专利名称：一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品，属于生物工程技术领域。
背景技术：
通常禽源病毒繁殖主要采用鸡胚繁殖法和细胞培养法，而禽流感病毒因无法直接在细胞中生产繁殖，仍然采用鸡胚繁殖法，通过将病毒接种在鸡胚基质中，在鸡胚生长过程中，病毒复制，达到大量生产病毒的目的，是一种类似于自然生物环境条件下繁殖病毒的方法。鸡胚繁殖法简单易行，不需对病毒进行处理、驯化，分离毒可直接接种鸡胚。但生产需要大量鸡胚，收获病毒液后，需对剩余鸡胚进行无害化处理，且易于感染禽源外源病毒，产生生物安全隐患。
病毒繁殖的另一种常用的方法是细胞繁殖法，将病毒接种于已扩增的动物细胞内，保持细胞活性，通过病毒在细胞间的不断感染和复制，来达到大量扩增病毒的目的。但禽流感病毒直接接种细胞不能感染、增殖。随着研究的深入开展，在二十世纪90年代有研究人员发现在繁殖禽流感病毒时，加入适量的胰酶有助于病毒的增殖，但病毒滴度无法达到生产要求。然而，在生产病毒时，大量、高密度生长良好的细胞是生产高滴度病毒的前提，因此如何解决这一矛盾是细胞培养禽流感病毒成功的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决禽流感病毒细胞繁殖难，而目前禽流感生产大量使用鸡胚又常常导致生物安全隐患的问题，提供一种安全连续封闭式细胞培养病毒生产的方法及产品，使该疫苗的生产能够不再依赖鸡胚繁殖而降低生物安全隐患，同时使用该细胞培养方法也能生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求，在发生疫情时，能够快速提供疫苗。
本发明将通过以下技术方案实现 一、一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤 (1)病毒适应细胞系MDCK细胞的驯化 将病毒适应细胞系MDCK细胞进行无载体培养的驯化，改变其贴壁生长的特性，使其适应全悬浮培养的生长环境； 其中，所述的无载体培养驯化方法为将复苏后经2～3代贴壁培养的MDCK细胞胰酶消化后，按2×105cells/mL密度加入三角摇瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培养基摇床培养，PH 7.1～7.5，40～48小时后，待细胞密度达1～5×106cells/mL时，分瓶传代，同时观察细胞形态，每次传代选取细胞形态良好的摇瓶分瓶传代，按上述方法摇床培养，连传43代，分装，液氮冻存； (2)MDCK细胞的初级扩增培养 将驯化完成的MDCK细胞向细胞培养生物反应器中接种1～5×105cells/mL的细胞，悬浮培养，直至扩增至0.3～1×107cells/mL，实现细胞初级扩增培养； 其中，所述的培养基为含6～10％血清的F-DMEM培养基； 所述的培养条件为溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、温度35～38℃、初级流加速率6L/天，稳定后流加速率3L/天； (3)病毒适应细胞的连续培养 初级扩增培养结束后，在上述细胞培养生物反应器中流加新鲜培养基和泵出细胞悬浮液，以维持生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至0.3～1×107cells/mL，实现细胞连续培养； 其中，所述的培养基为流加培养基为悬浮MDCK的无血清NF-DMEM培养基； 所述的培养条件为溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、温度35～38℃、流加速率3L/天； (4)接种病毒培养制备病毒液 将驯化的已适应细胞繁殖的H9N2亚型禽流感分离株JY株病毒接种于悬浮细胞，改变培养因素，随着细胞悬浮液的不断流入和病毒上清液以同样速度的不断流出，在维持系统动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖，使病毒适应在悬浮培养细胞中扩增病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝价HA≥28； 其中，所述的改变的培养因素为溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、温度32～36℃、流加培养基为悬浮MDCK的含1.2～1.6μg/mL胰酶无血清培养基、流加速率2L/天； (5)病毒浓缩、灭活及制成疫苗产品 其中，病毒液的浓缩及灭活方法为 收集步骤(4)得到的病毒液，预处理后经30KD截流分子量的膜包浓缩至病毒HA血凝效价≥29时，停止浓缩，采用甲醛溶液灭活，使灭活剂终浓度为0.1％，37℃灭活16小时； 其中，灭活疫苗的制备 油相制备取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-806份，混合后，高压灭菌备用； 水相制备取浓缩后灭活的病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解； 乳化取油相3份置于乳化罐中，搅拌的同时缓慢加入水相1份，持续搅拌30～60分钟，搅拌速度800r/min，后通过剪切机2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成禽流感(H9亚型JY株)灭活疫苗； 检测取样5～10mL，以3000r/min离心15分钟，如有分层现象，应重复乳化1次。
二、根据本发明所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法制得的疫苗产品。
本发明的有益效果在于 本发明的技术方案首先避免采用目前禽流感生产大量使用鸡胚的病毒繁殖方法，既避免了生物安全隐患的问题，又克服了疫苗的大量生产受制于鸡胚的供应；其次，本发明提供一种安全连续的封闭式细胞培养病毒生产的方法，用于H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗的制备，使得不仅能使用细胞培养方法，也能同时生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求；最后，由于本发明所述的疫苗的生产方法简单快速，因此能在发生疫情时快速提供疫苗。
具体实施例方式 实施例1 本实施例说明本发明所述的H9N2亚型禽流感分离株JY株的病毒适应细胞系的筛选方法和病毒适应细胞系的最终确定方法。
一、筛选 本发明所述的H9N2亚型禽流感分离株JY株购自中国农科院家禽研究所，毒株代号A型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jiangsu/JY/99(H9N2)株，简称JY株。
本发明所述的用于筛选的待选病毒适应细胞为 MDCK(犬肾细胞)，购自扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室； VERO(非洲绿猴肾细胞)，购自上海交通大学药学院。
(1)将H9N2亚型禽流感分离株JY株接种于MDCK细胞，在Ax Cevir-MDCK无血清培养基中控制培养条件为PH值7.0～7.4、温度32～36℃、胰酶浓度1.0～2.0μg/mL，细胞代次不超过51代，病毒代次不超过12代，测定病毒繁殖滴度达到≥107.0TCID50/mL、HA血凝价≥28以使得病毒毒株适应细胞，确定培养条件为PH值7.0～7.2、温度33±1℃、胰酶浓度1.1～1.6μg/mL； (2)或者，将H9N2亚型禽流感分离株JY株接种于VERO细胞，在NCTC135培养基中控制培养条件为PH值7.0～7.4、温度32～38℃、胰酶浓度1.0～2.0μg/mL，细胞代次不超过51代，病毒代次不超过12代，测定病毒繁殖滴度达到≥107.0TCID50/mL、HA血凝价≥28以使得病毒毒株适应细胞，确定培养条件为PH值7.0～7.2、温度33±1℃、胰酶浓度1.2～1.5μg/mL。
二、细胞的选定 将H9N2亚型禽流感分离株JY株在实施例1中的细胞系上于(1)对应的适宜的培养条件下不断传代15次，传代培养方法分为细胞培养和病毒增殖两阶段 细胞培养阶段选用含6～10％血清的DMEM培养基，PH值7.0～7.4、培养温度36.5±1℃、培养时间36～48小时； 病毒增殖阶段采用含少量胰酶的无血清Ax Cevir-MDCK培养基，PH值7.0～7.4、培养温度33±1℃、培养时间24～96小时。
传代结束后，同时对下述病毒特性进行鉴定 (1)鉴定病毒的特异性 用灭菌生理盐水将毒种稀释成含4HA单位的抗原液，分别与ND、EDS、H5亚型禽流感、H7亚型禽流感阳性血清，SPF鸡血清和H9亚型禽流感阳性血清作HI试验，毒种对H9亚型禽流感阳性血清应为阳性，对ND等其它阳性血清及SPF鸡血清均应为阴性。
(2)鉴定免疫原性 将收获的细胞毒液，经甲醛溶液灭活后，加油佐剂制成油包水型灭活疫苗(具体方法参见实施例5)，按以下方法进行检验 首先，从山东SPF鸡场购买SPF蛋，在相对隔离的条件下孵化，隔离器饲养。
血清学方法用21～28日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2mL，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不小于7log2，对照组HI抗体效价的几何平均值应不大于2log2。
其中，A、禽流感(H9亚型)血凝抑制试验抗原制造及检验标准为 a、抗原制造 病毒繁殖取A型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/JY/99(H9N2)株生产用毒种，用SPF鸡胚繁殖病毒，收获鸡胚液。
灭活取含毒鸡胚液，加入10％甲醛溶液，使其终浓度均为0.1％，37℃灭活16小时。
配制灭活后的鸡胚液，加入灭菌甘油25％，充分混匀，定量分装，保存于2～8℃。
b、检验 性状白色或淡黄色液体。
无菌检验按《中国兽药典》进行，应无菌生长。
效价测定按瓶签标明的量用灭菌生理盐水进行稀释，用微量法测定HA效价，应≥7.0log2。
特异性检验分别与ND、EDS76、H5亚型禽流感、H7亚型禽流感阳性血清，SPF鸡血清和H9亚型禽流感阳性血清作HI试验，抗原对H9亚型禽流感阳性血清应为阳性，对ND等其他阳性血清及SPF鸡血清应为阴性。
B、禽流感(H9亚型)血凝抑制(HI)试验操作术方法为 a、取微量反应板，分别向1～11孔中加入0.025mL生理盐水，第12孔中加入0.05mL生理盐水。
b、吸取0.025mL血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取0.025mL至第2孔，依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL，弃去。
c、分别向1～11孔中加入含4HA单位的抗原0.025mL，室温下静置30～40分钟。
d、每孔中加入0.025mL 1％(V/V)鸡红细胞悬液，轻轻混匀，室温下静置30～40分钟。对照红细胞将呈显著纽扣状。
e、结果判定将反应板倾斜后判定结果。当阴性对照血清HI≤2log2、阳性对照血清HI效价与已知结果相比，误差≤1log2时，试验方可成立。以完全抑止4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。
免疫攻毒法用21～28日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2mL，另5只作对照。接种后21～28日，用1∶10稀释的AIV JY毒种进行翅静脉注射，每只鸡0.2mL。攻毒后第5日，分别采集每只鸡的泄殖腔拭子，每个样品经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2mL，孵育观察5日，逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚液的HA效价≥1∶16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。免疫组应至少有9只鸡病毒分离阴性，对照组应至少有4只鸡病毒分离阳性。
(3)鉴定毒力 对鸡胚的毒力用灭菌生理盐水将毒种作1∶10000稀释，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚20枚，每胚0.1mL(约103.0EID50)，接种后24～96小时内，应至少有18个鸡胚死亡。剖检观察，死亡鸡胚应出现全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。
对雏鸡的毒力用灭菌生理盐水将毒种作1∶10稀释，翅静脉接种4～8周龄SPF鸡10只，每只鸡0.2mL，接种后观察10日，鸡只应不出现死亡或明显异常反应但有个别鸡出现轻微的呼吸道症状。接毒后第5日，采集泄殖腔拭子，用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒，至少9只病毒分离阳性。
(4)进行基因序列分析 引物的设计与合成根据GenBank登录的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/1/94株的HA基因序列(登录号AF156380)和NA基因序列(登录号AF156398)设计2对引物，分别扩增细胞化JY株病毒的HA基因和NA基因部分编码区。
HA15’-atggaaacaatatcactaataa-3’ HA25’-aagatccattggacatggccca-3’ NA15’-atgaatccaaatcagaagataata-3’ NA25’-tatagccatgaaattgatattcgc-3’ 细胞化JY株的HA和NA基因编码区的扩增及克隆病毒RNA的提取如J.萨姆布鲁克等人著的《分子克隆实验指南》所述步骤进行。经过反转录后进行PCR扩增。反应条件为94℃变性40s，48℃退火1min，72℃延伸1min；运行5个循环后，继续按下列条件运行94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸1min；运行30个循环后，72℃延伸10min，4℃运行10min。PCR产物经凝胶电泳鉴定，用核酸纯化试剂盒回收获得目的片断，并克隆到pMD18-T载体上，构建重组质粒pT-HA和pT-NA。
细胞化JY株的HA和NA基因编码区核苷酸测序将经过鉴定的阳性质粒pT-HA和pT-NA进行测序，测得的序列与与原胚毒化的JY株的HA和NA序列进行比较，并与GenBank上的4株H9N2亚型和5株H5N1亚型禽流感病毒的HA和NA序列进行同源性比较，确定该细胞化JY株病毒的基因序列是否发生改变。
上述鉴定和分析结束后的结果证明，实施例1所述(1)的细胞系培养的病毒与原分离毒株在特异性、毒力、免疫原性方面与原毒株没有发生明显改变，即确定采用细胞系为MDCK细胞。
实施例2 本实施例说明经实施例1确定的病毒适应细胞系MDCK细胞的驯化方法。
将病毒适应细胞系MDCK细胞进行无载体培养的驯化，改变其贴壁生长的特性，使其适应全悬浮培养的生长环境 将复苏后经2～3代贴壁培养的MDCK细胞胰酶消化后，按2×105cells/mL密度加入三角摇瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培养基摇床培养，PH 7.5～7.1，40～48小时后，待细胞密度达1～2×106cells/mL时，分瓶传代，同时观察细胞形态，每次传代选取细胞形态良好的摇瓶分瓶传代，按上述方法摇床培养，连传43代，分装，液氮冻存。
实施例3 病毒适应细胞的初级扩增培养和连续培养方法。
(1)初级扩增培养 将驯化完成的MDCK细胞向5L细胞培养生物反应器中接种1～5×105cells/mL的细胞，悬浮培养，直至扩增至0.3～1×107cells/mL，实现细胞初级扩增培养； 其中，所述的培养基为含6～10％血清的F-DMEM培养基； 所述的培养条件为溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、温度35～38℃、初级流加速率6L/天，稳定后流加速率3L/天； (2)连续培养 初级扩增培养结束后，在上述细胞培养生物反应器中流加新鲜培养基和泵出细胞悬浮液，以维持生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至0.3～1×107cells/mL，实现细胞连续培养； 其中，所述的培养基为流加培养基为悬浮MDCK的无血清NF-DMEM培养基； 所述的培养条件为溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、温度35～38℃、流加速率3L/天。
实施例4 本实施例说明将病毒接种并培养制备病毒液的方法。
将实施例2中驯化后的已适应细胞繁殖的H9N2亚型禽流感分离株JY株病毒接种于5L的病毒增殖反应器的悬浮细胞中培养，接种感染复数0.01的病毒，改变培养因素为溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、温度32～36℃、流加培养基为悬浮MDCK专用的含1.2～1.6μg/mL胰酶无血清培养基、流加速率2L/天，使病毒在悬浮培养细胞中感染增殖，使病毒适应在悬浮培养细胞中扩增病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝价HA≥28； 泵出细胞悬浮液至100L的病毒增殖反应器接入禽流感病毒，随着细胞悬浮液的以40L/天不断流入和病毒上清液的不断流出，在维持系统动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖，最终得到的病毒上清液的病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝价HA≥28。
实施例5 本实施例说明将病毒上清液浓缩、灭活及制备成疫苗产品的方法。
病毒液的浓缩及灭活 收集实施例4中最终得到的病毒液，经30KD截流分子量的膜包浓缩至病毒HA血凝效价≥29时，停止浓缩，采用甲醛溶液灭活，使灭活剂终浓度为0.1％，37℃灭活16小时，可以完全灭活病毒。
灭活疫苗的制备 (1)油相制备取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-806份，混合后，高压灭菌备用； (2)水相制备取浓缩后灭活的病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解； (3)乳化取油相3份置于乳化罐中，搅拌的同时缓慢加入水相1份，持续搅拌30～60分钟，搅拌速度800r/min，后通过剪切机2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成禽流感(H9亚型JY株)灭活疫苗； (4)检测取样5～10mL，以3000r/min离心15分钟，如有分层现象，应重复乳化1次。
实施例6 本实施例说明得到的疫苗产品的效果实验。
一、免疫抗体水平与攻毒保护关系的试验 其中，H9亚型阳性血清购自哈尔滨兽医研究所；SPF鸡胚及试验用鸡，从山东SPF鸡场购买SPF蛋，在相对隔离的条件下孵化，隔离器饲养。
试验方法 1、免疫将4周龄的SPF鸡随机分成9个试验组，每组10只，阴性对照组为5只。每批疫苗分3个试验组，第1组疫苗颈部皮下接种试验鸡10只，接种剂量0.02mL/只；第2组疫苗接种试验鸡10只，0.1mL/只；第3组疫苗接种试验鸡10只，0.2mL/只。三批疫苗均以此方法免疫接种。
2、血清抗体HI的测定免疫后3周，采集每只鸡血清，按现行《中国兽药典》附录方法测定试验组和阴性对照组每只鸡的HI抗体效价。
3、攻毒试验试验组鸡免疫3周后，用10倍稀释的禽流感病毒JY株E1代病毒液静脉注射攻击试验组和对照组鸡，攻击5天后，采集泄殖腔棉拭子，用10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。以从泄殖腔没有分离到病毒判定为免疫攻毒保护。
试验结果 三批疫苗按照不同的剂量对4周龄的SPF鸡进行免疫，疫苗免疫剂量、HI抗体效价和抗攻毒保护之间的关系见表1。从结果可见，免疫0.2mL剂量组共保护30/30(100％)，HI抗体效价几何平均值均≥7.4log2；免疫0.1mL剂量组共保护30/30(100％)，HI抗体效价几何平均值均≥6.8log2，免疫0.02mL剂量组共保护25/30(83.3％)，HI抗体效价几何平均值均≥4.9log2。对照组5只，HI抗体效价0，攻毒保护为1/5(20％)。疫苗免疫剂量与攻毒保护率表现出一定的相关性，随着免疫剂量的加大，免疫组鸡获得攻毒保护的数量增多，但这种差异没有统计学意义上的差异；血清HI抗体效价与抗攻毒保护则呈现明显的正相关。
表1疫苗免疫剂量、HI抗体效价和攻毒保护之间的关系
注分母为接种鸡的数量，分子为病毒分离阴性鸡的数量 三批疫苗按照不同的剂量对4周龄的SPF鸡进行免疫，HI抗体效价和攻毒保护之间的关系见表2，结果表明，免疫后血清HI抗体效价与攻毒保护率呈正相关。HI≤2log2，攻毒保护率为20％；HI≥5log2，攻毒保护率为100％。
表2免疫后HI抗体效价与攻毒保护的平行关系
注分母为接种鸡的数量，分子为病毒分离阴性鸡的数量；括号内数字为保护百分率 本试验结果表明，禽流感(H9亚型)病毒JY株灭活疫苗免疫剂量与攻毒保护呈现一定的正相关，但表现不明显。血清HI抗体效价与抗攻毒保护呈现较明显的正相关性，HI抗体≥5log2，即可获得100％攻毒保护，因此，HI抗体效价可作为疫苗效检的判定标准。即HI抗体≥5log2，可获得100％攻毒保护，则该疫苗免疫效力合格。考虑到泄殖腔病毒分离具有一定的不确定性，为保证疫苗的免疫效力，在用免疫HI抗体滴度作为疫苗效力评价指标时，规定HI抗体滴度几何平均值≥7log2，同时阴性对照组鸡HI抗体滴度≤2log2时，判定该疫苗合格。
二、疫苗的免疫效力及最小免疫剂量试验 其中，试验鸡为SPF鸡，SPF种蛋购自山东家禽所SPF鸡场，孵化后在负压隔离器内饲养； 标准抗原和抗血清为禽流感(H9亚型)抗原和抗血清，灭活的抗原HA效价≥1∶128；抗血清HI≥1∶64。
试验方法 1、分组及免疫将三批疫苗分别以20μL/只、0.1L/只、0.2mL/只接种21日龄的SPF鸡每组各免疫10只，各组鸡分别设对照5只，每组鸡都进行编号，各组鸡隔离饲养； 2、免疫21天后，检测抗禽流感(H9亚型)的HI抗体；然后用禽流感(H9亚型)JY株(静脉注射10倍稀释的病毒尿囊液，0.2mL/只)分别攻击。攻毒5天后，分别采集每只鸡泄殖腔拭子，每个样品经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，0.2mL/胚，37℃孵育5日，逐胚测定HA，每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚液的HA效价≥1∶16(微量法)，即可判定为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，再盲传1代后判定。以确定免疫效力及禽流感(H9亚型)JY株部分的最小免疫剂量。
试验结果 从表3中可以见到，分别以20μL、0.1mL、0.2mL，免疫不同日龄的SPF鸡。在免疫后21天，每只免疫20μL的免疫组，HI抗体几何平均值≥5log2，攻毒保护率可达到85％；免疫0.1mL、0.2mL的两组鸡，抗禽流感(H9亚型)的HI抗体几何平均值均≥7log2，攻毒保护SPF鸡达到100％，与实验室前期研究结果相符。根据上述实验结果，确定疫苗最小免疫剂量为0.1mL，免疫21天后，HI抗体几何平均值≥7log2。考虑实际应用中的复杂性，及饲养条件与实验室的差异等不利因素，为确保免疫效果的可靠性，推荐免疫剂量为0.2mL/只。
表3二联疫苗禽流感(H9亚型)部分免疫效力试验
注HI抗体滴度为10只鸡抗体的几何平均数，表示为X±SD，X代表平均值，SD代表离散度
权利要求
1.一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤
(1)病毒适应细胞系MDCK细胞的驯化
将病毒适应细胞系MDCK细胞进行无载体培养的驯化，改变其贴壁生长的特性，使其适应全悬浮培养的生长环境；
(2)MDCK细胞的初级扩增培养
将驯化完成的MDCK细胞向细胞培养生物反应器中接种1～5×105cells/mL的细胞，悬浮培养，直至扩增至0.3～1×107cells/mL，实现细胞初级扩增培养；
(3)病毒适应细胞的连续培养
初级扩增培养结束后，在上述细胞培养生物反应器中流加新鲜培养基和泵出细胞悬浮液，以维持生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至0.3～1×107cells/mL，实现细胞连续培养；
(4)接种病毒培养制备病毒液
将驯化的已适应细胞繁殖的H9N2亚型禽流感分离株JY株病毒接种于悬浮细胞，改变培养因素，随着细胞悬浮液的不断流入和病毒上清液以同样速度的不断流出，在维持系统动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖，使病毒适应在悬浮培养细胞中扩增病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝价HA≥28；
(5)病毒浓缩、灭活及制成疫苗产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)的无载体培养驯化方法为将复苏后经2～3代贴壁培养的MDCK细胞胰酶消化后，按2×105cells/mL密度加入三角摇瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培养基摇床培养，PH 7.1～7.5，40～48小时后，待细胞密度达1～5×106cells/mL时，分瓶传代，同时观察细胞形态，每次传代选取细胞形态良好的摇瓶分瓶传代，按上述方法摇床培养，连传43代，分装，液氮冻存。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中的培养基为含6～10％血清的F-DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中所述的培养条件为溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、温度35～38℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中流加的培养基为悬浮MDCK的无血清NF-DMEM培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中所述的培养条件为溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、温度35～38℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中所述的改变的培养因素为溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、温度32～36℃、流加培养基为悬浮MDCK的含1.2～1.6μg/mL胰酶无血清培养基。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(5)的病毒液的浓缩及灭活方法为收集步骤(4)得到的病毒液，预处理后经30KD截流分子量的膜包浓缩至病毒HA血凝效价≥29时，停止浓缩，采用甲醛溶液灭活，使灭活剂终浓度为0.1％，37℃灭活16小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(5)的将浓缩及灭活后病毒液制备成疫苗产品的方法为
油相制备取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-806份，混合后，高压灭菌备用；
水相制备取浓缩后灭活的病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解；
乳化取油相3份置于乳化罐中，搅拌的同时缓慢加入水相1份，持续搅拌30～60分钟，搅拌速度800r/min，后通过剪切机2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成H9N2亚型禽流感灭活疫苗；
检测取样5～10mL，以3000r/min离心15分钟，如有分层现象，应重复乳化1次。
10.根据权利要求1所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
全文摘要
本发明涉及一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品，其技术要点主要涉及病毒适应细胞系的筛选、确定、驯化，病毒适应细胞的初级扩增培养和连续培养、接种病毒培养制备病毒液以及最终的灭活及疫苗产品的制备。本发明首先避免采用目前禽流感生产大量使用鸡胚的病毒繁殖方法，既避免了生物安全隐患的问题，又克服了疫苗的大量生产受制于鸡胚的供应；其次，本发明提供一种安全连续的封闭式细胞培养病毒生产的方法，用于H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗的制备，使得不仅能使用细胞培养方法，也能同时生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求；最后，由于本发明所述的疫苗的生产方法简单快速，因此能在发生疫情时快速提供疫苗。
文档编号A61P31/16GK101816785SQ20101015974
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者李玉和, 沈明君, 范娟, 季明, 潘杰 申请人:扬州优邦生物制药有限公司