专利名称：一种新城疫病毒感染免疫复合物疫苗的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA疫苗的制备和应用，具体涉及一种新城疫病毒感染免疫复合物疫苗的制备方法和应用。
背景技术：
新城疫(Newcastle Disease，ND)，又称亚洲鸡瘟，伪鸡瘟等，是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性高度接触性传染病。典型新城疫特征为体温升高，食欲减退，垂头缩颈或翅膀下垂，病鸡咳嗽，呼吸困难，嗉囊内充满液体内容物， 常有酸臭液体从口内流出，有的病鸡还出现神经症状，下痢，泄殖腔出血、坏死，腺胃乳头、 腺胃和肌胃交界处以及十二指肠出血，慢性病例常有呼吸道症状或神经症状。虽然现在广泛接种疫苗用于预防该病，但仍不时在养禽业中造成惨重的经济损失，当前仍是最主要和最危险的禽病之一。目前，控制该病的主要措施还是通过接种疫苗，但不论是灭活苗还是活疫苗都各有优缺点，面对新城疫常规疫苗的缺陷，许多研究者都致力于新型疫苗的研制工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新城疫病毒感染免疫复合物疫苗的制备方法和应用，通过被动免疫(疫苗)与主动免疫(特异性抗体)措施结合，及时而长久地使动物对病原微生物的感染起保护作用，在免疫措施、方法、剂量等方面进行研究，探讨其可行性，并通过动物攻毒试验评价被动与主动联合免疫的保护效果。本发明的新城疫病毒感染免疫复合物疫苗的制备方法，具体包括以下步骤1)以新城疫病毒上海株为种毒制备抗原及灭活苗；2)由鸡血清中的抗体转移至蛋黄中形成蛋黄抗体IgY ；3)将上述制备的灭活苗和蛋黄抗体IgY等体积混合，孵育，即制得本发明的免疫复合物疫苗。所述抗原的血凝价大于1 28的尿囊液，所述抗原加入0.2% (ν/ν)的甲醛，经 42°C水浴12h，即制得所述灭活苗。所述蛋黄抗体IgY的血凝抑制价大于1 21(1。本发明由鸡血清中的抗体转移至蛋黄中形成蛋黄抗体IgY，它与血清中的抗体具有相同的特异性和灵敏度，因而从鸡蛋中提取抗体不需要采血而且抗体的量较大。本发明所制得的免疫复合物疫苗可用于抑制新城疫病毒感染。
图1为免疫后鸡体内抗体水平图，其中+为抗原抗体复合物疫苗，_■一为灭活疫苗，+为阴性对照。图2为RT-PCR检测结果，其中M、1 4为接种Lasota灭活疫苗RT-PCR的检测结果，5 8为接种sh09NDV免疫复合物疫苗RT-PCR的检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。新城疫病毒上海株、Lasota灭活苗、sh09和F48E9病毒均由上海农科院畜牧所病
毒实验室保存。PEG、PEG_8000购自上海捷倍思基因技术有限公司，硫酸铵购自上海实验试剂有限公司。Trizol-A+总RNA提取试剂购自上海皓嘉科技发展有限公司。实施例1抗原及灭活苗的制备以新城疫病毒上海株为种毒，经尿囊腔接种，具体方法是取9 10日龄SPF鸡胚(购自北京SPF鸡场)，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的1Λ处用碘酊和酒精消毒。用钢锥打一小孔，将针头刺入约1. 5cm，注入病毒液0. 1 0. 5mL，用熔化的石赌封孔，置孵卵箱内继续孵育。24h时取出照蛋，将死亡的鸡胚弃掉，其余放入孵育箱，在48 60h内再次照蛋，将活的鸡胚放入4°C冰箱，24h后取出收获其尿囊液，用血凝试验(HA试验)测定其血凝价，血凝价大于1 28的尿囊液经检验合格后保存备用。以上制备的抗原加入0.2% (ν/ν)的甲醛，经42°C水浴12h，获得灭活苗。实施例2蛋黄抗体IgY的制备用实施例1制备的灭活苗免疫SPF产蛋鸡四次后，收集产下的鸡蛋，用PEG和硫酸铵沉淀来制备蛋黄抗体(IgY)。具体过程如下从鸡蛋中小心分离蛋黄，将IOml蛋黄液、40ml 0. lmol/LpH7. 4的磷酸盐缓冲液 (PBS)，混勻，以4500r/min离心30min，取上清液加入PEG-8000，使浓度为6wt%，在室温下搅拌溶解，4°C 12000r/min离心15分钟，得到的蛋黄抗体IgY溶解于IOmL PBS中，再缓慢加入PEG-8000使浓度为15wt%，沉淀后离心以纯化IgYjf IgY溶于50mL PBS中，缓慢加入饱和硫酸铵使终浓度达到50 % (ν/ν)，40C 12000r/min离心15分钟，沉淀溶于PBS中，再在PBS中透析过夜以除去饱和硫酸铵。用血凝抑制试验(HI试验)测定血凝抑制价，血凝抑制价大于1 21°的抗体经检验合格后保存备用。实施例3免疫复合物疫苗的制备将实施例1制备的灭活苗和实施例2制备的抗体等体积混合，20°C孵育1小时，即得本发明的免疫复合物疫苗。实施例4免疫试验取45只SPF鸡，随即分三组。第一组每只注射生理盐水0. 2mL/只做为阴性对照。第二组每只注射NDV灭活苗0. 2mL/只。第三组每只注射免疫复合物疫苗0. 2mL/只，在接种后十五天按相同剂量加强免疫一次。每隔一周随即取上述鸡只，测其血清HI效价。对测得的血清HI效价，取各组的平均值，绘图，参见图1。结果表明注射免疫复合物疫苗的鸡体内抗体HI效价上升较显著， 明显高于只注射灭活疫苗组。实施例5攻毒试验取80只SPF鸡，随即分4组，前三组接种的剂量和方法同实施例4。第四组每只注射Lasota灭活苗0. 2mL/只在免疫后35天攻毒，注射106LD50的sh09和F48E9病毒各0. ImL,比较各组的免
疫保护率。对各组的抗体效价和存活率进行相互比较，结果参见表1。可以看到Sh09品系 Lasota接种组存活率为0，Sh09组在攻毒实验后存活率显著地高于阴性对照组。免疫复合物疫苗可以很好的应对sh09，即使在接种低效价的疫苗时，死亡率也为零，而阴性对照组为 100%死亡率。最低剂量l(fEID50的疫苗完全具有保护性，其血清中和反应效价同那些被免疫100倍量的病毒的小鸡具有一样高的的水平。表1免疫复合物疫苗应对sh09和F48E9病毒的免疫保护效果
组别疫苗效价 (EID50)HI titer at 34 DPI (Iog2)接种病毒存活率(％)sh090/15 (0)阴性对照00F48E90/15 (0)
，sh092/15 (13.3)
IO76.5 土 0.6 -
F48E95/15 (33.3)
ssh093/15 (20)
Sh09IO87.3 土 0.9 -
F48E97/15 (46.8)
。sh0915/15(100)
IO911.8 士 0.3 -
F48E915/15 (100)
，sh0915/15(100)
IO712.5 土 0.6 -
F48E915/15 (100)
Sh09 免疫ssh0915/15 (100)
IO813.3 士 0.5 -
复合物F48E915/15 (100)
。sh0915/15 (100)
IO913.8 土 0.4 -
____F48E9__15/15 (100)
sh090/15 (0)
10811.6 士 0.8 -^―
Lasota __14/15 (93.
Osh090/15 (0)
10912.4 士 0.3 -^―
____F48E9__15/15 (100)
5
实施例6攻毒后RT-PCR检测新城疫病毒通过对病毒在鸡体内的繁殖情况来测试NDV免疫复合物的效果，在用sh09品系进行攻毒后3天，用RT-PCR检测病毒的数量。取攻毒后的鸡脑组织样品0. lg，按Trizol-A+提取总RNA说明书进行RNA提取。根据NDV-HN基因序列，设计合成一对特异性引物，引物序列如下上游弓丨物AATGCGGCCGCAATGGACCGCGCCGTTAGC下游引物TATTTGAGGATCTCAACTAGTAACGGAAC根据宝生物提供的PT-PCR反应体系进行扩增，PCR参数为94°C预变性3min，94°C 变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，35个循环，最后72°C延伸lOmin，结果参见图2。可以看出sh09免疫复合物接种组没有检测到病毒的存在，但在所有接种Lasota灭活疫苗的鸡中都检测到了 NDV病毒的存在。该实验进一步证明本发明的sh09NDV免疫复合物疫苗完全地抑制了病毒在鸡体内的繁殖。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
1.一种新城疫病毒感染免疫复合物疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)以新城疫病毒上海株为种毒制备抗原及灭活苗；2)由鸡血清中的抗体转移至蛋黄中形成蛋黄抗体IgY;3)将上述制备的灭活苗和蛋黄抗体IgY等体积混合，孵育，即制得本发明的免疫复合物疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原的血凝价大于1 28的尿囊液，所述抗原加入0.2% (ν/ν)的甲醛，经水浴，即制得所述灭活苗。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋黄抗体IgY的血凝抑制价大于 1 210。
4.权利要求1所制备的免疫复合物疫苗在抑制新城疫病毒感染中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新城疫病毒感染免疫复合物疫苗的制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤1)以新城疫病毒上海株为种毒制备抗原及灭活苗；2)将鸡血清中的抗体转移至蛋黄中形成蛋黄抗体IgY；3)将上述制备的灭活苗和蛋黄抗体IgY等体积混合，孵育，即制得本发明的免疫复合物疫苗。本发明通过将被动免疫(疫苗)与主动免疫(特异性抗体)措施结合，及时而长久地使动物对病原微生物的感染起保护作用。
文档编号A61P31/14GK102233133SQ20101016602
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者刘成倩, 易建中 申请人:上海市农业科学院