专利名称：一种用于促进胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于促进胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用。
背景技术：
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)现象是一种双链 RNA(doublestrandedRNA dsRNA)引发的转录后基因静默机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的 双链RNA(double strand RNA, dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生 相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene siliencing, PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物，真菌，无脊椎 动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，机制也更为复杂。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于促进胰岛素分泌的基因。本发明的目的之二在于提供该基因的制备方法。本发明的目的之三在于提供该基因的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案—种用于促进胰岛素分泌的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2).与序列表中序列1限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同功能 蛋白质的DNA序列。。一种制备上述的用于促进胰岛素分泌的基因的方法，其特征在于该方法的具体步 骤为根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于 Kir6. 2基因733-753位，即GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC的shRNA的寡核苷酸序列引物， 各为53bp，然后进行合成，得到用于促进胰岛素分泌的基因；所述的shRNA的寡核苷酸序列 引物为Sense 5' -ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3'Anti-sense :5， -AAA AAG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAGATG CG-3，。一种上述的用于促进胰岛素分泌的基因在制备促进胰岛素的分泌药物中的应用。本发明设计对与胰岛素分泌有关联的基因的RNAi，并应用胰岛β细胞模型研究 其对胰岛素分泌的促进作用。为RNAi在糖尿病的治疗应用提供了一种新方法。
图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和Psilenrarcle质粒的连接图。
具体实施例方式一、正常胰岛β细胞的培养胰岛β细胞ΗΙΤ-15细胞系培养于37°C，5% 0)2恒 温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混勻细胞；用移液 器将其移入15ml离心管中，1500rpm离心3min ；去上清；用5ml无菌1 XPBS将细胞悬起，并 吹打混勻；加约Iml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5% CO2培养 箱中培养，约3天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。二、大鼠胰岛β细胞的分离正常大鼠和“糖尿病”大鼠一只，体重200 300g. 颈椎脱白处死后消毒腹部，迅速打开左侧腹腔，沿脾动脉剪取胰腺体尾部分，立即浸入4°C 的KRBB溶液中.清洗二次，剪去白色脂肪组织，然后将胰腺剪成小块，转移至盛有5mL消化 酶液的三角瓶中，于恒温摇床中37°C保温，摇床转速lOOr/min，每IOmin玻璃管反复吹打一 次，放置30min将该悬液离心500-1000rpm，离心5min，最后剩下的为夹有少量腺泡团的胰 岛.在黑背景的体视显微镜下，胰岛呈圆或椭圆形，灰色或淡棕色，易与腺泡团分辨开.将 胰岛用玻管挑出，每只大鼠可以得到直径在100-300 μ m的胰岛80-100个。三、Kir6.2-RNAi 质粒的设计和转染根据 SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于Kir6. 2基因733-753位(GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC)的shRNA的寡核苷酸序列引物，各为53bp，并进行合成。Kir6. 2-RNAi对应的序列为Sense :5’ -ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3'Anti-sense 5' -AAA AAG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAG ATGCG-3'根据SilenCircle TM RNAi Transcr iption Kit中载体设计的具体要求，将设计 的ir6. 2-RNAi的干扰片段和PSil—质粒连接，参见图1，然后转染进胰岛β细胞。Kir6. 2-RNAi质粒的转染转染前一天，在含有5ml无抗生素的RPMI 1640生长培 养基的60-mm培养皿里种上2 X IO7个胰岛β细胞。然后用500 μ 1无血清的培养基(DMEM 或 RPMI1640)溶解 8. 0 μ g 的 Kir6. 2-RNAi 表达载体，用 500 μ 1 培养基(DMEM 或 RPMI1640) 溶解LipOfectamineTM2000 (20 μ 1)，轻轻地混勻，再室温孵育5分钟。孵育5分钟后，这个 shRNA表达载体与LipOfectamineTM2000充分结合，然后将它们轻轻混勻，室温孵育20分钟， 这样做是为了形成Lipofectamine 2000的复合物。DNA-Lipofectamine 2000复合物被加 入到60mm培养皿里，之后细胞在37°C，5% CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。四、实验分组与检测指标正常对照组正常胰岛β细胞和糖尿病鼠胰岛β细胞细 胞，培养液为正常胰岛β细胞培养液；RNAi组正常胰岛β细胞和糖尿病鼠胰岛β细胞。 不同浓度葡萄糖加入转染RNAi片段的培养液中正常胰岛β细胞和糖尿病鼠胰岛β细胞 中，作为实验组.相同浓度梯度的葡萄糖加入到未转染RNAi的正常胰岛β细胞和糖尿病 鼠胰岛β细胞中，形成对照组。胰岛β细胞胰岛素分泌将ImL密度为5 X IO5Hir1各组细胞悬液置于24孔板
中，置InsulinMock(mIU/L)Control(mlU/L) RNAi(mlU/L)secretion
3d0. 849862 士 0. 002 0. 850773 士 0. 010 1.4552 士 0.0124d0. 850293 士 0. 014 0. 851994 士 0. 004 1. 116674 士 0. 0075d0. 820966 士 0. 017 0. 811966 士 0. 020 1. 09053 士 0. 008于37°C，5% CO2的培养箱中培养，使用Elisa大鼠胰岛素检测试剂盒检测胰岛素 分泌的情况。五、结果RNAi组胰岛β细胞分泌胰岛素在3d以后胰岛素分泌量明显多于对照 组胰岛β细胞。RNAi组糖尿病大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素和对照组相比在3d以后也 明显增加(P <0.001)。RNAi组细胞在相同葡萄糖浓度刺激下，分泌胰岛素明显增加(P <0.001)。说明在胰岛β细胞中和糖尿病大鼠的胰岛β细胞中Kir6. 2-RNAi在3d后可 以明显促进胰岛素的分泌。
权利要求
一种用于促进胰岛素分泌的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2).与序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.一种制备根据权利要求1所述的用于促进胰岛素分泌的基因的方法，其特征在于该 方法的具体步骤为根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要 求，设计对应于 Kir6. 2 基因 733-753 位，即 GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC 的 shRNA 的寡 核苷酸序列引物，各为53bp，然后进行合成，得到用于促进胰岛素分泌的基因；所述的shRNA的寡核苷酸序列引物为Sense 5' -ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3'Anti-sense 5'-AAA AAG CAT CTT CAT GAAAAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAGATG CG-3，。
3.一种根据权利要求1所述的用于促进胰岛素分泌的基因在制备促进胰岛素的分泌 药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于促进胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用。该基因具有下列核苷酸序列之一(1)具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2)与序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明设计对与胰岛素分泌有关联的基因的RNAi，并应用胰岛β细胞模型研究其对胰岛素分泌的促进作用。为RNAi在糖尿病的治疗应用提供了一种新方法。
文档编号A61P5/48GK101935656SQ20101012665
公开日2011年1月5日 申请日期2010年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者余抗抗, 赵璟, 郑大, 陈付学 申请人:上海大学