专利名称：一种层状多级结构仿生复合材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料领域。
背景技术：
天然生物体的硬组织具有从微观到宏观的分级结构，如何在成分模拟的基础上实现从微观结构到宏观结构的层次化仿生制造是目前组织工程支架材料的设计和制造中所面临的重大挑战。层状多孔结构的高度仿生结构硬组织修复支架是由层状多级结构仿生复合材料制成，该支架将为细胞的生长提供适宜的空间和微环境，有利于构建具有完整三维结构的组织工程修复支架，且层状结构能够为支架材供良好的机械性能。近期研究结果表明，层状复合材料在吸附、离子交换、合成材料、日用化工、催化、超导和环境保护等方面也表现具有巨大的应用潜力。 采用冰模板法制备上述材料，是将冰模板法与模板自组装技术相融合，利用具有纳米仿生结构的无机/有机复合材料制造具备层状多级结构仿生复合材料；在低温环境下进行材料的成型加工，使得生物活性物质在最终支架产品中保持高活性。2006年，Deville等人和Halloran在Science上报道以氧化铝或羟基磷灰石纳米粒子作为起始原料，用冰冻的方法将含有高浓度陶瓷粉的水混合体制造成多孔材料。然后用另一种材料填充到这种多孔材料中，来制造超强、超轻的组合材料，该组合材料具有比传统陶瓷材料更好的机械性质。材料科学家和工程师JohnHalloran在相关的研究评述中指出，这种组合材料有广泛的工程应用。但单一的冰模板法具有以下缺点材料选择比较单一，结构设计不够精细。到目前为止，还基本上是简单的平行层结构，孔隙的相互贯通程度低、孔隙率与孔分布的可控性差，这将影响到细胞的长入和组织的血管化。 复合微球制备法是一种将不同材料分散均匀复合成介于50nm 2mm之间的球形颗粒的方法，包括乳液-溶剂挥发法、原位化学沉积法、溶胶一凝胶法、化学镀法、自组装法等等。复合微球由于具有较小的可控的粒径，而致使其具有明显的表面效应，且材料的亲和性好、在生物体内易吸收、易游走，易于制备及功能化以及对生物体相容性可调、有利于研究与生物体成份相互作用等特点。复合微球在轻质雷达吸波材料、光子晶体、生物医药栽体材料、化妆品等领域有广泛的应用。 利用复合微球制备法与冰模板法结合制备层状多级结构仿生复合材料，目前在各种文献中均未报道。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供一种新的层状多级结构仿生复合材料及其
制备方法，具体由冰模板法结合复合微球法制备层状多级结构仿生复合材料，所制备出的
复合材料具有优良的性能。 本发明所采用的技术方案是
一种层状多级结构仿生复合材料的制备方法，由冰模板法结合复合微球法制备仿生复合材料，包括以下步骤
(a) 制作复合微球粉末；
(b) 将机物溶解在体积百分比为O. 2% 2%有机溶剂中，将复合微球粉末放入有机溶剂中，使复合微球粉末与有机溶剂中的有机物的质量比为30 :1 2 :l，均匀搅拌成糊状混合浆料，然后去除空气；
(C)按照制备复合材料形状的需要，制成冰冻模具，该冰冻模具底部安装有金属底座；
(d) 将糊状混合浆料注入冰冻模具里，再次去除去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖冰冻模具除金属底座外的部分，置于_30°C -12(TC冰冻环境中，冰冻lh 2h，直到样品完全冻结成型；
(e) 从冰冻模具取出冰冻样品，在低于_301:的冷冻干燥环境中，冷冻干燥12h 36h直到完全冻干，即得到层状多级结构仿生复合材料。 优选地，所述步骤(a) 、 (b)中复合微球粉末为胶原、壳聚糖(CS)、聚乙交酯(PLA)、聚丙交酯(PGA)、共聚物乙交酯-丙交酯(PLGA)中的一种或几种混合磷石灰或生物活性物质制得。 优选地，所述磷石灰为13 -磷酸三f丐、羟基磷灰石或元素改性羟基磷灰石。
优选地，所述生物活性物质为蛋白质、多肽类生物活性药物或生物活性生长因子。
优选地，所述步骤(b)中有机物为胶原、壳聚糖、丝素、聚乳酸、共聚物乙交酯-丙交酯、聚己内酯或可生物降解聚合物。 优选地，所述步骤(b)中有机溶剂为乙醇或醋酸。 优选地，所述步骤(c) 、 (d) 、 (e)的冰冻模具为聚四氟乙烯管或聚氯乙烯管。
优选地，所述步骤(c) 、 (d)中金属底座材料为导热金属铜、铁，铝。
进一步地，所述步骤(d)冷冻环境由低温冰箱、液氮以及冰盐浴提供。本发明具有以下优点
本发明在冰模板的基础上结合复合微球技术，制备出层状多级结构仿生复合材料，该复合材料结构精细、强度高、质量轻、选择多，适合细胞黏附，具有良好的生物相容性。该复合材料的层片厚度随所加冷冻浆料不同可加以控制，层片厚度能达到2 ii m 50 ii m，层间距和孔隙率随溶剂的量的不同而变化，其中层间距能达到2 100 ii m，孔隙率能达到50% 95%;同时层片规则排列，层间连通性好，并有类似矿物桥的桥连层片上形状规则的微球，或均匀嵌在薄层有机物中，或少许以丝状有机物为轴串在层片周围形成类糖葫芦状；其层片上微球所提供的凹凸和极大的表面积，可为组织细胞和血管生长创造良好的粘附和增殖条件。在成分模拟的基础上，为实现从微观结构到宏观结构的多级仿生制造提供了新的思路。
本发明的制备方法兼具经济性和环境友好性，而且可以在持续低温条件下进行，不易导致生物活性材料变性。
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本发明制备得到的层状多级结构仿生复合材料通过进一步成型处理能形成更接 近天然生物矿物的多层级仿生陶瓷材料，可在生物医用材料领域具有广泛应用前景；在真 空冷冻干燥除冰后形成的空隙内渗入金属或聚合物可进一步形成致密的复合材料。
图1为实施例1制备得到的层状多级结构仿生复合材料比例尺为400um的扫描电 镜图2为实施例1制备得到的层状多级结构仿生复合材料比例尺为50um的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1
取0. 8g分子量为1万的PLA溶解在浓度为0. 067g/ml的12ml丙酮中，待充分溶解，此 为溶液A ;取0. 2g纳米羟基磷灰石分散到6ml水中，超声分散，呈乳液状为溶液B ;将溶液B 倒入溶液A中，快速搅拌至分散均匀为溶液C ;取O. 4g聚乙烯醇(PVA)溶解在200ml水中，置 于搅拌器上以400rpm的速度搅拌，待充分溶解，此溶液为D ;将C溶液匀速倒入正在搅拌的 D溶液中，得溶液E ;溶液E继续搅拌6小时使有机溶剂挥发；接着用透析的方法洗去PVA， 收集HA/PLA微球粉末入锥形瓶内，超声分散，放入-2(TC预冻12小时；预冻后放入冷冻干 燥机在_50°C ，小于20Pa条件下冷冻干燥24小时，即得HA/PLA微球。 筛选粒径50 lOOum的复合磷灰石微球粉末lg与0. 15g溶解在10ml体积百分 比为1%醋酸里的胶原混合，复合磷灰石微球粉与胶原的质量比为20 :3，接着搅拌均匀成糊 状得混合浆料，最后去除空气；制作内径为lOmm，高度为40mm的圆柱形冰冻模具；将糊状 混合浆料小心注入模具里，再去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖模具除金属底 座外的部分，置于一8(TC低温冰箱中，冰冻1. 5h，直至样品完全冻结成型；剔除模具金属底 座，迅速取出冰冻样品，冷冻干燥36h直至完全冻干，即到所要制备的层状多级结构仿生复 合材料。 参照图1和图2，将制备得到的层状多级结构仿生复合材料在扫描电镜下进行观 察，平均粒径在50 100 ii m左右的PCL微球含HA较多，形状规则。冻结干燥后，样品的层 片结构规律明显，层片由一个个紧挨着的微球组成，胶原胶黏在其中，孔连通情况良好，层 间距约50 ii m ;层间形成了类似矿物桥的桥连。
实施例2
取分子量为6万的10gPLA溶解在浓度为0. lg/ml的100ml 二氯甲烷中，待充分溶解， 此为溶液A ;取5gn-HA分散到20ml 二氯甲烷中，超声分散，呈乳液状为溶液B ;将溶液B倒 入溶液A中，快速搅拌至分散均匀为溶液C ;取0. 5%的PVA溶解在1000ml水中，置于搅拌 器上以400rpm的速度搅拌，待充分溶解，分装在四个烧杯，此溶液为D ;将C溶液缓慢匀速 滴加到正在搅拌的D溶液中，得溶液E ;溶液E继续搅拌8小时使有机溶剂挥发；接着用抽滤的方法洗去PVA，收集HA/PLA微球粉末放入锥形瓶内，超声分散，放入-S(TC预冻12小时； 预冻后放入冷冻干燥机在_50°C ，小于20Pa条件下冷冻干燥24小时，即得HA/PLA微球。
筛选粒径50 lOOum的复合磷灰石微球粉末lg与0. 2g溶解在10ml体积百分比 为1%醋酸里的壳聚糖混合，复合磷灰石微球粉末与壳聚糖质量比为20 :4，接着搅拌均匀成 糊状得混合浆料，最后除去空气；自制内径为10mm，高度为40mm的圆柱形冰冻模具；将糊 状混合浆料小心注入模具里，再去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖模具除金属 底座外的部分，置于一4(TC的冰盐浴中，冰冻2h，直至样品完全冻结成型；剔除模具金属底 座，迅速取出冰冻样品，冷冻干燥12h直至完全冻干，即到所要制备的层状多级结构仿生复 合材料。 制备得到的层状多级结构仿生复合材料平均粒径在50 100 ii m左右的PLA微球 含HA较多，形状规则。冻结干燥后，样品的层片结构规律明显，层片由一个个紧挨着的微球 组成，壳聚糖胶黏在其中，孔连通情况良好，层间距约50 ii m ;层间形成了类似矿物桥的桥连。 实施例3
取分子量为10万的1. 5gPCL溶解在浓度为6. 67g/ml的22. 5ml 二氯甲烷中待充分溶 解，此为溶液A ;取lg 13 -TCP分散到20ml乙醇中，超声分散，呈乳液状为溶液B ;将溶液B倒 入溶液A中，快速搅拌至分散均匀为溶液C ;取0. 5%的PVA溶解在400ml水中，置于搅拌器 上以400rpm的速度搅拌，待充分溶解，分装在四个烧杯，此溶液为D ;将C溶液缓慢匀速滴 加到正在搅拌的D溶液中，得溶液E ;溶液E继续搅拌8小时使有机溶剂挥发；接着用抽滤 的方法洗去PVA，收集HA/PCL微球粉末放入锥形瓶内，超声分散，放入-80°C预冻12小时； 预冻后放入冷冻干燥机在_50°C ，小于20Pa条件下冷冻干燥24小时，即得HA/PLA微球。
筛选粒径50 100um的复合磷灰石微球粉末lg与0. 15g溶解在10ml体积百分 比为0. 2%乙醇里的聚乳酸混合，复合磷灰石微球粉与聚乳酸质量比为30 :l，接着搅拌均匀 成糊状得混合浆料，最后除去空气；自制内径为10mm，高度为40mm的圆柱形冰冻模具；将糊 状混合浆料小心注入模具里，再去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖模具除金属 底座外的部分，置于一12(TC液氮中，冰冻1.5h，直至样品完全冻结成型；剔除模具金属底 座，迅速取出冰冻样品，冷冻干燥24h直至完全冻干，即到所要制备的层状多级结构仿生复 合材料。 制备得到的层状多级结构仿生复合材料，平均粒径在50 100 ii m左右的PCL\HA 微球含HA较多，形状规则。冻结干燥后，样品的层片结构规律明显，层片由一个个紧挨着的 微球组成，胶原胶黏在其中，孔连通情况良好，层间距约50ym ;层间形成了类似矿物桥的 桥连。 实施例4
取分子量为5万的0. 9gPLGA溶解在浓度为0. 075g/ml的12ml 二氯甲烷中，待充分溶 解，此为溶液A ;取0. 2gn-HA分散到5ml 二氯甲烷中，超声分散，呈乳液状为溶液B ;将溶液 B倒入溶液A中，快速搅拌至分散均匀为溶液C ;取0. 5%的poloxamer-188溶解在200ml 水中，置于搅拌器上以400rpm的速度搅拌，待充分溶解，此溶液为D ;将C溶液匀速倒入正 在搅拌的D溶液中，得溶液E ;溶液E继续搅拌6小时使有机溶剂挥发；接着用4000rpm离 心的方法洗去poloxamer-188，收集HA/PLGA微球粉末入锥形瓶内，超声分散，放入-20。C预冻12小时；预冻后放入冷冻干燥机在_50°C，小于20Pa条件下冷冻干燥24小时，即得HA/ PLGA微球。 多次重复上述操作，收集足够量的微球；将制得的复合磷灰石微球粉末lg与0. 2g 溶解在10ml体积百分比为2%醋酸里的壳聚糖混合，复合磷灰石微球粉末与壳聚糖质量比 为2 :l，接着搅拌均匀成糊状得混合浆料，最后除去空气；自制内径为10mm，高度为40mm的 圆柱形冰冻模具；将糊状混合浆料小心注入模具里，再去空气，然后用隔热装置或隔热材料 严密覆盖模具除金属底座外的部分，置于_8(TC低温冰箱中，冰冻lh，直至样品完全冻结成 型；剔除模具金属底座，迅速取出冰冻样品，冷冻干燥136h直至完全冻干，即到所要制备的 层状多级结构仿生复合材料。 制备得到的层状多级结构仿生复合材料含18. 2%HA的PLGA微球平均粒径在30 150 m左右，形状规则。冰冻结干燥后，样品的层片结构规律明显，孔连通情况良好，层间距 约50ym ;层间形成了类似矿物桥的桥连。用比重法测得孔隙率为91%。
实施例5
采用自乳化/溶剂扩散法，取分子量为5万的PLGA3g，姜黄素0. 5g，构建有机相使用 丙酮/乙醇按1 :10的比例组成的二元水混溶性溶剂500ml，均质分散均匀；取聚乙烯醇 (PVA)以2%的比例溶解在水中，置于搅拌器上以400rpm的速度搅拌，待充分溶解，将有机 相以2ml/min的速度缓慢滴入，形成半透明乳液，置于通风橱继续搅拌3小时使有机溶剂挥 发；低温高速离心10000rpm分离载药微球，三蒸水洗涤三次；将微球重新悬于少量水中，_ 5(TC真空冷冻干燥得淡黄色粉末；4t:避光密封保存；
筛选粒径合适的PLGA载姜黄素微球粉末lg与0. 15g溶解在10ml体积百分比为1%乙 醇里的胶原混合，并且进行避光，PLGA载姜黄素微球粉末与胶原质量比为20 :3，搅拌均匀 成糊状得混合浆料，去除空气；自制内径为10mm，高度为40mm的圆柱形冰冻模具；将糊状 混合浆料小心注入模具里，再去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖模具除金属底 座外的部分，置于一8(TC低温冰箱中，冰冻1. 5h，直至样品完全冻结成型；剔除模具金属底 座，迅速取出冰冻样品，避光冷冻干燥36h直至完全冻干，即到所要制备的基于载姜黄素的 PLGA微球的层状多级结构仿生复合材料。 制备得到的层状多级结构仿生复合材料，微球平均粒径约300nm，载药率11%，包 封率33.54%。肉眼即可观察到明显的类似书页的层状结构。光镜可见层片由一个个紧挨着 的微球组成，胶原胶黏在其中，孔连通情况良好，层与层间距较小。
实施例6
OGP-PLGA缓释微球的制备将lgPLGA50 :50溶于4ml 二氯甲烷溶液中，充分溶解后加 入lmg/mLOGP溶液1500uL，超声波匀化形成初乳。以100g/L聚乙烯醇溶液为水相分散介 质，其无机盐浓度为20g / L。将4ml3g / L聚乙烯醇溶液滴加入上述乳液，匀化后，将此液 加入8ml同浓度的聚乙烯醇溶液中，室温下2000r / min磁力搅拌至二氯甲烷挥发完全，即 得OGP—PLGA缓释微球溶液；常规一 2(TC冻干保存。 筛选粒径合适的OGP-PLGA缓释微球粉末lg与0. 2g溶解在10ml体积百分比为1% 醋酸里的胶原混合，OGP-PLGA缓释微球粉末与胶原质量比为20 :4，接着搅拌均匀成糊状得 混合浆料，最后去除空气；自制内径为10mm，高度为50mm的圆柱形冰冻模具；将糊状混合 浆料小心注入模具里，再去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖模具除金属底座外
7的部分，置于一8(TC低温冰箱中，冰冻1.5h，直至样品完全冻结成型；剔除模具金属底座， 迅速取出冰冻样品，冷冻干燥12h直至完全冻干，即到所要制备的基于0GP-PLGA缓释微球 的层状多级结构仿生复合材料。 制备得到的层状多级结构仿生复合材料的0GP-PLGA缓释微球表面光滑圆整，球 体均匀度好，无粘连现象。微球的平均粒径为30um 70um，载药率和包封率为80. 9±2. 21%和65. 9±3. 13%，证明复乳法制备生物活性生长因子的有效性及可行性。肉眼即可 观察到明显的类似书页的层状结构。光镜可见层片由一个个紧挨着的微球组成，胶原胶黏 在其中，孔连通情况良好，层与层间距较小。 最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽量参照 较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围当中。
权利要求
一种层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，由冰模板法结合复合微球法制备仿生复合材料，包括以下步骤(a)制作复合微球粉末；(b)将机物溶解在体积百分比为0.2%～2%有机溶剂中，将复合微球粉末放入有机溶剂中，使复合微球粉末与有机溶剂中的有机物的质量比为301～21，均匀搅拌成糊状混合浆料，然后去除空气；(c)按照制备复合材料形状的需要，制成冰冻模具，该冰冻模具底部安装有金属底座；(d)将糊状混合浆料注入冰冻模具里，再次去除去空气，然后用隔热装置或隔热材料严密覆盖冰冻模具除金属底座外的部分，置于-30℃～-120℃冰冻环境中，冰冻1h～2h，直到样品完全冻结成型；(e)从冰冻模具取出冰冻样品，在低于-30℃的冷冻干燥环境中，冷冻干燥12h～36h直到完全冻干，即得到层状多级结构仿生复合材料。
2. 根据权利要求1所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)、 (b)中复合微球粉末为胶原、壳聚糖(CS)、聚乙交酯(PLA)、聚丙交酯(PGA)、共聚物乙交酯_丙交酯(PLGA)中的一种或几种混合磷石灰或生物活性物质制得。
3. 根据权利要求2所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述磷石灰为P _磷酸三钙、羟基磷灰石或元素改性羟基磷灰石。
4. 根据权利要求2所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述生物活性物质为蛋白质、多肽类生物活性药物或生物活性生长因子。
5. 根据权利要求1所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中有机物为胶原、壳聚糖、丝素、聚乳酸、共聚物乙交酯-丙交酯、聚己内酯或可生物降解聚合物。
6 根据权利要求1所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中有机溶剂为乙醇或醋酸。
7. 根据权利要求1所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)、 (d)、 (e)的冰冻模具为聚四氟乙烯管或聚氯乙烯管。
8. 根据权利要求1所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)、 (d)中金属底座材料为导热金属铜、铁，铝。
9. 根据权利要求1所述的层状多级结构仿生复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)冷冻环境由低温冰箱、液氮以及冰盐浴提供。
全文摘要
本发明公开了一种层状多级结构仿生复合材料的制备方法，属于生物医学材料领域。该方法由冰模板法结合复合微球法，制备出具有层状多级结构仿生复合材料。该方法兼具经济性和环境友好性,而且可以在持续低温条件下进行，不易导致生物活性材料变性，制备出的复合材料结构精细、强度高、质量轻、选择多，更利于细胞黏附，具有良好的生物相容性，同时层片规则排列，层间连通性好，并有类似矿物桥的桥连。层片上形状规则的微球，或均匀嵌在薄层有机物中，或少许以丝状有机物为轴串在层片周围形成类糖葫芦状；其层片上微球所提供的凹凸和极大的表面积，可为组织细胞和血管生长创造良好的粘附和增殖条件。
文档编号A61L27/46GK101785877SQ201010140280
公开日2010年7月28日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者周磊, 张胜民, 杨建霞 申请人:华中科技大学