白细胞介素-1受体拮抗剂的用途的制作方法

专利名称：白细胞介素-1受体拮抗剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物。
背景技术：
人与动物的肝脏均具有调控其生长和重量的独特能力。如果某种有害物质损害了部分肝实质，则存活的肝细胞能够进行复制，从而替代损伤的实质。如果病毒性、毒性、免疫原性或代谢来源的肝切除术或肝细胞损伤影响了实质的绝大部分，以至于超过残留肝组织的再生能力，则将发展为致命性的肝功能不全。目前，没有任何具有肝保护和刺激再生作用的药物可用于治疗急性或慢性肝功能不全，从此意义上而言，这些药物非常重要；即肝脏学所用的药物应包括这些指示性的治疗产物。肝保护试剂是一种能够保护肝细胞抵抗各种可对肝细胞造成毒性和/或损害并最终导致坏死或凋亡的刺激的产物或活性成分。因此，无论何时诱导肝损害，给药合适剂量的肝保护试剂将提高肝细胞存活，其利于肝再生、有助于肝功能正常化，而且在极端情况下可挽救患者的生命。肝损伤由毒性试剂(包括醇类、药物)、病毒、自身免疫疾病、局部缺血、局部缺血/再灌注(如肝移植中移植肝中诱导的损伤)及一般由任何炎症所诱导。一种好的肝保护试剂将排除或降低那些情况中肝损伤的发展和肝细胞的死亡。“ ^MMiYM "I ^Wia^liM" (interleukin-l receptor antagonist, IL-IRa), 与IL-Ia、IL-I β三者共同属于IL-I家族成员。IL-IRa是IL_1 a、IL-I β共同的拮抗剂，它的蛋白序列与IL-Ia、IL-I β在受体结合部位即C-末端区显著相似。IL-IRa可竞争性的抑制IL-I与其受体结合，阻滞在多个组织和器官中表达IL-I的生物活性，临床上用于类风湿性关节炎、败血症等疾病。人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的IL-IRa分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实，糖基化对IL-Ifci生物学活性无影响(R Daig, G Rogler,E Aschenbrenner, et al. Gut2000(46) :350-358)。

发明内容
本发明所要解决的技术问题为在病毒性的、代谢性的或毒性病原学的病因情况下，提供了一种肝保护试剂可排除或降低肝损伤的发展和肝细胞的死亡。为此，本发明公开了一种如下(a)或(b)的蛋白在制备用于治疗肝损伤的药物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列 70%同源性且具有肝保护试剂活性的蛋白。在一些实施方式中，所述肝损伤为毒性病原学导致的急性肝衰竭或急性肝损伤、 亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭、慢性肝衰竭或慢性肝损伤。所述肝损伤优选由毒性物质导致的肝损伤，所述毒性物质可为内外毒素、黄曲霉素、亚硝胺、酒精、药物或病毒，最优选为药物性肝损伤或肝衰竭。在一些实施方式中，所述药物的制剂为肠外给药制剂，所述肠外给药制剂可为注射剂或注射用无菌粉末。另一方面，本发明公开了上述蛋白作为活性成分可治疗病毒性的、代谢性的或毒性病原学的急性、亚急性、爆发性或慢性的肝病的方法，该方法包括给予有效剂量的上述蛋白。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明所述蛋白可有效地排除或降低肝损伤的发展和肝细胞的死亡，将可能为今后临床肝损伤的治疗提供新的选择。


图1 :rhIL-lRa对650mg/kg对乙酰氨基酚(APAP)诱导的急性肝衰竭(ALF)小鼠生存率的影响；图2 :rhIL-lRa对550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠生存率的影响；图3 :rhIL-lRa对2. 6ml/kg CCl4诱导急性肝损伤模型小鼠生存率的影响图4 :rhIL-lRa显著减少了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠血清的ALT和AST 水平。图5 :rhIL-lRa显著减少了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠肝脏的坏死面积图6 :rhIL-lRa显著减少了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠的肝细胞凋亡数量图7 :rhIL-lRa显著促进了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠肝细胞再生的速度图8 :rhIL-lRa显著减少了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠肝脏的坏死面积图9 :rhIL-lRa显著减轻了 550mg/kg的APAP诱导的ALF造模后小鼠肝脏细胞凋亡图10 :rhIL-lRa显著加快了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠肝细胞再生的速度图11 :rhIL-lRa显著抑制了 550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠肝组织细胞凋亡信号传导通路的活性图12 :rhIL-lRa对lml/kg CCl4诱导急性肝损伤模型小鼠体内谷草转氨酶水平影响；图13 :rhIL-lRa对lml/kg CCl4诱导急性肝损伤模型小鼠体内谷丙转氨酶水平影响；图14 :rhIL-lRa对lml/kg CCl4诱导急性肝损伤模型小鼠肝组织切片HE染色肝脏坏死面积比较。
具体实施例方式在本文，术语所述肝损伤，是由各种毒性化学物质如细菌产生的内、外毒素，食物中存在黄曲霉素、亚硝胺、酒精、药物及病毒等对肝脏造成的损伤。所述药物性肝损伤是指由于药物或其代谢物引起的肝损伤，常见的可引起药物性肝损伤的药物抗结核药(如利福平、异烟胼、吡嗪酰胺、乙硫异烟胺)，抗生素(如金霉素、 磺胺嘧啶、红霉素、氧氟沙星、痢特灵)，中成药(如疳积散、克银丸、消核片、雷公藤片、牛黄解毒片、六神丸)，中草药(如小柴胡汤)，解热镇痛药(如扑热息痛、阿司匹林、消炎痛)，降血脂药(如非诺贝特、烟酸)等。“白细胞介素-1 受体拮抗剂”(interleukin-1 receptor antagonist，IL-lRa)，与 IL-I α、IL-I β三者共同属于IL-I家族成员。IL-IRa是IL-1 α、IL-1 β共同的拮抗剂， 它的蛋白序列与IL-Ici、IL-I β在受体结合部位即C-末端区显著相似。hIL_lRa的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述，人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的IL-IRa分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实，糖基化对 IL-IRa 生物学活性无影响(R Daig, G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut 2000(46) :350-358)。本发明的所述蛋白质优选该物质是hIL-IRa蛋白质及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ ID NO. 1描述的氨基酸序列的蛋白质的载体例如DNA载体(质粒或病毒)。功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、 修饰、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。术语“类似物”也包括嵌合蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体、上述化合物的前体和其它功能等效物或模拟物。也包括模拟IL-IRa结合蛋白活性的合成体。术语“突变体”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述hIL_lRa的突变体。相比于天然的IL-IRa蛋白，该突变体与它们野生型相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、 或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)确定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^^Ι/τWii^1JixiS 至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。本发明涉及的方面还包括IL-IRa蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明IL-IRA蛋白的稳定性和/或生物活性。蛋白的表达本发明包括编码本发明的IL-IRa蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、 酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如 F. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology. GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience (1992)禾口 Sambrook etal. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端 DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λ PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA, UGA 或 UAG)。如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、 六聚组氨酸肽(His. Tag)、蛋白质A (protein Α)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His. Tag与Ni-Chelating
6Sepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解) 蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al. ,Basic Methods InMolecular Biology(1986)。编码本发明的所述蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。 如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent etal (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质。通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、 疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。 在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Q sepharoseHigh Performance 柱、Blue sepharose FF 柱、Blue 柱、Phenyl Sepharose FF 柱、DEAE Sepharose FF> Ni-Chelating Sepharose FF 柱或 Methyl 柱等。另外，可使用国际公开号W000/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的蛋白。药物组合物用于本发明或者含有本发明所述蛋白的组药物合物。通常，当本发明药物组合物用于上述用途时，所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。本发明的蛋白可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。上述剂型中可经口服给药的剂型为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、 等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是冻干粉针剂。本发明的药用组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。药用组合物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体，并适宜为单位剂量形式。本发明的药用组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质，该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本发明物的活性形式。本发明的药用组合物还可与其它疗法联合应用，如同时、序贯或分别应用。本发明的药用组合物可包含有其它活性作用物。用途公开了所述蛋白作为活性成分可以预防或治疗急性肝衰竭或急性肝损伤、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭或者慢性肝衰竭的方法，该方法包括给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。在一些实施方式中，所述的肝损伤为急性肝衰竭或急性肝损伤、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭或者慢性肝衰竭时，所述方法可通过药物给药前、药物给药后、药物给药前和化疗药物给药后方式，给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。“有效剂量”或“治疗量”均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量约为0. Ol-IOOOmgo通常，成人临床给药量的范围为0. 01-200mg/日，优选为0. 05-100mg/日。以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、生存率实验1. IrhIL-IRa对650mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠生存率的影响实验方法8至10周龄的C57BL/6小鼠分为rhIL_lRa组及生理盐水(NS)组，所有小鼠按照体重650mg/kg —次性腹腔注射APAP溶液进行造模。造模用药1小时后，rhIL_lRa组小鼠按照体重给予lmg/kg的rhIL-IRa皮下注射治疗，NS组给予等体积的生理盐水皮下注射作为对照治疗，治疗均为12小时一次。连续治疗7天。用药后连续观察并记录各组小鼠死亡数量，共观察7天。实验结果如图1所示，治疗48小时后rhIL-IRa(人白介素1受体拮抗剂)组(n = 10) 的生存率(80%)要显著高于NS组(η = 18)的生存率(33. 33 ，具有显著性差异 (Kaplan-Meier方法统计，P < 0. 05)。48小时后两组均无小鼠死亡。1. 2rhIL-lRa对550mg/kg的APAP诱导的ALF小鼠生存率的影响实验方法8至10周龄的C57BL/6小鼠分为rhIL_lRa组及NS组，所有小鼠按照体重550mg/ kg 一次性腹腔注射APAP溶液进行造模。造模用药1小时后，rhIL-IRa组小鼠按照体重给予lmg/kg的rhIL-IRa皮下注射治疗，NS组给予等体积的生理盐水皮下注射作为对照治疗， 治疗均为12小时一次。连续治疗7天。用药后连续观察并记录各组小鼠死亡数量，共观察 7天。实验结果如图2所示，治疗48小时后rhIL-IRa组(η = 14)的生存率(100%)要显著高于 NS组(n = 14)的生存率(35. 71% )，具有显著性差异(Kaplan-Meier方法统计，P < 0. 01)。 48小时后两组均无小鼠死亡。1. 3rhIL-lRa对2. 6mL/kg CCl4诱导的急性肝损伤模型小鼠生存率的影响。实验方法20只健康8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为实验组，每只小鼠腹腔注射CC14LD50剂量(1 1玉米油稀释)，造模1小时后按lmg/kg体重皮下注射rhIL-IRa，间隔Ia1再次注射蛋白，连续注射5天；健康8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为对照组，每只小鼠腹腔注射 CC14LD50剂量(1 1玉米油稀释)，并在其后按照rhIL-IRa给药时间注射等体积的PBS作为治疗性对照。用药后连续观察并记录各组小鼠死亡数量，共观察5天。实验结果如图3所示，治疗60小时以后rhIL-IRa组(n = 6)的生存率(60%)要显著高于NS组(n = 1)的生存率(10% )，具有显著性差异(Kaplan-Meier方法统计，P < 0. 01)。 60小时后两组均无小鼠死亡。实施例2、rhIL-IRa治疗ALF小鼠的病理及生化检测2. 1实验方法2. 1. 1动物分组设计首先，将120只8至10周龄的C57BL/6小鼠分为治疗组(T 组，其观察终点为3小时、6小时、24小时、48小时、96小时和168小时，记为T3、T6、T24、T48、T96、T168，共6个小组，每小组各有10只小鼠，T之后的数值代表观察终点的小时数) 和对照组(C组，其观察终点为3小时、6小时、24小时、48小时、96小时和168小时，记为 C3、C6、C24、C48、C96、C168，共6个小组，每小组各有10只小鼠，C之后的数值代表观察终
点的小时数)两大组。2. 1. 2动物造模、处理及样本检测所有小鼠按照体重550mg/kg —次性腹腔注射 APAP溶液。造模用药1小时后，治疗组小鼠均按照体重lmg/kg给予rhIL-IRa皮下注射， 对照组给予等体积的NS皮下注射作为对照治疗，治疗均为12小时一次，连续治疗至观察终点。在每组小鼠观察终点时处死小鼠，立即取肝脏，一部分用甲醛固定后进行病理观察，另一部分冻存于-70°C用于生化检测。肝脏样本均取自左叶和右中叶相同的部位。2. 2实验结果由于之前的生存率保护实验显示了小鼠死亡全部发生在48小时之内，而且大部分是发生在6-12小时；与此同时，在12- 小时仅有少量的小鼠死亡，在6小时之前及M 小时之后仅有极少数的死亡发生。为了更好地对照统计及阐释rhIL-IRa能有效改善APAP 诱导的急性肝衰竭小鼠生存率的机制，本实验重点阐述了三个方面的对比情况I)在死亡高发时间段(即6-12小时)之前，即3小时和6小时，治疗组和对照组肝细胞坏死、凋亡和再生的对比情况。II)在造模M小时后各时间点小组内幸存的小鼠肝细胞坏死、凋亡和再生的对比情况。III)在证实肝细胞凋亡在导致急性肝衰竭小鼠死亡结局发生中的重要作用后，我们进一步研究了在3小时和6小时治疗组和对照组肝细胞凋亡信号传导通路中重要信号分子的表达水平和活力的对比。2. 2. IrhIL-IRa显著减少了急性肝衰竭小鼠血清的ALT和AST水平在APAP诱导小鼠急性肝衰竭之后3小时和6小时，治疗组(T组)和对照组(C组) 小鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平均较正常小鼠有显著升高。但是，相比之下，治疗组小鼠血清ALT和AST水平均较对照组明显要低(图4)；在3小时和6小时时间点，治疗组小鼠ALT水平比对照组小鼠分别降低了 67. 78 %和82.观％，而AST水平则分别降低了 62. 85%和78. 99%。图例rhIL_lRa显著减少了急性肝衰竭小鼠血清的ALT和AST水平。在3小时和 6小时rhIL-IRa显著抑制了急性肝衰竭小鼠血清ALT和AST活力水平。(图4A)血清ALT 活力水平的比较(n = 10，< 0· 01)。(图4Β)血清AST活力水平的比较(#p < 0. 01)。2. 2. 2rhIL-lRa显著减少了急性肝衰竭小鼠肝脏的坏死面积在APAP诱导小鼠急性肝衰竭之后3小时和6小时，肝脏的外观发生了显著变化， 颜色呈红褐色，外形肿大，质地较韧(图5A)；从组织学来看，肝细胞出现了明显的融合性坏死，坏死基本上是从小叶中央开始，向四周蔓延，而汇管区的肝细胞则以变性为主要病理改变；在肝细胞的坏死区域，仅有很少量的炎性细胞(图5B)。治疗组与对照组相比较，肝脏的坏死面积明显要小(图5C)，提示rhIL-IRa显著减少了急性肝衰竭小鼠的肝细胞坏死面积。图例rhIL-lRa显著减少了急性肝衰竭小鼠肝脏的坏死面积。在3小时和6小时 rhIL-IRa对550mg/kg的APAP诱导的急性肝衰竭小鼠肝脏坏死面积的影响。图5A 治疗组和对照组肝脏大体图。图5B:各组具有代表性的肝脏病理切片图(HE染色，X 100)。图5C: 各组肝脏坏死面积(100倍镜下视野面积统计)的比较(n = 10，**ρ < 0. 01)。2. 2. 3rhIL-lRa显著减少了急性肝衰竭小鼠的肝细胞凋亡数量在3小时和6小时时间点，我们发现治疗组的肝细胞凋亡的数量和对照组相比较显著地减少了(P <0.01)；特别是在6小时时，对照组小鼠的肝细胞凋亡数量非常显著，凋亡的肝细胞除了坏死区域的周边之外，其他区域也有比较广泛的分布；而对照组的凋亡肝细胞数量则明显要少，凋亡的肝细胞则主要是出现在坏死区域的周边(图6A，B)。这提示 rhIL-IRa显著减少了急性肝衰竭小鼠的肝细胞凋亡数量。图例rhIL-lRa显著减少了急性肝衰竭小鼠的肝细胞凋亡数量。在3小时和6小时rhIL-IRa对急性肝衰竭小鼠肝脏细胞凋亡数量的影响。图6A 各组肝脏细胞凋亡检测具有代表性的图片(TUNEL，X200)。图6B:各组细胞凋亡数量QOO倍镜下视野统计)的比较(n = 10，**ρ < 0. 01)。2. 2. 4rhIL-lRa显著促进了急性肝衰竭小鼠肝细胞再生的速度在3小时和6小时，治疗组和对照组均只有很少量的PCNA阳性细胞能够被检测到 (图7A)；这说明在这一阶段，肝细胞的再生尚且不是肝脏病理变化；这也提示，在急性肝衰竭小鼠的发病过程中，早期的肝再生可能不是小鼠存活与否的决定性因素。不过，在3小时和6小时时间点，与对照组相比较，治疗组小鼠肝脏的PCNA阳性细胞的数量显著增加了(P < 0. 01)(图7B)；这说明rhIL-IRa在急性肝衰竭疾病进展的过程中，能够显著地促进肝脏再生。图例rhIL-lRa显著促进了急性肝衰竭小鼠肝细胞再生的速度。在3小时和6小时时间点rhIL-IRa对急性肝衰竭小鼠肝细胞再生的影响。图7A 各组肝脏PCNA阳性细胞检测具有代表性的图片(免疫组化，X 100)。图7B 在3小时和6小时时间点，与对照组相比较，治疗组阳性细胞数量(100倍镜下视野统计)更多(n = 10，< 0. 01)。2. 2. 5rhIL-lRa显著减少了造模后急性肝衰竭小鼠肝脏的坏死面积从大体上看，在APAP诱导小鼠发生急性肝衰竭之后M小时，两组小鼠的肝脏均呈深红褐色，外形肿大明显，质地较韧；在48小时，两组肝脏的红褐色均已经显著变淡，但仍然肿大明显，质地仍然较韧；在96小时，肝脏呈现比较接近正常肝脏的粉红色，肿胀也明显减轻，而质地较柔软；而在168小时，肝脏在颜色、外形、质地上均非常接近正常肝脏。相比较而言，在各个时间点，治疗组小鼠的肝脏病变明显要轻，而恢复至正常肝脏的速度更加迅速(图8A)。从HE染色肝脏切片所示的组织学改变来看，从M小时直至48小时，肝脏坏死情况仍在持续加剧；不过，在这两个时间点，残余的肝细胞与坏死区域界限非常明显，也无特别显著的水肿变性、嗜酸性变性等情况，说明肝脏的炎症已经被逐渐局限化；而且在这些残余肝细胞可以观察到比较活跃有丝分裂的表现。而在96小时肝脏切片已经不能发现肝脏新近坏死的表现了，肝脏的大体结构已经比较接近正常了 ；在168小时，部分对照组小鼠的肝脏仍然可以观察到大量炎性细胞(主要是中性粒细胞等)吞噬清除残余死亡肝组织的表现；但是总体来讲，在168小时肝脏的结构已经非常接近正常肝脏的结构了(肝板排列整齐、未见水肿变性、嗜酸性变性等)(图8B)。两组相比较而言，在M小时和48小时，治疗组肝脏坏死面积明显要小(P < 0. 05)(图8C)；这显示在急性肝衰竭的恢复阶段，注射rhIL-IRa能够显著减少急性肝衰竭小鼠的肝细胞坏死面积。图例rhIL-lRa显著减少了造模后急性肝衰竭小鼠肝脏的坏死面积。造模后对照组和治疗组肝脏坏死情况的对比。图8A:治疗组和对照组肝脏大体图。图8B:各组具有代表性的肝脏病理切片图(HE染色，X 100)。在图片C168上还可以观察到大量炎症细胞吞噬清除残余死亡肝组织的表现。图8C 24小时和48小时治疗组和对照组肝脏坏死面积(100 倍镜下视野统计)的比较(*P < 0. 05)；在96小时和168小时时，治疗组和对照组肝脏切片均未观察到新近肝细胞坏死的表现。2. 2. BrhIL-IRa能显著减轻急性肝衰竭造模后小鼠肝脏细胞凋亡在造模后，在M小时，对照组和治疗组肝细胞凋亡的数量没有显著性差异(ρ > 0. 05)；但是在48小时，两组之间存在显著性差异(ρ < 0. 05)(图9A、B)。治疗组凋亡细胞数量明显少于对照。在其后的时间点，两组均无凋亡细胞，说明肝脏的凋亡已得到修复。此实验结果表明，rhIL-IRa能显著减轻肝脏细胞凋亡。图例rhIL-lRa能显著减轻急性肝衰竭造模后小鼠肝脏细胞凋亡。造模M小时后对照组和治疗组幸存小鼠肝细胞凋亡数量的对比。图9A 各组肝脏细胞凋亡检测具有代表性的图片(TUNEL，X200)。图9B:48小时治疗组和对照组肝细胞凋亡数量QOO倍镜下视野统计)的相比较具有显著性差异(*P < 0. 05)。而在96小时和168小时时间点治疗组和对照组均不能检测到肝细胞凋亡。2. 2. 7rhIL-lRa能够显著加快造模后幸存的急性肝衰竭小鼠肝细胞再生的速度在M小时，在治疗组和对照组都有较多的阳性肝细胞被检测到；而且随着时间的延长，阳性细胞的数量迅速增加；治疗组和对照组分别在48小时和96小时时达到肝细胞增殖的高峰；之后阳性细胞的数量均开始下降，至168小时时肝细胞增殖则接近尾声，只有极少量的阳性细胞可以被检测到(图10A，B)。这显示rhIL-IRa也能够在急性肝衰竭小鼠的肝脏恢复阶段促进肝脏再生。图例rhIL-lRa能够显著加快造模后幸存的急性肝衰竭小鼠肝细胞再生的速度。 在M小时后治疗组和对照组幸存小鼠肝脏PCNA阳性细胞数量的对比。图IOA 各对照组和各治疗组小鼠PCNA检测具有代表性的图片。图IOB 与对照组相比，治疗组PCNA阳性细胞数量(100倍镜下视野统计)的峰值被明显提前了(48小时vs. 96小时)。2. 2. SrhIL-IRa能够显著抑制急性肝衰竭小鼠肝组织细胞凋亡信号传导通路的活性在证实了 rhIL-IRa能够显著减少急性肝衰竭小鼠肝细胞的凋亡之后，我们进一步研究了 rhIL-IRa对急性肝衰竭小鼠肝组织细胞凋亡信号传导通路的活性的影响，以探索其抑制细胞凋亡的作用机制。我们选择了在肝细胞凋亡的信号传导通路中占有重要地位的信号分子细胞色素C、Bax, caspase-3、caspase-8及caspase-9作为研究对象。通过研究发现，在3小时和6小时，与对照组相比较，治疗组的肝细胞线粒体内的细胞色素C泄漏到细胞浆的水平显著减少了 ；肝组织Bax的表达水平被显著抑制；而肝组织的caspase-3、 caspase-8及caspase-9活性也被显著降低了(ρ < 0. 01)(图11)。这显示rhlL-lRa通过抑制细胞色素C、Bax, caspase-3、caspase-8及caspase-9介导的细胞凋亡信号传导通路而抑制了 APAP诱导的急性肝衰竭小鼠的肝细胞凋亡。图例rhIL-lRa能够显著抑制急性肝衰竭小鼠肝组织细胞凋亡信号传导通路的活性。图IlA 在3小时和6小时，与对照组相比较，治疗组肝细胞内细胞色素C从线粒体泄漏到细胞浆的量明显要少，而肝组织Bax的表达水平也明显要低。β-actin水平检测作为对照。本图片来自三次具有相似结果的实验之一。图IlB为ca spase-3活性比较、图IlC 为caspase-8活性比较和图IlD为caspase-8活性比较在3小时和6小时，与对照组相比较，治疗组肝细胞caspase-3、caspase-8及caspase-9的活性均显著降低(n = 10，**ρ < 0.01)。各组倍数值为与正常小鼠检测值的比值。实施例3、rhIL-IRa治疗CCl4急性肝损伤小鼠的病理及生化检测3.1实验方法60只健康8周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分成两组组1:每只小鼠腹腔注射CCl4,剂量为lmL/kg体重(1 3玉米油稀释)，Ih后按 lmg/kg体重皮下注射rhIL-IRa，间隔1 再次注射，连续5天；组2:处理方法同组1，每只小鼠腹腔注射CCl4,剂量为lmL/kg体重(1 3玉米油稀释)，注射等体积的PBS作为对照；腹腔注射014后1、2、3、5、7天时间点采集血样和肝脏，每组每次6只。小鼠称量体重后，眼底采血后分离血清置-20°C保存待测，小鼠断颈处死，保定并分离出肝脏，称量肝重，取肝脏相同位置的一小块肝脏放入4%的甲醛溶液中固定。3. 2实验结果急性肝损伤模型小鼠中，rhIL-IRa(人白介素1受体拮抗剂)治疗组小鼠谷草转氨酶(AST)水平在3天和5天时都显著低于对照组(ρ < 0. 01)，见图12，而3天血清谷丙转氨酶(ALT)显著低于对照组(ρ < 0. 05)，见图13。如图14，rhIL-lRa治疗有效减轻肝损伤，组织损伤面积显著小于对照组(P < 0. 01)。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
权利要求
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质在制备用于治疗肝损伤的药物的用途(a)其氨基酸序列如SEQID NO 1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列有70%同源性且具有肝保护试剂活性的蛋白。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述肝损伤为毒性病原学导致的急性肝衰竭或急性肝损伤、亚急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭或慢性肝损伤。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述肝损伤为由毒性物质导致的肝损伤。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述毒性物质为内外毒素、黄曲霉素、亚硝胺、酒精、药物或病毒。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物为抗结核药、抗生素、中成药、中草药、解热镇痛药或降血脂药。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列与SEQIDN0:1所示的氨基酸序列有至少77%的同源性且具有肝保护试剂活性。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征是，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:2所7J\ ο
8.—种药物组合物，其特征在于该组合物含有活性成分为氨基酸序列如SEQID NO 1 所示的蛋白质以及药学上可接受的载体或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征是，所述药物组合物的制剂为肠外给药制剂。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体涉及白细胞介素-1受体拮抗剂的用途。本发明公开了一种如下(a)或(b)的蛋白在制备用于治疗肝损伤的药物的用途(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列70％同源性且具有肝保护试剂活性的蛋白或多肽。本发明所述蛋白可有效地排除或降低肝损伤或肝衰竭的发展和肝细胞的死亡，将可能为今后临床肝损伤的治疗提供新的选择。
文档编号A61P1/16GK102240395SQ20101017556
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者俞雁, 朱润芝, 胡建军, 韩伟 申请人:上海交通大学, 上海伍洋生物医药技术有限公司