专利名称：：利用超声结合edta溶液去除狂犬病疫苗制品中残留dna的方法
技术领域：
：本发明涉及在疫苗制品中去除宿主DNA及杂蛋白的方法，具体说是利用超声结合EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法。EDTA溶液是一种络合剂，化学名称为乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠，本发明中提到的EDTA可以是乙二胺四乙酸，也可以是乙二胺四乙酸二钠，或者是二者的混合物。
背景技术：
：狂犬病疫苗是将狂犬病毒接种于适合的动物细胞上，经繁殖后病毒释放到培养液中，此间一些残余的宿主细胞或其碎片也会随着混在培养液中.经澄清，滤过，浓縮纯化后，提取得到狂犬病病毒疫苗原液中，会产生游离的宿主DNA及与抗原蛋白结合的宿主DNA，原液中还含有大量的宿主蛋白，浓縮纯化工艺会将一定比例的游离的DNA除去，但仍会有残余DNA存在，特别是与病毒或抗原蛋白结合的DNA会残留在纯化原液中，如去除不彻底，这部分DNA会随着疫苗一起被注入到人体内，可能会在人体内引起不良反应，或具有导致癌症发生的可能。目前狂犬病疫苗传统工艺的提取普遍采用简单超滤浓縮、分子筛层析纯化，使用这种工艺提取得到的狂犬病疫苗，存在以下缺陷1、病毒疫苗提取后残留的宿主DNA含量过高。2、病毒疫苗在提取后仍含有过高的宿主蛋白，去除杂蛋白率不高，导致疫苗在临床使用后有较大的副作用。3、上述缺陷，影响了病毒疫苗产品的质量，制约了疫苗产品的生产。为此许多人在提取过程中，改变超滤浓縮的倍数，对层析柱连接方式进行尝试，对平衡盐PH值进行调节，比如使用传统工艺的分子筛层析对狂犬病疫苗浓縮液进行纯化，具体例如，选取超滤浓縮25倍的狂犬病疫苗浓縮液(指浓度是收获液的25倍)40ml，批号是S-20100201，通过XK50层析柱，S印harose4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6的10mmol/LPBS作流动相，收集第一个吸收峰，即狂犬病病毒蛋白吸收峰，收集到的狂犬病疫苗纯化液批号为S-20100202。将S-20100201、S-20100202分别经行抗原含量、DNA残留量检测。检测数据见表l，DNA杂交膜见附图5，分子筛层析纯化图谱见附图1;再比如，使用超声波细胞粉碎机超声处理狂犬病疫苗浓縮液，再使用传统工艺的分子筛层析纯化对超声处理后的狂犬病疫苗浓縮液进行纯化，具体例如，选取超滤浓縮25倍的狂犬病疫苗浓縮液(批号S-20100201)40ml，使用①6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓縮液进行超声处理，在冰浴保护下进行超声，保证浓縮液温度不超过26t:，设置超声功率为600W(64%)，工作时间2s，间隙时间3s，总工作时间20min(240次)，得到的超声后浓縮液批号为S_20100203。按照上述同样方法理狂犬病疫苗浓縮液40ml，通过XK50层析柱，S印harose4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6的10mmol/LPBS作流动相，收集到纯化液S-20100204。将S-20100203、S-20100204分别经行抗原含量、DNA残留量检测。检测数据见表l，DNA杂交膜见附图5，分子筛层析纯化图谱见附图2。结果仅取甚微的效果，没有在实质上解决问题。
发明内容为了实现在处理狂犬病疫苗的过程中尽可能不损失抗原，即不影响疫苗制品的药效，有效地去除杂蛋白及残留宿主DNA的目标，本发明的目的在于提供一种方法，即向狂犬病疫苗浓縮液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，以期达到保护病毒，分散病毒团块，再使用一定频率及一定强度的超声波处理，将DNA分子打成小片段，再用分子筛柱层析达到将小分子DNA片段去除的目的.从而达到成品狂犬病病毒疫苗DNA残余量达到合格标准。本发明的技术方案如下本发明的技术方案是以狂犬病疫苗浓縮液为原料，向狂犬病疫苗浓縮液中加入EDTA溶液，加入后使EDTA的最终浓度为0.5-1000mmol/L，二者反应后，再使用超声波细胞粉碎机超声处理狂犬病疫苗浓縮液，最后使用分子筛层析纯化对超声处理后的狂犬病疫苗浓縮液进行纯化。利用EDTA螯合二价阳离子，有助于DNA分子的分散，有助于病毒结团后的分散，有助于对病毒的保护，有助于已结合到病毒体上的DNA的解离，同时超声处理时将宿主基因组DNA进一步打碎，经过分子筛层析纯化则更易于被去除掉.在合理的调整超声频率，强度及作用时间，可选出对DNA破坏最大，而对病毒本身无损害的最佳条件。与现有技术相比，本发明的创新之处在于，在保证疫苗抗原原始结构的前提下，有效去除宿主DNA的含量，突破疫苗制品的质量瓶颈，提高产品质量及合格率。下面结合实施例及图谱详尽说明本发明。图1是狂犬病疫苗浓縮液分子筛层析纯化后的图谱。图2是狂犬病疫苗浓縮液超声后，再进行分子筛层析纯化的图谱。图3是在狂犬病疫苗浓縮液加入EDTA溶液(终浓度1Ommol/L)后进行超声处理，最后进行分子筛层析纯化的图谱。图4是狂犬病疫苗浓縮液加入EDTA溶液(终浓度lmmol/L)后进行超声处理，最后进行分子筛层析纯化的图谱。图5是DNA残留量检测图谱。图6是DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本
技术领域：
人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。实施例一选取超滤浓縮25倍的狂犬病疫苗浓縮液40ml，用移液枪加入100mmol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的终浓度为1Ommol/L，摇匀后在室温下静置40min，然后使用①6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓縮液进行超声处理，在冰浴保护下进行超声，保证浓縮液温度不超过26t:，设置超声功率为600W(64%)，工作时间2s，间隙时间3s，总工作时间20min(240次)，得到的超声后浓縮液批号为S_20100205。再通过XK50层析柱，S印harose4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6的1Ommol/LPBS作流动相，收集到纯化液S-20100206。实施例二选取超滤浓縮25倍的狂犬病疫苗浓縮液40ml，用移液枪加入1Ommol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的终浓度为lmmol/L，摇匀后在室温下静置40min，然后使用①6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓縮液进行超声处理，在冰浴保护下进行超声，保证浓縮液温度不超过26°C，设置超声功率为600W(64%)，工作时间2s，间隙时间3s，总工作时间20min(240次)，得到的超声后浓縮液批号为S_20100207。再通过XK50层析柱，S印harose4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6的lmmol/LPBS作流动相，收集到纯化液S_20100208。将S-20100205、S_20100206、S_20100207、S-20100208分别经行抗原含量、DNA残留量检测。检测数据见表1，DNA杂交膜见附图5，S-20100206分子筛层析纯化图谱见附图3、S-20100208分子筛层析纯化图谱见附图4。表1:S-20100201S-20100208抗原含量、DNA残留量检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通过实验结果，分析抗原回收率及DNA残留量，比较进过不同工艺对相同狂犬病疫苗浓縮液处理后宿主基因组DNA去除情况，数据如表2表2:不同工艺对相同狂犬病疫苗浓縮液处理后检测数据比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2可知，在狂犬病病毒抗原几乎无损失的前提下，浓縮液经过超声处理后再纯化，宿主DNA去除效果明显好于常规工艺的层析纯化；加入EDTA后超声，再经行纯化，宿主DNA去除效果又优于浓縮液经过超声处理后再纯化的纯化液。结合分子筛层析纯化图谱，浓縮液直接层析纯化的狂犬病毒蛋白吸收峰高于浓縮液经过超声处理后再纯化的狂犬病毒蛋白吸收峰，浓縮液经过超声处理后再纯化的狂犬病毒蛋白吸收峰高于浓縮液加入EDTA后超声，再经行纯化的狂犬病毒蛋白吸收峰，狂犬病毒蛋白吸收峰的高度随着加入EDTA的浓度增加而降低。综上，EDTA溶液在浓縮液超声过程中有影响宿主DNA与狂犬病抗原结合，使DNA在超声的处理下更容易破碎，达到去除更多宿主DNA的目的。最后，DNA的琼脂糖糖凝胶电泳检测超声破碎的效果；狂犬病疫苗浓縮液经超声处理后，宿主基因组DNA分子被打断，变成分子量更小的核酸分子。为了检测超声破碎的效果，对加入EDTA(终浓度为1Ommol/L)再超声的样品进行核酸电泳，并与超声前的样品对比，检测超声破碎的效果。如附图6所示，狂犬病疫苗常规浓縮液在>2000bp处有涂抹带，加入EDTA(终浓度为1Ommol/L)再超声的样品在<lOObp处有条带。琼脂糖凝胶电泳图谱见附图6。上述蛋白含量检测方法为《中华人民共和国药典》2005版三部附录中要求的Lowery法；抗原含量检测方法为《中华人民共和国药典》2005版三部附录中要求的ELISA法；DNA检测方法是按照中国药品生物制品鉴定所2009年最新提供的《Vero细胞DNA残留量测定标准操作规程》进行检测。权利要求一种利用超声结合EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法，其特征是以狂犬病疫苗浓缩液为原料，向狂犬病疫苗浓缩液中加入EDTA溶液，加入后使EDTA的最终浓度为0.5-1000mmol/L，二者反应后，再使用超声波细胞粉碎机超声处理狂犬病疫苗浓缩液，最后使用传统工艺的分子筛层析纯化对超声处理后的狂犬病疫苗浓缩液进行纯化。2.按照权利要求1所述的利用超声结合EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法，其特征是选取超滤浓縮25倍的狂犬病疫苗浓縮液40ml，用移液枪加入lOOmmol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的终浓度为10mmol/L，摇匀后在室温下静置40min，然后使用①6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓縮液进行超声处理，在冰浴保护下进行超声，保证浓縮液温度不超过26°C，设置超声功率为600W，工作时间2s，间隙时间3s，总工作时间20min，得到的超声后浓縮液批号为S_20100205。再通过XK50层析柱，S印harose4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为lOOmV，记录仪纸速设定为2cm/h。用pH7.6的1Ommol/LPBS作流动相，收集到纯化液S_20100206。3.按照权利要求1所述的利用超声结合EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法，其特征是选取超滤浓縮25倍的狂犬病疫苗浓縮液40ml，用移液枪加入1Ommol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的终浓度为lmmol/L，摇匀后在室温下静置40min，然后使用①6变幅杆的Scientz-IID型超声波细胞粉碎机对狂犬病疫苗浓縮液进行超声处理，在冰浴保护下进行超声，保证浓縮液温度不超过26t:，设置超声功率为600W，工作时间2s，间隙时间3s，总工作时间20min，得到的超声后浓縮液批号为S_20100207。再通过XK50层析柱，S印harose4FF凝胶层析纯化，紫外检测系统检测范围设定为0.2A，输出设定为100mV，记录仪纸速设定为2cm/h，用pH7.6的lmmol/LPBS作流动相，收集到纯化液S-20100208。全文摘要本发明提供了一种利用超声结合EDTA溶液去除狂犬病疫苗制品中残留DNA的方法，所要解决的问题是浓缩、纯化等提取狂犬病疫苗方法只能将一定比例的游离DNA去除，不能去除与抗原蛋白结合的宿主DNA；临床不良反应现象屡见不鲜。本发明的要点是向狂犬病疫苗浓缩液中加入EDTA溶液，再使用超声波对狂犬病疫苗进行超声处理，使宿主DNA在超声作用下更易被破碎，通过层析纯化去除宿主DNA。其效果是在保证疫苗效价的前提下，提高疫苗产品质量，去除大量杂蛋白及宿主DNA，使疫苗制品中残余DNA含量达到了100pg/剂以下，解决了目前狂犬病疫苗行业面临的质量问题。文档编号A61P31/14GK101780276SQ20101013255公开日2010年7月21日申请日期2010年3月26日优先权日2010年3月26日发明者张译,徐德启,汪春义,王凯,程晓耕,苏文全申请人:辽宁依生生物制药有限公司