活性物质的输送系统和活性物质的保护和施用方法

专利名称：活性物质的输送系统和活性物质的保护和施用方法
技术领域：
本发明是有关于活性物质的输送系统，更具体地涉及包含与活性物质共价连接的 多肽的组合物以及保护和施用活性物质的方法。
背景技术：
活性物质的输送系统对于一种生物活性物质(活性物质)向合适的靶位的有效输 送常常是很关键的。当考虑病人的顺应性和活性物质的稳定性时，这些系统的重要性就变 得明显。例如，一种活性物质以口服给药代替注射或其他侵入性技术时，可以预见病人的顺 应性会明显地提高。提高活性物质的稳定性，如延长有效期或胃内留存时间，会保证剂量的 再现性，并且或许甚至可减少所需的剂量以提高病人的顺应性。口服活性物质的吸收常常被胃液的酸性、胃肠道内强大的消化酶、细胞膜的渗透 性和穿过脂双层的转运所阻断。与佐剂如间苯二酚、表面活性剂、聚乙二醇(PEG)或胆汁 酸合用增加细胞膜的通透性。通过类蛋白微球体，脂质体或多糖将活性物质进行微囊化可 有效地减轻酶对活性物质的降解。酶抑制性佐剂也用于防止酶降解。肠溶包衣也已用作药 物在胃中的保护物。活性物质输送系统还能控制活性物质的释放，例如用谷氨酸和天冬氨酸共聚物制 成的地西泮制剂可使活性物质持续释放。如另一个例子，乳酸和戊二酸的共聚物可使人生 长激素按时间释放。很多药物据称可通过与二羧酸，修饰的氨基酸或热缩合氨基酸的酰胺 化将活性物质微囊化从而进行持续释放。缓释添加剂可与很多种活性物质在片剂中混合。上述每一技术均使活性物质的稳定性和释放_时间特性得以提高。可惜的是这 些技术受困于几个缺点。掺入活性物质常常依赖于其向微囊介质中的扩散情况，这或许非 定量的并使剂量再现性变得复杂。另外经包囊的药物有赖于其从基质外扩散出来的情况， 这很大程度上有赖于活性物质的水溶性。与之相反，水溶性微球体会以不确定的速率溶胀， 令人遗憾的是，这会使活性物质突然大量释放，而只有少量的活性物质能进行持续释放。另 外还有，这某些技术中，活性物质释放所需的对降解过程的控制是不可靠的，例如肠溶包 衣的活性物质释放有赖于PH值，同样的，难以控制释放的速率。过去，曾利用多肽中氨基酸的侧链作为侧基用于连接活性物质。这些技术一般需 要在氨基酸侧基和活性物质之间使用间隔基团。这类药物输送系统中的多肽-药物偶联物 有赖于血液中的酶来释放药物，也就是不能通过口服给药。按时间和定点释放这些注射用 或皮下用药的例子是将炔诺酮，通过一个羟丙基接头，与聚谷氨酸的位羧基连接；将 氮芥通过一个肽间隔物，与聚谷氨酰胺的位脲连接；地塞米松就不经间隔基团，直接与 聚天冬氨酸的3羧基共价连接。这个前药制剂的设计是用于结肠特异性药物输送系统，在 该系统中通过寄居在大肠中细菌的水解酶作用释放药物。接着，所释放的地塞米松活性物质定位于治疗大肠失调而不会被血液吸收。还有其他技术将药物共价结合与脂质体制剂的 优点结合起来，它们将活性成分通过肽接头与高度有序的脂质膜(称为“HAR”)连接。这 样，至今为止，尚无以下这样的药物输送系统的报道，该系统包含的概念是将活性成分与多 肽侧基相连接，其目标是通过口服给药输送至血液中。控制活性物质输送系统的分子量、分子 大小和微球体大小也是重要的。分子量的 不均一会造成不可预见的扩散速率和药物动力学。高分子量的载体消化缓慢和延迟，如在 连接有萘普生的葡聚糖的例子中，它几乎完全在结肠中被细菌酶所消化。大分子量的微球 体通常水分含量高，这对于水不稳定的活性物质会产生问题。颗粒大小不仅在注射用药如 HAR的运用中产生问题，而且通过肠纹缘膜进行吸收就限于小于5微米。发明简述本发明提供了将活性物质共价连接于肽或氨基酸的聚合物。本发明与前述的技术 本质不同在于，将活性物质(包括例如药物和营养素)共价连接于寡肽或多肽的N端，C端 上或直接连接于其氨基酸侧链上。这些寡肽或肽在此被称为载体肽。在某些应用中，多肽 通过构象保护使活性物质(主要在胃中)稳定。在这些应用中，活性物质的输送是部分通 过载体肽的去折叠动力学来控制。一旦进入肠道上端，通过各种固有的酶的选择性水解载 体肽的肽键使活性物质释放以被机体吸收。这类酶作用引入了二级缓释机制。本发明提供了包含有一种组合物，它含有多肽和与多肽共价连接的活性物质。较 佳地，该多肽是(i)寡肽，( )由20种天然存在的氨基酸(L或D型)或其异构物、同系物、 或其衍生物中的一种氨基酸所形成的均聚物，(iii)由两种或多种天然存在的氨基酸(L或 D型)或其异构物、同系物、或其衍生物中的氨基酸所形成的杂聚物，(iv)合成氨基酸的均 聚物，(ν)两种或多种的合成氨基酸所形成的杂聚物，(vi)由一种或多种天然氨基酸与一 种或多种合成氨基酸所形成的杂聚物。活性物质优选地与多肽的氨基酸侧链、N端或C端共价连接。在一个优选的实施例 中，活性物质是羧酸，与多肽的N端共价连接。在另一个优选的实施例中，活性物质是胺，与 多肽的C端共价连接。在另一个优选的实施例中，活性物质是醇，与多肽的C端共价连接。 在另一个优选的实施例中，活性物质是醇，与多肽的N端共价连接。本发明的组合物可以还包括一种或多种微囊剂，佐剂和药学上可接受的赋形剂。 微囊剂可选自聚乙二醇(PEG)，氨基酸，糖或盐。当组合物中包含有佐剂，佐剂宜激活肠道转 运剂。较佳地，本发明组合物是口服片剂，静脉制剂或口服混悬剂形式。活性物质可由在 活性物质周围的多肽折叠以构象形式进行保护。在另一个实施例中，多肽能以PH依赖的方 式将活性物质从组合物中释放出来。本发明还提供一种用于保护活性物质免受降解的方法，其包含将活性物质与多肽 共价连接。本发明还提供一种用于控制活性物质从组合物中释放的方法，此处的组合物包含 多肽，此方法包含将活性物质与多肽共价连接。本发明还提供一种用于将活性物质输送给患者的方法，患者是指人或非人动物， 该方法包括向患者施用一种组合物，其包含有多肽和与多肽共价连接的活性物质。在一个 优选的实施例中，活性物质通过酶催化从组合物中释放。在另一个优选的实施例中，活性物质以依赖于时间的方式进行释放，基于酶催化释放的药物动力学。在另一个优选的实施例 中，组合物还含有一种微囊剂，而且活性物质的释放是通过微囊剂的溶解。在另一个优选的 实施例中，活性物质通过依赖于PH的多肽去折叠而从组合物中释放。在另一个优选的实施 例中，活性物质从组合物中缓释。在还有一个优选的实施例中，组合物还含有一个与多肽共 价连接的佐剂，佐剂从组合物中的释放受控于多肽。佐剂可微囊化于载体肽_药物偶联物 中以使活性成分进行双相释放。本发明还提供一种方法用于制备一种组合物，其包含有一种多肽和一种与多肽共 价连接的活性物质。此方法包含以下步骤(a)将活性剂与氨基酸的侧链连接形成活性剂/氨基酸复合物； (b)从活性剂/氨基酸复合物制备活性剂/氨基酸复合物N-酸酐(NCA)；和
(c)将活性剂/氨基酸复合物N-酸酐(NCA)聚合。在一个优选的实施例中，活性物质是药物或佐剂。在另一个优选的实施例中，在步 骤(c)之前用第二种活性物质重复步骤(a)和步骤(b)。当在步骤(c)之前用第二种活性 物质重复步骤(a)和步骤(b)时，这种活性物质与第二种活性物质就能在步骤(c)中共聚。 在另一个优选的实施例中，氨基酸是谷氨酸，而活性物质从在肽水解时以二聚物形式从谷 氨酸上释放下来，此处活性物质的释放是由于同时进行的分子内的转氨作用。在另一个优 选的实施例中，谷氨酸被选自由天冬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸和 丝氨酸组成的一组氨基酸中的一个氨基酸所取代，其中活性物质与氨基酸的侧链相连，形 成酰胺、硫酯、酯、醚、尿烷、碳酸酯、酸酐或氨基甲酸酯。在另一个优选实施例中，谷氨酸被 人工合成的氨基酸代替，该氨基酸侧基含有胺、醇、巯基、酰胺、脲或酸功能团。应了解前述的概述和后文的详细描述对本发明是示例性的，而不是限制性的。附图简述当后续的详细描述与附图一起阅读，会更好地理解本发明，在附图中包括下列图 表

图1 显示了本发明的酸性活性物质/N-端方案。图2 显示了本发明的胺活性物质/C-端方案。图3 显示了本发明的醇活性物质/N-端方案。图4 显示了本发明的醇活性物质/谷氨酸二聚物的制备和偶联方案。图5 显示了来自谷氨酸二聚体方案的醇活性物质的机理。图6 显示了宝力士德(polythroid)在肠道上皮细胞培养中的原位消化。图7 表示基侧的T4浓度。图8 表示宝力士德基底浓度与基侧浓度的比较。图9 表示在胃模拟器与肠模拟器中T4分析的比较。图10 表示在胃模拟器与肠模拟器中T3分析的比较。发明详述本发明为活性物质的输送提供了多个益处。首先，本发明可使活性物质稳定而在 胃中免受消化。另外，由于活性物质释放的延迟，药物效应可延长。再者，活性物质还可组 合起来以产生协同效应。同样，活性物质在肠道内的吸收增强了。本发明还可使活性物质 能定点输送到特定的作用位点。
本发明的组合物含有一个多肽和一个多肽共价连接的活性物质。活性物质可从表 1中选择，既可单独也可以表中的其他物质组合。表 1 硫酸阿巴卡韦(abacavir)阿巴瑞克(abarelix)阿卡波糖对乙酰氨基酚对乙酰氨基酚；醋氢可待因磷酸盐对乙酰氨基酚；右丙氧芬萘磺酸盐乙酰水杨酸阿维 a活化的蛋白c阿昔洛韦阿德福韦二新戊酰氧甲酯(adefovir dipivoxil)腺苷促肾上腺皮质激素沙丁胺醇阿仑膦酸钠别嘌呤醇(allopurinal)a 1蛋白酶抑制剂阿普唑仓(alprazolam)前列地尔阿汀克林(altinicline)氨磷汀胺碘酮盐酸阿米替林苯磺酸氨氯地平苯磺酸氨氯地平；盐酸贝那普利阿莫西林阿莫西林；克拉维酸钾安泼那韦盐酸阿那格雷阿那立肽阿那曲唑反义寡核苷酸阿立哌唑阿司咪唑阿替洛尔阿伐他汀钙
7
阿托伐醌阿伐西迈(avasimibe)硫唑嘌呤盐酸氮卓斯汀阿奇毒素二水合物巴氯芬贝氟沙通盐酸贝那普利甲磺酸苯扎托品倍他米松比卡鲁胺比索洛尔/氢氯噻嗪波生坦溴隐亭盐酸安非他酮丁螺环酮酒石酸布托啡诺卡麦角林咖啡因骨化三醇坎地沙坦西赖替安酯(cilexetil)坎沙曲卡培他滨卡托普利卡马西平卡比多巴/左旋多巴卡钼卡立普多卡维地洛凯普真菌素(caspofungin)头孢克洛头孢羟氨苄；头孢羟氨苄半水合物头孢唑林钠头孢地尼头孢克肟1555 ； 1555U88头孢氨噻钠头孢替坦二钠头孢西丁钠头孢泊肟 头孢丙烯 头孢他啶
头孢布烯二水合物 264W94
头孢呋辛乙酰氧乙酯 头孢呋辛钠 塞乐可西(celecoxib) 头孢氨苄 西立伐他汀钠 盐酸西替利嗪 氯氮卓盐储存物 甲氨二氮卓 环索奈德 西兰司琼
西司他丁钠；亚胺培南 西洛米拉(cilomilast) 西眯替丁 环丙沙星 西沙必利
苯碳酸顺阿曲库胺 顺钼
氢溴酸西酞普兰 克拉霉素 氯米帕明 氯硝西泮 盐酸苯可乐定 氯吡格雷硫酸氢盐 4030W92
革柔酸才卜尔_ (chlorpheniramine tannate) 氯氮平
盐酸考来替泊 松柏维坦(conivaptan) 盐酸环苯扎林 环磷酰胺 环孢霉素 达特肝素钠 达匹坦
醋酸去氨加压素
偶联的雌激素偶联的雌激素醋酸甲 羟孕酮硫酸雌酮哌嗪艾塔西普(etanercept)乙炔基雌二醇/炔诺酮BMS CW189921乙炔基雌二醇；双醋炔诺醇乙炔基雌二醇；左炔诺孕酮乙炔基雌二醇；炔诺酮乙炔基雌二醇；醋酸炔诺酮乙炔基雌二醇；诺孕酯乙炔基雌二醇；炔诺孕酮羟乙二磷酸二钠依托度酸依托泊苷埃托可西(etoricoxib)
艾可善丁 -4 (exendin-4)泛昔洛韦法莫替丁非洛地平非诺贝特芬维A胺芬太尼盐酸非索非那定非格司亭SDOl非那雄胺醋酸氟卡尼氟康唑醋酸氟氢可的松氟马西尼氟西汀氟他胺氟伐他汀马来酸氟伏沙明α /β促卵泡素福莫特罗福辛普禾Ij磷苯妥英钠
呋塞米加巴喷丁钆双胺钆喷酸二葡甲胺钆特醇加那索龙(ganaxolone)更昔洛韦
干特非班(gantofiban)胃液素CWl7免疫原盐酸吉西他滨吉非贝齐等渗庆大霉素盐酸吉哌隆盐酸葛来塔马(glatiramer)格列美脲格列吡嗪盐酸高血糖素格列本脲盐酸格拉司琼氟哌啶醇BMS 284756氢氯噻嗪氢氯噻嗪；氨苯蝶啶盐酸氢吗啡酮硫酸羟氯喹布洛芬盐酸伊达比星伊德介素(ilodecakin)伊洛马司他伊米苷酶盐酸丙米嗪硫酸茚地那韦英弗单抗(infliximab)赖脯胰岛素干扰素α con-1干扰素β -Ia白细胞介素_2碘克沙醇碘普胺碘克沙酸葡甲胺；碘克沙酸钠
异丙托铵
厄贝沙坦
盐酸伊立替康
硝酸异山梨酯
异维a酸
伊拉地平
伊他司琼
伊曲康唑
酮康唑
酮洛芬
酮咯酸
酮替芬
盐酸拉贝洛尔 拉米夫定
拉米夫定；齐多夫定 拉莫三嗪 兰索拉唑
兰索拉唑，阿莫西林， 克拉霉素 来氟米特 来索吡琼
亮氨酰脯氨酸醋酸盐 左卡尼汀 左西替利嗪 左氧氟沙星 左甲状腺素
林替单抗(lintuzumab) 赖诺普利
赖诺普利；氢氯噻嗪 CS 834
盐酸洛哌丁胺 氯碳头孢 氯雷他定 劳拉西泮 氯沙坦钾 氯沙坦钾； 氢氯噻嗪 洛伐他汀，
13
马立马司他美卡舍明醋酸甲羟孕酮盐酸甲氟喹醋酸甲地孕酮CVT CW 124巯嘌呤美罗培南氨基水杨酸美司钠美他沙酮二甲双胍EM 800盐酸哌甲酯醋酸甲泼尼龙FK 463美托拉宗琥珀酸盐美托洛尔MK 826甲5肖唑乳酸米力农盐酸米诺环素米氮平米索前列醇米格列奈(mitiglinide)盐酸米托蒽醌米库氯铵莫达非尼盐酸莫昔普利孟鲁司特钠硫酸吗啡麦考酚酸莫伏替(mycophenolate mofetil)萘丁美酮纳多洛尔萘普生钠盐酸那拉曲坦盐酸奈法唑酮那乐拉滨(nelarabine)甲磺酸那非那韦
那沙立肽(nesiritide)奈韦拉平硝苯地平尼莫地平尼索地平呋喃妥因，呋喃妥因大晶体硝酸甘油 尼扎替丁降阿司咪唑(norastemizole)炔诺酮诺氟沙星盐酸去甲替林醋酸奥曲肽羟考酮/APAP氧氟沙星奥氮平奥美拉唑盐酸昂丹司琼奥普维轻(opreivekin)奥利司他奥芬那君枸橼酸盐奥沙普秦奥沙西泮氯化奥昔布宁盐酸氧可酮GM 611M-CSF帕戈隆帕利弗单抗(palivizumab)帕屈膦酸二钠哌 丐特洛(paricalcitrol)盐酸帕罗西汀匹米曲塞(pemetrexed)匹莫林青霉素V木聚硫钠己酮可可碱培高禾U特
NE 0080苯巴 比妥苯妥英钠盐酸匹格列酮哌拉西林钠普克那禾Ij (pleconaril)泊洛沙姆CW188泊沙、康唑(posaconazole)NN 304二盐酸普拉克索普伐他汀钠泼尼松普力口巴林(pregabalin)扑米酮普林马司他(prinomastat)马来酸丙氯拉嗪盐酸异丙嗪PD 135158右丙氧芬-N/APAP盐酸普萘洛尔前尿激酶富马酸喹硫平盐酸喹那普利雷贝拉唑钠盐酸雷洛昔芬雷米普利雷尼替丁盐酸雷诺嗪松弛素立马醋胺瑞格列奈瑞品坦(I^pinotan)利巴韦林+猪干扰素α -2b禾Ij鲁唑盐酸金刚乙胺利培酮利托那韦苯甲酸利扎曲普坦罗库溴铵
罗非可西(rofecoxib)盐酸罗平尼咯 马来酸罗西格列酮(rosiglitazone maleate)戈舍瑞林鲁比替康(rubitecan)沙莫司亭沙奎那韦多西他赛沙曲钼(satraplatin)盐酸塞利吉林盐酸舍曲林盐酸沙弗乐姆司韦单抗盐酸西布曲明柠檬酸西地那非辛伐他汀信那普肽(sinapultide)西他沙星聚苯乙烯磺酸钠盐酸索他洛尔斯帕弗酸(sparfosic acid)螺内酯斯塔夫定硫糖铝舒马普坦塔比莫瑞林(tabimorelin)他莫昔芬枸橼酸盐盐酸坦舒洛辛替马西泮(tenofovir) jft^^M (disoproxil)替泊沙林盐酸特拉唑嗪盐酸特比萘芬硫酸特布他林特立帕肽四环素沙利度胺茶碱塞替派
血小板生成素，TP0噻加宾盐酸盐酸噻氯匹定替法可近(tifacogin)替拉扎明盐酸替罗非班盐酸替扎尼定硫酸妥布霉素酒石酸托特罗定托莫西汀托吡酯盐酸拓扑替康(topotecan)托拉塞米tPA类似物盐酸曲马多群多普利曲土单抗(trastuzumab)盐酸曲马沙酮(trazadone)氨苯蝶啶/HCTZ曲格列酮甲磺酸曲伐沙星尿激酶乌索二醇(ursodiol)盐酸伐昔洛韦韦德可西丙戊酸缬沙坦，氢氯噻嗪缬沙泊达(valspodar)盐酸万古霉素维库溴铵盐酸顽发克星盐酸维拉帕米酒石酸长春瑞滨维生素B12维生素C弗利康唑(voriconazole)华法林钠沙里罗酸(xaliproden)扎鲁司特
扎来普隆折那司他齐多夫定佐米曲坦唑吡坦博来霉素
植物甾醇紫杉醇氟替卡松(fluticasone)氟尿嘧啶伪麻黄碱A 78773AGI 1067BCX CW1812BMS CW188667BMS CW193884BMS CW204352BPI21CD IlaCEB 925丙泊酚GT 102279重组肝炎疫苗L 159282LFA3TIP日用复合维生素红霉素/硫酸盐乙炔基雌二醇；去氧孕烯碳酸锂LYM 1甲泼尼龙琥珀酸钠轮状病毒疫苗甲磺酸沙奎那韦精氨酸肝素α胸腺素孟鲁司特钠和盐酸非索非那定碘甲状腺原氨酸
碘甲状腺原氨 酸和四碘甲腺氨酸可待因乙基吗啡二乙酰吗啡氢吗啡酮氢可酮羟吗啡酮双氢可待因双氢吗啡甲氢吗啡酮可待因和异丙嗪可待因，苯福林和异丙嗪可待因和愈创甘油醚可待因，愈创甘油醚和伪麻黄碱阿司匹林，卡立普多和可待因后马托品溴甲烷和重酒石酸氢可酮重酒石酸氢可酮和苯丙醇胺对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮马来酸氯苯，重酒石酸氢可酮和伪麻黄碱愈创甘油醚和氢可酮布洛芬和氢可酮氯苯那敏多腾喜龙(polistirex)和氢可酮多腾喜龙(polystirex)纳曲酮优选地，多肽是⑴寡肽，(ii)由20种天然存在的氨基酸(L或D型)、或其异构 物、同系物、或其衍生物中的一种所形成的均聚物，(iii)由两种或多种天然存在的氨基酸 (L或D型)、或其异构物、同系物、或其衍生物所形成的杂聚物，(iv)合成氨基酸的均聚物， (ν)两种或多种的合成氨基酸所形成的杂聚物，(vi)由一种或多种天然氨基酸与一种或多 种合成氨基酸所形成的杂聚物。蛋白质、寡肽和多肽是氨基酸的聚合物，含有一级，二级和三级结构。蛋白质的二 级结构是多肽链的局部构象，包括螺旋，片层和转角。蛋白质的氨基酸顺序和链构象上的结 构限制决定了分子的空间排列。二级结构的折叠和侧链的空间排列形成了三级结构。蛋白质的折叠是由于蛋白质上的原子与邻近的溶剂分子有关的动力学。蛋白质折叠和去折叠的热力学是由依赖于特定模型的蛋白质特定条件下的自由能所决定的。其中， 蛋白质的折叠过程涉及氨基酸残基装进疏水内核中。蛋白质内核中的氨基酸侧链与他们在 氨基酸结晶中占有同样的体积。已折叠的蛋白质内部更象一个固态的晶体而不是油滴，所 以用于确定对蛋白质稳定性有贡献的力的最好模型是固体参照态。对蛋白质折叠热力学有贡献的主要的力是范德华力，氢键，静电相互作用，构型的 熵和疏水效应。考虑蛋白质的稳定性，疏水效应是指能量效应将非极性基团从蛋白质内部 移去而将它们暴露在水中。将处于固态参照态的去折叠蛋白质的能量与氨基酸水解能量相 比较，疏水效应是主要的力。氢键是在蛋白质折叠过程中建立的，而分子内键的形成依靠与 水的氢键。水分子被从组装的蛋白质疏水内核中“挤出去”。所有这些力组合在一起，并对 折叠的蛋白质整体稳定性有贡献。其中组装的理想程度决定了蛋白质相对稳定性的程度。 最大程度组装的结果是形成一个残基的中心或疏水内核，该内核能最大程度地起屏蔽溶剂 的作用。既然亲脂类药物会存在于在肽的疏水内核中，那么在药物被释放前，肽的去折叠 将需要能量。去折叠过程通过氨基酸水化或达到蛋白质的融点温度来克服疏水效应。水 化产生的热量对蛋白质而言是有不稳定作用。通常，蛋白质的折叠态宜仅比去折叠态高 5-15kcal/mole。而且，在中性pH和室温条件下蛋白质的去折叠要有化学试剂。实际上，在 开始不可逆的化学或构象过程前常常可见蛋白质部分去折叠。而且，蛋白质的构象通常控 制着有害化学反应的速率及程度。蛋白质对活性物质的构象性保护取决于蛋白质折叠状态的稳定性和与活性物质 分解有关的热力学。活性物质分解的必需条件应与蛋白质去折叠条件不同。氨基酸的选择取决于所需要的物理性质。例如，需要增加体积或亲脂性，那么载体 肽应富含下表所列的氨基酸。极性氨基酸，在另一方面，能选作提高多肽的亲水性。离子化氨基酸可选作用于pH控制的多肽去折叠。天冬氨酸，谷氨酸和酪氨酸在胃 中带电为中性，但进入肠道就离子化。与之相反，碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸和精氨酸， 在胃中离子化而在碱性环境下呈中性。其他因素如芳香残基之间的Ji-Ji相互作用，引入脯氨酸产生的转角，二硫键的 交联和氢键可被都用于针对指定用途的最佳氨基酸序列的选择。一级序列的次序可以影响 这些相互作用如何最大化，并对于指导多肽的二级结构和三级结构很重要。还有，带有反应性侧链的氨基酸(如谷氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，苏氨酸和 半胱氨酸)可用于在同一载体蛋白上连接多种活性物质或佐剂。这对于需要有两种或多种 活性物质的协同效应是特别有用。如上所述，载体化合物分子量的不同会对活性物质释放动力学有复杂的影响。作 为结果，小分子量的活性物质输送系统是较好的。本发明的一个优点是根据所需要构象保 护的程度来优化多肽的链长和分子量。这特性根据一级释放机理的动力学而加以优化。这 样，本发明的另一个优点是通过提高载体多肽的分子量来达到延长释放时间。另外，本发明 显著的优点是，活性物质的释放动力学主要由载体肽和活性物质之间关键的键合的酶水解 来控制。葡聚糖是唯一已知的开发成为药物共价结合的大分子载体用于结肠特异性药物 输送的多糖。通常它只可能携带多达1/10药物-葡聚糖偶联物总重量的药物。如前述，多糖主要在结肠中消化，而药物的吸收主要限于结肠。与葡聚糖相比，本发明有两个主要的优 点。第一，肽可被在肠腔和纹缘膜中发现的几种氨肽酶的任一种水解，因此活性物质的释放 及后续的吸收可在空肠或回肠中进行。第二，载体分子的分子量可控，活性物质的载量也可 控。作为一个实际的例子，下表列出亲脂性氨基酸的分子量(少一个水分子)和所选 的止痛药和维生素。表 2
氨基酸分子量活性物质分子量
甘氨酸57醋氨酚151
丙氨酸71维生素B6169 缬氨酸99维生素C176亮氨酸113阿斯匹林180 异亮氨酸113布洛芬206 苯丙氨酸147视黄酸300 酪氨酸163维生素B2376
维生素D2397
维生素E431亲脂性氨基酸是优选的，对于所选的活性物质，穿过胃的构象保护是重要的，这些 物质的选择是基于易于与寡肽共价连接。氨基酸分子量中减去18，这样已经考虑了它们要 缩合成多肽。例如一个十聚甘氨酸(MW = 588)与阿斯匹林相连，总分子量为750，阿斯匹 林占总活性物质输送系统组合物总重量的24%，或是葡聚糖最大载量的2倍。这只是对于 N-和C-端应用，对于那些连接在十聚谷氨酸的侧基的活性物质，例如药物的分子量是180， 可得出载量是58%，虽然这可能并不完全是实际情况。活性物质的醇、胺或羧基与寡肽或多肽的N端、C端或侧链相共价连接，附加物的 位置一定程度上取决于功能团的选择。例如，如果活性药物是羧酸(如阿斯匹林)，那么 寡肽链的N端是一个优选的位点，如图1所示。如果活性药物是胺(如氨苄青霉素)，那 么多肽链的C端是一个优选的位点以获得稳定的与肽相连的活性物质，如图2所示。在N 端和C端的例子中，基本上是延长一个单体单元，从而形成一个新的肽键。如果活性物质是 醇，C端和N端都是优选的连接位点以得到稳定的组合物。在上述的例子中(其中醇，炔诺 酮被共价连接在聚羟丙基谷氨酰胺上)，醇可用光气制成氯甲酸烷基酯。那么本发明适用于 用图3中所示的载体肽的N端与这关键中间体反应。图1至图3也阐述了由肠肽酶将活性 成分从载体肽上释放出来。醇可选择性与谷氨酸的Y-羧基连接，然后这个偶联物再与载体肽的C端共价连 接。因为谷氨酸-药物的偶联物可视为一种二聚物，这个产物在载体肽的C端添上了 2个 单体，其中谷氨酸部分作为肽和药物之间的间隔物，如图4所示。肠道中的酶水解该关键的肽键后，就从载体肽中将谷氨酸-药物部分释放出来。然后新产生的谷氨酸残基上的游离 胺发生分子内的转氨反应，从而释放活性物质并同时产生焦谷氨酸，如图5所示。另外，谷 氨酸-药物二聚体能转化成谷氨酸N-酸酐的γ-酯。如上所述，在使用任何如图4所示适 当的引发剂，这个中间体可聚合。这样聚合成的产物是多聚谷氨酸，活性物质结合于多个侧 基。这样就能获得载体肽的最大药物载量。另外，其他氨基酸NCA也可与谷氨酸N-酸酐的 Y “酯共聚，以使药物输送系统能有特殊的性能。本发明还提 供了一种使其他带功能性侧链的多肽具有相同作用机理的方法，例子 包括(但不限于)聚赖氨酸、聚天冬酰胺、聚精氨酸、聚丝氨酸、聚半胱氨酸、聚酪氨酸、聚 苏氨酸和聚谷氨酰胺。该机理的解释是通过在侧基上的间隔物或接头，这些多肽优选地被 谷氨酸_药物二聚物所端接。这种载体肽_药物偶联物与以前的技术明显不同在于，药物 部分的释放主要依靠肽酶而不是酯酶。另外，活性物质可以直接与侧基连接，而消化道的某 些固有的酶可影响释放。使用已知的技术，可以将活性物质与多肽的N端、C端或侧链共价连接。将有机化 合物连接到多肽的N端的例子包括，但不限于，萘乙酸与LH-RH相连，香豆酸与阿片肽连接 及1，3_ 二烷基-3-酰基-氮三烯与胃泌素四肽和胃泌素五肽相联。另一例子是已知的将 形成生物素偶联的多肽和与肽连接的吖啶技术。多肽载体可用常规方法制备，优选的方法是氨基酸N-酸酐混合物的共聚。另外， 若需要一段特定的序列，也可用固相自动肽合成仪。往组合物中加入稳定剂可进一步稳定多肽。稳定剂如蔗糖、氨基酸、聚乙二醇 (PEG)和盐能防止蛋白质去折叠。在本发明的另一实施例中，通过将载体多肽-活性剂偶联 物微包囊于多糖、氨基酸复合物、PEG或盐，以获得活性物质的在一级释放之前的释放。有证据表明亲水化合物通过一种特殊的转运子经肠道上皮能有效地吸收。整个膜 转运系统本身就是非对称的，并且非对称地对辅助因子有响应。这样，可以预见，膜转运系 统地活化需要一些特殊的佐剂从而导致活性物质定点输送。根据被转运基质的物理性质， 可将肠道膜转运系统分为七种。它们包括氨基酸、寡肽、葡萄糖、单羧酸、磷酸盐、胆汁酸和 P-糖蛋白转运系统，并且每种都有自己相关的转运机制。这些机制可依赖氢离子，钠离子， 结合位点或其它的辅助因子。本发明专注于肠道上皮转运系统以促进活性物质的吸收。在本发明的另已实施例中，组合物中含有一种或一种以上的佐剂以提高活性物质 的生物利用度。当使用一种吸收很差的活性物质时，佐剂的添加是尤为优选的。合适的佐 剂包括，例如木瓜蛋白酶，这是一种强有力将氨肽酶-N催化结构域释放到肠腔中的酶；糖 识别子，它能激活在纹缘膜中的酶；以及胆汁酸，它可与肽结合以促进肽的吸收。优选的，所得的肽_活性物质偶联物用合适的赋形剂，并用湿法制粒或干法压制 成片剂。本发明的组合物，基本上由酸和胺形成的酰胺，并可以下列实例制得。酸/N-端的偶联(图1)一个酸性的生物活性物质在氮气下溶解在DMF中，并冷却至0°C。溶液用二异丙基 碳二亚胺和羟基苯并三唑处理，再加胺肽载体，室温下搅拌反应数小时，滤除副产物脲，用 醚沉淀产物，再用凝胶渗透色谱(GPC)或透析纯化。胺/C-端的偶联(图2)
载体肽在氮气下溶解在DMF中，并冷却至0°C。溶液用二异丙基碳二亚胺和羟基苯 并三唑处理，再加胺生物活性物质，室温下搅拌反应数小时，滤除副产物脲，用醚沉淀产物， 再用凝胶渗透色谱或透析纯化。醇/N端的偶联(图3)再下述例子中，将醇和光气混合产生氯甲酸酯，再与肽的N端反应生成氨基甲酸 酯。按照这点，醇性的活性物质在氮气下在无水DMF中用光气处理。然后缓慢加入已保护 好的载体肽，溶液在室温下搅拌反应数小时。用醚沉淀产品， 粗品去保护再用GPC纯化。也可以使用其它溶剂、激活剂、共催化剂和碱。其它溶剂的例子包括二甲基亚砜， 醚如四氢呋喃或氯化试剂如氯仿。其它激活剂的例子包括二环己基碳二亚胺或亚硫酰氯。 其它共催化剂的例子是N-羟基琥珀酰胺。碱的例子包括吡咯烷基吡啶，二甲氨基吡啶，三 乙胺或三丁胺。谷氨酸Y -烷基酯的制备(图4)已制备了 30种不同的谷氨酸Y-烷基酯，其中任一种都适用于所选择的药物醇。 例如，制备谷氨酸、醇和浓盐酸的混悬液并加热数小时，用丙酮沉淀谷氨酸Y-烷基酯产 物，过滤，干燥和在热水中重结晶。谷氨酸Υ -烷基酯/C端偶联物(图4)载体肽在氮气下溶解在DMF中，并冷却至0°C。溶液用二异丙基碳二亚胺和羟基 苯并三唑处理，再加谷氨酸Y -烷基酯生物活性物质，室温下搅拌反应数小时，滤除副产物 脲，用醚沉淀产物，再用凝胶渗透色谱或透析纯化。谷氨酸Y -烷基酯-NCA的制备谷氨酸Y-烷基酯在无水THF中悬浮，其中加入光气，氮气下回流至混合物成为均 一。溶液倒入庚烷中以沉淀NCA产物，过滤，干燥并用适宜的溶剂重结晶。聚谷氨酸Y -烷基酯的制备将谷氨酸Y -烷基酯-NCA溶于无水DMF中，溶液中加入催化量的伯胺直至呈粘稠 (通常过夜)。溶液倒入水中，并过滤，从而分离出产物。产物用GPC或透析纯化。实施例1制备封端的碘甲状腺原氨酸组合物，它含有Τ3和Τ4共价连接在聚谷氨酸N端的 共聚物通过各种已报道的方法可知聚谷氨酸的合成方法。本实施例中聚谷氨酸的合成通 过活化苄基谷氨酸NCA (BnGlu-NCA)的单体。BnGlu-NCA然后聚合，用溴化氢去除苄基。当 聚谷氨酸封端时，关键是从溴化氢复合物中释放出N端氨基，而对自由羧基不产生非预计 的亲核反应。用碳酸钠、碳酸氢钠和乙酸钠进行反应制备谷氨酸/Τ4/Τ3共聚物，Τ4和Τ3 的掺入随PKb的增加而减少。乙酸钠是较好的，因为其pKb值在溴化钠，聚谷氨酸和钠盐 之间。反应中用碱式氧化铝使T4-NCA和T3-NCA保持完整而没有明显的端封和自身聚合。 T4-NCA和T3-NCA的稳定性会影响谷氨酸/T4/T3共聚物的商业化生产。乙酸钠可被碳酸 钠，碳酸氢钠，丙酸钠，丁酸钠，戊酸钠，碱式氧化铝或其它任何能中和与氨基复合的溴化氢 的弱碱所替代。谷氨酸/T4/T3共聚物的合成起始于苄基谷氨酸，甲状腺素，和三碘甲状腺原氨 酸。所有这些合成原料在合适的有机溶剂中单独与光气反应。BuGlu-NCA的聚合是在四氢呋喃(THF)中进行，以甲醇钠为引发剂。聚苄基谷氨酸在乙酸中用15%的溴化氢脱保护。 产物中应不含有未复合的溴化氢，它曾溶解在DMF中，用乙酸钠处理过。把先前已制备好 的T4-NCA和T3-NCA混合，再加到溶液中。在搅拌下反应直至用薄层层析(TLC)检测不到 T4-NCA和T3-NCA。把最后的产物加到水中，用水洗涤沉淀，真空干燥，得到无定形的粉末。
用不同的弱碱所进行的试验揭示了不同的羧酸钠盐在聚谷氨酸封端中的作用。反 应中用丙酸钠、丁酸钠和戊酸钠代替乙酸钠都得到基本相同的结果。
苄基谷氨酸-NCA的制备苄基谷氨酸(25克)在氮气下悬浮于400ml无水乙酸乙酯中。混合物加热回流， 并分六等份加入30克的三光气。反应回流3小时至均一。溶液冷却至室温，过滤并真空浓 缩。将白色粉末在50ml热的无水乙酸乙酯中重结晶，得到17. 4克(63%)白色粉末T4-NCA 的制备在一个带氮气进口的圆底烧瓶中，5克甲状腺素和25ml四氢呋喃(THF)及1. 3克 三光气，混合物回流4小时至均一。溶液冷却至室温，在搅拌下滴加200ml庚烷，晶体过滤 并真空干燥。得到4.72g(91%) —种米色的粉末。T3-NCA 的制备在一个带氮气进口的圆底烧瓶中，4. 29克三碘甲状腺原氨酸和20ml四氢呋喃 (THF)及1. 45克三光气，混合物回流4小时至均一。溶液冷却至室温，在搅拌下滴加200ml 庚烷，从黄色胶状物中倾去液体，在无水乙酸乙酯和己烷中重结晶。得到2.5g(56%) —种 白色的粉末。其在高度真空下干燥聚苄基谷氨酸的制备苄基谷氨酸(17.4克)在氮气下溶于无水四氢呋喃(THF)中，往其中分批加入 238mg甲醇钠。溶液搅拌2天至粘度明显增加。在搅拌下，溶液倒入1. 5L石油醚中，倾去石 油醚，再加回1L石油醚。手工搅拌混合物。倾去石油醚，再加入500ml石油醚重复该过程。 白色固体在空气干燥然后真空干燥，得到14. 7g(95% )白色绒纸样固体。聚谷氨酸的制备乙酸(10ml)与10ml 30% (重量)溴化氢乙酸溶液搅拌，并在乙酸中手工加入 1.96g聚苄基谷氨酸。混合物在室温下搅拌一天，然后再加入到50ml醚中。白色沉淀过滤， 用30ml醚洗涤4次，并在高度真空下干燥。得到1. llg(97% ) 一种白色粉末。谷氨酸/T4/T3共聚物的制备聚谷氨酸(375mg)溶解在3ml无水DMF中，加入乙酸钠(24mg)，接着加入 105mgT4-NCA和8mgT3_NCA的混合物。溶液搅拌2天至TLC显示甲状腺素原料消失。溶液 倒入30ml水中并冷却至10°C过夜。沉淀过滤，用水洗涤高真空干燥。得到413mg(85%) 浅棕色粉末。经链霉蛋白酶系统完全消化2小时，质子NMR表明T3和T4共价连接到聚谷 氨酸的N端。实施例2肽聚合物的制备聚天冬氨酸Asp(OtBu) (13mg, 0. 07mmol)和 Asp (OtBu) -NCA (200mg, 0. 93mmol)溶 解在无水DMF(5ml)中，溶液在氩气下室温搅拌过夜。第二天早上，将2.5ml反应混合物转 移到另一个烧瓶中(烧瓶B)。T4-NCA(27mg，0.03mmol)加入到原先的烧瓶中(烧瓶A)。两份溶液在氩气下再搅拌24小时。在每个烧瓶中加入水(50ml)沉淀聚合物。过滤收集所得 的固体并在真空中干燥过夜。已干燥的Asp (OtBu) η (烧瓶B)和T4-NCA (OtBu) η (烧瓶Α)溶解在95%三氟醋酸 水溶液中(3ml)，在室温下搅拌2小时。加入乙醚(IOml)沉淀脱保护的聚合物并将混悬液 保存在4°C2小时。聚合物分别经过滤收集并在真空中干燥过夜。这样得到481^々印11(烧 瓶B)和12mgT4-Aspn (烧瓶A)。MALDI表明T4_Aspn(烧瓶A)含有不同长度聚合物的混合 物T4-Asp3_12。聚丝氨酸和聚苏氨酸也 按此法制备。丝氨酸反应混合物含N-甲基吗啉。(1.1当 量)氨基酸衍生物 聚合物分离量 产率 质量范围_Asp (OtBu)Asp (OtBu) η48mg84%NAT4_Asp (otBu) η 12mg14%T4_Asp3_12Ser (OtBu)Ser (OtBu) η73mg101% 3 Ser7_8T4_Ser (otBu) η 50mg43%T4_Ser4_9Thr (OtBu)Thr (OtBu) η29mg20%Thr 7_8T4-Thr (otBu) η 66mg24%T4_Thiv8产率是基于在拆分反应之前原反应中总氨基酸含量进行估算的。质量范围由 MALDI测定。产率超过100%是由于存在盐或在反应混合物拆分时分布不均一。HPLC和链霉蛋白酶试验表明T4_Asp3_12，T4_Ser4_9，T4-Thiv8样品中很少有游离的 T4，T4在消化后释放。_N-酸酐下列氨基酸的N-酸酐(NCA)的制备使用与谷氨酸中所报道的方法相似。它们最
终报告中的细微差别在下面注明。
实施例3(Glu) η-头孢氨苄的制备Glu (OtBu) NCA (1. OOOg, 4. 4mmol)和盐酸头孢氨苄(0. 106g, 0. 3mmol)溶解在无水 DMF(5ml)中。反应在氩气下室温搅拌进行。三天后，用真空旋转蒸发器去除溶剂。所得的 固体放置在氩气下，再用4N盐酸二噁烷溶液(2ml)溶解，然后再氩气下室温搅拌。1小时 后，用真空旋转蒸发器去除二噁烷和盐酸。将固体悬浮在甲醇(2ml)中，并再次用真空旋转 蒸发器去除残留的盐酸和二噁烷。产物再悬浮在甲醇(2ml)中，加水(20ml)沉淀之。水悬 浮液再于4°C保存4小时，离心分离固体。离心沉淀再真空干燥过夜。通过MADLI测定此过 程得到(Glu)n-头孢氨苄464mg。MALDI显示有聚合物(Glu) 7_13和(Glu) 5_14-头孢氨苄的 混合物。其他链长也许存在但MADLI色谱中不是清晰可见。反相HPLC(265nm，C18柱，16% 甲醇/4%THF/80%水为流动相)显示在所分离出的物质中没有游离的头孢氨苄。“水”在 HPLC中是指含0. 庚烷硫酸和1. 5%三甲胺的水缓冲液。实施例4纳曲酮衍生物 3-甲基-纳曲酮纳曲酮(6. 0g，16. 5mmol)溶解在100ml蒸馏水中。溶液用1N NaOH滴定至最终pH为11. 8。在滴定过程中，中性的纳曲酮沉淀出来并又溶解到溶液中。直 到pH为11. 8时，用旋转蒸发器在高真空下去除溶剂，所得的固体在真空下室温保存过夜。 固体然后悬浮/溶解在无水四氢呋喃(200ml)并在氩气下室温搅拌过夜，于超过30分钟内 滴加入在50ml四氢呋喃中的碘代甲烷(2. lmg，33mmol)。反应在氩气下室温搅拌再进行3 小时。在减压下旋转蒸发去除溶剂。残留固体然后溶解在40ml氯仿中，此有机溶液用30ml 饱和NaCl溶液，3 X 30ml IN的NaOH洗涤并最后用30ml饱和NaCl溶液洗涤两次。收集有 机溶液并用硫酸钠干燥。在真空下用旋转蒸发器除去有机溶剂并干燥过夜，得到纯3-甲基 纳曲酮(5. 6g，15. 8mmol,产率96% )，是棕色的残留物并用TLC和t-NMR鉴定。与纳曲酮光 谱比较，用于鉴定化合物的特征是t-NMR(360MHz，⑶Cl3) S 6. 677 (d，1H，纳曲酮芳香环)， 6. 591 (d，1H，纳曲酮芳香环)，3. 874 (s，3H，甲氧基)，0. 6-0. 5ppm(m, 2H，纳曲酮环丙基)和 0. 2-0. lppm (m, 2H,纳曲酮环丙基)。Boc-Glu(Nal)-0tBu :Boc-Glu-0tBu 固体(0. 96g，3. 18mmol)，纳曲酮(1. 00g， 2. 65mmol)和PyBrop (1. 73g，3. 71mmol)溶解在5ml无水DMF中并在氩气下室温搅拌。加入 无水N-甲基吗啉(1.08ml，9. 81mmol)且反应继续在氩气和室温下搅拌进行。两天后，加入 另外的 Boc-Glu-OtBu 固体(0. 096g，0. 318mmo 1), PyBrop (0. 173g，0. 371mmol)和 N_ 甲基吗 啉(0. 10ml, 0. 981mmol)。再过两天后，在高真空下旋转蒸发去除溶剂，所得固体然后溶解在 氯仿中，此有机溶液用2X20ml饱和NaCl溶液，3 X 20ml 10%的碳酸钠萃取并最后用20ml饱和NaCl溶液洗涤。收集有机溶液并用硫酸钠干燥，硅胶吸附。然后用闪色谱和梯度为 0-1. 5%的甲醇氯仿溶液得到纯的偶联有氨基酸的纳曲酮(0. 486g，0. 78mmol,29% )。所分 离物质的纯度由TLC鉴定(6 1甲醇/氯仿)，氨基酸分子和纳曲酮的存在都由1H-NMR确 定。指示质子=1H-匪R(360MHz，CDCl3) δ 6. 81 (d，1H，纳曲酮芳香环)，6. 63 (d，1H，纳曲酮芳 香环)，4. 3-4. 2 (m, 1H,谷氨酸 α H)，1. 7-1. 3 (bs 对，18H, Boc 和 OtBu 基团，0. 6-0. 4ppm (m, 2H，纳曲酮环丙基)和0. 2-0. Oppm (m, 2H，纳曲酮环丙基)。Boc-Glu (Nal) -OtBu =Boc-Glu (Nal) -OtBu 固体可用相似方法获得，收率 41 %。指 示质子=1H-NMR(360MHz, CDCl3) δ 6. 84 (d, 1H,纳曲酮芳香环)，6. 66 (d, 1H,纳曲酮芳香环)， 4. 6-4. 5 (m, 1H,天冬氨酸 α H)，1. 6-1. 3 (bs 对，18H, Boc 和 OtBu 基团，0. 7-0. 5ppm (m, 2H,纳 曲酮环丙基)和0. 4-0. Ippm (m, 2H，纳曲酮环丙基)。匪R定性 虽然纳曲酮NMR谱复杂，但有几个关键质子的化学位移特殊且是纳曲酮特有的。 实施例5 2-氨基-9-(2-羟-乙氧基甲基)_1，9-2氢-嘌呤-6-酮 聚-Glu (阿昔洛韦)往15 聚谷氨酸(0. 600g，0. 310mmol)的 DMF (25ml)溶液中加入 EDCI (2. 07g， 10. 8mmol)。所得混合物室温搅拌1小时。然后，加入N-甲基吗啉(0. 51ml, 4. 7mmol)，再加 入阿昔洛韦(1. 74g，7. 75mmol)和DMF (25ml)和N-甲基-吗啉(0. 85ml)的混合物。反应在 室温下搅拌进行4天。然后，加入50ml水，除去全部溶剂，往干燥的产物中加入水(100ml)， 并未反应的阿昔洛韦形成沉淀。离心去除固体，上清液用超滤纯化(YMl膜)。大约300ml 水穿过膜。NMR显示一个未预见的烷基-脲侧链连接的杂质。得到的聚Glu(阿昔洛韦) (0. 970g)是浅黄色固体=1H-WRGeOMHz, D2O) δ 1. 11 (br m，4H 脲)，2. 01 (br m，2H，谷氨酸 β H)，2. 39 (br m，2H，谷氨酸 γ H)，2. 72-(br 111，2!1，脲)，3. 32 (br m，6H，阿昔洛韦 CH2 和脲)， 3. 83 (br m，3H 脲)，4. 38(br，d，3H，谷氨酸 α H), 5. 47 (br s，2H，阿昔洛韦 1，CH2), 7. 94 (br s，IH阿昔洛韦8CH)。实施例6 2-(4-{1_羟基-4-[4_羟-二苯基-甲基)_哌啶-1-基]-丁基}_苯基)-2_甲
基_丙酸 聚-Glu (非索非那定)往15 聚谷氨酸(0. 078g, 0. 040mmol)的 DMF (5ml)溶液中加入 EDCI (0. 035g, 0. 18mmol)。搅拌30分钟后，加入N-甲基吗啉(0. 03ml, 0. 24mmol)，搅拌10分钟后，再用注 射器加入非索非那定(o. 100g,0. 20mmol)和N-甲基-吗啉(0. 07ml,0. 60mmol)和DMF(5ml) 的溶液。反应在室温下搅拌进行3天后，样品用水(25ml)溶解。形成固体沉淀，该沉淀是 药物偶联物和游离的非索非那定，将水酸化并使所有的固体溶解。超滤纯化(YM1膜，再用 YM3膜)和在pH7时用G25空间排阻色谱，得到聚_谷氨酸(非索非那定)(0. 010g)，白色 固体"H-NMR(360MHz，D20) 8 1. 37 (s，8H，非索非那定，CH2 禾口 CH3), 1. 58 (br m，5H，非索非那 定，CH 和 CH2)，1. 99 (br m, 24H,谷氨酸 3 H)，2. 31 (br m, 24H,谷氨酸 y H), 2. 70 (br m, 5H, 非索非那定，CH和CH2)，4. 14 (br m, 26H，谷氨酸0 H)，7. 25 (brs, 14H，非索非那定芳香氢)。实施例7
扎西他滨4-氨基-1- (5-羟甲基-4氢-呋喃-2-基)_1H_嘧啶_2_酮 聚-Glu (扎西他滨)往15 聚谷氨酸(0. 123g, 0. 060mmol)的 DMF (8ml)溶液中加入 EDCI (0. 403g, 2. 1 Ommol) ο 30分钟后，加入N-甲基吗啉(0. 13ml，1. 2mmol)，35分钟后，再用注射器加入扎 西他滨(0. 200g，0. 95mmol)和 N-甲基-吗啉(0. IOml,0. 9mmol)和 DMF(2ml)的溶液。反 应在室温下搅拌进行48小时后，去除溶剂，残留样品用水(15ml)溶解。超滤纯化(YMl膜， 再用YM3膜)和在pH7时用G25空间排阻色谱。得到聚-谷氨酸(扎西他滨)(0. 083g)，浅 黄色固体=1H-WR(DMSO-CiewA)2O) δ 1. 14 (br m 20H，脲)，1. 90 (br m，30H，谷氨酸 β H，谷氨 M YH 和扎西他宾的 CH2)，2. 66 (br m, 4H，脲)，3. 24 (br m, 36H，脲，扎西他宾的 CH 和 CH2)， 4. 29 (br 111，8!1，谷氨酸0!1)，5.87 0^ s，1H，扎西他宾 1，位 CH)，7. 18 (br s，l. 19H，扎西他 宾 NH2)，8. 52 (br s 1H，扎西他宾 6 位 CH)。实施例8 1-(5-羟甲基-2,5- 二氢-呋喃_2_基)_5_甲基-IH-嘧啶-2,4- 二酮 聚-Glu (斯塔夫定)其制备与聚-Glu(扎西他滨)相似，用超滤纯化(YMl)得到聚_Glu(斯塔夫 定)0. 089g，白色粉末=1H-NMR(D2O) δ 1. 87 (s，3Η，斯塔夫定 5 位 CH3)，2. 06 (brm，38Η，谷氨酸 β H，谷氨酸 γ H), 2. 49 (br m，12H，谷氨酸 γ H), 3. 55 (br m，12H，脲，斯塔夫定 5，位 CH2)， 4. 45 (br d，13H，谷氨酸 α H)，5. 98 (d，1H，斯塔夫定 1，位 CH)，6. 48 (d，1H，斯塔夫定 3 位 CH)， 6. 96 (d，1H，斯塔夫定 2，位 CH)，7. 63 (s，1H，斯塔夫定 6 位 CH)。实施例9 2- (2-甲基-5-硝基-咪唑-1-基)_乙醇 聚-Glu (甲硝唑)其制备与聚-Glu (扎西他滨)相似，用超滤纯化(YMl)得到聚-Glu (甲硝 唑)0. 326g，黄色粉末=1H-WR(DMSO-Cie) δ 1. 18 (br d，13H，脲)，1. 93 (br s，17H，谷氨酸 β H，谷氨酸 γ H), 2. 71 (br s，16H，脲)，4. 01 (br m，18H，谷氨酸 α H和甲硝唑 CH2)，4. 58 (br s，2H，甲硝唑 CH2)，8. 05 (br s，1H，甲硝唑 2 位 CH)。实施例10 甲基纳曲酮_葡萄糖缩酮偶联物往甲基纳曲酮(0. 200g，0. 56mmol)的二噁烷(20ml)溶液中加入D-α-葡萄糖(2. 02g，11. 2mmol)、triflic 酸(0. 05ml,0. 62mmol)和 CuSO4(1. OOg)。反应混合物在室温 下搅拌4天。反应物过滤，用饱和碳酸氢钠中和并再次过滤。除去二噁烷和水，残留物加 入到氯仿中用水抽提(3X100ml)有机层用MgS04干燥并用减压去除溶剂，粗品用硅胶纯 化(0-10%的甲醇的氯仿溶液)得到缩酮偶联物(O.OlOg)，与游离的甲基纳曲酮比例为 1 1。1H-WR(CDCl3) δ 0. 14 (br s，4H，纳曲酮环丙基)，0. 53 (br m，4H，纳曲酮环丙基)，
0.90 (m, 2H,纳曲酮环丙基)，1. 48 (m,6H,纳曲酮)，2· 19-2. 78 (m, 12H,纳曲酮)，3. 03 (m, 12H，纳曲酮)，3. 03 (m, 12H，纳曲酮)，3. 75 (q，2H，葡萄糖)，3. 87 (m, 8H，纳曲酮CH3和葡萄 糖)，3. 97 (q，2H，葡萄糖)，4. 14 (t，1H，葡萄糖)，4. 66 (s，1H，纳曲酮)，6. 65 (m，4H，纳曲酮)。实施例11 N- (4-羟基-苯基)_乙酰胺 2-氨基-戊二酸5- (4-乙氨基-苯)酯或Glu (醋氨酚)在BocGlu (OSuc)-OtBu (0. 500g，1. 25mmol)和醋氨酚(0. 944g,6. 25mmol)的 THF(15ml)溶液中加入N-甲基-吗啉(1. 40ml, 12. 5mmol)。反应加热至回流，并在回流 搅拌下过夜。除去溶剂，粗品用硅胶纯化(50-75%乙酸乙酯的己烷)得到Boc-Glu(醋氨 酚)-OtBu(0. 432g,0. 900mmol,72 % ) 1H-NMR(360MHz, CDCl3) δ 1. 43 (d, 18H, t_Bu)，
1.97 (m, 1H, Glu- β H), 2. 12 (s, 3Η,醋氨酚 CH3)，2· 25 (m，1Η，Glu-β H)，2· 60 (m，2Η， Glu- γ H), 4. 25 (m，1H，Glu- α H)，7. 04 (d，2H，醋氨酚芳香环)，7. 48 (d，2H，醋氨酚芳香环)。Boc-Glu (醋氨酚)-OtBu (0.097g，0.20mmol)的 4N 盐酸二噁烷(IOml)溶液中室温搅拌2小时。除去溶剂得到Glu(醋氨酚)(O. 90g)盐酸盐=1H-NMR(D2O) δ 2. 19(s，3H，醋 氨酚 CH3)，2. 41 (m, 1H, Glu- β H)，2. 97 (m, 2H, Glu- γ H), 4. 18 (t, 1H, Glu- α H)，7. 19 (d, 2H, 醋氨酚芳香环)，7. 51(d，2H，醋氨酚芳香环)；13CNMR0 (DMSO) δ 23. 80，29. 25，51. 00，66. 24， 119. 68，121. 69，137. 00，145. 35，168. 23，170. 42，170. 79。3-(2，5-二氧代-噁唑烷-4-基)丙酸4_乙酰氨基苯酯或Glu (醋氨酚)NCA往2-氨基-戊二酸 5-(4-乙酰氨基-苯)酯(1. 54g，4. 29mmol)的 THF (40ml)混 合物中加入三光气(1.02g，3.43mmOl)。所得的溶液回流搅拌3小时。在反应中，沉淀产物 并滤除，得到 Glu (醋氨酚)NCA(1. 02g，2. 64mmol,62% )，一种米色粉末=1H-WR(DMSO-Cie) δ 2. 01(s,3H,醋氨 CH3), 2. 15 (m, 2H, Glu- β H), 2. 81 (m, 2H, Glu- γ H), 3. 76 (t, 1Η, Glu- α H)，7. 06 (d，2Η，醋氨酚芳香环)，7. 63 (d，2H，醋氨酚芳香环)，8. 57 (br，s, 1H，酰胺)， 10。19 (s，1H，酰胺)；13C NMR0 (DMSO) δ 23. 81,29. 25,52. 13，54. 62，119. 66，121. 71，136. 98， 145. 35，168. 19，170. 46，170.77。实施例12 2-[{6_[双(2-羟基-乙基)_氨基]-4，8_ 二-哌啶-1-基-嘧啶[5，4_d]嘧 啶-2-基} - (2-羟基-乙基)_氨基]-乙醇 Glu (双嘧达莫)双嘧达莫(0.500g,0. 990mmol)和 Boc-Glu (Osuc) -OtBu (3. 96g, 9. 91mmol)的 THF(35ml)溶液中加入 DMAP (0. 072g，0. 60mmol)和 N-甲基吗啉(0. 22ml，1. 98mmol)。溶 液然后回流48小时。去除溶剂，粗品用硅胶(25-50%乙酸乙酯的己烷溶液)纯化。分离 得到两种主要产物，一种是R = 2-3 (0. 57g)，另一个是R = 3-4 (2. 80g)，为亮黄色油状物。 [对于 R =2-3 1H-匪R(CDCl3) δ 1. 41 (s, 42Η, t~Bu), 1. 64 (br s，5H，双嘧达莫)，1. 85 (m，2H， Glu- β H)，2. 07 (m, 2H, Glu- β H)，2. 37 (m, 4H, Glu- γ H), 3. 60-4. 24 (m, 12H, Glu- α H 和双嘧 达莫)]；[对于R = 3-4而言与上面类似，除1. 44 (s，56Η，t_Bu)之外]。Boc-Glu (双嘧达莫)-OtBu (R = 2-3，0. 57g)和 4NHC1 二噁烷(IOml)溶液室温搅拌 2. 5小时。去除溶剂，产物是一种亮黄色的固体=1H-NMR(DMSO-Cie) δ 1. 65 (br m，4H，Glu_3H 和双嘧达莫)，2. 04(br m,2H, Glu-β H), 2. 40 (br m，4H，Glu- γ H), 3. 75 (br m，8H，双嘧达 莫)3· 91 (br m, 2H, Glu- α H)，8· 55 (br m, 2Η,酰胺 H)。实施例13
齐多夫定UZT)1-(4-叠氮-5-羟甲基-四氢-呋喃-2-基)_5_甲基-IH-嘧啶_2，4- 二酮 Glu (AZT)齐多夫定(1.OOOg, 3. 75mmol)和 Boc-Glu (OSuc)-OtBu (3. OOg, 7. 49mmol)的二噁 烷(75ml)溶液中加入 DMAP (0. 137g, 1. 13mmol)和 N-甲基吗啉(0. 82ml，7. 49mmol)。溶液 然后加热回流6小时并在70°C加热12小时。除去溶剂粗品用硅胶纯化(100%氯仿)，得到 Boc-GIu(AZT) -OtBu (1. 09g, 1. 91mmol,51% )，一种黄色泡沫。1H-WR(CDCl3) δ 1. 40(d,32H, t_Bu)，1· 86 (s，3H，AZTCH3), 2. ll(m，2H，Glu-β H),
2.38 (m，4H，Glu-γ H 禾口 AZT 2，位 CH2)，4· 00_4· 31 (m，4H，AZT 4，位 CH 禾口 5 位，CH2 禾口 Glu-α H), 5. 21(d, ΙΗ,ΑΖΤ 3，位 CH)，6. 01 (t，1Η，AZT 1，位 CH)，7. 16 (s, 1H, AZT 6 位 CH)。Boc-GIu(AZT) -OtBu (1. 09g, 1. 91mmol)的 4NHC1 二噁烷溶液(20ml)搅拌 4 小时， 除去溶剂。得到产物Glu(AZT) (0.89g，1.99mmOl，定量)黄色玻璃状物质。1H-NMR(D2O) δ 1. 89(s，3H，AZT CH3)，2· 21 (m，2H，Glu-β H 禾口 AZT 2，位 CH2)，2· 58 (m，2Η，Glu-γ H)，
3.70 (t, 1Η, Glu-α H) ,4. 05-4. 41 (m，4Η，ΑΖΤ4，位 CH，3，位 CH 和 5，位 CH2)，6. 18 (t, ΙΗ,ΑΖΤΙ 位 CH)，7. 51 (s，1Η, AZT 6 位 CH)。实施例14 苏氨酸NCA在Thr-OtBu (0. 500g, 2. 85mmol)的 THF (25ml)混合物中加入三光气(0. 677g, 2.28mmol)。所得的溶液回流搅拌3小时。溶液蒸发至干燥，得到Thr-NCA(0. 500g， 2. 48mmol，87% )，为白色固体。Thr-NCA不再进行进一步表征鉴定。实施例15制备作为聚合反应的起始合成子的药物_谷氨酸偶联物对于非一级胺的药物被选物，药物_聚谷氨酸偶联物的形成有可能会困难，为克 服这个困难，使用下列路线，其中药物先与谷氨酸偶联，这个合成子被用来引发偶联。此方 法成功用于舍曲林和甲氧氯普胺。Boc-Glu (OtBu) -OH 与舍曲林的偶联1. Boc-Glu (OtBu)-OH(0. 44g, 1. 46mmol)和 PyBOP (0. 84g, 1. 60mmol)搅拌溶解在 无水 DMF (15ml)中。2.加入DIEA(0. 31ml, 1. 75mmol)，氨基酸衍生物活化15分钟。
3.边搅拌将盐酸舍曲林(0. 50g, 1. 46mmol)加入到混合物中，再加另外的0. 31ml DIEA。4.混合物搅拌16小时5.溶液经汽提得到棕色的油6.将此油溶解在乙酸乙酯(IOOml)中，所得的溶液分别用10% HCl (3X30ml)，饱
和碳酸氢钠，4M硫酸氢钠和盐水洗涤。7.溶液用硫酸镁干燥，过滤并在减压下用旋转蒸发器除去溶剂，产生浅棕色油。8.该油用真空干燥，用硅胶进行柱层析纯化，使用乙酸乙酯/己烷1 5至1 4 的溶剂系统。9.收集产品组分，再用回转蒸发器除去溶剂，得到0.85g(99%)的最终产物，舍曲 林-NH-C (0)-谷氨酸-NH3+。10.制备产物经真空干燥实施例16聚-赖氨酸-布洛芬的合成I.布洛芬-0-琥珀酰亚胺的制备(RI-172) (Grafe&Hoffman，制剂学 (Pharmazie)55 :286_292，2000) 室温下搅拌布洛芬(2. 06g, 1 Ommol)在5ml 二噁烷的溶液中加入二环己基碳二亚 胺(DCC，2. 27g，llmmol)的25ml 二噁烷溶液。10分钟后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，
1.16g, IOmmol)的15ml 二噁烷溶液。反应混合物室温搅拌5小时，然后用烧结玻璃漏 斗过滤以去除二环己基脲(D⑶)。经旋转蒸发后，产物经从二氯甲烷/己烷中结晶得到
2.36g(78% )的无色固体。1H-WR(DMSO-CW) δ 0. 86 (d, 6, CH3), 1. 49 (d, 3, α -CH3) ,1.81 (m, 1，CH), 2. 43 (d，2，CH2), 3. 33 (m，4，CH2CH2), 4. 22 (q, 1，CH), 7. 16 (d，2，芳基 H)，7· 28 (d, s,芳 基氢)II.聚赖氨酸与布洛芬-0-琥珀酰亚胺的偶联(RI-197) 聚赖氨酸-冊1~(516獻，10011^，34.511111101)溶解在Iml水中，用碳酸氢钠调ρΗ至 8，室温搅拌。将布洛芬-0-琥珀酰亚胺(116mg，380mmOl)的二噁烷溶液2毫升加入到此溶液中，搅拌过夜，二噁烷用旋转蒸发去除并用IOmlpHS的碳酸氢钠水溶液稀释。沉淀经 烧结玻璃漏斗过滤，并用3X IOml水和4X10ml 二乙基醚洗涤，高真空干燥过夜得到固体 105mg(62% )。1H-WR(DMSO-Cie) δ 0. 85 (br s，6，CH3)，1· 27 (br s，3，α-CH3)，1· 40-1. 79 (m， 5，布洛芬 CH 和赖氨酸 γ 和 δ CH2CH2)，2. 31 (d，2，β CH2)，2. 41-2. 52 在 DMSO 下(m，2， β CH2)，2. 73-3. 01 (m，2，ε CH2), 3. 51-3. 85 (m, 1,布洛芬 CH)，4. 01-4. 43 (m，1，α CH), 7. 14 (d, 2，芳基 H)，7· 6 (d, 2，芳基氢)，7. 90-8. 06 (m, 2，NH)。实施例17[赖氨酸]xx-[吉非诺齐或萘普生]或[谷氨酸]XX_L-多巴合成的总结[Glu] 15-L- 二羟基苯丙氨酸或[Glu] 15-L-多巴的合成L-多巴(0. 050g,254mmol)和 GluNCA (0. 666g，3. 85mmol)溶解在 6mlDMF 中。氮气 下搅拌过夜。反应用薄层层析(9 1水乙酸)来检测，显示有游离药物(Rf = 0. 70)和被认为是聚合物的更 极性的斑点(Rf = 0. 27).加12ml水终止反应。用INHCl调pH为1_2。用旋转蒸发除去溶 齐U，粘稠的残留物在真空中干燥。将所得的粘液转移到一个新的装水的容器中并冻干。得 到米色至浅棕色晶体。产量0470g，62%。1HNMR显示有焦谷氨酸的污染；这样，产物在水中悬浮，超滤(Millipore，再生纤 维素，YMl分子量截留1000)，滤余液在真空中干燥。产量0. 298g。1HNMR(SOi)MHz, DMS0) 显示谷氨酸和L-多巴的相对比例为30 1，6.6仏-多巴芳香环)，6.4仏-多巴芳香环)， 4. 1 (Glu, α )，1. 85 (Glu, Y，L-多巴)，2. 3 (L-多巴，苄基)，12. 4-11. 5 (Glu, C00H)，8. 0 (Glu
酰氨)。[谷氨酸]10-L-多巴的合成除了只用0. 439gGluNCA以外，其它同[Glu]15_L_多巴合成相同。最后纯品的产量 为 0. 007g。1HNMR (500MHz, DMS0)显示谷氨酸和L-多巴的相对比例为8:1。萘普生-琥珀酰亚胺的合成萘普生(2. 303g, IOmmol)的5ml 二噁烷中加入溶于15ml 二噁烷的N-羟基琥珀 酰亚胺(1. 16g，IOmmol)和溶于25ml 二噁烷的二环己基碳二亚胺(2. 2gllmmol)。反应 搅拌过夜，不溶性的二环己基脲用过滤除去。旋转蒸发除去溶剂，残留物溶解在30-40ml 二氯甲烷中。加入约IOml己烷，混合物冷却至4°C 2小时。再滴加己烷至小片状白色晶 体开始形成，溶液冷藏过夜。收集活性酯，用己烷洗涤和用真空干燥(2. 30g，70.0%) 1HNMR (500MHz, DMS0) 1. 70 (d，3H，CH3)，2· 9 (s，4H，琥珀酰亚胺)，3· 91 (s，3H，OCH3), 4. 18 (q, 1H, CH)，7. 75-7. 12 (m, 6H,芳香环)。聚赖氨酸_萘普生的合成
往Iml [Lys] 14 · 14 · HBr (0. 100g, 35mmol)水溶液(含 10mg/ml 碳酸钠)加入萘普 生-琥珀酰亚胺(0. 124g,379mmol)的2ml 二噁烷溶液。搅拌过夜形成沉淀。加入30_40ml 水(含10mg/ml碳酸钠)后形成更多沉淀，过滤分离，用50ml乙醚洗涤。细小的白色粉末经 干燥(0. 095g,53% ) =1HNMR (500MHz, DMS0) 8. 1 (m，1H，赖氨酸；酰胺)，7. 8-7. 0 (m，6H，芳香 环)，4. 4-4. 1 (m, 2H, α CH)，3. 3 (s，3H, OCH3)，2. 8 (m, 2H, ε )，1. 7-1. 0(m,9H, β , γ , δ CH3)。吉非诺齐_琥珀酰亚胺的合成
吉非诺齐(GEM) (5. 0g, 20. Ommo 1)的30ml 二噁烷中加入溶于20ml 二噁烷的 N-羟基琥珀酰亚胺(2. 3g,20. Ommol)和溶于50ml 二噁烷的二环己基碳二亚胺(4. 5g 22.0mmol)。反应搅拌过夜，不溶性的二环己基脲用过滤除去。旋转蒸发除去溶剂，残留物 溶解在15-20ml 二氯甲烷中。滴加己烷至晶体开始出现，混合物冷却至4°C过夜。再加入 3ml正己烷，混合物-20°C冷藏过夜。活性酯形成小片装结晶并收集，用己烷洗涤和用真空 干燥(5. 8g，80. 0% ) =1HNMR(500MHz, DMSO) 1. 2，1. 3(s，6H，CH3)，1. 8—1. 5(m，6H，GEM CH2)， 2. 3-2. 1 (s，6H，芳香环 CH3)，2. 85-2. 7 (d，4H，琥珀酰亚胺 CH2)，7. 0-6. 6 (m，3H，芳香 环)。聚赖氨酸-吉非诺齐的合成ft Iml [LysJ11 .11 'HBr (0. 100g，43. 5mmol)水溶液(含 10mg/ml 碳酸钠)加入吉非 诺齐-琥珀酰亚胺(0.094g，261. lmmol)的2ml 二噁烷溶液。搅拌过夜形成沉淀。加入30ml 水(含10mg/ml碳酸钠)后形成更多沉淀，过滤分离，用50ml乙醚洗涤。细小的白色粉末 经干燥(0. 019g, 1% ) ^HNMR (500MHz, DMSO) 1. 5—1. 0(m，12H, β , γ , δ , CH3)，1. 85—1. 5 (m， 4Η, CH2) ,22. 3,2. 1 (s,6H,芳香环 CH3)，3. 35 (s,2H, ε )，3. 85 (s, 2H, OCH2)，4. 05 (s, 1H, α )， 5. 6 (d，1H，氨基甲酸酯)，7. 0-6. 7 (m, 3H，芳香环)，8. 0 (d，1H，酰胺)。实施例18所有试剂均不进行进一步处理。IHNMR由 Bruker300MHz (300)和 JE0L500MHz (500) NMR光谱仪进行，使用四甲基硅烷为内部标准。薄层层析用硅胶60F254预铺板。色谱使用硅 胶 60(230-400 目)。聚精氨酸的制备方法1在溶有H-Arg (Z) 2_0H (0. 300g, 0. 68mmol)的3ml无水DMSO中加入叠氮磷酸二苯酯 (219μ l,1.02mmol)和三乙胺(236 μ 1，1. 69mmol)。反应在氩气下进行48小时，届时溶液倒 入100ml水中。所得的不均一的溶液经离心分离出白色沉淀，其用3 X 100ml水，3 X 100ml 甲醇和100ml乙醚洗涤然后，真空干燥，得到172mg米色粉末1HNMR(SOi)MHz, DMS0) 7. 31 (m， 10H)，5. 21 (m，1H，节基)，5. 02 (m, 1H，节基)，3. 83 (m, 1H, α )，3. 34 (m, 2H, δ ) 1. 54 (m, 4H, β，Y)。此产物溶解在1. 5ml无水苯甲醚中，并与0. 3ml无水甲磺酸搅拌3小时，届时再加 入0. 3ml无水甲磺酸且溶液搅拌1小时。反应混合物倒入6ml乙醚中并冷冻15分钟。此 异质的两相混合物用旋转蒸发器浓缩至0.5ml。再分三次加8ml乙醚，两相混合物经离心， 弃上相，留下一种黄色的胶状物。残留物用6ml丙酮洗涤两次，离心弃上相，留下黄白色的 残留物。此残留物溶解在0. 3ml水中，和AmberliteIRA-400振摇。过滤除树脂并用3ml 水洗涤，洗脱液和洗涤物合并经真空干燥得到黄色的膜0.063g，(90% ) =1HNMR(500MHz, D2O) 4. 37 (m, 1H，α )，3. 22 (m, 2Η, δ )，1. 94-1. 66 (m, 4Η，β，γ )。MALDI-MS 显示聚合程度从 6至14不等的残留物。方法2在溶有Boc-Arg (Z) 2_0Η(0. 025g, 0. 05mmol)和 H-Arg (Z) 2_0H(0. 280g, 0. 63mmol) 的3ml无水DMSO中加入叠氮磷酸二苯酯(219 μ 1,1. 02mmol)和三乙胺(236 μ 1， 1.69mm0l)。反应在氩气下进行48小时，届时溶液倒入100ml水中。所得的不均一的溶 液经离心分离沉淀，其用3X 100ml水、3X 100ml甲醇和100ml乙醚洗涤然后真空干燥得至Ij 132mg 固体HNMR (500MHz，DMSO) 7. 31 (m，10H)，5. 21 (m，1H，节基)，5. 01 (m，1H，节基)， 3. 83 (m, 1H, α )，3. 34 (m，2H，δ ) 1. 54(m,4H, β，Y)。此产物溶解在1. 5ml无水苯甲醚中，并与1. 3ml无水甲磺酸搅拌4小时。此溶液 用旋转蒸发器浓缩至0. 5ml。加8ml乙醚，两相混合物经离心，弃上相，分三次加入IOml丙 酮留下一种黄色的胶状物。离心弃上相，沉淀经真空干燥过夜。此残留物溶解在0.3ml水 中，和AmberliteIRA-400振摇。过滤除树脂并用3ml水洗涤，洗脱液和洗涤物合并经真空 干燥得到黄色的膜 0. 019g，(24% ) =1HNMR(500MHz, D2O) 4. 37 (m, 1H, α )，3· 22 (m，2H，δ ), 1.94-1. 66 (m,4H, β , y)D MALDI-MS显示聚合程度从5至11不等的残留物。T4偶联物的制备 偶联于氨基酸聚合物的T4，既可由将带保护的T4与市售的氨基酸均聚物偶联得 至IJ，也可通过T4部分与相应N-酸酐氨基酸聚合而得到。T4与现成的均聚物的偶联往溶有N_TeocT4(0. 017g，17ymol)的Iml无水DMF中入二环己基碳二亚胺 (0. 004g, 18 μ mol)，搅拌30分钟后加入N- 二甲基-4-氨基吡啶(0. 004g, 36 μ mol)和18聚 谷氨酸(0. 017g, 17 μ mol)，反应搅拌过夜。此浑浊的溶液倒入20ml水中并且用IOml 二氯 甲烷萃取二次。水相用IN盐酸酸化至pH3，并冷却至4°C，产物经离心分离，沉淀用8ml水 洗涤三次。沉淀经真空干燥得到二环己基脲和N-TeoCT4-Gly18 =1Hnmr(SOODMSO) 7. 8 (T4，芳 香环)，7. 1(T4，芳香环)，4. 1(a)。在不纯的带有保护的聚合物中加入2ml三氟乙酸。反应搅拌2小时，用旋转蒸发除 去溶剂。残留物溶解在ImlDMF中，过滤除去不溶物。用旋转蒸发除去DMF并经真空干燥得 到白色的物质(.012g,40%) "HNMRGOODMSO) . 8(T4，芳香环)，7. 1(丁4，芳香环)，4. l(bs， a ) 0氨基酸NCA的制备往溶有L-氨基酸(1. 5g)的100ml无水THF中加入三光气(0. 8当量)反应在装 有回流冷凝器和NaOH阱的容器中进行，加热回流3小时。用旋转蒸发除去溶剂，残留物经 己烷洗涤得到氨基酸NCA的白色残留物。LeuNCA =1HNMR (500 CDCl3) 6. 65 (s，1H，NH)，4. 33 (dd，1H，a ), 1. 82 (m, 2H, β ),
1.68 (m, 1Η, γ) ,0. 98(dd,6H, δ)。PheNCA =1HNMR (500 CDCl3) 7. 36-7. 18(m，5H)，5. 84(s，5H)，4. 53 (dd, 1Η)，3. 28 (dd, 1Η, α )，2· 98 (dd, 1Η, β )。Trp (Boc)NCA =1HWR (500 CDCl3) 8. 14 (d, 1Η)，7· 49(d，2H)，7· 36 (t, 1Η)，7· 27 (m, 1Η) ,5. 90 (s, 1Η, NH) ,4. 59 (dd, 1Η, α ) ,3. 41 (dd, 1Η, β )，3· 07 (dd，1Η，β )，1· 67 (s，9Η， t-Bu)。IleNCA =1HNMR(300 CDCl3) 6. 65 (s, 1Η，ΝΗ)，4· 25 (d, 1Η，α )，1. 94 (m, IH,), 1· 3 (dm, 2Η, Y-CH2), 1. 03(d,3H, Y-CH3) ,0. 94(t,3H, δ)。Lys(Boc)NCA =1HNMR(500 CDCl3) 6. 65 (bs, 1Η, NtH)，4. 64 (s，1Η，氨基甲酸酯 NH)， 4.31(t，lH，a )，3· 13(s，2H，ε )，2· 04 (m，2H，β )，1· 84 (m，2H，δ )，1· 48 (m，11H，γ，t_Bu)。MetNCA =1HNMR (500 CDCl3) 6. 89 (s, 1H, NH), 4. 50 (dd, 1H, a )，2. 69 (t，2H，y ),
2.10 (m, 1H, β )，2. 08(m，4H，β，δ )。
典型的T4-N-封端的均聚物制备T4-Leu15往溶有IleNCA(0. 200g, 1. 3 μ mol)的 2. 5mlDMF 加入异亮氨酸(0. 012g,
0.Ιμπιο )，在氩气下搅拌过夜后，T4-NCA(0. 037g，0. 050 μ mol)加入到反应中，再搅拌72 小时。此白色的液体加入到8ml水中。此不均一的溶液冷却至4°C，离心弃去上清，沉淀 物用8ml水洗涤。干燥的残留物用50ml加热至50°C的乙醇洗涤，干燥后得到白色的粉末 (0. 124g,55% ) =1Hnmr(SOODmSO) 7. 75 (S，T4 芳香环)，7. 08 (s，T4 芳香环)，4· 11 (dd, α ),
1.77 (m, β ), 1. 38 (m, β , γ-CH), 0. 91 (m, γ-CH, Y-CH3, δ)。T4-Phel5 白色粉末(58% ) 1HNMR(360MHz，DMSO) 7. 0-8. 1 (NH，芳香环)，4. 5 ( α )，3. 0 ( β )； MALDI-MS 显示T4-Phei_5。T4-Metl5白色粉末(10 % ) ^HNMR (500MHz, DMSO) 8. 0-8. 5 (酰胺 NH)，4. 4 ( α )，2. 5 ( γ )，
2.05( ε ) ,2. 0-1. 7(β )。T4-Val 15白色粉末(14%) =1HNMR(500MHz，DMSO) 7. 75 (T4 芳香环)，7. 08 (T4 芳香环)， 4. 35(α),3. 45(β),1.05(γ)ο对于那些使用带保护的NCA的偶联物，需要一个附加的，独立的脱保护步骤。在溶解有14-[1^8 0()]15(0.256g,61ymol)的 IOml 二氯甲烷和三氟乙酸(IOml) 一起搅拌2小时。用旋转蒸发器去除溶剂，残留物溶解在3ml水中并超滤(Amicon再生 纤维素，YM1NMWL1000,用30mlpH5的水洗涤)。滤余液真空干燥得到浅黄色的残留物 1HNMR(SOOd2O) 7. 82 (s，T4,芳香环)，7.41 (s，T4,芳香环)，4. 29 (bs，α ), 3. 00 (bs, α ), 2.13-1. 70 (m，β , δ , γ) ；MALDI-MS 显示产生的范围是 T4_Lys4_n。T4-Trpl5 :1HNMR(500DMS0)8. 25-6. 80(m，芳香环)，4· 50(bs，α ), 3. 40 (bs, β ),
3.00 (bs, β )。典型的T4-C-端封均聚物的制备往溶有Τ4 (0. 078g, IOOymol)的 IOml 无水 DMF 力口 入 Trp (Boc) NCA (0. 500g, 1.514mmol),在氩气下搅拌64小时，加入IOml水终止反应。此不均一溶液冷却至4°C，离心， 沉淀用25ml水洗涤3次。残留物经真空干燥，得到棕色固体Trp (Boc) 15-T4。该物质进一 步超滤纯化(Amicon再生纤维素，YM1，NMWL1000，用30ml pH5的水洗涤)，从而得到棕金黄 色的固体(0. 400g,79%) =1H NMR(500DMS0)8. 25-6. 80(m，芳香环)，4· 50 (bs, α )，3· 40 (bs, β ) ,3. 00 (bs, β )，1· 50 (bs, t_Bu)。[Trp(BoC)]15-T4(0. 509克)在8ml的1 1 二氯甲烷三氟乙酸中搅拌1. 5 小时。溶剂用旋转蒸发器去除，残留物真空干燥，得到一棕色固体(0.347g，97%) =1H NMR(500DMS0)8. 25-6. 80(m，芳香环)，4· 50(bs，α ), 3. 40 (bs, β ), 3. 00 (bs, β)。[Lys (Boc) ]15-Τ4 =1H NMR(500D20) 7. 82 (s, Τ4 芳香环)，7. 41 (s，Τ4 芳香环)，
4.29 (bs, α ) ,3. 00 (bs, ε )，2· 13-1. 70 (m，β , δ , γ)。Lys15-T4 =1H NMR(500D20) 7. 82 (s,T4 芳 香环)，7. 41 (s,T4 芳香环)，4. 29 (bs，α )， 3. 00 (bs, ε )，2. 13-1. 70 (m，β，δ，γ )。
典型的随机T4/均聚物的制备把T4NCA(0. 065g，0. Immo 1)和 Trp (Boc) NCA (0. 400g, 1. 2mmol)在 4 毫升无水 DMF 中混合。加入三乙胺(11微升，0. lmmol)，在氩气下搅拌反应44小时。加入10毫升水终止 反应之后，该不均一混合物被冷却至4°C，离心。分离出沉淀物，用10毫升水洗涤3次，真空 干燥。把10毫升1 1的二氯甲烷三氟乙酸加到该随机T4/[Trp(BoC)]15均聚物 中，一起搅拌反应1小时。用旋转蒸发器去除溶剂，真空干燥得到棕色的残留物(0.262g， 91% ),继续用超滤纯化(Amicon再生纤维素，YMl NMWL1000,用30mlpH5的水洗涤) 1Hnmr(SOODMSO)S. 25-6. 80 (m，芳香环)，4. 50 (bs，α ), 3. 40 (bs, β ), 3. 00 (bs, β)。随机T4/Lys 15 =1HNMR(SOC) D2O) ;7· 82 (s，Τ4 芳香环)，7· 41 (s，Τ4，芳香环)， 4. 29 (bs, α )，3. 00 (bs, ε )，2. 13-1. 70 (m, α，β，γ)。聚赖氨酸丙戊酸钠(Depakote)的制备在溶有羟戊酸(1. Og, 6. 9mmol)的14ml6 1 二氯甲烷DMF中加入N-羟基琥珀 酰亚胺(0. 8g，6. 9mmol)，双环己基碳二亚胺(1.6g，7. 6mmol)和三乙胺(0. 9g，8. 9mmol)。反 应搅拌60小时，届时溶液经过滤除去白色的沉淀并用旋转蒸发除去溶剂。残留物用闪色谱 纯化(10 1-2 1己烷乙酸乙酯)以得到琥珀酰亚胺酯是一种清澈的油(1.0g，59%) Rf (3 1 己烷:乙酸乙酯)0.43 ^HNMR(300MHz，CDCl3) 2.76 (s，4H，琥珀酰亚胺)，2.61 (m， 1H, CH)，1. 65-1. 19 (m, 8H, CH2)，0. 88 (t,6H, CH3)。在溶有Lys14HBr (0. 106g, 37 μ mol)的 0. 8mlpH8 的水中加入溶于 0. 4mlTHF 的丙戊 酸琥珀酰亚胺酯(0. 104g，431ymol)。反应搅拌过夜，届时加入8ml水。溶液用6M盐酸酸 化至PH3并用2ml 二氯甲烷萃取2次。水层经干燥，残留物溶于Iml水中。溶液经SEC纯 化(G-15，IOml干体积)并用水洗脱。合并那些含偶联物的组分并干燥得到白色的固体。 经NMR显示每个药物分子带有28个赖氨酸。1HNMR (D2O) 4. 29 (m, 1H, α ), 3. 00 (m, 2Η, ε ),
1.87-1. 68 (m, 4H, β，δ ), 1. 43 (m, γ，CH2)，0. 85 (t, CH3)。聚谷氨酸美伐他丁的制备AcNGlu15 (3-美伐他丁 ) 2在溶有15聚谷氨酸(0. 116g，69 μ mol)的3ml无水DMF中加入Iml吡啶和乙酸酐 (20 μ 1,207 μ mol)。搅拌21小时后混合物用6NHC1酸化至pHl然后冷却至4°C。离心收集 白色沉淀并用水洗涤3次，然后真空 干燥得到IlmgN-乙酰化的15聚谷氨酸(polyGlu15)。在溶有N-乙酰化15聚谷氨酸(O.Ollg，7 α mol)的4. 8ml无水DMF中加入二环己 基碳二亚胺(0.022g，108ymol)。搅拌20分钟后，此不均一的溶液经过滤除去不溶性的二 环己基脲并合并美伐他丁(0. 042g,108ymol)和N-二甲基-4-氨基吡啶(0. 013g，108 μ mo 1)。混合物搅拌23小时，届时加入20ml水终止反应。溶液用IOml氯仿萃取2次。水相用 INHCl调pH为3并冷却至4°C。离心收集所得的白色沉淀并用8ml水洗涤3次。固体溶于 Iml水中并用Iml 二氯甲烷洗涤和2ml乙酸乙酯洗涤2次。水相用INHCl调pH为3，离心 收集沉淀并用2ml水洗涤2次。经干燥的偶联物(2mg)由1HNMR显示每两个美伐他丁分子 有 15 个谷氨酸。1HNMR(500MHz, DMS0)，5. 92 (5，美伐他丁)，5. 72 (3，美伐他丁)，5. 19 (4， 美伐他丁)，5. 17 (8’ 美伐他丁)，3. 12 (3 美伐他丁)，4. 41 (5 美伐他丁)，4. 03 ( α，Glu)，
2.25(y , Glu)，1. 88 ( β，Glu)，0. 82 (4”，2，烯丙基甲基美伐他丁)，1. 17 (2” 美伐他丁 )。
Glu15 (3-美伐他丁)(160)在溶有15聚谷氨酸(0. 151g，77ymol)的3ml无水DMF中加入二环己基碳二亚 胺(0. 239g，1. 159mmol)。氮气下搅拌4小时。除去白色沉淀并加入溶于IOml氯仿的和 N- 二甲基-4-氨基吡啶(0. 141g，1. 159mol)和美伐他丁 (0. 222g，0. 569mmol)。混合物在 氩气下搅拌21小时，除去沉淀。溶液用旋转蒸发浓缩并加入40ml饱和NaCl (液体)调至 pH8。均一的溶液用20ml氯仿萃取3次并超滤(Amicon再生纤维素，YMl, NMWL 1，000)。 滤余液经真空干燥得到8mg白色的残留物。由1HNMR显示每个美伐他丁分子有15个谷氨 酸。1HNMR(500MHz, D2O)，5. 92，5. 72 (3，美伐他丁)，5. 19 (4，美伐他丁)，5. 17 (8，美伐他 丁)，3. 12 (3 美伐他丁)，4. 41 (5 美伐他丁)，4. 03 ( α，Glu), 2. 25 ( y , Glu)，1. 88 ( β，Glu)， 0. 82 (4”，2’烯丙甲基，美伐他丁)，1. 17 (2”美伐他丁 )。BocGlu (3-美伐他丁 ) O-t-Bu
在BocGlu (OSu) O-t-Bu (0. 181g, 453 α mol)和美伐他丁(0. 177g, 453 μ mol)的 40ml氯仿中加入N-二甲基-氨基吡啶(0. 055β，452μπιΟ1)。反应在氩气下加热回流7小时 再在20°C下搅拌8小时。用旋转蒸发除去溶剂，残留物用闪色谱纯化(8 1-1 1的己烷 乙酸乙酯)得到偶联物，一种透明的膜(0.038g，ll% ) :Rf(3 1己烷乙酸乙酯)0.22 ； IHNMR(CDC13 500MHz) 5. 97 (d, 1H，5，)，5· 73 (dd, 1Η，3”)，5· 55 (s, 1Η，4，)，5· 32 (s, 1Η，8”)， 5. 24 (dd 1Η, 3)，5. 09 (d, 1Η, NH)，4. 48 (m, 1Η, 5)，4. 20 (m, 1H, α )，2. 78 (m, 2H, 2)，2. 37 (m, 4H，2，，2”，y),1.45(s,18H, t_Bu)，1· 12 (d，3H，2”-CH3)，0· 88 (m，6H，4”，2，-CH3)。聚谷氨酸泼尼松的制备BocGlu (21-泼尼松)0_t_Bu在BocGlu0-t_Bu(0. 400g，1.32mmol)的 20ml 氯仿中加入二环己基碳 二亚胺 (0. 544g，2. 64mmol)。反应搅拌1小时，过滤除去不溶性的二环己基脲。加入N二甲基-氨基 吡啶(0. 320g，2. 64mmol)和泼尼松(0. 472g，1. 32mmol)。反应加热回流60小时并过滤。用 旋转蒸发除去溶剂，残留物用闪色谱纯化(10 1-0 1的己烷乙酸乙酯)得到偶联物， 一种透明的膜(0. 256g，31% ) :Rf (6 1 氯仿:甲醇)0· 54 ;1HNMR(CDC13 500MHz) 7. 68 (d, 1H, 1)，6. 16 (d, 1H，2)，6. 04 (s，1H，4)，5. 15 (d，1H, NH)，5. 03 (d, 1H，21)，4. 71 (d, 1H，21)， 4. 08 (t, 1H, α )，1. 40 (s, 18H, t_Bu)。谷氨酸(21-泼尼松)在溶有BocGlu (21-泼尼松)O-t-Bu (0. 060g，93 μ mol)的 15ml 二氯甲烷与三氟乙 酸(1. 5ml)搅拌1小时。用旋转蒸发除去溶剂，残留物用闪色谱(8 1氯仿甲醇)纯化 得到透明的膜Rf(6 1 氯仿:甲醇)0. n/HNMlUCDCljOOMHz) · 72(d，lH，l)，6. 25(d，lH， 2)，6. 14 (s，1H, 4)，5. 14 (d, 1H, 21) ,4. 75 (d, 1H, 21) ,4. 10 (t, 1H, α )。实施例19氨基引发的L-谷氨酸NCA聚合 分子量(g/mol)266.3 1731538 (η = 10)质量(mg)77 500466 = 100%毫摩尔0. 29 2. 890. 29当量1101DMF是四氢呋喃，无水，购自Aldrich。玻璃器皿用前烘干。1. GluNCA (500mg, 2. 89mmol)溶解在4mlDMF中，置于带气体入口管的15ml圆底烧 瓶中，在氩气下搅拌。2.阿替洛尔，溶解在ImlDMF中，加入到此Glu-NCA溶液中，室温搅拌72小时。大 致上，反应可进行至经TLC监测无氨基引发物存在。对于这个反应，TLC用硅胶板，用20% 的甲醇的乙酸乙酯溶液进行洗脱。3.将反应溶液倒入20ml 10%碳酸氢钠溶液(pH = 8)来终止反应4.水溶液用20ml 二氯甲烷洗涤两次，20ml乙酸乙酯洗涤3次。5.合并水层，用6NHCL调pH至6并用旋转蒸发减少体积至20ml。此溶液在冰箱 中冷却3小时以上。6.为沉淀聚合物产物，水溶液用6N盐酸酸化至pH 2，再放回冰箱中1_2小时。7.混悬液分份倒入IOml试管中，离心15分钟至沉淀在试管底部形成结实的团块， 这样水可被倾去。(在这点上，通常的步骤，最好用过滤漏斗过滤固体，再用酸性的水洗涤。 阿替洛尔上使用离心是因为固体对过滤器而言太细了。8.此固体在酸性水(pH约为2)再悬浮并振荡，再次离心倾去水。此步骤重复三次 洗涤。9.产物在高度真空下干燥过夜得到262克(59% )聚合物。NMR分析显示Glu/阿 替洛尔的比例为30/1。实施例20Caco2人肠上皮细胞的单细胞层越来越多地用于预测口服药物的吸收。我们使用 Caco-2透孔(transwell)系统和其他体外分析来评价宝力士德(polythroid)的性能。结 果显示，宝力士德可以增强甲状腺素激素的口服输送以治疗甲状腺机能减退症。体外性能Caco-2人肠上皮细胞测定Caco-2细胞在24孔板的胶原包被的孔表面上生长，形成连续的单细胞层以模拟 肠道的一个小片断。这些孔是可以移动的，带有一个顶腔以代表顶侧(面向肠道的腔道) 和一个底腔以代表基侧(浆膜的药物吸收位点)。上皮屏障的完整性可通过测量单细胞层 两侧的电阻来监控。通过在上腔中加入样品，经培育后测量在基侧腔中药物的浓度来研究 药物的吸收。小肠上皮细胞蛋白酶消化宝力士德 宝力士德是由与T4和T3经肽键共价连接的谷氨酸的合成聚合物。该聚合物是甲 状腺素激素的输送载体且被设计自身不穿过肠道屏障。相反，它被设计成以依赖于时间的 方式释放T4和T3。甲状腺素激素的释放有赖于谷氨酸聚合物的酶解。在理论上，这是由于 当宝力士德经过小肠道时遇到蛋白水解酶，蛋白质被胃蛋白酶和分泌到小肠中的胰酶消化成短肽。肠上皮细胞然后进一步发挥功能，切割这些短肽。这是通过蛋白水解酶(即结合 在细胞表面的纹缘蛋白酶)来达此目的的。监测纹缘蛋白酶对宝力士德的作用需要开发一种测定方法以将宝力士德与聚谷 氨酸和甲状腺素激素区分开来。这样，我们开发了一种酶联免疫吸附测定法(ELISA)来特 异性地识别宝力士德。此测定方法采用针对谷氨酸聚合物的抗体来俘获宝力士德，用针对 T4和T3的抗体来检测宝力士德的存在。此方法与聚谷氨酸或甲状腺素激素本身无交叉反 应。这样，宝力士德的蛋白酶降解导致T4和T3从聚合物中释放出来，从而ELISA的反应性 相应的减少。这样，宝力士德特异性的ELISA可以用来检测宝力士德的降解。宝力士德特 异性的测定方法用于测定宝力士德在Caco-2细胞培养中的原位降 解。将不同浓度的宝力士德加到Caco-2细胞的顶侧，并在37°C下于PBS中培育4小时(η =4)。4小时培育前后的顶侧宝力士德的浓度用宝力士德特异性的ELISA进行测定(图6)。 当浓度为相对较高的100微克时，26%宝力士德被降解，而当浓度低十倍时，84%的宝力士 德被降解。如加入的浓度为0.5微克(接近于一剂正常人用剂量时肠道中的浓度)经4小 时培育后残留的宝力士德的量低于ELISA的检测限(IOng)，提示基本上完全水解了。顶侧 腔体中宝力士德量的减少宝力士德吸收穿过了单细胞层，因为在任何试验中均不含有可检 测的宝力士德(见下)。我们不能排除宝力士德的细胞吸收，但对于顶侧宝力士德浓度的减 少而言，酶解很可能最主要的因素(如果不是全部因素的话)。在较高浓度下，对于细胞吸 收也难以解释如此大的残留宝力士德差异。宝力士德增强了 Τ4穿过Caco-2单细胞层的吸收用Caco-2细胞穿透孔技术(η = 4)来监测Τ4的吸收。将宝力士德(10微克)加入到穿透孔的顶侧。Τ4的顶侧加入量等于宝力士德中 Τ4的含量。一种市售的T4ELISA法用于测定在37°C培育4小时后基侧腔中T4的水平。从 宝力士德中吸收的T4水平明显比用与聚合物中含量相当的T4 一起培育的Caco-2细胞高。宝力士德没有穿过Caco-2单细胞层为了测定宝力士德自身有无穿过Caco-2单细胞层，我们在与高浓度(100微克) 宝力士德一起培育4小时后的基侧腔中用宝力士德特异性的ELISA测定了聚合物的浓 度。样品(η = 4)显示在基侧无ELISA反应。宝力士德的检测限是10ng，这样也就是少于 1/10，000的宝力士德被吸收。总之，就ELISA检测而言，宝力士德没有穿过Caco-2单细胞层。宝力士德在胃肠模拟器中的消化胃蛋白酶是由胃粘膜分泌，唯一在胃的酸性条件下有活力的蛋白酶。胰脏把一些 蛋白水解酶分泌到肠中来降解蛋白质和多肽。在理论上，当聚合物下行通过肠道时，这些内 源性的蛋白酶会将T4和T3从宝力士德中释放出来。我们检测了宝力士德在美国药典的人工胃液和人工肠液中的情况并比较了用不 同方法合成的宝力士德的消化情况。宝力士德的样品因甲状腺素激素的结合位点而不同。 样品溶解在含有胃蛋白酶的人工胃液缓冲液中或溶解在含有胰脏酶提取物(胰酶)的人工 肠液缓冲液中并在37°C下培育24小时。消化后，样品用HPLC测定以确定所释放的T4和 T3单体。图9和图10显示了在胃液和肠液消化后T4和T3的水平。释放也因甲状腺素激 素结合位点而不同。T4和T3结合在C端(C-封端)的宝力士德消化水平最高，另一方面，T4和T3结合在N端(N-封端)的宝力士德在人工胃液中未被消化，在人工肠液中的消化水 平也相对较低。随机结合的宝力士德在人工胃液中显示只有少量的消化，在人工肠液中有 中等程度的消化。总之，甲状腺素激素从宝力士德中释放的程度取决于合成的方法。这为 口服释放的时间控制提供了一种潜在的方法(精细调控)。结论和总结 从体外性能试验中可得以下结论 胰脏和肠细胞的蛋白酶将Τ4和Τ3从宝力士德中释放出来。 从宝力士德中释放出来的Τ4和Τ3穿过肠细胞单细胞层被吸收。 在体外，宝力士德能促进Τ4穿过肠上皮细胞吸收。 宝力士德本身在体外未穿过肠上皮屏障。 时间释放的动力学可由宝力士德的合成方法来调控。 将Τ4和Τ3与多肽共价相连为甲状腺素激素替代疗法中的口服输药带来很多好 处。由胰脏和肠上皮细胞产生的蛋白水解酶将Τ4和Τ3从宝力士德中释放出来。这样，当 他们在肠道中下行时，Τ4和Τ3就可以时间依赖性的方式释放。在Caco-2细胞模型中，一 旦释放，激素就穿过小肠上皮被吸收。另外，体外肠上皮模型的数据提示将T4和谷氨酸聚 合物结合可增强甲状腺激素的吸收，也许是由于第二种摄入机制和/或增加了激素的溶解 性。在体外Caco-2模型中宝力士德自身未穿过肠上皮屏障。这样，因为它不被血液吸收， 因此对于聚合物给全身带来的影响的担心就减小了。虽然上述的阐述和描述均以具体的实施例为参照。本发明并不是被限于所示的细 节。还有，在与权利要求相当的范围和程度内对细节的各种修饰均不被认为是超出了本发 明的内涵。
权利要求
一种口服给药的组合物，其特征在于，它含有多肽，所述多肽由20种天然存在的氨基酸中的一种或多种组成；非氨基酸的活性物质，其中所述活性物质是醇，所述活性物质通过活性物质中的所述醇与所述多肽的N端或C端共价相连，从而使所述活性物质在口服后通过酶催化释放到血液中，其中所述组合物是口服片剂、胶囊或口服混悬剂形式。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由选自谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸或丝氨酸的一种或多种氨基酸组成。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述多肽由谷氨酸组成。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述多肽由丝氨酸组成。
5 根据权利要求2所述的组合物，其中所述多肽由赖氨酸组成。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的组合物，其中所述活性物质通过C端相连。
7.根据权利要求1、2、3、4或5所述的组合物，其中所述活性物质通过N端相连。
8.—种口服给药的组合物，其特征在于，它含有多肽，所述多肽由20种天然存在的氨基酸中的一种或多种组成；非氨基酸的活性物质，其中所述活性物质是胺，所述活性物质通过活性物质中的所述 胺与所述多肽的C端共价相连，从而使所述活性物质在口服后通过酶催化释放到血液中， 其中所述组合物是口服片剂、胶囊或口服混悬剂形式。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述多肽由选自谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、天 冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸或丝氨酸的一种或多种氨基酸组成。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多肽由谷氨酸组成。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多肽由丝氨酸组成。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述多肽由赖氨酸组成。
13.一种口服给药的组合物，其特征在于，它含有多肽，所述多肽由20种天然存在的氨基酸中的一种或多种组成；非氨基酸的活性物质，其中所述活性物质是羧酸，所述活性物质通过活性物质中的所 述羧酸与所述多肽的N端共价相连，从而使所述活性物质在口服后通过酶催化释放到血液 中，其中所述组合物是口服片剂、胶囊或口服混悬剂形式。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述多肽由选自谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸或丝氨酸的一种或多种氨基酸组成。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述多肽由谷氨酸组成。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述多肽由丝氨酸组成。
17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述多肽由赖氨酸组成。
18.根据权利要求13、14、15、16或17所述的组合物，其中所述活性物质通过N端相连。
全文摘要
一种包含有多肽和与此多肽共价连接的活性物质的组合物。还提供了一种将活性物质输送到病人体内的方法，其包含了向病人施用一种包含有多肽和与此多肽共价连接的活性物质的组合物。还提供了一种保护活性物质免于降解的方法，其包含将此活性物质与多肽共价连接。还提供了一种将活性物质从组合物中进行控释的方法，包括将此活性物质与多肽共价连接(图1)。
文档编号A61K9/10GK101869713SQ20101017070
公开日2010年10月27日 申请日期2001年8月22日 优先权日2000年8月22日
发明者L·P·奥隆, R·J·柯克, T·皮卡列罗 申请人:希拉有限责任公司