专利名称：：苯丁酰基姜黄素衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属制药领域，尤其涉及苯丁酰基姜黄素衍生物及其制备方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：姜黄素(Curcumin，简称Cur)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗人类免疫缺陷病毒、抗胆固醇、抗氧化等多种药理作用，具有良好的临床应用潜力。但Cur不稳定，在体内代谢迅速，生物利用度低，体内难以达到有效浓度，严重制约了姜黄素开发成有效的抗癌药。通过结构改造合成姜黄素衍生物，提高生物利用度、延长生物消除半衰期t1/2有重要意义。
发明内容本发明的目的之一在于提供4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素和4，4’_[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素及其药学上可接受的盐。本发明的目的之二在于提供4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素和4，4’_[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素及其药学上可接受的盐的制备方法。为实现本发明的目的采用的技术方案如下本发明所述的4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素其结构式如下列化合物1所示；4，4’_[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素其结构式如下列化合物2所示，以及本发明所述的姜黄素衍生物的盐类是下式结构的化合物1和化合物2在药学上可接受的盐类<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>在药学上可接受盐包括碱金属盐、碱土金属盐、含有机碱的盐、含有机碱的盐。该可接受盐包括钙盐、镁盐、铵盐、三乙基胺盐、乙醇胺盐。本发明所述的姜黄素衍生物和盐类的制备方法，具体步骤如下将姜黄素溶于干燥过的二氯甲烷，加入催化量DMAP(N,N-4-二甲基氨基吡啶)，而后加入已溶解于二氯甲烷的4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸进行酯化反应，而后将产物经过柱层析分离纯化。在上述本发明的方法中可以先加脱水剂DCC(二环己基碳二亚胺)或EDCI(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，再加化学领域的通用催化量的DMAP。本发明所合成的化合物1和化合物2结构的姜黄素衍生物，均获得核磁共振光谱(NMR)、红外线光谱(IR)、紫外线光谱(UV)、液相色谱-质谱法(HPLC-Mass)鉴定，在鉴定后的化合物1和化合物2，依据需要而制成合适的药物学上的剂型。本发明是保护化合物1或化合物2的药物或其药学上可接受的盐，或含有化合物1或化合物2的药物或其药学上可接受的盐组成的药物组合物或制剂。在制备药物学上的剂型中，其载体为药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形齐U、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等；其可以制成口服和其他给药方式的各种剂型，如口服液、混悬液、胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、及粉针注射液等；按药学领域的常规生产方法制备，其选用含有重量百分比为0.-99.5%活性成分的化合物1或化合物2。也可含有0.-99.5%的化合物1或化合物2的药物组合物；为同领域一般技术人员能实现的技术。本发明的使用量可根据用药途径，患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其服用量可以是0.001-10g/kg体重，可以一次或多次给药。本发明目的之三在于4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素和4，4’-[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素，用于制备抗肿瘤药物的应用。姜黄素衍生物，可用于但不局限于制备治疗白血病、皮肤癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌或前列腺癌药物。白血病优选人慢性粒细胞白血病。本发明的有益效果本发明所述的化合物1姜黄素4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸酯在体内对多种动物肿瘤细胞移植模型均有明显抑制，尤其是对人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤的抑制作用可高达60%，而且给药组裸鼠体重无明显下降，无动物发生死亡。化合物1对人慢性粒细胞白血病K562细胞株接种NOD-SCID小鼠构建人慢性粒细胞白血病模型，生命延长率也提高了，且未见有对小鼠的严重毒性。对小鼠肝癌H22在体抑瘤率为40-75%，同样化合物2由于结构相似，实验证明也有同样的效果。因此，该类化合物具有比姜黄素更强的抑瘤作用。图1是化合物1静脉给药对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用2是化合物1口服给药对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用3是化合物1对人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤生长曲线4是化合物1对人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤的作用5和图6是化合物1对人慢性粒细胞白血病小鼠模型的小鼠大体解剖和小鼠骨髓bcr-abl基因表达7和图8是NS组和化合物1给药对人慢性粒细胞白血病模型小鼠外周血象9是化合物2对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用如图1所示，建立H22小鼠移植瘤，分别静脉给予小鼠生理盐(对照组)，化合物1:50、70mg/kg(给药组)。抑瘤率高达60%。如图2所示，建立H22小鼠移植瘤，分别口服给予小鼠生理盐(对照组)，化合物1:50、75、100mg/kg(给药组)，姜黄素50mg/kg(姜黄素对照组)。给药组抑瘤率分别为41.21%、52.93%、75.06%。姜黄素对照组(与化合物100mg/kg等摩尔)抑瘤率仅为16.58%，可见化合物抑瘤作用明显比姜黄素要强。如图3所示，建立人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤模型，分别口服给予裸鼠生理盐(对照组)，化合物1:40、60mg/kg(给药组)。于第0、4、8、11天用游标卡尺测小鼠瘤的长、宽、高，计算瘤体积=长X宽X高X1/2，增长百分率(％)=(实验组平均瘤体积_对照组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积X100%。从图3可见，给药组肿瘤的生长受到明显抑制。如图4所示，建立K562细胞裸鼠移植瘤模型，分别口服给予裸鼠生理盐(对照组)，化合物1:40、60mg/kg(给药组)。抑瘤率分别为66.6%、56.7%。如图5、图6所示，用NOD-SCID小鼠构建人慢性粒细胞白血病模型，对照组小鼠大体解剖，腹腔内见大量血性腹水，并出现实体瘤。小鼠骨髓细胞RT-PCR均检到人人慢性粒细胞白血病的特征基因bcr-abl，说明人慢性粒细胞白血病细胞K562归巢至NOD-SCID小鼠骨髓。如图7、图8所示，NOD-SCID小鼠人慢性粒细胞白血病模型，分别口服给予小鼠生理盐水(对照组)，化合物1:60mg/kg(给药组)，给药组外周血象幼稚细胞亦明显少于对照组。如图9所示，分别口服给予小鼠生理盐(对照组)，化合物2:35、50、75、115mg/kg(给药组)，姜黄素50mg/kg(姜黄素对照组)。给药组抑瘤率分别为27.43%,32.25%,62.60%,58.39%。姜黄素对照组(与化合物100mg/kg等摩尔)抑瘤率仅为13.42%，可见化合物2的抑瘤作用明显比姜黄素要强。具体实施例方式下列结合附图和实例对本发明进行详细说明实施例14-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素(化合物1)的合成EDCI1.92g(10mmOl)溶于无水二氯甲烷200ml中，在冰浴下搅拌并加入姜黄素7.36g(20mmol)，DMAP0.244g(2mmol)，再缓慢滴加溶有4_[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸3.04g(IOmmol)的二氯甲烷200ml，室温下继续搅拌反应6小时。用蒸馏水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤浓缩得粗品，粗品用中压制备色谱分离，反向C18柱，流动相甲醇水50%—100%(体积百分比)梯度洗脱，得到4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素纯品1.30g，产率20%，化学结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2.58(m,2H,-COCH2CH2CH2Ph)，3.62(t,4H,-NCH2CH2Cl)，3.71(t,4H,-NCH2CH2Cl)，3.85(s,6H,2Ar-0CH3)，6.14(s,1H,-COCH=C(OH)-)，6.70(d,2H,2-CH=CH-Ar)，6.78-6.99(m,2H)，7.13-7.19(m,2H)，7.33(m,2H)，7.51(d,2H)，7.58(d,2H)，7.62(d,2H,2Ar-CH=)，9.72(s，1H,Ar-OH)；HPLC-MSm/z654.2(M+1)实施例24，4'-[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素(化合物2)的合成EDCI1.92g(10mmOl)溶于无水二氯甲烷IOOml中，在冰浴下搅拌并加入姜黄素1.84g(5mmol),DMAP0.122g(Immol)，再缓慢滴加溶有4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸3.04g(IOmmol)的二氯甲烷200ml，室温下继续搅拌反应6小时。用蒸馏水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤浓缩得粗品，粗品用中压制备色谱分离，反向C18柱，流动相甲醇水50%—100%(体积百分比)梯度洗脱，得到4，4'_[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素纯品(化合物2)1.88g，产率40%，化学结构式如下OOH、jx^。1,1^v^cln"1N化合物2VNClClC49H54C14N2O8,mp58-60"C，1H匪R(CDCl3)δ2.04(m,4H,-COCH2CH2CH2Ph)，2.29(t,4H,-COCH2CH2CH2Ph)，2.60(m,4H,-COCH2CH2CH2Ph)，3.63(t,4H,-NCH2CH2Cl)，3.70(t,4H,-NCH2CH2Cl)，3.87(s,6H,2Ar-0CH3)，6.58(d,2H,J=16Hz，2—CH=CH-Ar)，6.63(d,4H,J=8Hz)，6.66(s，1H,-COCH=C(OH)-)，7.03(s,2H)，7.05(m,2H)，7.08(m,2H)，7.12(d,4H,J=8Hz)，7.17(m,2H)，7.51(d,2H)，7.53(d,2H)，7.62(d,2H,J=16Hz,2Ar-CH=)；HPLC-MSm/z941.3(M+1)实施例3化合物1对小鼠肝癌H22移植瘤模型的作用3.1材料812周龄昆明种健康小鼠，雌性，体重为(20士2)g；小鼠由福建医科大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(闽)200420002)。小鼠肝癌细胞株H22。化合物1使用前用配成所需浓度。3.2方法3.2.1荷瘤小鼠模型的建立H22肿瘤细胞传两代以上，调整细胞数至107ml，0.2mL/只接种于小鼠右前肢皮下，接种2只，待约两周，剥瘤，勻浆，再接种80只。3.2.2分组A共分为3组接种瘤株24h后的小鼠随机分成3组1组为生理盐水对照组，化合物1采用上述实施例方法制得的，以下同，II组为化合物1低剂量组(化合物150mg/kg)，III组为化合物1高剂量组(70mg/kg)，给药方法为尾静脉注射，0.lml/10goB共分为5组接种瘤株24h后的小鼠随机分成5组1组为生理盐水组(即肿瘤对照组)，II组为化合物1低剂量组(剂量为50mg/kg)，III组为化合物1中剂量组(剂量为75mg/kg)，IV组为化合物1高剂量组(剂量为100mg/kg)，V组为Cur组(剂量为50mg/kg，与高剂量IV组等摩尔)，给药方法为灌胃，0.lml/10go3.2.3抑瘤率处死小鼠后剥瘤称瘤质量，计算抑瘤率.肿瘤抑制率(％)=对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量X100%。3.3结果3.3.1化合物1静脉给药的抑瘤作用观察不同给药剂量的抑瘤作用，可见化合物1对小鼠肝癌H22移植瘤率具有明显的抑制作用(见表1，说明书附图的图1)。表1化合物1静脉给药对小鼠肝癌H22移植瘤抑制作用M~~鼠数瘤重(g)抑瘤率组别mg/kgxday前/后(%)NS0x1010/101.01士0.470低剂量组50x710/90.40±0.1560.84**高剂量组70x510/60.335±0.1666.83**注=NS(生理盐水对照组)，与NS组相比，*P<0.05广P<0.01.3.3.2化合物1口服给药的抑瘤作用观察口服给药6天的抑瘤作用。可见随剂量的增加抑瘤率逐渐提高，呈现良好的量效关系。给药组(100mg/kg)比等摩尔的对照药姜黄素(50mg/kg)抑瘤率有显著提高，而且大剂量未见有小鼠死亡，可见化合物1较安全。(见表2及说明书附图的图2)表2口服给药对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与NS组相比，*P<0.05广P<0.01.Cur为姜黄素实施例4化合物1对人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤模型的作用4.1材料4-6周龄SPF级裸鼠，雄性，购自由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号SCXX(沪)2007-0005)，在SPF实验室饲养。人类慢性粒细胞白血病K562细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。化合物1使用前配成所需浓度。4.2方法4.2.1荷瘤小鼠模型的建立K562细胞传两代以上，调整细胞数至5X107ml，0.2mL/只接种于裸鼠右前肢皮下，接种30只。4.2.2分组共分为3组接种瘤株6天后，根据小鼠肿瘤大小，将小鼠分层随机随机分成3组I组为生理盐水对照组，II组为化合物1低剂量组(40mg/kg)，III组为化合物1高剂量组(60mg/kg)，给药方法为灌胃给药，0.lml/10go4.2.3瘤增长百分率分别于第0、4、8、11天用游标卡尺测小鼠瘤的长、宽、高，计算瘤体积=长X宽X高X1/2，增长百分率(％)=(实验组平均瘤体积一对照组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积X100%。4.2.4抑瘤率处死小鼠后剥瘤称瘤质量，计算抑瘤率.肿瘤抑制率(％)=(对照组平均瘤质量一实验组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量X100%。4.3结果4.3.1瘤增长百分率各组荷瘤小鼠肿瘤生长的动态变化见说明书附图的图3，可见给药组的肿瘤增长速率明显比NS对照组要低。4.3.2口服给药的抑瘤作用观察口服给药11天的抑瘤作用。结果显示化合物1能明显抑制K562细胞裸鼠移植瘤的生长，其抑瘤率分别为66.6%、56.7%，经统计学处理(t检验)具有显著性差异，具有一定的量效关系(见表3，说明书附图的图4)。与生理盐水组比较，给药组裸鼠体重无明显下降，无动物发生死亡，提示化合物在提高药物抗癌作用的同时并没有增加药物的毒性。试验表明化合物1对人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤模型具有显著的抑瘤作用。表3口服给药对人慢性粒细胞白血病K562细胞裸鼠移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</table注与NS组相比，*P<0.05；**P<0.01.实施例5化合物1对人慢性粒细胞白血病小鼠模型的作用5.1材料5.1.1N0D-SCID小鼠雌性和雄性兼用，46周龄，体重1822g，中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号SCXK(京)2005-0013。NOD-SCID小鼠在SPF实验室层流架内带盖鼠盒中饲养(符合SPF标准)。标准颗粒饲料，饮水，垫料及一切与鼠接触物品均经灭菌处理。5.1.2人白血病细胞株(K562)购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，本室常规传代培养，采用对数生长期的细胞做动物体内移植。5.1.3化合物1使用前配成所需浓度。5.2方法5.2.1小鼠慢性粒细胞白血病模型的建立NOD-SCID小鼠接受2.OGyX射线全身照射，次日取对数生长期K562细胞用于移植，尾静脉一次性注射IXlO7ceIl/鼠。5.2.2化合物1对NOD-SCID小鼠慢性粒细胞白血病模型作用NOD-SCID小鼠移植K562细胞后，随机分组，分设生理盐水对照组及给药治疗组，每组四只。空白对照组给予生理盐水0.2ml/只灌胃，给药治疗组给予化合物160mg/kg灌胃，于移植后两周开始给药，连续给药5天，给药治疗组停药5天后再连续用药8天。给药期间密切观察小鼠一般情况、体重及食量，评估药物毒性及动物对药物的耐受程度以调整给药方案。记录各实验组小鼠生存时间，观察时间为三个月，K562细胞移植后存活两个月以上者为长期生存。5.2.3外周血涂片及白细胞计数各实验组小鼠分别于接种前和接种后1周、2周、3周、4周、5周，取尾静脉血计数白细胞总数，并制备血涂片，经瑞氏_吉姆萨染色，油镜下分类、计数。5.3结果5.3.1N0D-SCID小鼠人慢性粒细胞白血病模型构建生理盐水对照组小鼠移植人慢性粒细胞白血病细胞K562后，自然存活时间为32.5士9.0天。动物皮毛起皱、萎糜少动、步态不稳，体重逐渐减轻。移植后三周外周血白细胞明显升高，可达移植前2-10倍，外周血涂片见大量幼稚细胞。死亡小鼠大体解剖，腹腔内见大量血性腹水，并出现实体瘤，脾大不明显(见说明书附图5)。生理盐水对照组NOD-SCID小鼠骨髓细胞RT-PCR均检到人bcr-abl基因(见说明书附图6)，说明人慢性粒细胞白血病细胞K562归巢至NOD-SCID小鼠骨髓。证明人慢性粒细胞白血模型构建成功。5.3.2口服给药对小鼠慢性粒细胞白血病作用给药治疗组截至结束为止4只小鼠中有2只尚存活，生存时间已达85天，实现长期生存，其余小鼠生存时间较生理盐水对照组明显延长，外周血白细胞数明显低于生理盐水对照组，外周血象幼稚细胞亦明显少于对照组。(见表4、5，及说明书附图7、8)，试验表明实施例1所合成的化合物1对小鼠慢性粒细胞白血病有作用。表4口服给药对慢性粒细胞白血病小鼠生存时间影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*:P<0.05，VSNS组。表5各实验组小鼠外周血白细胞数(X109/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例6化合物2对小鼠肝癌H22移植肿瘤的抑制作用化合物2为上述实施例方法制得的，本实例的测试方法同化合物1。将化合物2使用前配成所需浓度。取肿瘤生长良好的种鼠脱颈处死，无菌条件下剥取瘤块，取生长状态良好的肿瘤组织，勻浆过滤制成单细胞悬液，调整细胞数为1.OXIOVml，每只接种0.2ml于小鼠右腋下，建立H22小鼠移植瘤模型。接种次日，将小鼠按体重随机分组，每组9只小鼠，并且记录给药前体重。按0.2ml/10g体重给药，每天一次，共8次口服给药。于末次给药后24h脱颈处死，剥瘤拍照并称重(见表6和说明书附图9)，计算肿瘤平均重量及肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(％)=[对照组平均瘤质量一实验组平均瘤质量]/对照组平均瘤质量X100%。表6化合物2口服给对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与NS组相比，*P<0.05；**P<0.01。本发明以上述实施例同样的方式也可验证包括化合物1或化合物2或其在药学上可接受盐以及含有化合物1或化合物2或其在药学上可接受盐形式的药物组合物具有类似的特性；药学上可接受盐的例子包括碱金属盐如钠盐或钾盐，碱土金属盐如钙盐或镁盐，含有机碱的盐如铵盐，或舍有机碱的盐如三乙基胺盐或乙醇胺盐。权利要求结构式为下述化合物1的4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素和结构式为下述化合物2的4，4’-[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素及其药学上可接受的盐FSA00000135574800011.tif2.权利要求1所述的化合物1或化合物2的制备方法，其特征在于将姜黄素溶于干燥过的二氯甲烧，加入催化量DMAP，而后加入已溶解于二氯甲烷的4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸进行酯化反应获得化合物1或化合物2产物，而后将化合物1或化合物2产物经过柱层析分离纯化得到纯化的化合物1或化合物2产物。3.根据权利要求2的化合物1或化合物2的制备方法，其特征在于所述的二氯甲烷溶解脱水剂DCC或EDCI后再溶解姜黄素，而后加入催化量的DMAP。4.权利要求1所述的化合物1或化合物2的姜黄素衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。5.含有权利要求1所述的化合物1或化合物2姜黄素衍生物或其药学上可接受的盐组合成的药学上可接受的药物组合物或制剂在制备抗肿瘤药物的应用。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述的抗肿瘤药物用于制备治疗白血病、淋巴瘤、皮肤癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌或其他恶性肿瘤的药物。7.一种含有权利要求1所述的药物或其药学上可接受的盐，或含有权利要求1所述的药物或其药学上可接受的盐组成的药物组合物或制剂。8.权利要求1所述的4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素的单酯或双酯或其药学上可接受的盐或含有4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素的单酯或双酯及其药学上可接受的盐组合成的药物组合物或制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。9.根据权利要求4或5或8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为白血病、皮肤癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌或前列腺癌药物。10.根据权利要求9所述的的应用，其特征在于白血病为人慢性粒细胞白血病。全文摘要本发明公开苯丁酰基姜黄素衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用；具体为本发明包括4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素和4，4’-[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素及其药学上可接受的盐以及制备方法。包括4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰基姜黄素和4，4’-[双(2-氯乙基)氨基]双苯丁酰基姜黄素用于制备抗肿瘤药物的应用。本发明的丁酰基姜黄素衍生物用于但不局限于制备治疗白血病、皮肤癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌或前列腺癌药物。在体内对多种动物肿瘤细胞移植模型均有明显抑制，尤其是对人慢性粒细胞白血病K562细胞株接种NOD-SCID小鼠构建的人慢性粒细胞白血病模型，生命延长率显著提高，且未见有对小鼠有严重毒性。文档编号A61P35/00GK101830819SQ201010183509公开日2010年9月15日申请日期2010年5月26日优先权日2010年5月26日发明者刘洋,吴丽贤,吴敏,吴枝娟,林燕芳,许建华,郭晓丹,黄秀旺申请人:福建医科大学