专利名称：一种增加脱乙酰化酶表达量的方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，更具体而言，本发明涉及通过使用艾塞那肽来增加脱乙酰化酶SIRTl的表达量的方法。
背景技术：
关于艾塞那肽(Exenatide，Εχ-4)据WHO预测，到2030年世界上将有3亿人被诊断为2型糖尿病患者，目前的疗法包括运动，饮食控制和降低血糖的药物治疗。在药物治疗方面，除目前常用的口服化学降糖药物而外，2005年美国FDA批准上市新多肽药物Exenatide (Ex_4)，其商品名称为Byetta， 中文名称为艾塞那肽。该药的问世被认为是治疗2型糖尿病的一个重大进展。该肽类药物具有促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰高血糖素的分泌，同时具有能够使胰岛β细胞增殖，抗β细胞凋亡的特点。因此，该药不仅表现出降低2型糖尿病症患者血糖的明确疗效， 而且也给人以治愈2型糖尿病症的希望。人体肠内释放于循环系统中的一种多肽激素胰高血糖素样肽-1，简称为GLP-1。 该内源性多肽的生理功能是增强葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，具有体内抗高血糖的功能。 但体内有特异的酶(DPP-4)降解该肽，因此GLP-I的药代动力学行为不好，其体内半衰期仅 3-5分钟。艾塞那肽是人体内源性多肽类激素GLP-I的类似物，从美国西南部的毒蜥唾液腺中分离出来的一种由39个氨基酸组成的多肽，该肽可激活处于休眠状态的消化系统，刺激胰岛细胞分泌胰岛素，以便消化食物。如图1所示，艾塞那肽与内源性多肽GLP-I有53%的同源性，是GLP-I的类似物， 它不仅具有GLP-I的葡萄糖依赖的胰岛素分泌增强活性，而且抗DPP-4酶降解，因此艾塞那肽具有很好的药代动力学性质。单次皮下注射艾塞那肽后，其药学活性可以保持4-6小时， 大约注射2小时之后达到血浆药物浓度峰值，其循环半衰期2-4小时，主要通过肾小球滤
出οGLP-I与Εχ-4的氨基酸序列比较如下GLP-I HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRGEx-4 :HGEGTFTSDLSKQMEEEAYRLFIEffLKNGGPSSGAPPPS其中下划线标出的氨基酸残基为GLP-I与Εχ-4中相同的残基。近些年来关于GLP-I和其类似物艾塞那肽的作用机理已有相当多的报道，其结果如下GLP-1和其类似物艾塞那肽都与同一特异的G蛋白偶联受体作用而体现出其生理和药物活性。如图1所示，GLP-I或艾塞那肽与GLP-I受体作用导致cAMP水平增高，cAMP增高是葡萄糖依赖性的，该效应同时引发急性反应，即蛋白激酶A(PKA)的活化，或通过cAMP 调节鸟嘌呤核苷酸交换因子II(EI^C2)改变离子通路活性，触动胞内Ca2+，并促进胰岛素的分泌。该胰岛素的释放依赖于体内葡萄糖浓度，即依赖于KATP通路。当葡萄糖引起细胞内 ATP浓度升高时KATP通路关闭。GLP-I或艾塞那肽通过cAMP的积累和蛋白酶A的活化调节通路的关闭和细胞膜去极化作用。有关GLP-I和艾塞那肽与GLP-I受体作用的信号转导通路问题还不断的有许多报道，但主要集中在促进胰岛素分泌通路的解读，对2型糖尿病的另一重要特征胰岛素抵抗方面的研究和理解还很少。关于SIRTl基因科学界对与衰老相关的基因及其表达蛋白质(SIRTl)的功能研究中发现了胰岛素抵抗的线索。众所周知，2型糖尿病是与衰老相关的代谢性疾病，目前已取得一系列实验证据证明了与衰老相关的SIRTl基因及其蛋白质产物脱乙酰化酶与胰岛素抵抗相关。在一些限制热量摄取的模型动物中证实SIR2蛋白质具有调节生命长短的作用。迄今已确认在哺乳动物中SIR2有7个同系物，即SIRT1-SIRT7。其中SIRTl是研究得最广泛和深入的功能蛋白质。SIRTl在行使其酶催化活性时使一些底物脱乙酰化，其中包括PGCl α、UCP2、 NF κ B和F0X01蛋白质，从而促进胰岛素分泌和细胞内葡萄糖代谢的稳定化。进一步研究证实，SIRTl除与促进胰岛素分泌有关外，与动物的胰岛素抵抗有密切关系。降低小鼠的SIRTl的表达会产生胰岛素抵抗和相关疾病的发生。在喂食高脂肪的小鼠和两种老化小鼠的动物模型中，都呈现出SIRTl蛋白质表达水平的降低，上述两种模型都与胰岛素抵抗有关。同样，在培养的胰岛素敏感的细胞和组织中抑制SIRTl可导致胰岛素抵抗。从另一方面的研究也证实了上述结果，在体外细胞实验中SIRTl的激动剂能以 SIRTl依赖方式增强细胞对胰岛素的敏感性，在模型动物实验中SIRTl激动剂具有降低胰岛素抵抗的作用(Bordone，Motta et al.，2006)。实验也揭示了 SIRTl促进胰岛素分泌的部分机理。在过表达SIRTl的β细胞中由于抑制UCP2而增加ATP的生成量，升高ATP水平导致细胞膜去极化，以及Ca2+依赖性的胞吐效应促进胰岛素分泌。使用过表达SIRTl的BESTO小鼠和缺少SIRTl表达的小鼠与正常鼠对比实验也得出同样的结论。研究也揭示出SIRTl直接或间接地参与胰岛素与其受体结合后的信号转导。这是一个比较复杂的过程，主要通过胰岛素受体底物iaRSl)的脱磷酸化，特别是SIRTl使IRS-2脱乙酰化调节IRS-2的酪氨酸磷酸化，并使胰岛素信号传递过程中的一个重要成员AKt活化来实现的。此外，本发明人注意到在另一种与衰老密切相关的疾病一一脑出血后脑损伤的发病机理中，SIRTl蛋白酶活性的增加能够调整细胞氧化还原状态，使脑损伤病症得到改善， 而且在脑组织细胞中也发现有GLP-I受体表达。但是，目前尚未验证艾塞那肽在脑损伤方面是否有拓展性临床应用。总之，GLP-I和艾塞那肽通过与GLP-I受体结合，通过cAMP_PKA通路传导对胰岛素分泌的调节；而SIRTl基因及其产物在调节胰岛素分泌和降低胰岛素抵抗方面也得到证实。但目前的研究尚没有揭示艾塞那肽与S^Tl之间关系。
发明内容
本发明的发明人重点研究了艾塞那肽与SIRTl基因之间的关系，揭示出存在着艾塞那肽-SIRTl传导途径，该途径可能是艾塞那肽促进胰岛素分泌的另一途径，以及降低胰岛素抵抗的重要途径。并且根据该通路作用特点，拓展了艾塞那肽在脑损伤方面的应用。本发明不仅深化了艾塞那肽作用机理的理解，也为抗2型糖尿病新药的开发和临床使用，以及在脑损伤方面的临床应用提供了更扩展性的目标和思路。因此，根据本发明的一个方面，提供了一种提高细胞的SIRTl基因转录水平和/或
4SIRTl蛋白表达水平的方法，所述方法包括给予所述细胞有效量的艾塞那肽。本发明还提供了艾塞那肽用于提高细胞的SIRTl基因转录水平和/或SIRTl蛋白表达水平的用途。在本发明的另一方面，提供了一种促进胰岛β细胞增殖和/或抑制胰岛β细胞凋亡的方法，所述方法包括给予所述细胞有效量的艾塞那肽。本发明还提供了艾塞那肽用于促进胰岛β细胞增殖和/或抑制胰岛β细胞凋亡的用途。在本发明的另一方面，提供了一种提高胰岛β细胞的胰岛素分泌量的方法，所述方法包括给予所述细胞有效量的艾塞那肽。本发明还提供了艾塞那肽用于提高胰岛β细胞的胰岛素分泌量的用途。本发明还涉及艾塞那肽在制备用于在脑缺血后保护脑损伤的药物中的用途。目前，艾塞那肽仅限于与二甲双胍合用，治疗因二甲双胍疗效不佳的患者。本发明证实艾塞那肽通过增加SIRTl的表达量，从而对降低胰岛素抵抗有效。胰岛素抵抗往往在 2型糖尿病形成前的若干年就已形成，因此，艾塞那肽也对因衰老或肥胖而致的亚健康人群有效，及时用药有可能预防或延迟糖尿病的发生。因此，在本发明的另一方面，提供了艾塞那肽用于制备预防或延迟糖尿病发病的药物中的用途。
图1为GLP-1/Exenatide在胰岛β细胞内信号转导途径的示意图；图2显示了 Εχ-4刺激RINm-5F细胞增殖活性的实验结果；图3显示了葡萄糖(Glu) +棕榈酸钠(Pal)诱导RINm_5F细胞凋亡模型的实验结果；图中各柱含义如下1 :50mM Glu+0. 4mM Pal ；2 :25mM Glu+0. 4mM Pal ；3 :50mM Glu+0. 2mM Pal ；4 :25mM Glu+0. 2mM Pal ；5 :12. 5mM Glu+0. 2mM Pal ；6 :25mM Glu+0. ImM Pal ；7 :12. 5mM Glu+0. ImM Pal ；8 :25mM Glu+0. 0. 5mM Pal ；9 :12.5mMGlu+0. 05mM Pal。图4显示了 Exendin-4抑制葡萄糖(Glu) +棕榈酸钠(Pal)诱导RINm_5F细胞凋亡的实验结果；图中各柱含义如下1 空白；2 =Glu(25mM) +Pal (0. 4mM) ；3 :Exendin_4(2. 5 μ Μ)+Glu (25mM)+Pal(0. 4mM) ；4 :Exendin_4 (12. 5 μ Μ)+Glu(25mM)+Pal(0. 4mM) ；5 =Exendi n-4(25 μ Μ)+Glu(25mM)+Pal(0. 4mM) ；6 :Exendin_4(50 μ Μ)+Glu(25mM)+Pal(0. 4mM) ；7 :Ex endin-4(75 μ Μ)+Glu(25mM)+Pal(0. 4mM)。图5显示了 Ex-4增加葡萄糖浓度依赖的RINm_5F细胞胰岛素分泌的实验结果； 图中各柱含义如下1 空白(4. OmM葡萄糖)；2 :50μΜ Exendin-4 ；3 :16. 7mM葡萄糖；4 50 μ M Exendin+16. 7mM 葡萄糖。图6显示了使用RT-PCR和实时PCR检测RINm_5F细胞内SIRTl基因表达量变化的实验结果；图6A:SIRT基因表达与参照基因β-actin基因的电泳比较图；图6B 图6A中各泳道的表达量的定量分析结果；在图6A和6B中泳道1 空白对照；泳道2 :50mM Glu+0. 2mM Pal ；泳道 3 :50mM Glu+0. 2mM Pal+100 μ M Exendin-4。图7显示了对RINm_5F细胞内的SIRTl蛋白表达量进行检测的试验结果，图中以 Tubulin蛋白作为参照标准；泳道1 仅有Exendin-4 ；泳道2 :Exendin_4+Glu+Pal ；泳道3 仅有Glu+Pal ；泳道4 空白对照。
具体实施例方式提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供本发明所要求保护的化合物、 组合物、产品、装置和/或方法的制备和评估手段的完全公开和描述，仅仅出于示例性目的，并非意在限制本公开的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以。C为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。在以下实施例中，使用大鼠胰岛瘤细胞RINm-5F细胞系作为胰岛β细胞的代表模型，说明艾塞那肽的作用。实施例实施例1艾塞那肽增加胰岛瘤细胞RINm-5F细胞增殖材料RINm-5F细胞、96孔板。试剂(1)磷酸盐缓冲液(pH 6. 4，0. lmol/L)将 27. 8ml 的 K2HPO4 (lmol/L)和 72. 2ml 的 KH2PO4(ImoVL)混合，将该混合液稀释至1000ml，4°C保存备用。(2)艾塞那肽(合成的Ex-4)用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基配制为ImM 的储液，_20°C储存备用。(3)MTT 称取 250mg MTT，加 50ml PBS (0. 01mol/L, pH 7. 4)在磁力搅拌器上搅拌 30min,用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌，分装，4°C保存，备用。(4)含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基。(5)含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。仪器酶标仪，微量震荡器，CO2培养箱，低速离心机，移液枪。实验方法(1)将RIMm-5F细胞接种于96孔板，每孔5X104个细胞，置于37°C，5% CO2培养箱内培养24h后加入艾塞那肽，每个浓度设五个平行样(计算平均值时，去掉一个比平均值偏差比较大的数值)，继续培养Mh(2)在培养结束前4h，向每孔中加入20 μ 1 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h。(3) 1000转/分离心5min，小心吸弃上清，再加入二甲亚砜150 μ 1/孔，于微量振荡器上缓慢作用lOmin。(4)在酶标仪上于490nm、处波长测光吸收值。
刺激率(％)=刺激孔的_ -对照孔_值χ 100%
对照孔的OD值本实施例的试验结果示于图2，从图2中可以看出，艾塞那肽对于RIMm_5F细胞的增殖有明显的刺激作用，并且该作用具有剂量依赖效应。实施例2葡萄糖和游离脂肪酸诱导胰岛瘤细胞RINm_5F细胞模型的建立材料RINm-5F细胞、96孔板。
试剂(1)磷酸盐缓冲液(pH 6. 4，0. lmol/L)将 27. 8ml 的 K2HPO4 (lmol/L)和 72. 2ml 的 KH2PO4(ImoVL)混合，将该混合液稀释至1000ml，4°C保存备用。(2)MTT 称取 25Omg MTT，加 50ml PBS (0. 01mol/L, pH 7. 4)在磁力搅拌器上搅拌 30min,用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌，分装，4°C保存，备用。(3)含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基。(4)含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。(5)葡萄糖(Glu)和棕榈酸钠(Pal)分别用含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基配制为500mM和10mM。仪器酶标仪，微量震荡器，CO2培养箱，低速离心机，移液枪。实验方法(1)将RIMm-5F细胞接种于96孔板，每孔5X104个细胞，置于37°C，5% CO2培养箱内培养24h后加入不同浓度的葡萄糖和棕榈酸钠，每个浓度设五个平行样(计算平均值时，去掉一个与平均值偏差比较大的数值)，继续培养48h。(2)在培养结束前4h，向每孔中加入20 μ 1 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h。(3) 1000转/分离心5min，小心吸弃上清，再加入二甲亚砜150 μ 1/孔，于微量振荡器上缓慢作用lOmin。(4)在酶标仪上于490nm、630nm处双波长测光吸收值。
权利要求
1.艾塞那肽用于制备用于提高细胞的SIRTl基因转录水平和/或SIRTl蛋白表达水平的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述细胞来自患有2型糖尿病的患者。
3.一种提高细胞的SIRTl基因转录水平和/或SIRTl蛋白表达水平的方法，所述方法包括给予所述细胞有效量的艾塞那肽。
4.艾塞那肽用于提高细胞的SIRT基因转录水平和/或SIRTl蛋白表达水平的用途。
5.一种促进胰岛β细胞增殖和/或抑制胰岛β细胞凋亡的方法，所述方法包括给予所述细胞有效量的艾塞那肽。
6.艾塞那肽用于促进胰岛β细胞增殖和/或抑制胰岛β细胞凋亡的用途。
7.一种提高胰岛β细胞的胰岛素分泌量的方法，所述方法包括给予所述细胞有效量的艾塞那肽。
8.艾塞那肽用于提高胰岛β细胞的胰岛素分泌量的用途。
9.艾塞那肽用于制备在脑缺血后保护脑损伤的药物中的用途。
10.艾塞那肽用于制备预防或延迟糖尿病发病的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种通过使用艾塞那肽来增加脱乙酰化酶表达量的方法。
文档编号A61P3/10GK102210850SQ20101014306
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者于佳一, 李惟 申请人:长春百克生物科技股份公司