专利名称：：受体调节剂上调叶酸受体表达在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物摄取中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及靶向癌症治疗，特别是一种受体调节剂上调叶酸受体表达在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物摄取中的应用，具体为一种在叶酸偶联药物制备中，使用受体调节剂上调肿瘤细胞表面叶酸受体(folatereceptor,FR)表达，进而增强叶酸偶联抗肿瘤药物对肿瘤细胞靶向作用的方法。
背景技术：
：大量研究表明FR在多种肿瘤细胞表面过度表达，而在多数正常组织中的表达仅限于一些难于进入血液循环的上皮细胞顶膜。基于FR表达的这种特性，FR天然配体——叶酸成为将药物靶向到肿瘤细胞的重要分子。叶酸具有与叶酸受体的高亲和力(Kd0.InM)、低免疫原性、易于修饰、体积小(MW=441.4)、高度化学稳定性和生物学稳定性，易与药物结合、以及低成本等优点，使叶酸介导肿瘤靶向的研究得到快速发展。叶酸可以与多种药物分子或载体偶联成复合物，如小分子化疗药物、大分子蛋白、半抗原、基因药物、成像剂、脂质体、胶束等。与其他分子偶联后，叶酸分子仍保留了与叶酸受体间的高亲和力，使得叶酸偶联复合物可以通过FR靶向性地输运到肿瘤细胞并将药物分子运送到细胞内部，达到肿瘤靶向效果。然而，叶酸偶联药物对肿瘤细胞的靶向作用依赖于肿瘤细胞表面表达足够量的叶酸受体。大量研究显示，不同肿瘤细胞表面表达FR的水平具有很大差异，而且同一肿瘤不同分期表达的受体水平有显著差异。叶酸受体这种不均一性表达导致肿瘤细胞对叶酸偶联药物或载体的摄取不一致，给叶酸偶联药物的靶向应用造成了很大障碍，限制了叶酸靶向药物在FR低表达肿瘤细胞中的应用。有研究发现，原发性乳腺癌FR-α的表达与雌激素受体的表达成负相关，雌激素的存在会抑制叶酸受体阳性肿瘤细胞中FR-α表达；而雌激素拮抗剂，如他莫昔芬、ICI182，780可以解除雌激素对FR-α表达的抑制，并且使FR-α表达得以上调。同时FR-α的mRNA和启动子活性也可被糖皮质激素受体激动剂，如地塞米松(Dex)上调。另外，全反式维甲酸(ATRA)可以在基因水平通过作用于FR-β启动子，上调FR-β阳性肿瘤细胞叶酸受体的表达；而组蛋白去乙酰化酶抑制剂，如曲古菌素-A(TSA)和丙戊酸(VPA)可以通过协同作用促进受体调节剂对FR-α和FR-β表达的上调作用。通过使用低剂量受体调节剂特异性提高肿瘤细胞叶酸受体的表达，达到增强叶酸偶联药物对肿瘤细胞的靶向作用。
发明内容本发明的目的是提供一种应用受体调节剂上调叶酸受体表达，在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物摄取中的应用。通过使用受体调节剂上调叶酸受体表达水平，增强肿瘤细胞对叶酸偶联药物及药物载体摄取，提高叶酸偶联药物对肿瘤细胞靶向作用。这种增强叶酸偶联抗肿瘤药物对肿瘤细胞靶向作用的方法，可在制备治疗肿瘤疾病的药物中应用。本发明提供的一种受体调节剂上调叶酸受体表达在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物(药物或载体)摄取中的应用。即提供的一种增强叶酸偶联抗肿瘤药物对肿瘤细胞靶向作用的方法，使用受体调节剂上调肿瘤细胞表面叶酸受体(folaterec印tor，FR)的表达。具体步骤1)叶酸偶联载药胶束的制备及体外摄取实验为考察叶酸偶联载药胶束及非叶酸偶联载药胶束在人宫颈癌细胞(Hela)内的摄取情况，以验证叶酸偶联纳米胶束的靶向作用，实验中以具有荧光特性的香豆素为模型药物，将包载香豆素的纳米胶束与Hela细胞共同孵育，用流式细胞仪测定荧光强度，以比较细胞摄取香豆素的相对量。2)地塞米松对叶酸受体的调节及FR-α表达水平的检测将地塞米松在去除雌激素的环境下刺激Hela细胞，共孵育96小时。分别从mRNA水平和蛋白水平检测FR-α的表达。由于实时定量荧光PCR(RealTimePCR，RT-PCR)方法由于其灵敏、准确和重复性好，因此逐步成为基因表达的定量测定的主要方法。在本实验中，采用RT-PCR方法检测细胞中叶酸受体mRNA的表达水平，可以方便的检测Dex处理前后FR-α的mRNA的含量变化。而流式细胞仪法用于分析细胞表面功能性蛋白具有直接、快捷、高通量的优点。用荧光标记的抗人叶酸受体抗体与细胞低温孵育，经流式细胞仪检测荧光强度，通过比较各组细胞平均荧光强度(mean)值，考察肿瘤细胞经Dex作用前后，细胞表面FR-α表达水平的变化。3)上调FR表达对增强肿瘤细胞摄取叶酸偶联药物中的作用进行叶酸偶联载药胶束摄取前，将肿瘤细胞用受体调节剂预处理；FR表达上调的肿瘤细胞与叶酸偶联载药胶束共孵育。采用用流式细胞仪检测细胞对靶向药物摄取情况。通过平均荧光强度反应细胞摄药量，考察上调FR表达在叶酸偶联纳米胶束体外靶向实验中的促进作用。所述的叶酸偶联物是指叶酸偶联药物载体。所述的叶酸偶联药物载体包括偶联有叶酸基团的脂质体、聚酯纳米粒子、高分子胶束或高分子纳米粒子药物载体。所述的受体调节剂为糖皮质激素类、雌激素类、组蛋白去乙酰化酶抑制剂或全反式维甲酸。所述的肿瘤细胞包括FR阳性肿瘤细胞及组织卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌肿瘤。本发明提供了一种上调叶酸受体表达在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物摄取中的应用。通过使用受体调节剂上调叶酸受体表达水平，增强肿瘤细胞对叶酸偶联药物及药物载体摄取，提高叶酸偶联药物对肿瘤细胞靶向作用，为制备有效治疗肿瘤疾病的药物开辟了新的途径。图1为Hela细胞摄取叶酸偶联载药胶束的流式细胞仪结果。图2为RT-PCR检测Hela细胞经Dex处理后FR基因表达的变化。图3为流式细胞仪检测Hela细胞经Dex处理后细胞表面FR表达的变化。图4为流式细胞仪检测Hela细胞经Dex处理后对叶酸偶联载药胶束的摄取情况。具体实施例方式通过体外细胞实验，来说明上调FR表达在叶酸偶联载药纳米胶束制备中的作用。本细胞试验仅用于说明地塞米松在叶酸偶联纳米药物制备中具有增强肿瘤细胞靶向作用的效果，不能视为对本发明保护范围的限制。增强叶酸偶联抗肿瘤药物对肿瘤细胞靶向作用的方法包载香豆素6的叶酸偶联纳米胶束的制备按表1的配方将各种溶液混合，旋蒸20分钟待有机溶剂蒸发完全，形成药膜，再将药膜真空干燥过夜，然后加入5mlH印es缓冲液(IOmMH印es，0.9%氯化钠，pH7.2)磁力搅拌水化20min，载药胶束形成。用高效液相色谱法分析胶束的载药量和包封率，结果见表2。表1载药胶束处方mPEG2000_DSPE氯仿溶Folate-PEG2000-DSPE香豆素6氯仿液(5mg/ml)氯仿溶液(0.5mg/ml)溶液__(0.5mg/ml)普通胶束Iml0.8ml叶酸偶联0.99ml0.2ml0.8ml胶束_表2载药胶束的载药量和包封率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>叶酸偶联纳米胶束对Hela细胞的靶向作用将对数生长的Hela细胞用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，以5XIO5细胞/ml接种于6孔板中，每孔接种2ml，置于37°C、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24h。弃掉培养基，重新加入2ml/孔新鲜培养基，同时加入终浓度为25μg/ml叶酸纳米胶束，37°C孵育lh。去除孵育液，用冷PBS洗涤3次，胰酶消化制成1XIO6细胞/ml单细胞悬液，用流式细胞仪检测荧光强度。实验结果见图1。由图1可见，细胞与载药胶束孵育lh，叶酸偶联组荧光强度约为非叶酸偶联组的2倍，说明Hela细胞摄取叶酸偶联纳米胶束主要通过叶酸受体介导的内吞作用为主。证明纳米药物载体与叶酸偶联后，对FR-α阳性肿瘤细胞具有明显的靶向作用。地塞米松(Dex)对Hela细胞FR-α表达的影响1.细胞消化计数后，将细胞悬液以IXIO4细胞/ml密度接种于6孔板，培养基加入2ml含5%活性炭吸附的胎牛血清的无酚红培养基，置于37°C，5%CO2培养箱中贴壁培养；2.细胞预贴壁6小时，弃掉培养基，每孔更换新鲜无酚红培养基2ml。对照组加入配制地塞米松的空白溶剂，实验组加入地塞米松试剂，Dex(dexamethasone)终浓度为500nmol/Lo细胞继续孵育96小时，平均两天更换一次含Dex培养基。3.通过实时荧光定量PCR检测细胞中叶酸受体mRNA水平，具体方法为Trizol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，设计特异性引物(QT01674316，Qiagen)进行荧光定量PCR检测。所述逆转录反应体系包含逆转录酶、oligodT、缓冲液、RNA500ng；逆转录反应条件为37°C、15min；终止酶反应条件为85°C、5s；所述荧光定量PCR反应成分为SYBRGreenMix、特异性上下游引物、模板cDNA；内参基因为GUSB；反应条件为95°C、IOminlcycle,(95°C、15s，60°C、10s)55cycles。所述荧光定量PCR检测采用BioradiQ5荧光定量PCR仪，实验结果如图2所示。4.通过流式细胞仪检测细胞表面叶酸受体水平，具体方法为胰酶消化收集细胞弃掉培养基，预冷的PBS洗两遍；0.25%胰酶消化细胞，1200rpm离心5min；含2%BSA的PBS洗液将细胞洗涤两遍，重悬；与抗体孵育。所述抗体孵育的过程为取IXIO6密度细胞悬液100μ1，加入1100稀释的AlexaFluor488标记anti-FOLRl抗体，4°C孵育30min；含2%BSA的PBS洗涤细胞两遍，0.5ml4%多聚甲醛固定；避光上机检测，实验结果如图3所示。由图2、图3可知，经Dex处理后，Hela细胞叶酸受体mRNA含量及细胞表面膜受体均显上调，说明Dex可以实现提高肿瘤细胞表面FR表达的作用。流式细胞仪检测FR上调后的肿瘤细胞对叶酸偶联载体的摄取1.取经地塞米松预处理的Hela细胞，预冷PBS洗两遍，加入2ml新鲜无叶酸培养基继续培养24小时。2.弃培养基，加入新鲜的含包载香豆素的叶酸偶联纳米胶束的无叶酸培养基，未经地塞米松处理细胞为对照组。置37°C,5%CO2培养箱中孵育60min。3.弃培养基，冷PBS洗涤三遍，0.25%胰酶消化细胞；细胞沉淀用0.5ml4%多聚甲醛固定液重悬，避光上机检测，实验结果见图4。此实验旨在证明在叶酸偶联纳米胶束的制备过程中，使用Dex上调肿瘤细胞表面FR表达，可以提高叶酸偶联药物对细胞的靶向作用。通过平均荧光强度(mean)值分析，细胞摄入荧光强度明显提高，证明Dex上调细胞FR表达水平后，增加了细胞对叶酸偶联纳米胶束的摄取，增强了叶酸偶联药物的靶向效果。通过以上体外细胞实验表明了上调FR表达在叶酸偶联药物制备中，具有提高肿瘤细胞对的叶酸靶向药物摄取的重要作用。权利要求受体调节剂上调叶酸受体表达在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物摄取中的应用。2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的叶酸偶联物是叶酸偶联药物或药物载体。3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的受体调节剂为糖皮质激素类、雌激素类、组蛋白去乙酰化酶抑制剂或全反式维甲酸。4.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的受体调节剂为地塞米松。5.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞包括FR阳性肿瘤细胞及组织卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌肿瘤。6.按照权利要求2所述的应用，其特征在于所述的叶酸偶联药物载体包括偶联有叶酸基团的脂质体、聚酯纳米粒子、高分子胶束或高分子纳米粒子药物载体。全文摘要本发明涉及一种受体调节剂上调叶酸受体表达在增强肿瘤细胞对叶酸偶联物摄取中的应用，具体为一种在叶酸偶联药物制备中，使用受体调节剂上调肿瘤细胞表面叶酸受体(folatereceptor，FR)表达，进而增强叶酸偶联抗肿瘤药物对肿瘤细胞靶向作用的方法。体外实验证明，地塞米松等激素类药物具有上调肿瘤细胞表面叶酸受体表达的作用，提高FR表达可以增强叶酸偶联纳米药物对肿瘤细胞的靶向效果。该增强叶酸偶联抗肿瘤药物对肿瘤细胞靶向作用的方法可应用于制备治疗肿瘤疾病的药物。文档编号A61K31/203GK101822835SQ20101017894公开日2010年9月8日申请日期2010年5月21日优先权日2010年5月21日发明者刘玲蓉,唐红波,张其清,张彤,李学敏,李磊,白永刚,陈汉申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所