专利名称：用于软骨组织修复的组合物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及用于软骨组织修复的组合物及其制造方法，更具体地，混合生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白，以对受损软骨组织进行修复，从而达到允许在组织上进行移植的状态，并且诱导有效的再生。因此在诱导相对快速而有效的软骨修复和再生的同时，使得减少人和动物的手术相关的压力成为可能，并且，结果是，能够大大地提高产品的质量和可信度，并给患者留下好印象。
背景技术：
在很多关节的表面上发现的关节软骨，是一种非常光滑并且光亮的材料，它们的功能是减少关节运动过程中的关节摩擦和磨损。当关节软骨受到损伤时关节软骨间的摩擦就增加了，关节软骨将受到磨损和侵蚀，并且会发生疼痛和功能失调，而且关节的软骨损伤会转变成骨关节炎。关节损伤的原因是外伤如跌倒、直击或者扭伤，或者疾病如关节炎、骨坏死、炎症性关节炎或者剥脱性骨软骨炎，其症状是疼痛、浮肿和具有传染性。近几十年来开展了很多关于关节软骨的生理性再生的研究，来治疗关节软骨损伤，并且有一些治疗方法已经应用。然而，据报道，直到现在，由于关节软骨组织不能再生，对于关节软骨损伤的治疗使用常规的治疗例如物理治疗或者药物治疗。使用手术或者非手术治疗。冷热敷和药物如NSAID，和类固醇的关节内注射是非手术治疗的例子，仅能减轻症状但是不能削弱疾病。补偿性过程如扩创(debriment)、微观断裂、钻孔/磨损关节成形术，自体骨软骨移植 (autologous osteochondroal and transplantation)，软骨细胞移植和关节软骨替换是手术治疗。最近，有一些手术治疗的尝试，那就是，将生物材料施用到软骨受损区域。生物材料和人的身体相合，不会显示任何的排斥。这些生物材料能够代替受损组织和器官或者使其再生，成为正常的组织和器官。因此，增加了对于这些能够用来代替或者再生受损组织和器官的生物材料的关注。人的身体排斥身体内的外来物质。因此，用其他材料来代替一部分人体器官是很难的。由于生物材料和人的身体有生物亲和性所以能够用于医疗手术过程。有两种类型的生物材料，合成的和天然的生物材料，可以用于生产诊断用途和治疗用途的植入式医疗设备。金属、无机材料、陶制品、合成聚合物属于合成生物材料，没有显示排斥但是也没有活性。天然的生物材料如纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和壳聚糖是经过研发并且商品化的材料。组成人体和支撑生命的物质是生物聚合物和细胞。人体中发现的多糖和蛋白是代表性的例子。如果他们没有免疫排斥反应，他们将会处于类似于天然的状态，并被期望用于具有生长功能的人体器官的再生。天然组织能够用作医疗生物材料，其赋予无机和合成的聚合物材料以生物功能。天然组织可以构建周围组织和移植到人体内的无机生物材料间的生物适应性，并且进一步，天然组织能够赋予无机生物材料以生物功能。生物相合的和生物降解的纤维蛋白能够用作天然的粘合剂和抗出血剂。纤维蛋白在伤口愈合过程中在几周内被吸收。据报道，纤维蛋白没有诸如炎症、免疫应答、实质性坏死和纤维增生等副作用。具有成纤维细胞的天然支持者构造的纤维蛋白在伤口愈合中有重要作用。纤维蛋白产品的构想在20世纪70年代提出，在1982年欧洲销售了首批工业化的纤维蛋白产品，并且一直销售至今。最近的研究证明纤维蛋白可以用作组织工程的支撑者， 在一些医疗领域如整形外科、牙科、和神经外科进行了最优化。胶原蛋白是一组蛋白，在真皮层、肌键/韧带、血管、骨头和软骨上被发现。哺乳动物总蛋白的1/3是胶原蛋白。目前已经报道了超过20种不同类型的胶原蛋白，其中，在皮肤，肌腱/韧带和骨头中发现的I型的胶原蛋白的数量大约为总胶原蛋白数量的90%。胶原蛋白由三倍螺旋结构组成，其分子量为300，000道尔顿(每个螺旋为100，000 道尔顿)。最小的氨基酸甘氨酸在胶原蛋白分子的每个第三位上(_GXY-;X和Y是任何的氨基酸)被发现。因此，胶原蛋白中的甘氨酸总量为氨基酸总量的三分之一。胶原蛋白有羟脯氨酸，并且羟脯氨酸的含量为氨基酸总量的10%。羟脯氨酸可以用于胶原蛋白的定量分析。胶原蛋白已经在一些医药领域中使用，如用作止血剂、创伤敷料，人造血管和改善皮肤褶皱的试剂。第一个胶原蛋白止血药Aviten是在1974年研发出来的，是从牛皮肤中提取出的粉末，一直延用至今。将胶原蛋白作为原料使用有三种途径。使用纯胶原蛋白、通过组织的脱细胞/去细胞过程处理得到的处理的胶原蛋白和变构胶原蛋白。纯胶原蛋白抗张强度小，因此尽管它有很高的稳定性和纯度，但是不推荐用于缝合。胶原蛋白比其他的聚合物的抗张强度和抗扯强度低，因此将其他材料如GAG或者生物适合的合成聚合物(PGA/PLA)加入到胶原蛋白中来提高他们的强度。胶原蛋白有很多优点，如低抗原性、高生物适应性和生物吸收性、细胞的粘附性、 细胞生长、细胞诱导分化、血液凝结、止血作用及与其他聚合物的生物适应性。然而，用于维持物理性质和体积的特性是差的，并且纯胶原蛋白很昂贵。纤维蛋白在量、弹性和粘附性方面有中等性质，并且也具有止血作用。因此，纤维蛋白是用于软骨组织修复和再生的有效生物材料。不像其他的间质组织，关节软骨没有血管和神经组织，其自我愈合能力非常有限。 因此，本发明的一个目的是提供通过添加用于软骨细胞培养的培养基成分来用于软骨组织再生的营养物。关节的软骨组织一旦被破坏，它在体内不能正常再生。患者带着剧痛忍受有限的日常生活，并且当它变成慢性的，将会引起致命的骨关节炎，而使得患者不可能正常生活。 在美国和欧洲分别进行了超过500，000例的关节造型术和整体的关节置换手术。因此，需要一个用于软骨受损区域治疗的简单的程序，所述治疗通过使用或者移植生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白进行。在软骨损伤的早期，这些软骨受损区域的治疗方法是非常有效的。并且当在软骨损伤的早期实行这样的治疗时，需要膝盖置换手术的患者的数量将会减少。通过这种预防性治疗，患骨关节炎的患者数量也会减少。在过去没有报道，通过使用生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白胶来进行软骨组织修复的组合物和使用它们用于治疗的方法。
发明内容
本发明用于解决现有技术中的问题。本发明的第一个目的是提供一种由纤维蛋白原和抗蛋白酶肽溶液、凝血酶和一种稳定溶液、以及胶原蛋白溶液组成的用于软骨修复的组合物。第二个目的是通过一种由生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白组成的可移植结构来进行受损软骨组织的有效再生。这种治疗减轻了手术的负担，并诱导了软骨受损区域的再生和复原。第三个目的是这个方法使得软骨受损区域的简单处理成为可能。第四个目的是通过软骨受损区域的早期治疗降低了需要进行关节手术的患者的数量。第五个目的是通过预防性治疗减少需要进行关节手术的患者的数量。第六个目的是提供一种用于软骨组织修复的组合物和制备该组合物的方法，使得提高了质量和可信度的产品给患者留下好印象。为了实现这些目的，本发明提供了一种制备用于软骨组织修复的组合物的方法， 包括步骤(a)在一种抗蛋白酶肽溶液中溶解冻干的纤维蛋白原；(b)在一种稳定溶液中溶解冻干的凝血酶；(c)将浓缩的胶原蛋白溶液与凝血酶和所述稳定溶液进行混合；并将纤维蛋白原溶液(a)放置在双试剂盒(dual kit)的一边，并将含有胶原蛋白溶液的溶液(c) 放置在另一边，然后混合(a)和(c)，然后注射到受损软骨组织中。本发明还提供了使用上述方法制备的用于软骨组织修复的组合物。如上所述，本发明提供了一种由纤维蛋白原和抗蛋白酶肽溶液、凝血酶和一种稳定溶液、以及胶原蛋白溶液组成的用于软骨修复的组合物。本发明提供了通过由生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白原组成的可移植结构来对受损软骨组织进行有效再生的方法，该方法减轻了手术的负担，诱导了软骨受损区域的快速有效的再生和复原。本发明提供了治疗软骨受损区域的简单方法。本发明通过对于软骨受损区域的早期治疗减少了需要进行关节手术的患者的数量。进一步地，本发明通过预防性治疗减少了需要进行关节手术的患者的数量。本发明提高了产品的质量和可信度，给患者留下了好印象。
图1显示了根据本发明的用于软骨组织修复的组合物的生产方法。图2显示了含有根据本发明的用于软骨组织修复的组合物的双试剂盒的应用照片。图3显示了将根据本发明的用于软骨组织修复的组合物应用于动物(猪)的软骨受损区域的照片。图4显示了将根据本发明的用于软骨组织修复的组合物应用于动物(兔子)的软骨受损区域的实验结果的视觉观察的照片。
图5显示了将根据本发明的用于软骨组织修复的组合物应用于动物(兔子)的软骨受损区域的实验结果的组织病理学观察的照片。
具体实施例方式下文中，将会结合附图对本发明的实施方式进行详细描述。图1-5中显示了根据本发明的用于软骨组织修复的组合物和该组合物的制备方法，以及它们的应用。当关于相关已知技术和技术构造的详细说明不必要的干扰了本发明的主旨时，我们对于该详细说明进行了省略。并且本发明中的定义由本发明的内容进行解释，这是因为术语可能通过制造厂商或者消费者的意图进行解释。首先，本发明提供了使用生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白原的固体材料，还提供了为软骨再生的环境提供营养的稳定溶液的制造方法和应用，并且提供了一种用于软骨组织修复的组合物，所述组合物通过以下几个步骤制备。具体地，制备用于软骨组织修复的组合物的步骤由以下组成(a)在抗蛋白酶肽溶液中溶解冻干的纤维蛋白原；(b)在一种稳定溶液中溶解冻干的凝血酶；(c)将浓缩的胶原蛋白溶液与凝血酶和所述稳定溶液进行混合；并将纤维蛋白原溶液(a)放置在双试剂盒的一边，含有所述胶原蛋白的溶液(C) 放置在另一边，然后混合(a)和(c)，并注射到受损软骨组织中。纤维蛋白原的浓度为35-55mg/mL，抗蛋白酶肽的浓度为1，500KIU/mL，凝血酶的浓度为29. 41IU/mL，稳定溶液的浓度为0. 65mg/mL，胶原蛋白的浓度为13. 23mg/mL。在稳定溶液中含有0. 26mg/mL的氯化钙。氯化钙加强的稳定溶液是通过将氯化钙加入到用于软骨细胞培养的DMEM培养基中制备的，并且DMEM培养基含有盐，氨基酸和维生素。在稳定溶液中氯化钙的终浓度为0. 1-0. 5mg/mL。并且在用于软骨组织修复的组合物中氯化钙的终浓度为2. 78-3. l^iig/mL。浓度小于5mg/mL的胶原蛋白通过0. 22um的过滤装置灭菌，然后胶原蛋白在无菌操作下浓缩。胶原蛋白的浓度为5-100mg/mL。本发明中的稳定溶液的制备详细解释如下。-将氯化钙加入到用于软骨细胞培养的DMEM培养基中以制备稳定溶液。DMEM培养基含有盐、氨基酸和维生素。氯化钙的浓度为0. 2-6mg/mL。-在胶原蛋白和稳定溶液中氯化钙的终浓度为0.1-0. 5mg/mL。-在稳定溶液中的氯化钙的浓度是由凝胶化时间和最大压力范围决定。凝胶化时间为3分钟，最大压力在ION以上。-稳定溶液的最小范围是用于培养条件的最小范围，经证实稳定溶液中氯化钙的最大量为0. 5mg/mL。在商业用纤维蛋白胶中的氯化钙的终浓度为2. 78-3. 12mg/mL，能对细胞起作用。
制备浓缩的胶原蛋白采取如下步骤优选使用高度浓缩的胶原蛋白。胶原蛋白(5mg/mL以下)通过0. 22um过滤装置灭菌，然后在无菌操作下浓缩。胶原蛋白的分子量大约为300，000道尔顿，并且胶原蛋白分子长度大约为300nm， 使得当胶原蛋白的浓度高于5mg/mL时很难过滤。胶原蛋白浓缩后为5-100mg/mL。胶原蛋白起始浓度为5mg/mL，浓度能够持续到100mg/mL(可溶并且可测量的浓度)。胶原蛋白使用透析和渗滤浓缩，或者采用在特定的pH和温度下进行离心的方法浓缩。浓缩后的胶原蛋白置于注射器中备用。胶原蛋白、纤维蛋白原和稳定溶液的混合在图2中显示。-将纤维蛋白胶产品中含有的冻干的纤维蛋白原溶解在2cc抗蛋白酶肽溶液中， 然后将溶液置于注射器中。-在2cc稳定溶液中溶解冻干的凝血酶，然后将该溶液置于0.4cc的注射器中。-浓缩的胶原蛋白(3%，3CC)溶液和凝血酶溶液混合，然后将溶液置于2cc的注射器中。-纤维蛋白原/抗蛋白酶肽溶液和胶原蛋白/凝血酶溶液置于双试剂盒中，然后应用于软骨受损区域。-在许多国家中销售有各种纤维蛋白原(纤维蛋白胶)产品，在韩国使用的产品列于表1。表 权利要求
1.一种用于软骨组织修复的组合物的生产方法，包含以下步骤(a)在抗蛋白酶肽溶液中溶解冻干的纤维蛋白原；(b)在稳定溶液中溶解冻干的凝血酶；(c)将浓缩的胶原蛋白溶液与凝血酶和稳定溶液进行混合；将纤维蛋白原溶液(a)加入到双试剂盒的一边，将包含胶原蛋白的溶液(c)加到另一边，然后混合溶液(a)和(c)，并注入到受损的软骨组织中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，纤维蛋白原的浓度为35-55mg/L，抗蛋白酶肽溶液的浓度为1，500KIU/mL,凝血酶的浓度为29. 41IU/mL,稳定溶液的浓度为0. 65mg/mL,胶原蛋白的浓度为13. 23mg/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述稳定溶液进一步含有含有0.^mg/niL的氯化钙的溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述稳定溶液通过将氯化钙加入到用于软骨细胞培养的DMEM培养基中制备得到，而且DMEM培养基含有盐、氨基酸和维生素。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述稳定溶液中的氯化钙的浓度为0.1-0. 5mg/mLo
6.根据权利要求1所述的方法，其中，用于软骨组织修复的组合物中的氯化钙的终浓度为 2. 78-3. 12mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，浓度小于5mg/mL的胶原蛋白通过使用0.22um的过滤装置灭菌，然后在无菌操作下浓缩所述胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，浓缩的胶原蛋白的浓度为5-100mg/mL。
9.一种由权利要求1所述的方法制备的用于软骨组织修复的组合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于软骨组织修复的组合物和其制造方法。为了实现这个目的，本发明包含如下步骤(a)在抗蛋白酶肽溶液中溶解冻干的纤维蛋白原；(b)在稳定溶液中溶解冻干的凝血酶；(c)将浓缩的胶原蛋白溶液与凝血酶和稳定溶液进行混合；将纤维蛋白原溶液(a)加入到双试剂盒的一边，将包含胶原蛋白的溶液(c)加到另一边，然后混合并注射到受损的软骨组织中。在本发明中，组成如上所述，混合生物材料如胶原蛋白和纤维蛋白以使受损软骨组织修复到允许在组织上进行移植的状态，并且诱导了有效的再生，因而在诱导相对快速和有效的软骨修复和再生的同时使得减少人和动物的手术相关的压力成为可能，并且，结果是，能够大大提高产品质量和可信度，给使用它的患者留下好印象。
文档编号A61L27/24GK102573942SQ200980162095
公开日2012年7月11日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年10月23日
发明者吕世根, 张在德, 张晶皓, 朴株姬, 朴炫信, 李赛春, 柳志喆, 金炫助, 金硕中 申请人:世元世龙技术株式会社