一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法

文档序号:993534阅读:334来源:国知局
专利名称:一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法
技术领域
本发明涉及一种药物的筛选方法,具体涉及一种用模式生物斑马鱼快速筛选抗肝损伤药物的新方法。

背景技术
抗肝损伤药物筛选研究常包括体内(动物)和体外(细胞、分子等)试验。体内抗肝损伤试验常采用小鼠、大鼠等动物进行,主要的肝损伤模型有急性肝损伤模型和慢性肝损伤模型研究。其中对于抗肝损伤药物的快速筛选目前大多选用小鼠急性肝损伤模型,但由于小鼠体内实验所需药物用量大,实验成本高,不利于少量药物的快速筛选,尤其是从中药中提取得到的单体化合物的量有时极少,用小鼠模型筛选抗肝损伤药物受到了限制。体外抗肝损伤药物筛选研究多采用细胞、分子等方法,方法简单、条件可控,适用于肝损伤药物的快速初筛,但离体细胞、分子等难以精确地模拟复杂的体内过程,试验过程常出现假阳性结果。因此,建立一种既能较好的模拟在体过程,又能快速方便预测抗肝损伤药物的保肝功效的研究方法具有重要意义。斑马鱼是一种极好的模式生物,是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜,所需空间场地不大,易于室内大规模繁殖。成体鱼长3~4cm,一次交配能获得100~200个胚胎,每周产卵一次,这样中等规模的鱼缸每年就能养殖成鱼数百万只,成本仅为养小鼠的0.1%-1%。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当,且在蛋白质水平上,其关键部位的同源性几乎是100%,所以可用斑马鱼模拟人类疾病。目前,人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型,如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病。如中国专利200810019040.5公开了一种用斑马月鱼研究药物毒性的方法,专利200780051025.2公开了一种通过干细胞营养进行的器官的形成和以及酒精损伤器官的再生方法,200310108710.8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病,斑马鱼已在国内外成为一种热门的药学研究工具,目前斑马鱼的研究主要限于发育遗传学方面,尚未见在抗肝损伤药物研究方面的应用。


发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种操作方便、成本低、实验结果准确、所需受试药物量少,用模式生物斑马鱼快速筛选出抗肝损药物的新方法。
技术方案为了实现以上目的,本发明采取的技术方案为 一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,具体包括以下步骤 (1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里,随即分为正常对照组、空白对照组、受试药物组,每组斑马鱼数量相等,空白对照组和受试药物组加入四氯化碳,使四氯化碳的摩尔浓度为0.5~2mmol/L,正常对照组加入等量的溶媒,持续造模3~5天,即得急性肝损伤斑马鱼模型,备用; (2)将受试药物配成所需浓度,加入到受试药物组的水溶液中,正常对照组和空白对照组加入等量的蒸馏水,给药48小时至72小时后,将各组斑马鱼取出处死,取各组斑马鱼肝脏随机分为2份,一份制成1%的肝组织匀浆,检测匀浆中ALT、AST水平和总蛋白含量,并计算匀浆中每克蛋白的ALT、AST水平,另一份肝脏组织标本经浓度10%福尔马林溶液固定,石蜡切片,H-E染色,光镜下观察各组斑马鱼肝组织的病理改变情况,进行病理分级评分,正常为1分,轻微脂肪变性为2分,中度病变为3分,脂肪变性严重者为4分,评价并筛选各组受试药物的抗肝损伤活性。
作为优选方案,以上所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其中步骤(1)用四氯化碳造模时,四氯化碳的终摩尔浓度为1mmol/L。因为四氯化碳的浓度如果太高,可能会对斑马鱼产生严重的毒性,导致斑马鱼大量死亡,从而使造模实验失败,但是如果四氯化碳的浓度过低,不能对斑马鱼的肝脏产生损伤,同样也不能得到符合要求的急性肝损伤模型,本发明通过对不同浓度的四氯化碳浓度进行筛选,以斑马鱼肝损伤为评价指标,得出最佳造模所需的四氯化碳浓度为1mmol/L。
作为优选方案,以上所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其中步骤(1)造模时所用的四氯化碳的极性比较小,不能很好的溶解在水溶液里,从而影响造模的成功,本发明在四氯化碳中加入适量二甲基亚砜即DMSO作为助溶剂,控制二甲基亚砜在溶液中的终浓度为0~1%,对斑马鱼的正常活动无影响,而正常对照组中相应加入等量的DMSO,以保证实验的科学性。
作为优选方案,本发明所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其中步骤(1)所述的造模时间为3天,因为如造模时间过短,斑马鱼肝脏未能发生病变,造模不能符合要求,但是如果造模时间太长,斑马鱼可能出现耐受,甚至死亡,也会导致造模失败,本发明通过对不同的造模时间进行筛选,确定四氯化碳造模的最佳时间为3天。
作为优选方案,本发明所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其中步骤(2)中在给药72小时后将各组斑马鱼取出处死,且步骤(2)采用全自动生化分析仪检测各组斑马鱼肝脏组织匀浆中的ALT、AST水平,并以ALT和AST的水平为指标评价各受试药物的抗肝损活性。
作为优选方案,本发明所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,筛选的受试药物可为化学药品、中药及其提取物、中药复方及其提取物、天然药物,或它们的组合物,且和小鼠等动物模型相比,本发明提供的筛选抗肝损伤药物的新方法,所需受试药物的量在10~100μg之间就可以进行实验,应用范围更广。
与小鼠、大鼠、犬等哺乳动物不同,斑马鱼的体积较小,口服或注射给药方式很困难,因此,步骤(1)中本发明将四氯化碳溶液溶解于斑马鱼所生活的水中,斑马鱼会自主连续的从溶液中吸收四氯化碳从而造成肝损伤;斑马鱼成体鱼长约3~4cm,其体内血液量极微量,难以实现采血,故检测血清生化指标观察肝功能的可行性存在问题,实验研究发现,斑马鱼的肝脏组织在其体内所占比例相对较大,解剖取肝脏进行病理组织学检查及肝脏组织中生化指标的检测相对可操作性较强,而且直接观察斑马鱼的肝脏病理改变及生化指标较其它指标更明显、客观,并可在相同条件下重复进行实验。因此,本发明通过测定斑马鱼肝组织匀浆中丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)水平来评价斑马鱼的肝脏功能,并通过肝脏组织病理学检查进一步评价其肝脏组织病变的程度,此方法可操作性强。
有益效果本发明提供的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法和现有技术相比具有以下优点 本发明提供的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法的制备方法,造模成功率高,可以模拟体内环境进行快速筛选,可操作性强,实验结果准确,尤其是所需受试药物量少,可重复性强,成本低,应用范围广泛,且可成批量进行筛选实验,工作效率高。

具体实施例方式 根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1急性肝损伤造模筛选实验 1、斑马鱼急性肝损伤模型所用四氯化碳浓度的选择 取斑马鱼成体鱼60条,分别置于含有200mL溶液的瓶中,每瓶2条,随机分成正常对照组,不同浓度的四氯化碳组,每组含10条斑马鱼成体鱼,四氯化碳组分别给与不同浓度的四氯化碳,由于四氯化碳极性低,因此加入适量的DMSO助溶,各实验组终溶液中DMSO的浓度低于1%,对斑马鱼的正常活动无影响,而正常对照组中相应加入含有等量DMSO的纯净水,以保证实验的科学性。加入四氯化碳后不同时间点动态观察斑马鱼的活动情况,记录其24小时内死亡数,计算死亡率。具体实验结果如表1所示。
表1不同浓度四氯化碳对斑马鱼肝损伤情况

由表1实验结果表明,当四氯化碳浓度超过2mmol/L时,部分斑马鱼出现典型的中毒症状,剧烈游动、甩尾和扭动,部分鱼很快死亡,当四氯化碳浓度超过5mmol/L时,所有斑马鱼在1小时内全部死亡。而当四氯化碳浓度低于1mmol/L时,则斑马鱼的活动状态与正常组无异。因此,斑马鱼较适宜和易耐受的四氯化碳最高浓度为1~2mmol/L,作为最佳选择,本发明在用四氯化碳造成斑马鱼肝损伤模型时,选用1mmol/L浓度的四氯化碳溶液。
2、斑马鱼急性肝损伤模型造模时间的考查 取斑马鱼成体鱼100条,分别置于含有200mL溶液的瓶中,每瓶2条,随机分成5组,每组含20条。其中1组为正常对照组,其它4组为四氯化碳组,四氯化碳组加入用DMSO助溶的四氯化碳,使四氯化碳的终浓度为1mmol/L进行造模实验,正常对照组加入含有等量DMSO的纯净水,加入四氯化碳后不同时间点动态取斑马鱼肝组织进行各项指标检测,观察肝损伤模型有无形成,每组20条鱼所取肝脏随机分为2份,每份为10条鱼的肝脏,一份制成1%的肝组织匀浆,以全自动生化分析仪检测匀浆中ALT、AST水平,另一份肝脏组织标本经常规10%福尔马林液固定,石蜡切片,H-E染色,光镜下观察各组斑马鱼肝组织的病理改变情况。根据肝组织匀浆中ALT、AST水平及肝脏病理组织学检查结果评价斑马鱼肝损伤程度。具体实验结果如表2所示。
表2四氯化碳作用于斑马鱼不同时间对其肝功能的影响(

n=10)
与正常对照组比较,t-检验,*P<0.05,**P<0.01。
由表2实验结果表明,当1mmol/L四氯化碳作用于斑马鱼1天时,对其肝功能的影响不显著,作用3天时,其肝功能出现明显异常,肝组织匀浆中ALT、AST水平显著低于正常对照组,病理组织学检查可见肝细胞出现明显的脂肪变性,表明其肝功能明显受到损伤。当1mmol/L四氯化碳作用于斑马鱼5天时,其肝功能仍出现明显异常,与3天时相似,当作用7天时,肝损伤程度反而有所减轻,这可能是其机体出现耐受性,而缓解肝功能损伤。由此可见,以1mmol/L四氯化碳造成斑马鱼急性肝损伤模型时,其造模时间以3-5天为宜。
本发明通过对四氯化碳的浓度和造模时间进行筛选确定最佳造模方法,可以为抗肝损药物活性的筛选提供保证。
实施例2斑马鱼急性肝损伤模型用于抗肝损伤药物的快速筛选 实验方法取斑马鱼160条,分别置于盛有200mL溶液的广口瓶中,随机分成8组,每组含20条,分别为正常对照组,四氯化碳模形对照组,四氯化碳造模+复方甘草甜素高、低浓度组,四氯化碳造模+白首乌总甾苷高、低浓度组和四氯化碳造模+印度獐牙菜提取物高、低浓度组。正常对照组给与等量的蒸馏水,其它给药组分为高低浓度组。其中造模方法为采用浓度为1mmol/l的四氯化碳造模3天,得到肝损伤模型的斑马鱼。正常对照组和四氯化碳模形对照组给与等量生理盐水,与给药72h后将各组斑马鱼取出处死,每组20条鱼所取肝脏随机分为2份,每份为10条鱼的肝脏,一份制成1%的肝组织匀浆,用全自动生化分析仪检测匀浆中ALT、AST水平和总蛋白含量,并计算匀浆中每克蛋白的ALT、AST水平,另一份肝脏组织标本经常规10%福尔马林液固定,石蜡切片,H-E染色,光镜下观察各组斑马鱼肝组织的病理改变情况,进行病理分级评分,正常为1分,轻微脂肪变性为2分,中度病变为3分,脂肪变性严重者为4分。具体实验结果如表3所示。
表3不同药物对四氯化碳所致斑马鱼肝损伤的保护作用(

n=10)
与模型对照组比较,t-检验,*P<0.05,**P<0.01。
由以上表3的实验结果表明,与正常对照组相比较,四氯化碳模形对照组的斑马鱼其肝组织匀浆中ALT、AST水平有极显著的降低(P<0.01),表明斑马鱼的肝功能受到了明显损伤,这与病理组织学检查结果完全一致,表明以四氯化碳造成的斑马鱼的肝损伤模型是成功的。而在四氯化碳模造后给予不同的药物72h后,则能明显减轻四氯化碳造成的斑马鱼的肝损伤程度,能显著地升高肝组织匀浆中ALT、AST水平(P<0.05-0.01),病理检查可见肝损伤程度也明显减轻(P<0.05-0.01)。且实验结果也表明复方甘草甜素具有比白首乌总甾苷和印度獐牙菜提取物更好抗肝损作用,即有更好的保肝功效,这表明本发明提供的方法所建立的肝损伤模型是成功的,且能用于抗肝损伤药物的体内快速筛选。
斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当,且在蛋白质水平上,其关键部位的同源性几乎是100%,所以本发明选用斑马鱼作为肝损伤造模对象,通过对造模方法的优选,可以模拟复杂的体内过程,且实验结果表明通过该模型可以快速方便筛选出具有抗肝损伤的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,包括以下步骤
(1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里,随即分为正常对照组、空白对照组、受试药物组,每组斑马鱼数量相等,空白对照组和受试药物组加入四氯化碳,使四氯化碳的摩尔浓度为0.5~2mmol/L,正常对照组加入等量的溶媒,持续造模3~5天,即得急性肝损伤斑马鱼模型,备用;
(2)将受试药物配成所需浓度,加入到受试药物组的水溶液中,正常对照组和空白对照组加入等量的蒸馏水,给药48小时至72小时后,将各组斑马鱼取出处死,取各组斑马鱼肝脏随机分为2份,一份制成1%的肝组织匀浆,检测匀浆中ALT、AST水平和总蛋白含量,并计算匀浆中每克蛋白的ALT、AST水平,另一份肝脏组织标本经浓度10%福尔马林溶液固定,石蜡切片,H-E染色,光镜下观察各组斑马鱼肝组织的病理改变情况,进行病理分级评分,正常为1分,轻微脂肪变性为2分,中度病变为3分,脂肪变性严重者为4分,评价并筛选各组受试药物的抗肝损伤活性。
2.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,步骤(1)用四氯化碳造模时,四氯化碳的终摩尔浓度为1mmol/L。
3.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,步骤(1)所用的四氯化碳加入二甲基亚砜助溶,二甲基亚砜在溶液中的终浓度为0~1%,正常对照组加入的溶媒为等量的二甲基亚砜。
4.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,步骤(1)所述的造模时间为3天。
5.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,步骤(2)中在给药72小时后将各组斑马鱼取出处死取肝组织。
6.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,步骤(2)采用全自动生化分析仪检测各组斑马鱼肝脏组织匀浆中的ALT、AST水平。
7.根据权利要求1至6任一项所述的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,其特征在于,步骤(2)所述的受试药物为化学药品、中药、中药复方、天然药物或它们的组合物。
全文摘要
本发明公开了一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,该方法通过优选的1mmol/L浓度的四氯化碳以斑马鱼为造模对象连续造模3天,得到肝损伤模型的斑马鱼,然后以斑马鱼肝组织中ALT、AST水平和斑马鱼肝组织的病理改变情况来评价不同受试药物的抗肝损伤活性。实验结果表明,本发明提供的用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的新方法,造模成功率高,可以模拟体内环境进行快速筛选,可操作性强,实验结果准确,尤其是所需受试药物量少,可重复性强,成本低,应用范围广泛,且可成批量进行筛选实验,工作效率高。
文档编号A61K33/00GK101810866SQ20101017067
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者彭蕴茹, 韦英杰, 丁永芳, 罗宇慧, 石磊 申请人:江苏省中医药研究院
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