专利名称：用于治疗多发性硬化的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及寡肽和融合蛋白及其在多发性硬化的进展过程中参与MBP的结合和催化性降解的表位特异性抗MBP自身抗体(ESAMBPCAA)的失活中的用途。本发明也涉及包含所述寡肽、所述寡肽的组合物和由上述寡肽组成的融合蛋白的药物组合物及其用于治疗多发性硬化的用途。
背景技术：
多发性硬化(下文缩写为MS)是具有多项病理生理学和临床表现和非常复杂病因学的人中枢神经系统的炎性脱髓鞘疾病(Hafler等，2004. J. Clin. Invest. 113 :788-794 ；Kornek等，2003. Brain Res. Bull. 61 :321-326.)。人类中所述疾病的进展导致髓鞘破坏从而最终影响神经传导电脉冲的能力(Schwartz, R. S. , 1993,在Fundamental Immunology, ed. Paul, ff. E. (Raven,纽约)中，第 1033-1097 页)。设想了病毒拟态假说以解释这个病理学的起始(Merkler等，2006. J. Clin.Invest 116:1254-1263.)。然而，目前还没有明确确定所述疾病的真正发生机理(Hohlfeld 等，2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (SuppI. 2) 14599-14606)。已经证实MS患者中一些增殖T细胞针对MBP (Allegretto等，Science, 247,718-721,1990)并且人T细胞可以识别MBP分子上的多个表位(Richert等,J. Neuroimmun23，55-66，1989)。MBP也显示出能够活化一些T细胞而没有抗原提呈细胞参与(Altman等，Eur. J. Immun. 17,1635-1640,1987)。尽管免疫T细胞参与人和所述疾病的实验动物模型中MS的发展和进展的证据被强烈和普遍接受，但是特异B细胞反应对髓鞘破坏的贡献的研究还较少(Klawiter等，2007. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 7 :231-238. ；Nikbin 等，2007. Int Rev. Neurobiol. 79 13-42.)。充分的数据表明大部分MS病例表征为血液中存在针对MBP成分的自身抗体(Reindl 等，1999，Brain, 122，2047-2056 ；Genain 等，1999，Nat. Med. 5，170-175)。而且，高分辨率显微分析在人MS和绒猴MS样疾病中的脱髓鞘斑区域检测到髓鞘特异性自身抗体，表明其对脱髓鞘破坏的直接贡献(Genain等，1999，Nat. Med. 5，170-175)。虽然在MS发病机理中自身抗体的作用的机制还是未知的，但是MBP和髓鞘少突细胞糖蛋白(MOG)抗体被提议为用于MS临床预后的生物标记物(Berger等，2003，N. Engl. J. Med. 349，139-145. 10)。在作为MS动物模型的诱导的实验性过敏性脑脊髓炎的小鼠中发现类似的免疫球蛋白(Fritz等，1983，J. Immunol. 130，191-194.)。在MS活性形式的患者的脑脊液(CSF)中观察到MBP自身抗体滴度增加(Warren等，Ann Neurol 209 =20-25,1986)。临床上，MS表征为疾病活动阶段如急性复发或慢性进展，以及临床缓解阶段。活动期MS与鞘内出现MBP自身抗体的增加水平相关(Warren 等，Ann Neurol 209 :20-25,1986 ；Catz 等，Can J Neurol Sci 13 21-24,1986)。这些抗体在急性复发期间主要以游离(F)形式出现，而在疾病潜伏进展时主要以结合(B)形式出现(Warren等，Ann Neurol 209 :20-25,1986)。使用选择性针对和去除CD20+B淋巴细胞的利妥昔单抗治疗复发缓解型多发性硬化(RRMS)患者在一定程度上是安全和有效的(Stiive, 0.等，Long-term B-Iymphocyte depletion with rituximab inpatients with relapsing-remitting multiple sclerosis.,Arch Neurol. 2009 年 2 月；66(2) :259-61)。根据现有科学背景，近十年期间已经发展了使用完全MBP分子和MBP蛋白及其片段的多个肽代表片段和同系物的免疫调节治疗MS的方法。众所周知，人MBP由170个氨基酸组成。在科学和专利文献中，根据MBP片段的第一个氨基酸残基和从C末端数的最后一个氨基酸残基在全长MBP序列(SEQ ID NO I)中的位置对MBP片段标记。在WO 9612737中，提供了多种用于预防和治疗MS的具有“T-细胞活性”(即影响免疫T细胞或其亚群的活性或功能的能力)的肽(人MBP片段)，并且已经公开了所述肽适合用于治疗用途。为了展示MBP中的T细胞识别表位，已经测试了 16个短的(长度各约20个氨基酸)和另外3个长的(82-100、83-105、141-165)彼此“重叠”的肽序列刺激MS患者外周血细胞体外增殖的能力。发明人提供的肽的氨基酸结构对应于下面的MBP片段
II-30；11-29 ；11-31 ；83-105 ;82_105 ;82_104 ;80_98 ;82_102 ;80_104 ;80_102 ;111_130 ；
III-129;141-165 ;101-125。而且，这些作者公开了这些肽与现有技术已知的具有MBP T细胞活性的其它肽的组合，其它肽如:13-25 ；31-50 ；61-80 ;82_92 ;82_96 ;82_97 ;82_98 ；82-100 ；82-100 ；83-100 ;83_101 ;84_97 ;84_100 ;85_100 ;86_105 ;87_99 ；87-99[91K >A] ；88-100 ；88-99 ；82-100 ;111_135 ；122-140 ；139-170 ；141-160 ;142_166 ;142_168 ；146-160 ;153-170。Wraith D. C.和共同作者提供了一种用于筛选能结合MHC I类或II类分子而不需要进一步抗原处理的致耐受肽的方法，以及在药物组合物中使用这些肽用于治疗和/或防止多发性硬化。这些作者已经合成和使用了对应于人MBP的片段1-24 ； 15-39 ;30_54 ；45-69 ；60-84 ;75_99 ;90_114 ;105_129 ;120_144 ;135_159 ;150_170 ;131_145 ;132_146 ；133-147 ；134-148 ;135_149 ；136-150 ;137_151 ;138_152 ;139_153 ；140-154 ;141_155 ；142-156 ；143-157 ； 144-158的多种肽，用于鉴定被MS患者外周血细胞识别的人MBP表位，然后用于研究这些肽结合MHC I类或II类分子的能力。选择了对于调节免疫T细胞功能有活性的多种短肽，并且将所述短肽用于MS治疗134-148 ；135-149 ;136_150 ；137-151 ；138-152 ;139_153 ;140_154 ；30-44 ;80_94 ;83_99 ;81_95 ;82_96 ;83_97 ;84_98 ； 110-124 ； 130-144 ；131-145 ;132_146 ; 133-147 (参见申请EP1918298、US 11/979，224、WO03/64464)。在US2005209156中，已经公开了选自具有氨基酸序列AGAPVVHPPLAIVTPAT包括其替代、添加或缺失的MBP片段(75-98)的肽用于MS治疗。在美国专利No. 5858980中，MBP片段84-102和143-168被鉴定为包含在MS发展中有活性的MBP的免疫显性T细胞识别表位，以及提供了包含氨基酸序列ENPVVHFFKNIVTPRT (MBP 片段 83-98)及其类似物和 AQGTLSKIFKLGGRD (MBP 片段 146-160)的肽，以及包含所述肽的药物组合物。Warren K. G.与共同作者提供了用于中和抗MBP自身抗体、具有对应于下面的人 MBP 的氨基酸残基61-75 ；64-78 ;69_83 ;75_95 ;69_83 ;80_97 ;91_106 ;84_93 ;85_94 ；86-95 ；87-96 ;82_98的可溶性的合成肽。这些肽与MBP序列的61-106位氨基酸残基重叠(参见WO 98/45327)。选择的肽之一(称为MBP 75-95)显示体外和体内(MS患者血液中)结合MBP游离抗体的能力。相反，不结合的对照肽MBP 35-58对MS患者中游离和结合抗体没有作用。在临床试验中已经评价了一些基于MBP的肽和DNA疫苗含有完全MBP序列的基因的 Bayhill Therapeutics 的 DNA 疫苗 BHT-3009 ;来自 Neurocrine Biosciences 的改变的肽配体GP77116和NBI-5788 ;来自Autoimmune(R)的基于完全MBP序列的口服致耐受性组合物Myloral。然而，由于严重的不利事件或不能减慢MS进展，这些治疗剂没有取得显著成功(Hohlfeld 等，Proc Nat Acad. Sci U S A. 2004 年 10 月 5 日，101 (Suppl. 2)14599-14606.)。现在，在临床试验II期中正在广泛研究对应于MBP的氨基酸残基82-98 (DENPVVHFFKNIVTPRT)并且编码为MBP8298的上述合成肽用于治疗进展型多发性硬化。所述肽以每6个月500mg的剂量静脉施用。已经显示对MBP8298治疗的应答者是仅具有 HLA 亚型(heliotypes)DR2 和 / 或 DR4 的患者(Warren, K. G.等，European Journal ofImmunology, 2006, vol. 13, No 8,第 887-895 页)。 上述MBP 84-102片段(美国专利No. 5858980)用作制备临床试验I期中继发进展型MS的治疗剂的活性成分。根据扩展残疾状态量表，九孔柱试验，通过磁共振成像诊断的新损伤测定(Goodkin, D. E.等，Neurology 2000, vol. 54,第 1414-1420 页)没有检测到治疗效果。因此，寻找和选择具有针对MS治疗活性的寡肽、MBP新片段是艰巨的任务，并且，即使在广泛的临床前体外和/或体内试验的基础上，本领域技术人员预先不能预测相对于MS治疗的这种寡肽的药学性质。通过发现参与MS发展和进展的新的免疫病理学机制，可以完成这种新的有效的肽的鉴定和选择。早期我们已经提供如下证据在MS患者血液中循环的小部分抗MBP自身抗体显示对MBP分子的位点特异性蛋白裂解切割，并且代表髓鞘破坏和MS进展的新的免疫病理学机制(Ponomarenko 等，Immunology Letters 103, 2006,第 45-50 页)。因此，本发明的目的是确定能中和在多发性硬化进展期间参与MBP的结合和催化性降解的表位特异性抗MBP自身抗体的新的寡肽(ESAMBPCAA-表位特异性抗MBP催化性自身抗体)，和使用这些新的寡肽治疗MS的新的有效方法。通过提供中和ESAMBPCAA的新寡肽部分(寡肽、由这些寡肽和这些寡肽的片段组成的融合蛋白)、包含所述寡肽和融合蛋白的药物组合物，可以实现这个目的。令人惊讶地，尽管ESAMBPCAA仅代表MS中小部分循环抗MBP自身抗体，本发明的发明人已经发现中和ESAMBPCAA的包含短至SEQ ID NO 2的6个氨基酸残基的序列的寡肽在治疗MS中表现意想不到的高效力。在阅读下面本发明的详细描述后，本发明的其它优点和方面将变得显而易见。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供具有氨基酸序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO:2)的寡肽(I)。在进一步的实施方式中，本发明提供包含SEQ ID NO :2中的一个或多个氨基酸序列改变的寡肽，其中，所述寡肽包含SEQ ID NO :2的至少6个连续的氨基酸残基，并且能结合ESAMBPCAA。在又进一步的实施方式中，本发明提供寡肽I的片段或包含SEQ ID NO 2的一个或多个氨基酸序列改变的寡肽I的片段，其中，所述片段具有至少6个氨基酸残基的长度并且能结合ESAMBPCAA。在进一步的实施方式中，本发明提供一种包含作为活性成分的治疗有效量的寡肽和制药学可接受载体或稀释剂或药物递送系统的药物组合物，所述寡肽是以下任意一种-具有氨基酸序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO 2)的寡肽 I ;-包含SEQID NO :2的一个或多个氨基酸序列改变的寡肽，其中所述寡肽包含SEQID NO :2的至少6个连续氨基酸残基并且能结合ESAMBPCAA ；-具有氨基酸SEQID NO :2的寡肽I片段或包含SEQ ID NO :2的一个或多个氨基酸序列改变的寡肽片段，其中，所述片段具有至少6个氨基酸残基长度，并且能结合 ESAMBPCAA。在另一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的作为有效成分的治疗有效量的具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的寡肽I或其片段，或一种包含SEQ ID NO :2的一个或多个氨基酸序列改变的寡肽或其片段，并且进一步包含选自具有SEQ ID NO 3的寡肽II和具有SEQ ID NO 4的寡肽III的至少一种寡肽。在另一个实施方式中，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由一种或多种具有选自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的序列的肽或其片段组成，所述肽或其片段以任何顺序通过肽或非肽接头彼此顺序连接，其中所述融合蛋白包含至少一种SEQ IDNO 2的寡肽或其片段。在优选的实施方式中，根据本发明的融合肽由序列SEQ ID NO :2的片段组成，所述片段具有至少6个氨基酸残基的长度，并且通过肽或非肽接头彼此顺序连接。在本发明进一步的实施方式中，提供了一种用于治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效剂量的本发明的寡肽或其片段或融合肽或药物组合物。在本发明具体实施方式
中，用于治疗多发性硬化的方法包括将患有多发性硬化的患者的血液暴露于有效剂量的本发明的寡肽或片段或融合蛋白或药物组合物。在另一个实施方式中，提供了本发明的寡肽或融合蛋白用于制备用于治疗多发性硬化的药物的用途。
图I显示完整的人MBP分子的氨基酸序列。大写字母代表人MBP的氨基酸残基。也对应显示部分MBP-对应于本发明的寡肽(SEQ ID N02)的氨基酸序列以及具有氨基酸序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的寡肽的氨基酸序列。这些部分MBP-氨基酸序列用黑线框起。图2显示在ESAMBPCAA存在下MBP的降解，以及在不同MBP肽片段存在下降解的抑制(图的水平行对应于第一个氨基酸残基和从C末端数的最后一个氨基酸残基在全长MBP序列中的位置)。图3说明通过包含MBP片段43-68的氨基酸序列的不同合成寡肽抑制了ESAMBPCAA活性。横轴——抑制测定中使用的寡肽的浓度；纵轴——相对的ESAMBPCAA活性(对照测定(PBS)中ESAMBPCAA活性被视为I)。寡肽的编码在实施例3中表明。图4说明患有实验性过敏性脑脊髓炎的DA大鼠通过本发明的寡肽和融合蛋白处理的MDS积分的抑制。DA大鼠中进行的EAE在第24天MDS积分抑制。各组大鼠的最大临床积分、中位数和95%可信区间。图5说明在进行的实验性MS (泰勒氏病毒感染)中寡肽组合对MDS积分的抑制。
具体实施例方式定义如文中使用的，术语“寡肽”指包含通过肽键连接的多至约20个氨基酸残基的任何分子，即术语“寡肽”表示长度为多至20个氨基酸的多肽。术语“寡肽”包含寡肽及其盐。合适的盐包括钠盐或钾盐或乙酸盐或磷酸盐。
如在本说明书中使用的，术语“寡肽”包含具有特定氨基酸序列的“寡肽”及其功能性变体。所述功能性变体包括特定序列的寡肽的任何片段，其中，所述片段具有6-20个氨基酸长度，条件是其保持结合ESAMBPCAA的能力。如在本说明书中使用的，术语本发明的寡肽的“片段”包含至少约6个、优选至少约8个、优选至少约12个、更优选至少约14个、以及最优选至少约16个或更多个连续氨基
酸残基。进一步预期的是通过改变母本寡肽氨基酸序列获得的本发明寡肽的变体。这种改变可以包含一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加，条件是得到的变体包含母本序列的至少6个连续氨基酸并且能结合ESAMBPCAA。如在本说明书中使用的，术语“融合蛋白”指的是与另一种寡肽或其片段融合的寡肽或其片段，各融合部分通过肽键与另一部分直接连接(一种寡肽的N末端氨基基团(NH2)连接到另一种寡肽或其片段的C末端的羧酸基团(COOH))或可选地通过接头连接。“接头”可以选自“肽接头”或“非肽接头”。“肽接头”可以由包含约I至约20个氨基酸、彼此通过肽键线性连接并且可以任选包括用于蛋白酶分裂位点的序列的序列组成。本文中使用的术语“非肽接头”指的是除肽接头外，具有两个或更多个反应性基团的任何连接部分。优选的接头是非肽聚合物。用作本发明的接头的非肽聚合物是在两端均携带反应性基团的聚合物，所述反应性基团均能独立地结合寡肽的反应性基团，其中所述寡肽的反应性基团的例子包括末端氨基或末端羧基、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基。聚合物的反应性基团包括醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基、酮基、乙烯砜基、硫醇基、酰肼基、羰基二咪唑基(⑶I)、硝基苯基碳酸酯基(NPC)、trysylate基、异氰酸酯基和丁二酰亚胺衍生物。丁二酰亚胺衍生物的例子包括丁二酰亚胺基丙酸酯(SPA)、丁二酰亚胺基丁酸(SBA)、丁二酰亚胺基羧甲酯(SCM)、丁二酰亚胺基丁二酰亚胺(SSA)、丁二酰亚胺基丁二酸酯(SS)、丁二酰亚胺基碳酸酯和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。非肽聚合物末端的反应性基团可以相同或不同。例如，所述聚合物可以在一端具有马来酰亚胺基并在另一端具有醛基。低分子量接头包括碳二亚胺或戊二醛。如在本说明书中使用的，术语“ESAMBPCAA”指的是在MS患者血液中循环的小部分自体免疫球蛋白分子，其结合髓鞘碱性蛋白并催化MBP分子位点特异性蛋白水解裂解。如在本说明书中使用的，术语“治疗”指的是由主治医生或任何本领域技术人员通过任何常规方法评价，向患有疾病的受试者施用疗法、制剂、化合物或组合物以降低、减轻或消除正在治疗的状况的至少一种症状。如在本说明书中使用的，术语“中和、失活、抑制”表示如用特定合适的测试系统测定的降低特定活性。如在本说明书中使用的，“有效量”是指在施用时，能降低、减轻或消除多发性硬化的至少一种症状的如上所述的寡肽、其片段或融合蛋白的量。此外，有效量表示能降低或预防多发性硬化状况的量。基于我们以前的工作(Belogurov等，The Journal of Immunology, 2008,180 1258-1267)，发现了参与MS患者中髓鞘碱性蛋白的识别和降解的自身抗体新的类型。这些催化活性抗体代表非常小部分的抗MBP抗体，然而，发现其催化活性与MS的进展状态相关。因此，抗MBP自身抗体介导MBP蛋白质水解的量化可作为MS的新生物标记物。令人惊奇地，尽管ESAMBPCAA仅代表MS中小部分循环抗MBP自身抗体，本发明的作者已经发现对ESAMBPCAA具有强中和活性的某些寡肽证实在人和完善的多发性硬化的动物模型中的MS治疗中具有意想不到的高效力。根据本发明，提供了具有氨基酸序列GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO 2)的寡肽。这个序列对应于人MBP的氨基酸序列46-62， 下文称为“MBP 46-62”。所述寡肽能抑制ESAMBPCAA。寡肽GGDRGAPKRGSGKDSHH的片段和功能性变体组成本发明优选的实施方式之一。在使用寡肽GGDRGAPKRGSGKDSHH的一系列截短形式进行的ESAMBPCAA抑制测定的基础上，确定了寡肽片段为保持其生物学活性所需要的的最小数量的氨基酸。因此，根据本发明，寡肽GGDRGAPKRGSGKDSHH的片段或功能性变体必需保持SEQ ID NO 2的至少6个连续的氨基酸残基。基于公开内容，本领域技术人员容易经验性地确定可以对寡肽序列GGDRGAPKRGSGKDSHH进行何种改变，而不影响肽的ESAMBPCAA抑制活性。另一方面，本发明提供了分别具有序列GFGYGGRASDYKSAHK (SEQ ID NO : 3)和QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(SEQ ID NO 4)的两种寡肽。这些肽包含本领域公知的由免疫T细胞和/或来自MS患者的“常规”(非蛋白质水解)抗MBP自身抗体识别的MBP表位。本发明人出人意料地发现在治疗人的多发性硬化和阻止(或降低)建立的MS实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)动物模型的发展中，这些寡肽(SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4)协同增强本发明寡肽(SEQ ID NO 2)的效力。与寡肽(SEQ ID NO 2)相比，尽管对ESAMBPCAA具有低抑制活性，当向动物和人共施用时，这两种寡肽增强GGDRGAPKRGSGKDSHH寡肽的治疗效果。虽然不希望被任何理论限制，可以假设这是由于以下事实几种免疫机制一免疫T细胞功能和自身抗体介导的MBP水解的同时调节，可以提供增倍的治疗效果。因此，提供了包含寡肽SEQ ID NO :2、其片段或功能性变体和序列SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的两种寡肽中至少一种的药物组合物。在本发明的进一步的实施方式中，SEQ ID NO :2的寡肽、其片段或功能性变体彼此连接以形成融合肽。这种融合肽包含多个拷贝的ESAMBPCAA的失活部分。在本发明进一步的实施方式中，寡肽(SEQ ID NO 2)或其片段或功能性类似物和寡肽(SEQ ID NO 3)或其片段和寡肽(SEQ ID NO 4)或其片段以任意顺序彼此连接以形成融合肽。因此，本发明的融合肽可以包含多个重复拷贝的寡肽(SEQ ID NO 2)的ESAMBPCAA失活部分和寡肽(SEQ ID NO 3)表位和寡肽(SEQ ID NO 4)表位。本发明进一步提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的寡肽(SEQ ID NO 2)或其片段或功能性变体或融合蛋白和药学可接受载体或稀释剂和/或药物递送系统。药学可接受载体的例子是本领域公知的，包括例如生理盐水。药物递送系统的例子也是本领域公知的，包括例如脂质体或合成的聚合物纳米颗粒。本发明的寡肽可以根据合成具有根据公开的式子的寡肽的现有方法制备。融合蛋白可以通过重组DNA技术制备。如本发明公开的，知道选择的融合蛋白的序列，通过常规的已知的合成DNA序列的方可以制备合适的DNA序列。可以将这样制备的DNA序列克隆至合适的克隆载体中，并且用于转化合适的宿主细胞以产生重组肽。上述的所有方法都是常规的并且对本领域技术人员是公知的。本发明进一步提供一种用于治疗多发性硬化的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效剂量的寡肽或片段或融合肽、或包含寡肽或片段或融合肽的药物组合物。用于治疗MS的寡肽或融合蛋白的治疗剂量可以是约0. Olmg每千克体重至约10. Omg每千克体重；所述组合物可以静脉内、皮下、鞘内施用。在本发明的一个实施方式中，所述组合物经口向目标施用，被称为“粘膜递送途径”施用。所述组合物可以根据需要，可以作为单次剂量 或连续剂量施用。本发明特别参照其优选实施方式进行了详细描述，下述实施例用于说明但不限制本发明。实施例实施例I. ESAMBPCAA——结合多发性硬化患者血液中髓鞘碱性蛋白并且催化MBP分子的位点特异性蛋白水解裂解的自身免疫球蛋白分子的检测使用24名没有接受类固醇或非类固醇抗炎药物治疗的MS患者(17-54岁，平均年龄32岁)的血清进行抗MBP自身抗体的纯化和表征。MS诊断被证实和确定，并且根据Poser/ s疾病进展分类，使用临床、免疫学和MRI数据计算EDSS (扩展残疾状态量表)值(Poser 等，Clin Neurol Neurosurg 2001 ;103 :1-11.)。通过三次重复50%硫酸铵沉淀，接着通过在G蛋白-琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences)上亲和层析从血清中分离免疫球蛋白(IgG)。然后对包含IgG的部分用含0. 05% NaN3的PBS或TBS于4°C进行透析。通过ELISA对IgG的量进行量化和标准化。通过电泳，接着进行银染色、在非还原条件下免疫印迹以及通过表面增强激光解析/电离(SELDI)质谱分析法评价IgG纯度。进一步在固定有MBP的NHS-琼脂糖凝胶(Amersham)柱上通过抗原亲和层析分离IgG,其纯度通过电泳接着通过银染色技术进行评价。根据Miller (Miller 等，1996. Experimental autoimmune encephalomyelitis inthe mouse.在 Current Protocols in Immunology ；J. E. Coligan, ed. Wiley,纽约，第 S19页中)从牛脑制备MBP。产生的蛋白质通过反相HPLC在柱C410/250(Mashery-Nagel，德国)上纯化。通过抗MBP自身抗体的MBP水解如下进行评价纯化抗体(0. I-Imkg)在含l_2mkgMBP的终体积12. 5mkl PBS、0. 02% NaN3中于37°C孵育14小时。样品与Laemmli ' s缓冲液混合。在Tris-甘氨酸和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液系统中通过SDS-PAGE观察MBP降解的程度。对于定量MBP降解测定，将MBP (IOmkM)与在0. Iml PBS,0. 02% NaN3中的抗体(60nM)于37°C孵育12小时。通过加入10% TFA达到pH 2. 5终止反应。将样品进一步在柱C44. 0/150 (Waters)上层析。不裂解的MBP的量通过监测280nm处吸光度进行计笪结果在表I中显示。 表I :24名多发性硬化患者的临床状态和通过ESAMBPCAA的MBP水解的对应速率
权利要求
1.一种寡肽，具有氨基酸序列 GGDRGAPKRGSGKDSHH(SEQ ID NO :2)。
2.权利要求I的寡肽，包含SEQID NO 2的一个或多个氨基酸序列变化，其中，所述寡肽包含SEQ ID NO 2的至少6个连续氨基酸残基，并且能结合抗髓鞘碱性蛋白水解自身抗体(ESAMBPCAA)。
3.权利要求I或2任一项所述的寡肽的片段，其中，所述片段具有至少6个氨基酸残基的长度，并且能结合抗髓鞘碱性蛋白水解自身抗体(ESAMBPCAA)。
4.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求I或2任一项所述的寡肽或根据权利要求3所述的片段作为活性组分，和药学可接受的载体、赋形剂或药物递送系统。
5.权利要求3所述的药物组合物，其中，所述药物组合物进一步包含选自具有SEQIDNO 3和SEQ ID NO 4序列的寡肽中的至少一种寡肽。
6.一种融合肽，由SEQ ID NO :2的片段组成，具有至少6个氨基酸残基的长度，并且通过肽或非肽接头彼此顺序连接。
7.一种融合肽，由选自通过肽接头或非肽接头以任何顺序彼此顺序连接的选自SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4或其片段的序列的一种或多种肽组成，其中，所述融合肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO 2或其片段的至少一种寡肽。
8.—种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求6或7任一项所述的融合蛋白作为活性组分，和药学可接受载体、赋形剂或药物递送系统。
9.一种治疗或预防需要这种治疗的受试者中多发性硬化的方法，其中，所述方法包括向受试者施用根据权利要求4、5或8中任一项所述的组合物。
10.根据权利要求4、5或8中任一项所述的组合物在制备用于治疗多发性硬化的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了新的寡肽、寡肽组合物和由上述寡肽组成的融合蛋白。所述寡肽与人髓鞘碱性蛋白(MBP)的氨基酸序列的选择部分的氨基酸序列同源，并且能通过结合并失活在多发性硬化进展过程中参与结合和催化性降解MBP的表位特异性抗MBP自身抗体(ESAMBPCAA)而改善多发性硬化的进展。
文档编号A61K39/00GK102781465SQ200980162867
公开日2012年11月14日 申请日期2009年10月12日 优先权日2009年10月12日
发明者A·A·别洛古罗夫, A·G·哈比博夫, N·A·波诺马连科 申请人:生命生物实验室有限公司