克蛋白的表达相关的病症可以是癌症或肿瘤。根据本发明的方法治疗的癌症包括但不限于乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、血液肿瘤，横纹肌肉瘤、肝癌、皮肤癌、白血病，基底细胞癌、 膀胱癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、胃肠癌。在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括供给一种促进HSFl乙酰化的试剂并结合供给一种化疗药物。可利用的化疗药物包括但不限于，烷基化试剂，如cyclosphosphamide (环磷酰胺 )，烷基磺酸盐，如马利兰， improsulfan 禾口 piposulfan ；如苯丙氧杂，carboquone, meturedopa, uredopa 氣杂环 M ^υ ； Zi M 1 1methylamelamines Tn ￥替姆，trietylenephosphoramide, triethyIenethiophosphaoramide 禾口 trimethylolomelamine ；如苯丁酸氮芥，氮芥 chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine,异环 舞酉先月安，■^氣甲基■^乙月安，
甲基二乙胺氧化物盐酸盐，马法兰，novembichin, phenesterine,(抗肿瘤药)松龙苯芥， trofosfamide,尿啼唆芥末；如卡莫司汀，chlorozotocin nitrosureas fotemustine,洛莫司汀，nimustine, ranimustine aclacinomysins,放线菌素，阿奇霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，方文身寸菌素，calicheamicin, carabicin,洋红霉素，carzinophilin,色霉素，更生霉素，柔红霉素，detorubicin如抗生素，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表阿霉素，esorubicin,去甲氧柔红霉素，马西罗霉素，米托萘胺，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素， ρ印lomycin, potfiromycin, 口票呤，quelamycin, rodorubicin,链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，zinostatin zorubicin，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)抗代谢物； denopterin,甲氨蝶呤，蝶罗呤，trimetrexate如叶酸类似物；嘌呤类似物，如氟达拉滨，
216-巯基，thiamiprine，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如ancitabine，阿扎胞苷，6 azauridine， 卡莫氟，阿糖胞苷，dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine,氟尿苷；抗肾上腺，如氨鲁米特，米托坦，trilostane ；叶酸补充剂，如frolinic酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基酮戊酸；amsacrine ；bestrabucil ；bisantrene ；edatraxate ；雄激素，如 calusterone, dromostanolone 丙酸，epitiostanol, mepitiostane, testolactone defofamine ；秋水仙胺；diaziquone ；elfornithine ；elliptinium醋酸；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖； Ionidamine ；mitoguazone ；米: 酉昆；mopidamol ；ni tracrine ；pentostatin ；phenamet ； 吡柔比星；足叶草酸；2 ethylhydrazide ；甲基苄胼，PSK ； razoxane ；sizofiran ； spirogermanium ；tenuazonic 酸；三乙撑亚月安苯酉昆；2, 2' ,2 "trichlorotriethyIamine ； 氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生； gacytosine ；阿糖胞苷(ARA-C “)；环磷酰胺，塞替派；紫杉烷类化合物，如紫杉醇(紫杉醇 ，百时美施贵宝公司肿瘤，普林斯顿，新泽西州)和多西紫杉醇(泰索帝 ;，法国安万特安东尼)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤巯基嘌呤，甲氨蝶呤；钼类似物，如顺钼和卡钼，长春碱，钼，依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺，丝裂霉素C米托蒽醌，长春新碱，长春瑞滨，诺维；novantrone ；替尼泊甙，柔红霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦；彩管_11 ；拓扑异构酶抑制剂RFS的2000年二氟(DMFO)；维甲酸；esperamicins ；卡培他滨；和药学上可接受的盐，酸或任何上述衍生工具。这个定义中还包括抗激素药物，行为规范或抑制激素，如肿瘤抗雌激素，例如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香化酶抑制4 (5)咪唑，4-羟基trioxifene， keoxifene, LY 行动 117018，onapristone，托瑞米芬(Fareston)；抗雄激素，如氟他胺， nilutamide,比卡鲁胺，醋酸亮丙瑞林，和戈舍瑞林；和药学上可接受的盐，酸或任何上述衍生工具。在又一实施例中，发明是一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括与放射治疗相结合的促进HSFl的乙酰化方法。在另一个实施例中，所述与提高热休克蛋白的表达相关的病症，是一种病毒感染。 在进一步实施例，病毒感染是由选自肿瘤病毒和RNA病毒的病毒导致的。范例肿瘤病毒是疱疹病毒、乳头状瘤病毒、多瘤病毒和HTLV-I [McCance等Human Tumor Viruses, 1998, American Society for Microbiology]。疱疹病毒包括但不限于 EBV (HHV-4)、HHV-6 和 HHV-8。乳头状瘤病毒包括但不限于 HPV-1，-2，-4，-5，-6，-8，-6，-11，-16，-18，-31，-33，-3 5，-45，-51，-52，-58 和-58。RNA病毒包括，例如，沙粒、布尼安病毒、calciviridae、冠状病毒、丝状病 _、fIaviridae> orthomyxoviridae> glj _ _ 禾斗、picornaviridae> ^f Ml ^ 'M _、 rhabdoviridae、逆转录病毒、或披膜病毒。模范RNA病毒包括、但不仅限于、人类的冠状病毒，如SARS相关冠状病毒、肠道和呼吸系统疾病相关的人类toroviruses、诺沃克病毒。黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、普通感冒病毒、A型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、博尔纳病病毒；布尼安病毒、如加利福尼亚脑炎病毒、 汉坦病毒、日本脑炎病毒、病毒君越、裂谷热病毒、布尼亚病毒、虫媒病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)。在进一步的实施例，本发明中是一种治疗罹患病毒感染的方法，包括提供一种促进HSFl乙酰化的试剂并结合提供一种抗病毒药物。在本发明的另一个方面，与热休克蛋白增强表达相关的病症是一种炎症和/或一种自身免疫性疾病。根据本发明的治疗方法使用的药理学试剂或药物组成取决于预定的给药模式和治疗中的应用。根据所需的配方，药剂成分还可以包括，被定义为载体的通常用于形成药物组成为人或动物给药的、药学上可以接受的、无毒的载体或稀释剂。如此选择的稀释剂不能影响药剂或成分生物活性。这种稀释剂的例子是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液和汉克溶液。此外，药品的成分或配方可能还包括其他载体、佐剂、或无毒、非治疗，非免疫原性的稳定剂等。药物成分还可以包括大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚羟基脂肪酸和共聚物(如乳胶官能琼脂糖 ，琼脂糖，纤维素等)，高分子氨基酸，氨基酸共聚物和脂质聚合物(如油滴或脂质体)。对于肠外给药，药物成分或药物制剂，，可以是无菌液体如水油、盐水、甘油或乙醇等生理上可接受的稀释剂和药物载体形成的溶液注射剂、或物质悬浮液的方式给药。此外， 辅助物质，如湿润或乳化剂、表面活性剂、PH缓冲物质等也可以出现在组成中。药物组成的其他组分是石油、动植物或合成来源的物质，例如，花生油、豆油、矿物油。在一般情况下，乙二醇如丙二醇或聚乙二醇是首选液体载体，尤其是对注射液。药剂成分可制成注射剂配方，或者是液体溶液或是悬浮液。在注射之前也可以制备成适于溶解于或悬浮于液体载体中的固体形式。如上所述，也可以制备成乳化的或封装在脂质体即微粒中，如聚乳酸，聚乙交酯，或具有增强效应的共聚物中。[Langer，Science 249 :1527,1990and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28 :97-119,1997. ] 本发明所述的组成和药物制剂可以储存室注射液的形式。或植入的形式给药，以允许活性成分持续或以脉冲方式释放。适用于其他的给药模式的附加配方包括口腔、鼻腔、和肺制剂、栓剂及透皮应用。对于栓剂，粘合剂和载体包括，例如，聚亚烷基乙二醇或甘油三酸脂等，这种栓剂可以用含有0.5%到10%范围有效成分的混合物形成，优选范围是-2%的混合物。口服制剂包括辅料，如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、，纤维素和碳酸镁。局部应用可导致透皮或皮内输送。透皮给药可以用皮贴或有传递作用的东西实现。[Paul等， Eur. J. Immunol. 25 :3521-24,1995 ；Cevc 等，Biochem. Biophys. Acta 1368 :201-15,1998]。在另一个实施例中，本发明涉及一种确定在细胞中调节HSFl活性的试验试剂的方法，包括供给细胞一种试验试剂，并控制HSFl的DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化，其中相对于试验试剂不存在时，DNA结合域乙酰化的变化显示试验试剂在细胞内调控HSFl的活性。测试试剂可从多种来源获得，包括合成的或天然的化合物库。例如，有许多方法可供多种有机化合物和其他试剂的随机和定向的合成。天然的化合物库可以以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在或易于生产。此外，天然的或合成的库和化合物很容易地通过传统的化学、物理和生物化学方法修饰，可用于生成组合库。药物制剂也可定向或随机的化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、氨基化等生产结构类似物。测试试剂包括多种化学类类型， 一般地合成、半合成或天然存在的无机或有机分子。测试试剂包括那些已发现的大量的合成或天然化合物库。
在一个实施例中，所述试剂抑制DNA结合域的乙酰化。在另一个实施例中，所述试剂促进DNA结合域的乙酰化。在又一实施例中，所述在DNA结合域的赖氨酸的乙酰化是可控的。例如，HSFl K80或相应的在非人源HSFl的保守氨基酸的乙酰化是可控的。在一个附加的实施例，细胞是人源细胞。在又一实施例中，发明是一种确定能调控HSFl活性的试剂的方法a.供给细胞或细胞裂解液一种试剂。b.测量沉默调节蛋白基板的乙酰化。c.比较步骤(b)中沉默调节蛋白基板的乙酰化和没有试剂情况下沉默调节蛋白基板的乙酰化；其中在供给试剂后沉默调节蛋白基板的乙酰化提高表明该试剂抑制HSFl的活性，并且其中在供给试剂后沉默调节蛋白基板的乙酰化降低表明该试剂促进HSFl的活性。 一个沉默调节蛋白基板是一种能够被沉默调节蛋白乙酰化的试剂(如蛋白质或肽)。在一个实施例中，所述沉默调节蛋白基板是HSFl。在另一个实施例中，所述沉默调节蛋白基板是异于HSFl的基板。沉默调节蛋白基板的乙酰化是可测量的，例如，在一种细胞均浆中。在一个实施例中，所述试剂抑制沉默调节蛋白的活性。在一个进一步实施例，沉默调节蛋白是 SIRTl0在另一个实施例中，所述细胞是人源细胞。测量去乙酰化酶活性和测量沉默调节蛋白基板乙酰化的分析方法已描述过，例如在美国专利申请公布No. 20080249103中，其中的内容作为参考文献纳入本发明。在又一个实施例中，本发明涉及确定一种调控HSFl活性的试剂的方法，a.供给细胞或细胞裂解液一种试剂。b.测量HAT基板的乙酰化。 c.比较步骤(b) HAT基板的乙酰化和在没有试剂时HAT基板的乙酰化；其中供给试剂后提高了 HAT基板的乙酰化水平，表明试剂抑制HSFl的活性，并且其特征是供给试剂后降低了 HAT基板的乙酰化水平，表明试剂提高HSFl的活性。一个HAT 基板(如一种蛋白质或肽)是一种试剂能够被组蛋白乙酰转移酶乙酰化的试剂。在某些方面，HAT基板不是HSFl。在另一个方面，本发明是用本文所述的方法确定的一个调节HSFl活性的试剂。本发明用下面的例子说明，但这并不意味着要以任何方式限制。
具体实施例方式实施例1 通过脱乙酰基酶SIRTl应激诱导的热休克因子1的调控热休克因子I(HSFl)对于保护细胞免于与蛋白质错误折叠相关的蛋白质损坏以及调节胰岛素信号通路和衰老是必不可少的。在这里，我们展示了在一个负调控DNA结合活性的关键残基上对人源HSFl进行的诱导性乙酰化。通过维持HSFl在脱乙酰化、DNA结合的合适状态、脱乙酰酶的活化作用和长寿因子SIRTl延长HSFl与Hsp70启动子的结合。 相反，向下调整SIRTl则加速热休克反应的衰减并从同源启动子元素释放HSF1。这些结果提供了寿命调节需要HSFl和建立SIRTl在蛋白质平衡及HSR中的作用的一个机理基础。由不同的环境和生理紧张性刺激导致的HSFl瞬态激活是一个多步骤的过程，涉及到一种惰性HSFl的单体、单体转化为一种DNA结合的合适的三聚体表达、在丝氨酸残基中增加HSFl的磷酸化、增强转录、HSFl DNA结合的衰减和转录活性(1)。HSFl激活大量调节蛋白质平衡的基因，包括分子伴侣HSP70和HSP90的转录。这些伴侣与HSFl产生负反馈回路并抑制HSFl的转录活性有关O)。然而，HSFl不能从其目标启动子位点释放(J)，表示必须存在额外的机制完成HSFl的循环。抗逆性和代谢状态与蛋白质平衡和提高寿命密切相关。在C. elegans中，减少胰岛素信号的保护作用，需要HSFl和R)x0转录因子DAF-16，以防止蛋白质错误折叠的损害， 从而延长寿命G，5)。低热量摄入的有益影响由沉默调节蛋白系成员Sir2、代谢控制下的 DNA依赖性去乙酰化酶所传递。我们用沉默调节蛋白抑制剂烟酰胺(8)处理HeLa细胞，然后将细胞暴露于各种已知的应激下诱导HSR (9)。烟酰胺处理降低从所有热休克基因类型(HSP70，HSP90，hsp40和 HSP27，见图1A)中应激诱导的mRNA的丰度，显示HSR的全面诱导需要沉默调节蛋白。三种核心沉默调节蛋白中，SIRTl具有很好的特征化的目标(10)。因此，我们研究了用SIRTl 作为调节HSR的候选。根据siRNA对SIRT的消耗，在6小时热休克(HS)中产生的hsp70 mRNA的数量是用对照siRNA转染细胞中的四分之一(图1B)。为了检验SIRTl是否影响hsp70启动子对HSFl的补充，我们对对照样SIRTl siRNA转染细胞在HS(图1C)进行了染色质免疫沉淀(ChIP)分析。在对照样siRNA处理的细胞中，HSFl与hsp70启动子的结合快速发生并在和休克(11) 30分钟内开始衰减并在6 小时内缓慢下降。然而在SIRTl siRNA转染的细胞中，整个时间历程中大约有四分之一的 HSFl与启动子相关联。这些结果支持SIRTl是HSFl DNA结合活性和hsp70表达的体内调节剂的作用。为了确定HSFl是否是SIRTl的直接目标，我们研究HSFl的乙酰化状态。我们用编码标志标示性HSFl融合蛋白和P300转染细胞并将他们暴露于几种HSR诱导剂。将免疫沉淀的HSFl用结合乙酰化赖氨酸的抗体通过蛋白质印迹分析。在未经处理的细胞中没有检测到乙酰化HSF1，但出现在暴露于各种应激条件下的细胞中(图加)。调节HSFl乙酰化的内源性乙酰转移酶可能是Ρ300或CBP，如Ρ300或CBP过度表达，但不是PCAF，导致 HSFl的乙酰化(图5Α)并且经过HS后Ρ300被hsp70启动子吸收(图5B)。在基准和应激条件下SIRTl也与结合HSP70启动子结合(图5C)。脱乙酰化酶分为三类，S卩I和II的HDAC类可以被曲古菌素A抑制(12)和NAD+依赖的III类，可被烟酰胺抑制的沉默调节蛋白(8)。曲古菌素A对HSFl的脱乙酰化没有影响，而烟酰胺可单独或在曲古霉素存在下抑制脱乙酰化作用(图2B)。SIRTl WT的过表达抑制HSFl的乙酰化(图2C)，但不是受损NAD依赖的脱乙酰基酶活性的点突变，表明SIRTl 在HSFl功能中所起的作用。正如在和Cos7细胞中所检测的，HSFl的乙酰化作用不是因细胞类型而具体化的，并且尽管HSFl的乙酰化作用伴随p300的过度表达而增强，但这并不需要P300的过度表达。HSFl的乙酰化动力学与HSFl的激活动力学不匹配。乙酰化被延迟并在HSFl的活性和DNA的结合衰减后的期间内保持(11)。此外，十个潜在磷酸化丝氨酸被丙氨酸取代的HSFl仍保持乙酰化能力，表明HSFl的磷酸化不是乙酰化的先决条件。HSFl乙酰化在HSR和SIRTl与HSFl共免疫沉淀的后续时间点的持续(图2D)促使我们研究SIRTl是否在HSFl活性的衰减中起作用。我们用白藜芦醇，一种SIRTl活性的小分子诱导剂，处理HeLa细胞(14)，并在基于寡核苷酸的下拉实验中测定HSF1DNA结合活性(75)(图2E)。在仅用HS和载色剂处理的细胞中，对HSFl DNA结合诱导低于2小时并在6小时后衰减。HSFl的瞬态激活由改变流动性反应在SDS-PAGE上，这检测了应激诱导的HSFl的磷酸化状态。相反，在白藜芦醇处理的细胞中，即使在经过持续的HS八小时之后，HSFl仍保持在具有DNA结合能力和磷酸化的状态。正如由CHIP试验所测定的一样，在 SIRTl过度表达的细胞中，HSFl的DNA结合被强化而衰减被抑制。这些结果表明SIRTl的丰度和活性的变化可调节HSR的衰减。为了阐明乙酰化调节HSFl的DNA结合的机制，利用源自从细胞分离的标志 HSFl的肽的质谱，我们确定了在HSFl上乙酰化的位点。至少有九个赖氨酸被乙酰化在应激反应中，其中，因为相应的酵母HSF的赖氨酸突变导致功能损失的表型位，于DNA结合域的Κ80特别有趣(17，18)。此外，K.球菌HSF的晶体结构分析表明，相应的人源HSFl Κ80 的赖氨酸位于连接主DNA结合螺旋到一个柔软和溶剂暴露环路的短区域并与DNA磷酸骨架形成氢键(19)。HSF-HSE晶体结构的比较蛋白质模型表明，人源HSFl Κ80与DNA骨架(图 8)的密切联系，表明通过乙酰化中和赖氨酸的正电荷应干扰DNA结合。因此，我们与谷氨酰胺仿构乙酰化取代Κ80。在源自hsf 1-1-成纤维细胞(20)、用 HSFl WT转染和HSFl K80Q表达结构的提取物中，在电泳迁移实验(EMSA)测试中突变蛋白未能与DNA结合(图3A)。但是K80Q突变仍然组装进入HS诱导的三聚体，一种DNA结合状态的标志(图9)。用K80的其他氨基酸(K80R，在K80-H-N，和-T)替换时，也导致有缺陷的DNA结合(图3，图10)。在体外，重组的非-乙酰化WT HSFl容易与一种人工合成的 HSE结合，但K80Q突变蛋白却不能(图:3B)。我们将WT和K80突变体引入hsf 1_1_成纤维细胞并用qPRC分析HS诱导的HSFl目标的表达。虽然WT HSFl诱导HSP mRNA的表达， HSFl K80的突变体是非功能性的(图3C)。根据HS，突变体位于核心位置，但受损于发生在热休克人源细胞核心应激体的重定位(图11-12) (21)。HSFl的HSE结合活性、重定位到核心应激体和目标基因的表达表现出需要在残基80中未修饰的赖氨酸侧链。因此，我们建议HSFl K80乙酰化导致调节从DNA释放HSFl三聚体，从而在HSR的衰减中表现了一个调节步骤(图13)。为了验证SIRTl调控的HSR的生物学意义，我们用抗逆性的检测，在其中赋予伴侣表达增加耐热性0 。使用或不用SIRTl转染细胞，暴露于45°C的HS下20或30分钟，允许细胞恢复二十四小时，并分析细胞的死亡。正如所料，随处理时间增加，45°C下的HS 导致细胞死亡(图如)。在两个时间点，细胞过表达SIRTl约占经历死亡细胞的三分之一 (图4a)。为了要检验是否SIRTl中年龄调控的变化是否影响HSFl活性和HSR，我们用已广泛应用于研究衰老过程分子变化的人源WI-38成纤维细胞。当比较早期和晚期的通道号码，我们发现，衰老导致HSR的降低并并随SIRTl丰度的降低HSFl DNA结合活性的激活作用降低(图4b)。SIRTl调节HSFl的发现补充了(4，5)先前在调节寿命中HSFl作用的观测结果。HSFl似乎是一个联系细胞营养，应激和寿命调控网络的枢纽。许多SIRTl调节的转录因子，包括F0X03，P53和NF-κ B，在细胞应激反应中有重要作用(7，23，M)。HSFl对这种应激调控网络的额外作用强调在SIRTl介导的细胞保护中的蛋白质动态平衡的核心作用(图14)，并可能连接HSR分子反应与代谢需求。一个基于细胞和动物实验研究中一致的观察结果是HSR与衰老相关的下降(22)，这可能会导致SIRTl至少部分地控制HSFl的活性。在有机体的水平上，我们预计HSFl目标基因的调控可能通过饮食和营养受到影响。
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材料和方法组成，抗体和试剂mHSFl-标志和hHSFl_Myc在前面已描述过05，沈)。HSFl点突变体是由 QuikChange定点突变(Mratagene公司)产生，并经测序证实。对于MYC-HSF1十丝氨酸突变体，磷酸丝氨酸残基 S230, S303, S307, S314, S319, S320, S338, S363, S368 和 S369 (参考文献27和我们未发表的数据)，所有都突变成丙氨酸。SIRTl WT和H363Y突变表达组成由 Tony Kouzarides博士友情提供(英国剑桥大学)，P300表达组成由David Livingston博士提供(哈佛大学)。在这项研究中所使用的抗体是α -FLAG M2 (Sigma公司)，α -ACK (Ce 11 Signaling 9441 公司)，α -HSFl (4)，α -SIR2 的(上州生物 #07-131)，α -Myc 基因 (Clontech公司)和α -Ρ300 (圣克鲁斯)。所使用的化合物是烟酰胺(Sigma公司)，曲古菌素A (上州)，EGS (Sigma公司)，雷公藤红素(GAIA化工股份有限公司)，氯化镉(Sigma 公司)和 MG132 (Calbiochem)。细胞培养，转染和处理条件所有的细胞均保持在37°C在饱和湿润的含5% (X)2的气氛。K562细胞在RPMI 1640 培养基中辅以10% FCS和抗生素(青霉素和链霉素)进行培养。^3T、HeLa、C0S7和WI-38 细胞在DMEM中辅以10%胎牛血清和抗生素进行培养，hsfl-Ι小鼠胚胎成纤维细胞09)在含有10% FCS、10毫米非必需的氨基酸、每100毫升含0. 96 μ L的2-巯基乙醇及抗生素的 DMEM中培养。根据制造商的说明书使用Polyfect(QIAGEN)转染细胞。K562、C0S7和 hsfl-Ι细胞由一台基因脉冲电转化仪(BIO-RAD)通过点穿孔法转染。热休克通过淹没细胞在一个42°C预热循环水浴1小时实现。雷公藤红素处理在5 μ M浓度下处理1小时，氯化镉处理在50 μ M浓度处理6小时，以及MG132处理在20 μ M浓度下处理6小时。1 μ M的曲古菌素A添加到细胞中经过一夜，5 μ M的烟酰胺添加到细胞中经过一夜和50 μ M的白藜芦醇添加到细胞中经过40小时。siRNA 的转染根据制造商的协议对HeLa细胞转染用Oligofectamine (Invitrogen公司)，使用 200纳米Dharmacon SmartPool SIRTl的siRNA。二十四小时后，细胞分裂并再次转。二次转然后用iTrizol法对RNA分离48小时。引物被用来验证SIRTl击倒。乙酰化测试用标示性HSFl或Myc-HSFl和p300转染对或Cos7细胞转染，然后在用各种应激处理前使用或不使用烟酰胺进行处理。细胞裂解液用标志抗体或Myc抗体免疫，乙酰化HSFl用识别乙酰化赖氨酸的抗体通过蛋白质印迹法。染色质免疫沉淀(ChIP)ChIP反应的实施基本与前述一致。自HeLa细胞产生的样品用10 μ 1 α -HSFl (28) 在4°C免疫沉淀一夜。引物用于hsp70. 1启动子(GenBankACC#1717毫升)并环绕近端的 HSE0将试验结果标准化为的输入进行反应的结果。HSFl从细胞的纯化。根据制造商的协议，293Τ细胞用mHSFl标志转染，使用或不实用CMV-P300 Polyfect OiIAGEN)。在所示的应激处理前细胞用曲古霉素A或烟酰胺处理4小时。然后收获并在RIPA缓冲液中裂解。mHSFl标志与α -FLAG M2免疫凝胶珠沉淀(Sigma公司F2426)并用标志肽洗脱。蛋白质印迹分析前用SDS-PAGE分离样品。质谱分析如上所述，从mHSFl标志和CMV-P300转染的细胞中获得纯化的mHSFl标志物，并在进行HS或雷公藤红素处理前用1 μ M曲古霉素A和5 μ M烟酰胺处理18小时。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离、从凝胶切除、用胰蛋白酶消化，并通过配备纳米电喷射源的混合四极杆飞行时间设备接受串联质谱分析。(QSTAR，Applied Biosystems,Foster City, CA)。将 MS/MS 谱图使用 Mascot (Matrix Science, Boston, MA ；version 1. 9. 05)和 X ！ Tandem (www. thegpm. org ；2006. 04. 01. 2版)数据库搜索算法对IPI鼠标序列数据库搜索 (68222项；3. 15版)进行搜索。用一个片段和前体离子质量容限0. 3Da对Mascot and X ！ Tandem进行搜索，假定消化酶胰蛋白酶具有一个错过裂解的可能性。在数据库中搜索中， 半胱氨酸的脲基甲基化作为固定修饰而蛋氨酸氧化、N-末端蛋白和赖氨酸乙酰化作为变量修饰。由肽先知算法(31)确定并由人工检查MS/MS谱图验证的肽识别的可接受概率大于 95. 0%。重组蛋白如前所述，小鼠的His-HSFl在大肠杆菌BL-21 (32)中生成，将收获细菌悬浮于冷裂解缓冲液中[50mM的1Tris-HCl (pH值7. 4)，140毫米氯化钠，10%甘油]和lmg/mL溶菌酶在室温下裂解15分钟。加入ImM PMSF (苯甲基磺酰氟)、ImMDTT ( 二硫苏糖醇)和无EDTA 的蛋白酶抑制剂的混合液(罗氏)后，裂解液经超声并用Talon金属亲和树脂(Clontech 公司)在4°C培养2小时。用含有0. 5%的Triton X-100的裂解缓冲液充分洗涤树脂并在含有醋酸钠50mM(pH值5. 0)、氯化钠300mM的200mM咪唑中洗脱。洗脱蛋白质对PBS透析并等量稀释。电泳迁移实验(EMSA)源自WI-38细胞和转染hsfl-/-细胞或重组的HSFl蛋白油提取缓冲液C (15 μ g) 与32P标记的代表人源HSP70启动子近端的HSE的寡核苷酸培养(3 。在4%原生聚丙烯酰胺凝胶上对蛋白质-DNA复合物进行分析。寡核苷酸下拉法检测检测方法基本上如前所述(32)，仅稍作修改。HeLa细胞在含有蛋白酶抑制剂的冷裂解缓冲液[25mM HEPES (pH 7. 4), IOOmM NaCl, 5mM EDTA, 20mM ρ-甘油磷酸盐，20mM P-硝基-苯基磷酸盐，0. 5% Triton X_100，20mM 100 μ M原钒酸钠]中裂解。细胞提取物用1 μ g 生物素标记的寡核苷酸(低聚物，赫尔辛基，芬兰)培养，并使蛋白质在室温下与寡核苷酸结合30分钟。为得到IH，使寡核苷酸用UltraLink链霉亲和素珠(Pierce)在4°C沉淀。被结合的组分用洗涤缓冲液洗3次[20mM的1Tris-HCl (pH值7. 5)，ImM的EDTA，10%的甘油， 0. 1% TRITON X-100)，用变性缓冲液洗脱并用蛋白质印迹分析。RT-PCR 分析根据制造商的说明收获HeLa细胞并使用Trizol试剂产生RNA (GIBC0-BRL，盖士堡，马里兰州)。使用一个逆转录反应和PCR获得如下蛋白HSP90、HSP70、hsp40、HSP 25、 HSP27U8S 和 gapdh。定量实时RT-PCR分析在转染的hsfl-/-细胞中的hsp70和hsp25基因表达的分析，基本按以上描述实施(34)。简单地说，使用的RNeasy试剂盒^jiagen)分离RNA。对每个样本，用RQL DNA酶 (Promega公司)处理1微克的RNA并用莫洛尼鼠白血病病毒核糖核酸酶H(-) (Promega公司)反转录。用绝对QPCR ROX混合物(Advanced Biotechnologies)制备反应混合物。将相对量的HSPmRNA对GAPDH进行标准化。所有源自三个生物重复的样本按一式三份进行反应。共聚焦显微镜检查将在盖玻片上生长的HeLa细胞保持在控制温度即在42°C热休克1小时。用PBS 洗涤细胞，同时固定在含有0. 5^WTriton X-100的3. 7%多聚甲醛中。用PBS洗涤细胞两次并在封闭液(PBS-0.05%吐温20中含20%正常山羊血清)中培养1小时。主要抗体[兔 α-HSFl (11)，鼠 α-Myc 蛋白(Sigma 公司)]在 1 500 稀释在含 5 % BSA 的 PBS-0. 05 % 吐温20中在40°C下隔夜使用。用PBS-0.05% Tween 20经过3次洗涤后，使用二次山羊 α _ 鼠 IgG (Rhodamine Red-X and Alexa Fluor 488, Molecular Probes)或山羊 α-兔 IgG(Alexa Fluor 546,Molecular 488,Molecular Probes)检测主抗体。所有二次抗体在室温下按1 500稀释在含5% BSA的PBS-0. 05% Tween中1小时后使用。经过三次洗涤后，将细胞放置到在Vectashield中含有DAPI (4‘ ,6' - 二脒基_2_苯基吲哚；Vector Laboratories)的载玻片上。用一台kiss LSM510 ΜΕΤΑ共聚焦显微镜分析。图像用Adobe Photoshop软件做进一步处理。交联将细胞保持在37°C或在42°C热休克15分钟并在室温下置于冷裂解缓冲液 [25mM HEPES (pH 7. 4), IOOmM NaCl，5mM EDTA,0. 5 % Triton X-100，20πιΜβ -甘油，20mM P-硝基-苯基磷酸盐，100 μ M邻钒钠，0. 5mM苯甲基磺酰氟，ImM 二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂混合液]中裂解并在4°C 15000g下离心lOmin，IOOyg蛋白与2mMEGS[乙二醇双 (succinimidylsuccinate)]在室温下交联15分钟。交联冷却后加入100毫米甘氨酸，将样品在变性缓冲液中煮沸，依次用5% SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹分析。热抗逆性测定对矢量对照(模拟)或SIRTl转染的细胞进行比较耐45°C的热休克。将细胞淹没在45°C的水浴中20或30min，然后让其恢复在37°C。台盼蓝摄取M小时后测定细胞％细胞死亡。参考文献1. J. Anckar, L. Sistonen, Adv Exp Med Biol 594,78(2007).2. Y. Shi, D. D. Mosser, R. I. Morimoto, Genes Dev 12,654(1998).3. S. K. Rabindran, J. ffisniewski, L. Li, G. C. Li, C. ffu, MoI Cell Biol 14， 6552(1994).4. A. L. Hsu, C. Τ. Murphy, C. Kenyon, Science 300,1142(2003).5. J. F. Morley, R. I. Morimoto, MoI Biol Cell 15,657(2004).6. S. Imai, C. M. Armstrong, M. Kaeberlein, L. Guarente, Nature 403,795(2000).7. A. Brunet et al，Science 303,2011(2004).8. K. J. Bitterman, R. M. Anderson, H. Y. Cohen, M. Latorre-Esteves , D. A. Sinclair,J Biol Chem 277,45099(2002).
29
9. MaOnline.
10.N
11.M
12.M
13.E
14.K
15.J
16.K
17.S
18.F
19.0
20.D
7523(1998).
0199]21.C0200]22.K0201]23.H0202]24.F0203]25.J0204]26.C0205]27.T0206]28.S0207]29.D
7523(1998).
0208]30.
0209]31. 5383(2002).
0210]32.
0211]33, 4736(1988).
0212]34.
0213]35.
9. Materials and methods are available as supporting material on Science
DaIi-Youcef et al. ，Ann Med 39,335(2007). P.Kline, R. I. Morimoto, MoI Cell Biol 17,2107(1997). Yoshida，M.Kijima，M.Akita，T.B印pu，J Biol Chem 265,17174(1990). Langley" α /·，￡7kffiOJ21, 2383 (2002). Τ. Howitz et al, Nature 425,191(2003). Anckar et al, MoI Cell Biol 26,955(2006).
D. Sarge, S. P. Murphy, R. I.Morimoto, MoI Cell Biol 13,1392(1993). T. Hubl, J. C. Owens, H. C. Nelson, Nat Struct Biol 1,615(1994). A. Torres, J.J.Bonner, MoI Cell Biol 15,5063(1995). Littlefield, H. C. Nelson, Nat Struct Biol 6,464(1999). R. McMillan, X. Xiao, L. Shao, K. Graves, I. J. Benjamin, J Biol Chem 273,
Jolly et al, J Cell Biol 156,775(2002).
C.Kregel, JAppl Physiol 92,2177(2002). Vaziri et al, Cell 107,149(2001). Yeung et al, Embo J 23,2369(2004).
Cotto, S. Fox, R. Morimoto,J Cell Sci 110 (Pt 23),2925(1997). I. Holmberg et al.，Embo J 20,3800(2001).
Guettouche, F. Boellmann, W. S. Lane, R. VoelImy, BMC Biochem 6,4.
D.Westerheide et al. , J Biol Chem 279,56053(2004). R. McMillan, X. Xiao, L. Shao, K. Graves, I. J. Benjamin, J Biol Chem 273,
G. W. Beresford, J. M. Boss, Nat Immunol 2,652(2001).
A. Keller, A. I. Nesvizhskii, E. Kolker, R. Aebersold, Anal Chem 74,
J. Anckar et al.，MoI Cell Biol 26,955(2006).
D.D.Mosser, N. G.Theodorakis, R. I. Morimoto, MoI Cell Biol 8,
V. Hietakangas et al, Proc Natl Acad Sci USA 103,45(2006). C.I. Holmberg, S.A.11Iman, M.Kallio, A.Mikhailov, L.Sistonen, Cell Stress Chaperones 5,219 (2000).
0214]36. J. Y. Kim, K. W. Kim, H. J. Kwon, D. W. Lee, J. S. Yoo, Anal Chem 74，5443 (2002) ·
0215]37. 0. Littlefield, H. C. Nelson, Nat Struct Biol 6,464(1999).
0216]38. S. K. Rabindran, R. I. Haroun, J. Clos, J. ffisniewski, C. Wu, Science 259, 230(1993).
0217]^MM 2 :SIRT1激活作用与与雷公 红素、木克反应的小分子活仆流丨的协同
0218]许多热休克反应的激活剂已经确定[2]。正在研究一些小分子热休克激活剂在治
30疗蛋白质错误折叠疾病的应用。由于在治疗剂量和毒性剂量之间的分别往往很小，这将有利于使用小分子在可能的最低剂量下激活热休克反应。目前的实验表明，激活SIRTl与热休克反应诱导剂具有协同效应，从而允许低水平的热量或雷公藤红素、热休克反应的小分子活化剂的反应诱导[3]。目前通过激活热休克反应治疗蛋白质错误折叠疾病的策略包括利用高水平的热量或利用大量足以有效诱导这种反应的小分子对这种组织进行处理。在某些情况下，热量水平和所需的诱导热休克反应的化合物也能导致细胞损伤或毒性。通过同时对SIRTl激活。这种热休克或诱导热休克反应所需的小分子化合物的用量可以降低。如例1所述，已发现通过防止HSFl活性周期的衰减步骤[I] SIRTl与热休克结合而激活热休克反应。目前的研究显示，SIRTl的活化作用与热休克和热休克反应的小分子激活剂具有协同效应从而降低热休克温度或稳定的反应激活作用所需的化合物的EC50。如图16和17所示，如报告基因检测确定，SIRTl活化剂白藜芦醇[4]与热休克和诱导热休克反应的雷公藤红素都有协同效应。作为一种探测热休克反应活化作用的工具， 制备了含有-188到+150序列、融合到荧光素酶的人源hsp70. 1启动子的HeLa稳定细胞系 (图15，W])。使用该细胞系，研究了调查白藜芦醇对SIRTl的激活作用，是否可以降低热休克反应激活作用的温度阈值。如图16所示，一例在42°C下的热休克诱导15倍记录，而一个在41°C下的热休克诱导的记录只有5倍。用白藜芦醇预处理过提高了在两个温度下的诱导记录，表示SIRTl激活作用与热休克协同并允许较低的温度下激活热休克反应。同样地，如图17所示，人们发现，白藜芦醇可以与协同雷公藤红素，一种已知的热休克反应诱导剂是5 μ M[4]EC50o而1 μ M雷公藤红素仅激活2倍记录，白藜芦醇和1 μ M雷公藤红素组合物对稳定激活作用的诱导记录超过40倍。hsp70. lpr-luc HeLa的稳定细胞系包含从-188至+150的hsp70. 1启动子序列，并包含近端热休克元件(HSE)。这种细胞系的形成曾由Westerheide等述及。(2004 年)。雷公藤红素作为热休克反应和细胞保护作用的诱导剂。J Biol Chem, 2004. 279(53) p. 56053-60，其中的内容作为参考文献纳入本本发明。以每孔15X IO3细胞的密度将HeLa hsp70. lpr-luc细胞接种在白色96孔盘内的IOOyL DMEM加10%胎牛血清的培养基中。细胞在使用或不使用白藜芦醇处理前在在 37°C，5% CO2条件下培养20小时。白藜芦醇用乙醇稀释，并加入Ι.Ομ M到细胞中。两个小时后，在所示温度下，通过将细胞浸没在水浴1小时对细胞进行热休克处理。热休克处理后，将培养盘放回在37°C，5% CO2的孵化其中，在进行荧光素酶检测之前培养18小时。以每孔15X IO3细胞的密度将HeLa hsp70. lpr-luc细胞接种在白色96孔盘内的IOOyL DMEM加10%胎牛血清的培养基中。细胞在使用或不使用白藜芦醇处理前在在 37°C，5% CO2条件下培养20小时。白藜芦醇用乙醇稀释，并加入Ι.Ομ M到细胞中。两个小时后，使用或不使用如所示的雷公藤红素处理细胞(雷公藤红素溶解在DMSO中)。加入雷公藤红素18小时后，用荧光素酶检测发对细胞测定。图例图16. SIRTl激活剂白藜芦醇用热休克增效以激活hsp70. Ipr-LUC受体。图17. SIRTl激活剂白藜芦醇用热休克增效以激活hsp70. Ipr-LUC受体。1. Westerheide, S.D. , et al. , Stress—inducible regulation of heat shockfactor 1 by the deacetylase SIRT1. Science,2009. 323(5917) :ρ· 1063—6.2. Westerheide, S. D.，et al.，Triptolide, an inhibitor of the human heat shock response that enhances stress-induced cell death. J Biol Chem, 2006. 3. ffesterheide, S. D. , et al. , Celastrols as inducers of the heat shock response and cytoprotection. J Biol Chem,2004. 279(53) :p. 56053-60. 4. Howitz,K. Τ., et al. , Small molecule activators ofsirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature,2003. 425(6954) :p. 191—6.虽然本发明已通过其优选实施例进行了具体公开和描述，本领域技术人员应该了解，各种形式和细节变化都将不会偏离本发明附属权利要求的范围。SEQID NO 1
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3权利要求
1.一种调节细胞中热休克转录因子I(HSFl)活性的方法包括修饰在HSF 1的DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述HSFl的活性通过抑制赖氨酸残基的乙酰化作用提高。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述HSFl的活性通过促进赖氨酸残基的乙酰化作用降低。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞是人体细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述残基是赖氨酸80(HSF1 K80)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述HSFl的活性通过抑制HSFlK80的乙酰化作用提高。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述HSFl的活性通过促进HSFlK80的乙酰化作用降低。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述HSF1的乙酰化作用通过供给细胞有效剂量的一种抑制HSF 1的乙酰化作用的试剂抑制，其中所述试剂选自单离沉默调节蛋白、沉默调节蛋白激活剂和组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述HSF1的乙酰化作用通过供给细胞有效剂量的一种抑制HSF 1的乙酰化作用的试剂抑制。其中所述试剂选自单离沉默调节蛋白、沉默调节蛋白激活剂和组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于其单离沉默调节蛋白是沉默调节蛋白I(SIRTl)。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述SIRTl激活剂是供给的。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述HAT抑制剂是供给的。
13.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述HSF1的乙酰化作用通过供给细胞有效剂量的一种促进HSF 1的乙酰化作用的试剂促进，其中所述试剂选自一种沉默调节蛋白抑制剂和一种HAT激活剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述SIRTl抑制剂是供给的。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述SIRTl抑制剂是小分子、核酸或抗体。
16.一种提高对其有需要的主体内HSFl活性的方法，包括抑制所述主体细胞中HSFl的DNA结合域内赖氨酸残基的乙酰化作用。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述赖氨酸残基是HSFlK80或相对应的保守赖氨酸残基。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于一种抑制HSFl乙酰化作用的试剂以一个有效剂量供给所述主体。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述抑制HSFlK80的乙酰化作用的试剂是一种单离沉默调节蛋白、一种沉默调节蛋白激活剂或一种HAT抑制剂。
20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述主体是人类。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于一种SIRTl激活剂是供给的。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于一种HAT抑制剂是供给的。
23.一种降低对其有需要的主体内HSFl活性的方法，包括促进所述主体细胞中HSFl的DNA结合域内赖氨酸残基的乙酰化作用。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述赖氨酸残基是HSFlK80o
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于一种促进HSF1 K80或相对应的保守赖氨酸残基的乙酰化作用的试剂是供给所述主体的。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述HSF1 K80的乙酰化作用通过供给所述主体一种沉默调节蛋白抑制剂或HAT激活剂促进。
27.根据权利要求沈所述的方法，其特征在于所述沉默调节蛋白抑制剂是一种SIRTl抑制剂。
28.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述主体是人类。
29.一种治疗患有与蛋白质内稳态功能障碍有关的病症的患者的方法，包括供给所述患者治疗有效剂量的抑制HSFl乙酰化作用的试剂。
30.根据权利要求四所述的方法，其特征在于所述试剂抑制HSF1K80的乙酰化作用。
31.根据权利要求四所述的方法，其特征在于所述抑制HSF1 K80乙酰化作用的试剂是一种单离沉默调节蛋白、一种沉默调节蛋白激活剂或一种HAT抑制剂。
32.根据权利要求四所述的方法，其特征在于所述与蛋白质内稳态功能性障碍有关的病症是一种损伤性功能失调。
33.根据权利要求四所述的方法，其特征在于所述与蛋白质内稳态功能性障碍有关的病症是一种获得性功能失调。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于所述抑制HSF1乙酰化作用的试剂是HAT抑制剂。
35.根据权利要求32所述的方法，其特征在于所述损伤性功能失调选自囊性纤维化和溶酶体贮积症。
36.一种治疗患有与提高热休克蛋白表达有关的病症的患者的方法包括在治疗上供给所述患者有效剂量的促进HSFl乙酰化作用的试剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述试剂促进HSF1 K80乙酰化作用。
38.根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述促进HSF1 K80乙酰化作用的试剂是一种沉默调节蛋白抑制剂或一种HAT激活剂。
39.根据权利要求36所述的方法，其特征在于所述与提高热休克蛋白表达有关的病症是癌症。
40.根据权利要求39所述的方法，还包括一种化疗药物的供给。
41.根据权利要求39所述的方法，还包括一种放射治疗。
42.根据权利要求39所述的方法，其特征在于所述与提高热休克蛋白表达有关的病症是病毒感染。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于所述病毒感染是由选自肿瘤病毒和RNA病毒的病毒导致的。
44.一种鉴定调节细胞内HSFl活性的试剂的方法，包括供给细胞一种试剂；控制HSFl中DNA结合域的赖氨酸残基的乙酰化作用；其特征在于相对于没有试剂存在时DNA结合域的乙酰化作用的变化显示该试剂调节细胞内HSFl的活性。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于所述试剂抑制DNA结合域的乙酰化作用。
46.根据权利要求44所述的方法，其特征在于所述试剂提高DNA结合域的乙酰化作用
47.根据权利要求44所述的方法，其特征在于所述HSFlK80的乙酰化作用或相应的保守氨基酸是可控的。
48.一种治疗患有与蛋白质内稳态功能障碍有关的病症的患者的方法，包括供给患者治疗有效剂量的抑制HSFl乙酰化作用的试剂结合一种机制不同的蛋白质内稳态调节剂。
49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于所述机制不同的蛋白质内稳态调节剂是一种热休克反应激活剂。
50.根据权利要求48所述的方法，其特征在于所述热休克反应激活剂和HSFl乙酰化作用抑制剂都以一种剂量供给，其复合剂量足以提高热休克反应。
51.根据权利要求48所述的方法，其特征在于所述热休克反应激活剂是一种小分子。
52.根据权利要求48所述的方法，其特征在于所述抑制HSF1乙酰化作用的试剂是一种沉默调节蛋白，或着沉默调节蛋白激活剂是一种单离沉默调节蛋白，一种沉默调节蛋白激活剂或一种HAT抑制剂。
53.一种在细胞内激活热休克反应的方法，包括供给所述细胞一种热休克反应激活剂和一种抑制HSFl乙酰化作用的试剂，其特征在于所述抑制HSF 1乙酰化作用的试剂和热休克反应激活剂的复合剂量足以提高热休克反应。
54.一种激活对其有需要的患者热休克反应的方法，包括供给患者一种抑制HSFl乙酰化作用的试剂和一种热休克反应激活剂，其特征在于所述抑制HSFl乙酰化作用的试剂和热休克反应激活剂的复合剂量足以提高热休克反应。
55.一种药物组合物，包括一种药学上可接受的载体、一种热休克反应激活剂和一种抑制HSFl乙酰化作用的试剂，其特征在于所述抑制HSFl乙酰化作用的试剂和热休克反应激活剂的复合剂量足以提高热休克反应。
56.根据权利要求55所述的组合物，其特征在于所述抑制HSFl乙酰化作用的试剂是HAT抑制剂。
57.根据权利要求55所述的组合物，其特征在于所述抑制HSFl乙酰化作用的试剂是沉默调节蛋白激活剂。
58.根据权利要求55所述的组合物，其特征在于所述抑制HSFl乙酰化作用的试剂是白藜芦醇。
59.根据权利要求55所述的组合物，其特征在于所述热休克反应激活剂是一种雷公藤红素。
全文摘要
本发明涉及用于调节HSF1活性的方法，包括HSF1的DNA结合域乙酰化修饰。
文档编号A61K31/7088GK102369014SQ200980156388
公开日2012年3月7日 申请日期2009年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者B·卡拉米尼, J·安科尔, L·西斯托宁, R·I·莫瑞蒙托, S·韦斯特黑德 申请人:西北大学