激光制备纳米药物制剂的方法

专利名称：激光制备纳米药物制剂的方法
技术领域：
本发明涉及难溶性药物纳米粒的制备方法。
背景技术：
难溶性药物制剂一直是药剂工作者的研究热点，由于该类药物在水性介质中溶解 性差，致使其在体液中有效浓度低，不仅难以透过生物膜而影响药物疗效，同时也给药剂制 备带来不便。应用现状对于很多溶解度低但疗效佳的药物，制剂常用制备工艺包括增溶、脂质 体包合、(微)乳化、环糊精包裹、嵌段共聚物胶束包裹、水溶性前药、天然高分子包合以及 “纯药物”纳米粒等。目前，纳米粒制备技术可分为3类机械粉碎法、物理分散法和化学合成法。除传 统的一些机械粉碎设备的改进，如振动磨、气流粉碎机、超声喷雾器等外，一些新的机械粉 碎技术也逐渐被用于药物纳米粒制备，如超临界流体技术、超临界流体-液膜超声技术、高 压均质法-气穴爆破技术等先进技术及相关设备。近年来上述大部分药物制剂纳米化方法 都有了长足的发展，但很多依然停留在实验室的研究阶段，尚未实现工业化生产。主要原因 在于现有技术的一些局限性。脂质体脂质体是由亲脂性药物与脂质体内层是靠范德华力结合而产生的给药系 统。其稳定性受温度影响较大，如果作为注射给药还存在着不稳定，易泄漏，成本高，大生产 困难等问题。目前国内紫杉醇脂质体注射剂频频发生质量问题，使得本类制剂的临床应用 受到明显限制。(微)乳化给药系统对于粒径低于lOOnm的纳米级微乳，其制备处方除了水相和油相外，尚需要应用 大量的乳化剂、助乳化剂。在药物制剂尤其是注射剂中大量乳化剂对机体的刺激性或毒性 问题引人关注[2]。粒径在lOO-lOOOnm的亚微乳，制备时物料往往需要倾入高压乳勻机内 乳化，该过程易出现由高压引起的系统温度升高，由此对敏感药物的稳定性存在隐患。环糊精包合物制剂环糊精类药用因其独特的“笼”状结构-外部亲水、内部疏水而备受药剂学界瞩 目。其中羟丙基环糊精由于水溶性大、毒性小，应用最为广泛。但作为一类新开发的药 用辅料，其制剂尤其是静脉用制剂的长期安全性值得详细考察。有关资料显示静脉注射羟 丙基环糊精的不良反应主要表现为肾毒性和溶血性。细菌和哺乳动物基因突变测定和 染色体畸变试验可知，羟丙基环糊精可能具有一定的致畸和致癌性。从FDA批准的伊 曲康唑注射液说明书的警告项下可知，羟丙基环糊精主要在肾脏代谢，特别是该辅料 的主要杂质环糊精的肾毒性较大，所以肾功能不全的病人应慎用。此外羟丙基环 糊精可导致大鼠胰腺癌的产生，但在小鼠的致癌性试验未见发现[3]。研究显示国产羟丙基
环糊精的45%水溶液0. lmL即引起家兔2%红细胞悬液溶血，证明其溶血作用不可轻 视。强生公司伊曲康唑静脉注射液含羟丙基环糊精40%，临床试用时用控制滴速至
3lmL/min的方法缓解这个问题。嵌段共聚物胶束给药系统嵌段共聚物是指在单一线性分子中存在两种或两种以上结构不同的链段，可根据 需要合成具有特定化学结构、分子量的共聚物。具两亲性的嵌段共聚物在溶液中可自主装 成特定的超分子有序聚集体-胶束。其制备方法主要有物理法和化学法。该类高分子胶束 具有亲水性外壳和亲脂性内核，以此结构完成对药物的增溶和包裹。作为一种新型给药系统，嵌段共聚物胶束在制药领域具有重大潜力，但目前存在 的问题也很多。在合成方面，共聚物的纯度和分子量分布范围等因素均限制了其在药物制 剂中的应用。再者，高分子中亲水性片段的用量和分子量、药物的晶型和分子量、胶束粒径 的大小及环境PH值等均会影响嵌段共聚物胶束的释药特性。用药后在体内配置方面，常用 高分子材料降解时间长，可在体内蓄积，引发辅料导致的制剂毒性。另外，物理方法制备的 胶束还存在药物突释的问题；化学方法制备的胶束由于经历化学反应，可能影响药物本身 的结构和药理活性；热敏胶束存在释药准确性的问题；共聚物胶束在亚细胞的靶向性方面 也有待确证。水溶性前体药物将水溶性集团与难溶性药物中活度高的部位通过化学反应生成的新的衍生化合 物，该类化合物水溶性较活性原药明显增大、不具备原药的药理活性，但在机体内经转化后 释放出活性原药。这种转化可以是自发的，也可以是因水解或酶催化引起的。前药的修饰 大致分为小分子衍生，如无机酸碱、有机酸碱，以及水溶性高分子支载。前体药物的开发有 两个基本要求一，给药后，在机体内发生次级代谢以前能够迅速转化为活性原药。二，前药 必须具备合适的物理化学稳定性。否则可能导致两种后果稳定性差的前药部分降解后将 导致活性原药在给药前就沉淀析出，这个问题对于水溶性极差的原药显得尤其重要；或是 稳定性过强，前药在体内进行生物转化的比例过低，在治疗部位的活性原药浓度不能达到 治疗水平。由此可见，水溶性前药的设计需要同时考虑至少两个以上相互矛盾的因素。天然高分子包裹通过高压乳勻等手段，选用天然高分子尤其是人体内源性高 分子，如人血白蛋白，对难溶性药物进行纳米包衣，成为难溶性药物制剂研究的一个新 热点。2005年美国FDA批准的注射用紫杉醇白蛋白微粒(paclitaxel protein-bound particles, ABI-007/商品名Abraxane)是其中具有代表性的成功例证。Abraxane属于白蛋白包衣纳米制剂，是一种新的、用人血白蛋白作为载体的紫杉 醇纳米微粒冻干剂，这种药物的制备通过先将药物溶解于有机溶剂中，再利用高压勻浆技 术将紫杉醇和人血白蛋白制成紫杉醇白蛋白纳米颗粒悬浮液(微粒直径130 150nm)。溶 解度较原药大大提高，且因不使用原药注射液中导致强过敏反应的辅料，无需提前给药预 防其过敏反应，可以采用标准输注导管、并可以高剂量短时间内静脉给药，给医患双方带来 明显的便利和安全。然而，研究人员又发现Abraxane在制备中存在不足由于单纯依靠人血清白蛋白 分子间的二硫键在高压和高剪切力作用下重排而是蛋白质分子间交联，高压勻质的时间较 长，一方面药物稳定性受到影响，特别是紫杉醇等热不稳定性药物易降解，高压勻质器械的 损耗也很大；另一方面白蛋白中的二硫键数目有限，故在药物纳晶周围蛋白质分子间重排 交联的比例较小，形成的外壳不稳固，一定时间内(如24小时)仍会聚集，不利于稳定的生产。由此提出新型蛋白稳定的纳米制剂，通过采用安全有效的含巯基或二硫键的物质，帮助 蛋白质分子间的二硫键在高压高剪切力作用下重排而是蛋白质分子间加速交联和提高交 联比例。“纯药物”纳米粒由于上述多种纳米方法中都要采用高压勻质器械，因而难以避 开产热过程。对难溶性热敏药物而言无疑是极大的挑战，所以不含任何赋形剂的“裸药”纳 米粒子应运而生。该剂型是加入适宜表面活性剂的纳米级“纯药物”的稳定胶状分散系统， 又被称为“纳米混悬剂”(nanosuspensions)。这类制剂与传统意义上的纳米粒具有概念上 的区别，后者属于基质骨架型纳米系统。“纳米混悬液”的制备大都采取上述方法。最近有 中国专利报道通过溶剂法制备“纯药物”纳米粒的新工艺。具体技术方案如下1)将药物 溶于第一溶剂(良溶剂)中形成溶液，2)把溶液与第二溶剂(非良溶剂，一般为水)混合 形成预混悬剂，3)对预混悬液施加能量形成平均有效粒径小于2 ym的纳米粒，4)对此纳 米粒进一步制剂加工。据称，该纳米混悬剂的制备具有工艺简单、制剂稳定性好的特点，纳 米粒有被动靶向和缓控释作用。其最终产品的粒径随着药物和后处理方法的不同大致在 100-1000nm, 50_200nm，70_600nm，80_800nm 之间波动。

发明内容
本发明的目的是提供一种激光制备纳米药物制剂的方法，以克服现有技术存在的 上述缺陷。本发明的方法，包括如下步骤将难溶性药物与辅料的水性混悬液，经过激光辐射，获得含有纳米粒子的混悬液， 其中所述的纳米粒子的粒径为30-300nm ；所述纳米粒子是结晶体或无定型化合物，或两者的混合物；所述难溶性药物包括但是不限于紫杉醇、足叶乙苷、伊曲康唑或姜黄素；所述辅料包括但不限于有机酸、弱碱、糖醇类、多糖类、聚醇类、表面活性剂或纤维 素类中的一种以上；所述有机酸选自柠檬酸、枸橼酸、海藻酸、酒石酸、草酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲 酸、水杨酸或咖啡酸等中的一种以上；所述弱碱选自碳酸氢钠、海藻酸钠或三乙醇胺等中的一种以上；所述糖醇类选自D-海藻糖、D —山梨醇、海藻酸钠、右旋糖苷40、D_半乳糖、乳糖、 葡萄糖、甘露醇或木糖醇中的一种以上；所述多糖类选自阿拉伯胶、糖原、淀粉、葡聚糖或壳聚糖及其衍生物中的一种以 上；所述纤维素类选自甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、丙基纤维素(PC)、羟甲基 纤维素(HMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙甲基纤维素(HPMC)或羧甲基 纤维素(CMC)等中的一种以上；所述聚醇类选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙二醇甲醚(MPEG)、聚对苯 甲酸(PBG)或聚乙二醇共聚物等中的一种以上；所述表面活性剂选自磷脂类、胆酸盐类、吐温80或泊洛沙姆188等中的一种以 上；
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所述辅料和难溶性药物的质量比范围为10 1-1 10 ；中所述水性混悬液可以包括但不限于蒸馏水及水性缓冲溶液，如磷酸盐缓冲液、 碳酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液等；所述激光辐射所用波长为21nm 700 y m ；所述激光辐射所用辐射宽度为10fs 100ns ；所述激光辐射所用能量密度为5 u J/cm2 2000mJ/cm2 ；所述激光辐射所用重复比率为0. 001Hz 1000Hz ；激光辐射是通过激光辐射仪进行的，所述激光辐射仪可采用市售产品，如德国 InnoLas公司的Nd:YAG三倍频紫外固体激光器SpitLight2100_10 ；本发明采用一种激光纳米化技术，利用特定波长的激光束处理难溶性药物溶液， 通过激光辐射的原理将难溶性药物在水性溶液中微粒化，成为“预纳米制剂”。该“预纳米 制剂”可以根据药物理化性质经过进一步的制剂过程，制备成为经注射、口服、黏膜给药或 皮肤局部给药系统。该激光纳米工艺完全避免了有机溶剂的污染和高压高剪切过程对药物 的温度影响。且在整个纳米化过程中，操作所用器械和药物溶液之间没有任何物理接触，可 以很好地保证药液的无菌状态，省却繁复的灭菌步骤。更重要的是，激光辐射所形成的纳米 粒子粒径在30-300nm之间可以精确控制，粒度均勻，在注射制剂中能够很好地达到被动靶 向的效果。


图1为实施例1的纳米粒子粒径的扫描电镜图。
图2是实施例1的纳米粒子的粒径分别图。图3为实施例1再分散后粒径分布。图4是实施例2的纳米粒子的粒径分别图。图5是实施例2再分散后粒径分布。图6是实施例3的纳米粒子的粒径分别图。图7实施例3再分散后粒径分布。
具体实施例方式实施例1紫杉醇纳米粒冻干粉的制备将600mg的紫杉醇置于50mL灭菌水溶液中，得到混悬液1。另配制枸橼酸饱和水溶液，0. 22um薄膜过滤，得到1000mL溶液2。再将lg甘露醇溶于10mL水溶液中，0. 22 um薄膜过滤，得到溶液3。在无菌室内将溶液3倾入混悬液1，得到混悬液4，再将溶液2滴入混悬液4，调节 其pH值至3. 0-5. 0，随后将此混悬液以灭菌蒸馏水定容至100mL。然后分装入10mL棕色安瓿中，再将安瓿置于激光纳米仪内，以Nd:YAG倍频绿光固 体激光器为光源，辐射波长为532nm，能量密度为80mJ/cm2，辐射宽度为15ns，重复比率为 10Hz，制得粒径为46nm的药物纳米混悬液，纳米粒子粒径的扫描电镜图见图1，其粒径分布 情况见图2。
最后将安瓿置入超低温冰箱中-80°C下预冻30min，取出后在冻干仪中-10°C冻干 48hr。该纳米冻干粉加lOOmLl浓度为0. 9%氯化钠水溶液再分散性良好，再分散后粒径 分布见图3。将该重分散后纳米制剂、市售紫杉醇注射液及对照品小鼠静脉给药后结果见以 下“过敏性试验”部分的内容。实施例2足叶乙苷纳米冻干剂的制备将2. Og的足叶乙苷置于约50mL灭菌水溶液中，得到混悬液1。另配制重量浓度为30%的酸溶液，0. 22um薄膜过滤，得到1000mL溶液2。再将0. 5g D-海藻糖溶于10mL水溶液中，0. 22 u m薄膜过滤，得到溶液3。在无菌室内将溶液3倾入混悬液1，得到混悬液4，再将溶液2滴入混悬液4，调节 其pH值至3. 5-5. 5，随后将此混悬液以灭菌蒸馏水定容至100mL。然后分装入10mL棕色 安瓿中，再将安瓿置于激光纳米仪内辐射，然后分装入10mL棕色安瓿中，再将安瓿置于激 光纳米仪内，以紫外XeCl受激准分子激光器为光源，辐射波长为351nm，能量密度为30mJ/ cm2，辐射宽度为35ns，重复比率为10Hz，制得粒径为190nm的药物纳米混悬液，其粒径分布 情况见图4。最后将安瓿置入超低温冰箱中-80°C预冻90min，取出后在冻干仪中-10°C冻 干36hr。该纳米冻干粉加入lOOmL^l浓度为5 %葡萄糖水溶液再分散性良好，再分散后 粒径分布见图5。实施例3伊曲康唑纳米粒冻干剂的制备将1. Og的无菌伊曲康唑置于约50mL灭菌水溶液中，得到混悬液1。另将1. Og D-山梨醇溶于10mL水溶液中，0. 22 u m薄膜过滤，得到9. 5mL溶液2。在无菌室内将溶液2倾入混悬液1，得到混悬液3。随后将此混悬液以灭菌蒸馏水定容至lOOmL。然后分装入10mL棕色安瓿中，再将 安瓿置于激光纳米仪内辐射，以Nd:YAG三倍频紫外固体激光器为光源，辐射波长为355nm， 能量密度为80mJ/cm2，辐射宽度为10ns，重复比率为10Hz，制得粒径为lOOnm的药物纳米混 悬液，其粒径分布情况见图6。最后将安瓿置入超低温冰箱中-80°C预冻90min，取出后在冻 干仪中-10°C冻干36hr。该纳米冻干粉加入lOOmL重量浓度5%葡萄糖水溶液再分散性良 好，再分散后粒径分布见图7。实施例4姜黄素纳米干粉的制备将1. 5g的无菌姜黄素置于约50mL水溶液中，得到混悬液1。另将1. Og D-半乳糖溶于10mL水溶液中，得到溶液2。
将溶液2倾入混悬液1，得到混悬液3。随后将此混悬液以蒸馏水定容至lOOmL。然后分装入20mL棕色安瓿中，再将安瓿 置于激光纳米仪内辐射，以半导体激光器为光源，辐射波长为580nm，能量密度为50mJ/cm2， 辐射宽度为10ns，重复比率为10Hz，制得粒径为200nm的药物纳米混悬液。在此混悬液内加入3. 6g乳糖，混勻，制粒，55°C下干燥，整粒分装，即得。实施例5药理学检验
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全身主动过敏试验(ASA)受试药物实施例1的紫杉醇纳米制剂(规格30mg/ml)试剂牛血清白蛋白(阳性对照品)；0. 9%氯化钠注射液(空白对照品)动物Hartley白色健康豚鼠24只，体重350g左右，雌雄兼用方法选取健康豚鼠24只，随机平均分为4组空白对照组、阳性对照组、受试药物低剂 量组及受试药物高剂量组。空白组和阳性对照组的给药量为3mg/只，受试药物低剂量组为 2. 7g/m2，受试药物低剂量组为5. 4g/m2，隔日1次，共3次腹腔注射进行致敏。末次致敏后 第12天腹腔快速注射两倍剂量的以上相应各试剂组进行激发，观察30min内是否出现过敏 反应。致敏期间，每天观察动物的症状，并于初次致敏及激发当日测定每个动物的体重。静 脉注射激发后即刻至30min，按照表1观察记录动物有无相应症状，并记录症状出现及消失 时间，并结合表2进行致敏程度的评价。表1.过敏反应症状 表2.全身致敏性评价标准 结果
在致敏期间各试验组豚鼠均未出现任何异常反应，活动、摄食、饮水正常，对豚鼠 体重增长未有影响。给予激发剂量后，受试低剂量组、阴性对照组均未出现明显异常反应， 未出现1 20级反应症状，未出现豚鼠的死亡，由此判定自制紫杉醇纳米制剂的过敏反应 为阴性。受试高剂量组除一只出现躁动、竖毛、颤抖、搔鼻的弱阳性(+)过敏反应外，其余 均未出现明显异常反应。阳性对照组豚鼠出现了咳嗽、搔鼻、流泪、呼吸困难、抽搐、潮是呼 吸等明显的过敏反应但未见动物死亡的强阳性(+++)过敏反应，过敏反应症状在激发后 30min内基本消失，过敏反应为阳性。表3.过敏反应级数表 - 阳性对照组+++极不安全 阴性对照组 - 安全结论低剂量组受试制剂过敏反应为阴性，可以确定临床应用的给药剂量时，受试者不 会出现过敏反应。高剂量组受试制剂过敏反应主要为阴性，极少数出现弱阳性，可能和药物 用量过大(常规用量的2-4倍)有关。该试验结果表明，受试药物在常规用药剂量内安全， 其安全范围较大。肿瘤抑制率测定通过MTT法测定了实施例一中紫杉醇纳米制剂对黑色素瘤细胞A375的体外杀伤 效果，如表4所示。表4肿瘤细胞抑制率％
浓度(pg/ml)紫杉醇水性混悬液市售紫杉醇注射液自制紫杉醇纳
米混悬液
208.1 28.1 29.9
54.3 21.3 20.4
1.251.6 17.2 16.7 由此可见，激光辐射纳米混悬液对黑色素瘤细胞A375的抑制率和市售紫杉醇制 剂相比，毒副作用明显减轻。且在同浓度下对肿瘤细胞的抑制作用相当。
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权利要求
激光制备纳米药物制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤将难溶性药物与辅料的水性混悬液，经过激光辐射，获得含有纳米粒子的混悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有纳米粒子的混悬液中，纳米粒子的粒 径为 30-300nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米粒子是结晶体或无定型化合物， 或两者的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅料包括但不限于有机酸、弱碱、糖 醇类、多糖类、聚醇类、表面活性剂或纤维素类中的一种以上；所述有机酸选自柠檬酸、枸橼酸、海藻酸、酒石酸、草酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、水 杨酸或咖啡酸等中的一种以上；所述弱碱选自碳酸氢钠、海藻酸钠或三乙醇胺等中的一种以上；所述糖醇类选自D-海藻糖、D —山梨醇、海藻酸钠、右旋糖苷40、D-半乳糖、乳糖、葡萄 糖、甘露醇或木糖醇中的一种以上；所述多糖类选自阿拉伯胶、糖原、淀粉、葡聚糖或壳聚糖及其衍生物中的一种以上；所述纤维素类选自甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、丙基纤维素(PC)、羟甲基纤维 素(HMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙甲基纤维素(HPMC)或羧甲基纤维 素(CMC)等中的一种以上；所述聚醇类选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙二醇甲醚(MPEG)、聚对苯甲酸 (PBG)或聚乙二醇共聚物等中的一种以上；所述表面活性剂选自磷脂类、胆酸盐类、吐温80或泊洛沙姆188中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水性混悬液包括但不限于蒸馏水及 水性缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激光辐射所用波长为21nm 700i!m;所述激光辐射所用辐射宽度为10fs 100ns ；所述激光辐射所用能量密度为 5 u J/cm2 2000mJ/cm2 ；所述激光辐射所用重复比率为0. 001Hz 1000Hz。
7.根据权利要求1 6任一项所述的方法，其特征在于，所述辅料和难溶性药物的质量 比范围为10 1-1 10。
8.根据权利要求1 6任一项所述的方法，其特征在于，所述难溶性药物包括但是不限 于紫杉醇、足叶乙苷、伊曲康唑或姜黄素。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述难溶性药物包括但是不限于紫杉醇、 足叶乙苷、伊曲康唑或姜黄素。
全文摘要
本发明公开了一种激光制备纳米药物制剂的方法，包括如下步骤将难溶性药物与辅料的水性混悬液，经过激光辐射，获得含有纳米粒子的混悬液。本发明采用激光纳米化技术，利用特定波长的激光束处理难溶性药物溶液，通过激光辐射的原理将难溶性药物在水性溶液中微粒化，成为“预纳米制剂”。本发明完全避免了有机溶剂的污染和高压高剪切过程对药物的温度影响。且在整个纳米化过程中，操作所用器械和药物溶液之间没有任何物理接触，可以很好地保证药液的无菌状态，省却繁复的灭菌步骤。更重要的是，激光辐射所形成的纳米粒子粒径在30-300nm之间可以精确控制，粒度均匀，在注射制剂中能够很好地达到被动靶向的效果。
文档编号A61K45/00GK101890164SQ20101010880
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者李子樵, 练子富, 许清芳 申请人:上海蓝怡科技有限公司