专利名称：一种中国陆生常见蝰科蛇毒多价抗血清的制备方法及用法的制作方法
技术领域：
本发明属于抗蛇毒血清，特别是涉及多价抗血清的制备及多价抗血清的使用方 法。
背景技术：
毒蛇属种具有很大的地区差异性，同一种类的毒蛇由于地区差异所产生的蛇毒毒 性成分不同。中国陆生常见蝰科蛇以中国南方地区蝰蛇、烙铁头蛇、蝮蛇、五步蛇、竹叶青 的蝰科蝮亚科和蝰亚科毒蛇为主。在毒蛇咬伤后如果能够鉴别毒蛇种类，首先应考虑使用 单价抗蛇毒血清，然而，资料表明在某一地区被不同种类蛇伤的全身症状相似，蛇伤患者中 能够鉴定出咬伤蛇种类的仅占20%，临床上很难或者不可能有针对性地使用单价抗蛇毒血 清，反而由于免疫性疾病造成的损害，导致治疗失败和昂贵的抗蛇毒血清浪费。目前我国生 产的抗蛇毒血清均为单价，相关技术包括由申请人此前提出的“抗蝰蛇蛇毒冻干血清及制 备方法”(发明专利申请号01010141970. 5)，该方法的结果表明按所选剂量诱导马免疫应答 收集的IgG血浆，通过酶解并疏水层析能够获得纯化的F (ab)，2片段，当满足一定比例时， F(ab)，2能够与小鼠体内蛇毒特异性结合，从而中和溶解蛇毒。但是，该申请仍然为单价抗 蛇毒血清。
发明内容
针对我国常见蝰科毒蛇品种和特点，本发明目的是提供一种能够有效中和我国常 见蝰科毒蛇平均排毒量的多价抗蛇毒血清制剂的制备方法，并提供相应的使用方法。本发明通过以下方式实现从免疫马血浆获得纯化的F (ab) ’ 2片段，并且用小鼠中和法分别测定抗五步蛇、抗蝰蛇和抗蝮蛇毒F(ab) ’ 2冻干品效价，即五步蛇蛇毒的LD5tl为3. ZSygq-1，抗五步蛇毒血清F(ab' )2冻干品与五步蛇蛇 蛇毒质量比为10 Kmg mg)；蝰蛇蛇毒的LD5tl为1. 75μ g巧―1，抗蝰蛇毒血清F(ab' )2冻干品与蝰蛇毒质量比 为 15 1 (mg mg)；蝮蛇蛇毒的LD5tl为3. Oyg .g—1，抗蝮蛇毒血清F (ab' )2冻干品与蝮蛇毒质量比 为 20 1 (mg mg)；称取抗五步蛇蛇毒血清600-870mg、抗蝰蛇毒血清400_550mg及抗蝮蛇血清 500-650mg，用305ml注射用水复溶，经0. 22um膜过滤后灌装成IOml/瓶注射剂，冻干。所述的所制备的多价抗血清F(ab)，2分子量为95-110Kda，F(ab)，2含量大于85%， IgG含量小于5%，Fc片段含量小于10%。所制备的多价抗血清用法及剂量为静脉注射，成人1500-2070mg/次，儿童与成
人同剂量，一次/日，病情缓解较慢时可适当增加剂量。本发明通过选择达到一定效价水平的几种蝰科毒蛇的特异性单价抗蛇毒血清F(ab) ’ 2，按照选择的剂量范围装量成注射剂，提供一种能够中和蝰科不同种类的蛇毒的多 价抗蝰科蛇毒血清。经小鼠中和法检测该血清能有效中和我国常见五种蝰科毒蛇的平均一 次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-110mg、或蝰蛇毒30-55mg、或烙铁头蛇毒55_75mg、或竹叶青 蛇毒20-35mg、或蝮蛇毒20-35mg，可以直接应用于蛇伤重危患者，而不需要鉴定咬伤蛇的 种类，从而降低蛇伤重患率和死亡率。本发明制备的多价抗蝰科蛇毒血清本发明制备工艺 稳定、高效，产品纯度高于《中国药典》2010年版中单价抗蛇毒血清的标准，其它项目符合 《中国药典》2010年版中单价抗蛇毒血清的标准。
图1为本发明多价抗蝰科蛇毒血清非还原性SDS-PAGE电泳图谱。图中，1.穿透 峰；2. 80-65ms/cm 洗脱峰；3. 65_55ms/cm 洗脱峰；4. 55_30ms/cm 洗脱峰；5. 30_5ms/cm 洗脱 峰；6.标准MK。图2为抗五步蛇毒免疫血浆ELISA分析结果图。图3为抗蝮蛇毒免疫血浆ELISA分析结果图。图4为抗蝰蛇蛇毒免疫血浆ELISA分析结果图。
具体实施例方式( 一 )本发明制备方法及对蝰科蛇毒中和试验效果实施例1 取五步蛇毒加佐剂乳化混勻对马匹进行两次免疫，血浆抗体效价IO5采血，离心分 离血浆，盐析、灭菌、酶解后疏水层析收集蛋白峰F(ab)’ 2纯化片段，用8000-10000膜超滤 脱盐后0. 22um膜过滤除菌冷冻干燥，获得抗五步蛇血清冻干品。取蝰蛇毒、蝮蛇毒按相同 工艺获得对应抗血清冻干品。分别称取抗五步蛇血清13g、抗蝰蛇血清9g、抗蝮蛇血清llg， 经200ml注射用水复溶后0. 22um膜过滤后分装，IOml/瓶，冻干，成为20人份用量。所制备的冻干抗血清每瓶经小鼠中和法检测能有效中和尖吻蝮蛇毒109mg、蝰蛇 毒50mg、烙铁头蛇毒62mg、竹叶青蛇毒24mg及蝮蛇毒26mg。所制备的多价抗血清F(ab)，2分子量为102Kda, F(ab)，2含量92. 7%，IgG含量 5%，Fc片段含量小于10%。实施例2 取五步蛇毒加佐剂乳化混勻对马匹进行两次免疫，血浆抗体效价IO5采血，离心 分离血浆盐析后，灭菌、酶解、疏水层析收集蛋白峰F(ab)，2纯化片段，用8000-10000膜超 滤脱盐后0. 22um膜过滤除菌冷冻干燥，获得冻干抗五步蛇血清。取蝰蛇毒、蝮蛇毒按相同 工艺获得对应冻干抗血清。分别称取冻干抗蝮蛇血清6. 3g，抗蝰蛇血清5g，抗五步蛇血清 8. 9g冻干品，IOOml注射用水复溶后0. 22um膜过滤后分装，IOml/瓶，冻干。所制备的冻干抗血清经小鼠中和法检测能有效中和尖吻蝮蛇毒llOmg、蝰蛇毒 50mg、烙铁头蛇毒67mg、竹叶青蛇毒26mg及蝮蛇毒26mg。所制备的多价抗血清F(ab)，2分子量为108Kda，F(ab)，2含量92. 6%，IgG含量 4%，Fc片段含量小于10%。实施例3
取五步蛇毒加佐剂乳化混勻对马匹进行两次免疫，血浆抗体效价IO5采血，离心分离血浆，盐析、灭菌、酶解后疏水层析收集蛋白峰F(ab)，2纯化片段，用8000-10000膜超 滤脱盐后0. 22um膜过滤除菌冷冻干燥，获得冻干抗五步蛇血清。取蝰蛇毒、蝮蛇毒按相同 工艺获得对应冻干抗血清。分别称取抗蝮蛇血清10. 5g，抗蝰蛇血清8. 7g，抗五步蛇血清 12. 5g冻干品，200ml注射用水复溶后0. 22um膜过滤后分装，IOml/瓶，冻干。所制备的多价抗血清F(ab)，2分子量为97Kda，F(ab)，2含量94. 2%，IgG含量小 于3%，Fc片段含量小于10%。( 二)本发明免疫扩散试验结果及小鼠中和能力测定(1)免疫扩散实验结果纯化后的F(ab' )2冻干品与蝰蛇毒在8 1时出现明显免疫沉淀线。纯化后的F(ab' )2冻干品与五步蛇毒在4 1时出现明显免疫沉淀线。纯化后的F(ab' )2冻干品与蝮蛇毒在4 1时出现明显免疫沉淀线。(2)抗蝰蛇毒血清成品小鼠中和法测定抗体效价采用Blliss简化机率单位法分 别测得蝰蛇蛇毒LD5tl 为 1. 75 μ g/g ；五步蛇蛇毒的LD50为3. 25 μ g · g-1 ；蝮蛇蛇毒的LD5tl 为 3. 0 μ g · g-1。小鼠体外中和实验小鼠分为抗蝰蛇、抗五步蛇、抗蝮蛇、对照组四个组，每组 6只小鼠，雌雄各半。以硼酸盐缓冲溶液溶解抗血清与蛇毒，蛇毒量均为2LD5(I，注射液 为抗蝰科蛇毒血清F(ab' )2冻干品与蛇毒按质量比5 UlO 1、15 1,20 1、 25 1,30 1混合摇勻后置37°C结合45min后注射小鼠腹腔，每个稀释度注射6只，腹 腔注射，每只0. 4ml ；对照组为硼酸盐缓冲液与2LD5(i蝰蛇毒、五步蛇毒、蝮蛇毒腹腔注射 0.4ml/只，观察72h并记录小鼠死亡情况。结果本发明抗血清F(ab' )2冻干品与蝰蛇 毒质量比为15 Kmg mg)；本发明抗血清F(ab' )2冻干品与五步蛇蛇蛇毒质量比为 10 Kmg mg)；本发明抗血清F(ab' )2冻干品与蝮蛇毒质量比为20 l(mg mg)，可 保护小鼠100%存活，而对照组小鼠全部死亡。(三)免疫血浆抗体滴度测定以包被液稀释浓度为10 μ g/mL的蝰蛇毒、五步蛇毒、蝮蛇毒(1 20)包被酶标 板，每孔100μ L，4°C过夜，洗板3次，将免疫马血浆按10-1-10-6稀释作为检测抗体加入酶 标板，并以健康马血清稀释相同倍数作为阴性对照，37°C结合2h后，洗板3次，再加入酶标 记二抗(兔抗马HRP)，370C结合2h，洗板后加入显色液，置暗处显色30-45min后加入2mol/ L H2SO4中止反应，用酶标分析仪测定A492nm值。抗蝰蛇毒免疫血浆稀释至10_6时可与蝰蛇蛇毒发生特异性结合呈阳性，抗五步蛇 毒免疫血浆稀释至10_5时可与五步蛇毒发生特异性结合呈阳性，抗蝮蛇毒免疫血浆稀释至 10_5时可与蝮蛇蛇毒发生特异性结合呈阳性。(四)成品制备及使用方法分别称取抗蝮蛇血清500_650mg，抗五步蛇蛇毒血清600_870mg，抗蝰蛇毒血清 400-550mg后，用305ml注射用水复溶，经0. 22um膜过滤后分装，IOml/瓶，冻干。剂量及用法静脉注射，成人1500-2070mg/次，儿童与成人同剂量，一次/日，如病情缓解较慢可适当增加剂量 。
权利要求
一种中国陆生常见蝰科蛇毒多价抗血清的制备方法，包括从免疫马血浆获得纯化的F(ab)’2片段，其特征是a.用小鼠中和法分别测定抗五步蛇、抗蝰蛇和抗蝮蛇毒F(ab)’2冻干品效价，包括五步蛇蛇毒的LD50为3.25μg·g-1，抗五步蛇毒血清F(ab′)2冻干品与五步蛇蛇蛇毒质量比为10∶1(mg∶mg)；蝰蛇蛇毒的LD50为1.75μg·g-1，抗蝰蛇毒血清F(ab′)2冻干品与蝰蛇毒质量比为15∶1(mg∶mg)；蝮蛇蛇毒的LD50为3.0μg·g-1，抗蝮蛇毒血清F(ab′)2冻干品与蝮蛇毒质量比为20∶1(mg∶mg)；b.称取符合以上效价的抗五步蛇蛇毒血清600-870mg、抗蝰蛇毒血清400-550mg及抗蝮蛇血清500-650mg，用305ml注射用水复溶，经0.22um膜过滤后灌装成10ml/瓶注射剂，冻干保存。
2.根据权利要求1所述的中国陆生常见蝰科蛇毒多价抗血清的制备方法，其特征是所 制备的多价抗血清F(ab)，2分子量为95-llOKda，F(ab)，2含量大于85%，IgG含量小于 5%，Fc片段含量小于10%。
3.如权利要求1或2所述的中国陆生常见蝰科蛇毒多价抗血清的用法，其特征是该多 价抗血清用法及剂量为静脉注射，成人1500-2070mg/次，儿童与成人同剂量，一次/日，病 情缓解较慢时可适当增加剂量。
全文摘要
一种中国陆生常见蝰科蛇毒多价抗血清的制备方法及用法，涉及多价抗血清的制备及用法。本发明选择达到一定效价水平的几种蝰科毒蛇的特异性单价抗蛇毒血清F(ab)’2，装量成10ml/瓶注射剂。经小鼠中和法检测该血清能有效中和我国常见五种蝰科毒蛇的平均一次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-110mg、或蝰蛇毒30-55mg或烙铁头蛇毒55-75mg或竹叶青蛇毒20-35mg或蝮蛇毒20-35mg，可直接应用于蛇伤重危患者，不需鉴定咬伤蛇种类，降低蝰科毒蛇伤致残率和死亡率。
文档编号A61K35/16GK101843902SQ20101017917
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者叶峰平, 张富强, 张志晓, 范泉水, 邱薇, 郑颖 申请人:成都军区疾病预防控制中心军事医学研究所