去甲二氢愈创木酸在制备抗肿瘤干细胞的药物中的应用的制作方法

专利名称：去甲二氢愈创木酸在制备抗肿瘤干细胞的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物的新应用，特别涉及去甲二氢愈创木酸(简称NDGA)在制备抗 肿瘤干细胞(简称CSC)的药物中的应用。
背景技术：
近年研究发现，恶性肿瘤的发生和进展取决于一小部分具有自我更新和多向分化 能力的肿瘤细胞群体，即CSC亚群，其它绝大多数肿瘤细胞均由这一小群细胞分化而来并 导致了肿瘤组织在形态和功能上的异质性，CSC才是肿瘤发生的根源和始动细胞。这一研 究发现对于开发更有效的抗肿瘤治疗新方案具有重要意义。缺乏CSC靶向性的抗肿瘤治疗 方案虽然能够短期内杀死大量分化型肿瘤细胞(简称non-CSC)，使得肿瘤体积消退，却无 法避免治疗停止后肿瘤复发与远处播散。因此，恶性肿瘤的治疗效果主要取决于所采用的 治疗方案对CSC的根除效率。目前已成功从胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和胶质瘤中分离得到了 CSC。研究 显示，与non-CSC相比，CSC对放疗和化疗具有更强的抵抗能力，这一生存优势导致CSC在 恶性肿瘤治疗抵抗和复发中发挥关键作用，同时也使得探索针对CSC、抑制其增殖或者诱导 其分化的药物具有极大的临床价值。NDGA是一种从植物中提取出的天然药物成分。既往研究表明，NDGA具有抗肿瘤作 用，能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。但迄今为止，NDGA是否具有抗CSC的作用尚 未见报道。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于确认NDGA是否具有抗CSC的作用，在制备抗CSC的 药物方面有无应用可能性。为实现上述目的，本发明进行了以下研究①通过干细胞培养基筛选培养胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞Hu-7、肺癌细胞A549、 结肠癌细胞HCT116、乳腺癌细胞MCF-7和胶质瘤细胞U87中的CSC，使用CCK-8试剂盒检测 NDGA处理对CSC增殖的影响。结果显示NDGA能够显著抑制胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺 癌和胶质瘤CSC的增殖。②通过干细胞培养基筛选培养胶质瘤U87皮下移植瘤细胞中的CSC，采用免疫荧 光染色观察移植瘤组织中花生四烯酸-5-脂氧化酶(简称AL0X-5)和干细胞标志物nestin 的共表达情况；采用Western-blot法检测胶质瘤CSC和non-CSC的AL0X-5蛋白表达水平； 采用定量RT-PCR法检测胶质瘤CSC和non-CSC的AL0X-5 mRNA表达水平；使用脂氧化酶 抑制剂筛选试剂盒检测NDGA对AL0X-5活性的抑制效率；使用CCK-8试剂盒检测NDGA和 AL0X-5的产物白三烯B4 (简称LTB4)处理对胶质瘤CSC增殖的影响；采用流式细胞术检 测NDGA处理对移植瘤⑶133+细胞比例的影响；采用梯度稀释法检测NDGA处理对移植瘤 细胞成球能力的影响；采用免疫荧光染色观察NDGA处理对胶质瘤CSC表达星形细胞标记物GFAP的影响；采用半定量RT-PCR法检测NDGA处理导致的胶质瘤CSC目的基因mRNA表 达变化；采用流式细胞术检测NDGA处理对胶质瘤CSC细胞周期的影响。结果显示胶质瘤 CSC较non-CSC表达更高水平的AL0X-5，NDGA能够明显抑制AL0X-5的活性，且此效应介导 了 NDGA对CSC增殖的抑制作用；NDGA处理能够选择性去除体外培养的U87移植瘤细胞中 的CSC ；NDGA处理呈时间和剂量依赖性的促进胶质瘤CSC表达GFAP，降低其自我更新相关 基因转录，并导致其细胞周期发生动态变化，诱导CSC向星形细胞表型分化。③从胶质瘤U87皮下移植瘤细胞中筛选CSC并注射至裸鼠皮下，构建胶质瘤CSC 始动的移植瘤模型，采用NDGA体外预处理CSC和CSC成瘤后NDGA体内治疗两种方案，通过 检测移植瘤体积，流式细胞术分析移植瘤CD133+细胞比例，梯度稀释法检测移植瘤细胞成 球能力，免疫荧光染色法观察移植瘤干细胞标记物、增殖指数和分化细胞标志物的表达比 例，综合评价NDGA对CSC始动的胶质瘤发生和生长的干预作用。结果显示NDGA体外预处 理CSC能显著抑制其在裸鼠体内的成瘤能力；CSC成瘤后NDGA体内治疗能明显抑制移植瘤 的生长，与经典胶质瘤化疗药物卡莫司汀(简称BCNU)相比，NDGA抑制肿瘤生长的效应持 续时间更长；NDGA治疗呈剂量依赖性降低移植瘤CD133+细胞比例，而BCNU治疗则显著地富 集了⑶133+细胞；NDGA治疗组移植瘤细胞成球能力显著低于对照，而BCNU治疗组使移植瘤 中具有成球生长能力的细胞大幅增加；NDGA治疗组的移植瘤干细胞标记物和增殖指数明 显低于对照，分化细胞标记物上调，而BCNU治疗组导致移植瘤干细胞标记物富集，分化指 数和分化标记物均降低；上述结果说明NDGA可以靶向去除胶质瘤中的CSC，其机制可能与 诱导CSC分化有关。根据上述研究结果，本发明确认了 NDGA具有抗CSC的作用，可以用于制备抗CSC 的药物。进一步，所述抗CSC的药物为抗胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌或胶质瘤CSC的 药物；进一步，所述抗CSC的药物为抗胶质瘤CSC的药物；进一步，所述抗胶质瘤CSC的药物为诱导胶质瘤CSC分化的药物；进一步，所述诱导胶质瘤CSC分化的药物是通过抑制AL0X-5的活性诱导胶质瘤 CSC分化；进一步，所述NDGA为外消旋NDGA (简称Nordy)。本发明的有益效果在于本发明提供了 NDGA在制备抗CSC的药物中的应用，为靶 向CSC的肿瘤治疗提供了新的方案和药物，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有
重要意义。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为常规培养条件下贴壁生长的non-CSC和悬浮生长的CSC(100倍放大)A和 B分别为胃癌细胞SGC7901的non-CSC和CSC ；C和D分别为乳腺癌细胞MCF-7的non-CSC和 CSC ；E和F分别为肝癌细胞Hu-7的non-CSC和CSC ；G和H分别为肺癌细胞A549的non-CSC 和CSC ；I和J分别为结肠癌细胞HCT116的non-CSC和CSC ；K和L分别为胶质瘤细胞U87的 non-CSC 和 CSC。图2为Nordy抑制多种肿瘤CSC的增殖:A为SGC7901胃癌CSC ；B为乳腺癌 MCF-7CSC ；C为Hu-7肝癌CSC ；D为A549肺癌CSC ；E为HCT116结肠癌CSC ；F为U87胶质瘤 CSC ;#、*表示组间差异显著(p < 0. 05)。图3为免疫荧光染色观察移植瘤组织中AL0X-5和干细胞标志物nestin的共表达 情况；图4为Western-blot法检测胶质瘤CSC和non-CSC的AL0X-5蛋白表达水平。图5为定量RT-PCR法检测胶质瘤CSC和non_CSC的AL0X_5mRNA表达水平，#表 示组间差异显著(P < 0. 05)。图6为NDGA、内消旋NDGA (meso-NDGA)和Nordy对AL0X-5活性的抑制效率，#表 示组间差异显著(P < 0. 05)。图7为不同浓度Nordy和LTB4处理对胶质瘤CSC增殖的影响，#、*表示组间差异 显著(p < 0. 05)。图8为流式细胞术检测体外培养的U87移植瘤细胞经不同浓度Nordy和LTB4处 理后的⑶133+细胞比例，#、*表示组间差异显著(p < 0. 05)。图9为单个U87移植瘤细胞经不同浓度Nordy和LTB4预处理2天再用干细胞培 养基培养14天后在干细胞培养基中的成球能力(A)及单个U87移植瘤细胞经不同浓度 Nordy和LTB4持续处理14后在干细胞培养基中的成球能力(B)，#、*表示组间差异显著(p < 0. 05)。图10为免疫荧光染色观察胶质瘤CSC经不同浓度Nordy分别处理不同时间后 GFAP的表达比例，#表示组间差异显著(p < 0. 05)。图11为半定量RT-PCR法检测Nordy 10 u M处理胶质瘤CSC 2天和4天时目的基 因mRNA表达变化。图12为流式细胞术检测Nordy 10 u M处理胶质瘤CSC 2天和4天时细胞周期变 化情况，#、*表示组间差异显著(P < 0. 05)。图13为胶质瘤CSC分别经Nordy 50 y M和100 u M预处理后裸鼠皮下移植第5周 的肿瘤体积，#表示组间差异显著(P < 0. 05)。图14为免疫荧光染色观察胶质瘤CSC分别经Nordy 50 y M和100 u M预处理后裸 鼠皮下移植第5周的⑶133和GFAP的表达情况，#、*表示组间差异显著(p < 0. 05)。图15为BCNU和Nordy治疗荷瘤鼠对胶质瘤CSC始动的移植瘤生长速度的影响 (A)及各组治疗结束时(第26天)和延长观察结束时(第34天)移植瘤典型图片(B)，#、 *表示组间差异显著(P < 0. 05)。图16为流式细胞术检测BCNU和Nordy治疗荷瘤鼠结束时(第26天)移植瘤 ⑶133+细胞比例，#、*表示组间差异显著(p < 0. 05)。图17为BCNU和Nordy治疗荷瘤鼠结束时(第26天)单个移植瘤细胞在干细胞 培养基中的成球生长能力，#、*表示组间差异显著(P < 0. 05)。图18为免疫荧光染色观察BCNU和Nordy治疗结束时(第26天)干细胞标记物、 增殖指数和分化细胞标记物的表达情况，#，*，※，★表示组间差异显著(P < 0. 05)
具体实施例方式以下将参照附图，对NDGA抗CSC的作用进行详细的描述。实验材料和仪器Nordy制备方法参见文献(Bian Xff, et al. Proteomics，2008， 8(3) 484-494)和申请号为02133700. 4的中国专利申请；胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞 Hu-7、结肠癌细胞HCT116、乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549和胶质瘤细胞U87均购自美 国标准菌种收藏所(ATCC)；兔抗人AL0X-5多克隆抗体购自Santa cruz公司，兔抗人GFAP 多克隆抗体购自Zymed公司，小鼠抗人nestin多克隆抗体购自Chemicon公司，小鼠抗人 CD133多克隆抗体购自Abcom公司，PE标记的鼠抗人CD133抗体购自Miltenyi Biotec 公司，小鼠抗人Ki-67多克隆抗体购自北京中杉公司；脂氧化酶抑制剂筛选试剂盒购自 Cayman Chemical公司(货号760700)，半定量RT-PCR试剂盒和定量RT-PCR试剂盒购自 TAKARA公司；体重16 20g的4 6周龄雌性BALB/c_nu/nu小鼠购自第三军医大学实验 动物中心；Leica TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜；Rotor-Gene6000型荧光定量PCR仪。统计学分析定量数据均以均值士标准差表示，采用SPSS12. 0统计软件
进行分析，使用独立样本t检验分析两个组之间的差异，单因素方差分析比较多个组之间 的差异。一、NDGA抑制多种肿瘤CSC的增殖1、CSC的条件筛选和培养将胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞Hu-7、结肠癌细胞HCT116、乳腺癌细胞MCF-7、肺癌 细胞A549和胶质瘤细胞U87按照ATCC提供的培养条件进行标准培养传代，可见上述各株 细胞在含血清培养基中呈单层贴壁生长，其中SGC7901、Hu-7和MCF-7细胞在光镜下为扁平 上皮型形态，HCT116、A549和U87细胞为长或短梭形成纤维型形态，与ATCC提供图片相似 (图1)。取指数生长期的上述各株细胞，参照文献方法(Yu SC,et al. Cancer Lett, 2008, 265(1) 124-134 ；Galli R, etal. Cancer Res, 2004,64 (19) :7011_7021)筛选培养 CSC 用 干细胞培养基(由1XB27、浓度为20ng/ml的EGF、浓度为20ng/ml的bFGF和DEME/F12培 养基组成)稀释至细胞密度为4X 104/ml，接种24孔板，500ul/孔，在温度为37°C、C02气 体体积分数为5%的条件下培养，每3天换液，第7天获得大量悬浮生长的CSC细胞球(图 1)。2、NDGA抑制多种肿瘤CSC的增殖收集上述各种CSC，以巴氏吸管反复吹打为单细胞悬液，用干细胞培养基重悬并 调整细胞密度至2X 104/ml，接种96孔板，0. 2ml/孔，再加入DMS0 lul (vehicle)或Nordy 50 u M，在温度为37°C、C02气体体积分数为5%的条件下培养6天，每天用CCK-8试剂盒检 测细胞增殖，以波长450nm处的吸光度值表示。结果显示(图2)，Nordy组较vehicle组能 够显著抑制多种肿瘤CSC的增殖，这一现象在第5天和第6天具有显著差异，提示Nordy有 可能通过靶向CSC而对上述各种肿瘤具有治疗作用。二、NDGA抑制胶质瘤U87皮下移植瘤细胞中CSC的增殖并诱导其分化1、胶质瘤U87皮下移植瘤模型的建立及其CSC的培养收集按标准条件培养的U87胶质瘤细胞制成单细胞悬液，调节细胞密度至1 X 106/ ml，接种于BALB/c-nu/nu裸小鼠左前胸部皮下，按标准条件饲养。接种后第8周，将实验动 物麻醉后取皮下移植瘤，将移植瘤均勻剪碎成约1mm3大小组织块，一部分重新移植到裸小鼠体内以连续传代，另一部分置混合消化液(由质量分数均为0. 1 %的I型和IV型胶原酶组 成)中消化15分钟，获取单细胞悬液后，以细胞密度为10/yl接种于干细胞培养基中，每 2天半量换液，第7天获得胶质瘤CSC细胞球。2、AL0X-5介导NDGA对胶质瘤CSC增殖的抑制作用(1)胶质瘤CSC高表达AL0X-5取人胶质瘤手术标本冰冻切片，冷丙酮固定，正常山羊血清封闭，加入兔抗人 AL0X-5多克隆抗体和小鼠抗人Nestin多克隆抗体，4°C孵育过夜，再加入Cy3标记的羊 抗兔二抗和Cy5标记的羊抗小鼠二抗，用碘化丙啶(PI)复染胞核，缓冲甘油封片，激光 扫描共聚焦显微镜下观察。结果显示(图3)，人胶质瘤组织中AL0X-5与干细胞标志物 Nestin存在共分布现象，其中较多Nestin阳性的细胞也表达AL0X-5，提示人胶质瘤CSC 表达AL0X-5。进一步Western-blot结果显示(图4)，人胶质瘤CSC比non-CSC表达更多 的 AL0X-5 蛋白。定量 PCR(AL0X_5 基因扩增引物 F :5，-gaagacctgatgtttggctacc-3，，R 5，-aatgttcccttgctggacctc-3，；产物长度162bp，退火温度60°C )结果显示(图5)，人胶 质瘤CSC中的AL0X-5mRNA表达水平是non_CSC的4. 1 士 1. 9倍(p < 0. 05)。这些结果证实 人胶质瘤CSC高表达AL0X-5。(2) NDGA 抑制 AL0X-5 活性 由于NDGA是一种脂氧化酶抑制剂，本发明分别检测了 NDGA、meso-NDGA和 Nordy对AL0X-5活性的抑制效率。采用脂氧化酶抑制剂筛选试剂盒并按照试剂盒说明 书设计对照和实施实验，读取波长500nm处的吸光度值，按以下公式计算AL0X-5活性 的抑制效率:A500/min = (A500 样本-A500 对照)/5min ；初始 AL0X-5 活性=(A500/ min)/9. 47mM-l X (0. 21/0. 09)；绘制药物浓度-初始AL0X-5活性曲线图，根据曲线图得到 半数抑制浓度(IC5Q)。结果显示(图6)，冊64、!^80-冊64和吣『(^均可以显著抑制411 -5 活性，其初始AL0X-5活性与药物浓度呈负相关，NDGA, meso-NDGA, Nordy的IC5(1分别为 19 士 1. 5iiM、25 士 2. liiM、36±2.5iiM。(3) NDGA抑制胶质瘤CSC增殖结合(1) (2)两项结果和AL0X-5激活后具有促进细胞增殖的作用，进一步研究 Nordy是否可以抑制胶质瘤CSC增殖，且这一效应是否与其对AL0X-5活性的抑制效应有关。 以干细胞培养基重悬胶质瘤CSC制成单细胞悬液，调整细胞密度至2X 104/ml，接种96孔 板,0. 2ml/孑L，再力口入 DMS0 lul (vehicle control)、Nordy 10 u M> Nordy 50 ii M 或 Nordy 10 u M+LTB4 0.4iiM，在温度为37°C、C02气体体积分数为5 %的条件下培养5天，每天用 CCK-8试剂盒检测细胞增殖，以波长450nm处的吸光度值表示。结果显示(图7)，第5天 时Nordy 10 iiM组和Nordy 50 y M组对胶质瘤CSC增殖的抑制率分别为53%和67%，与 vehicle control 相比均具有显著性差异(p < 0. 05)；而 Nordy 10 u M+LTB4 0. 4 ii M 组较 Nordy 10 uM组使胶质瘤CSC增殖恢复了 60% (p < 0. 05)，说明AL0X-5的产物LTB4可以 逆转Nordy对胶质瘤CSC增殖的抑制作用。3、NDGA选择性去除体外培养的U87移植瘤细胞中的CSC(l)NDGA降低U87移植瘤细胞中⑶133+细胞比例以干细胞培养基培养U87移植瘤细胞，并加入Nordy 10 u M、Nordy 50 u M、Nordy 50 u M+LTB4 0. 1 y M 或 Nordy 50 u M+LTB4 0. 4 y M，培养 5 天后收集细胞，以鼠抗人 IgG2b为同型对照，与PE标记的鼠抗人⑶133抗体于4°C孵育30分钟，洗涤重悬后，用流式细胞仪 检测⑶133+细胞比例。结果显示(图8)，体外培养的U87移植瘤细胞中⑶133+细胞比例为
6.2士0.7% (Medium Control) ；Nordy处理呈剂量依赖性地降低体外培养的U87移植瘤细 胞中CD133+细胞比例，NordylO u M组和Nordy 50 u M组的CD133+比例分别为2. 9 士0. 3%禾口 1. 0士0. 1%，与Medium Control 相比 CD133+细胞比例分别降低了 54%和 84% (P < 0. 05)； 而LTB4处理可以减轻Nordy对CD133+细胞的抑制程度，Nordy 50 u M+LTB4 0. 1 u M组和 Nordy 50 u M+LTB4 组的 CD133+ 细胞比例分别为 1. 8士0. 3%禾口 7. 4士0. 6%，与 Nordy50 u M 组相比CD133+细胞比例分别升高了 86%和679% (P < 0. 05)。(2) NDGA降低单个U87移植瘤细胞成球能力采用梯度稀释法以干细胞培养基稀释U87移植瘤细胞至细胞密度为100/ml，接 种96孔板，0. lml/孔，倒置相差显微镜下观察并标记单细胞孔，在单细胞孔中加入Nordy 10 iiM、Nordy 50 u M, Nordy 50 u M+LTB4 0. 1 ii M 或 Nordy 50 ii M+LTB40. 4 ii M，在温度为 37°C、0)2气体体积分数为5%的条件下培养，每3天换液，培养14天后镜下计数含细胞数 大于50的细胞球数，按以下公式计算成球率成球率=细胞球数/单细胞孔数X 100%。 结果显示，Nordy处理可以降低单个U87移植瘤细胞在干细胞培养基中的成球能力(图 9A)，单个U87移植瘤细胞在干细胞培养基中培养14天后具有成球生长特性的细胞比例为
7.3 士 1. 0% (MediumControl)，分别以Nordy 10 ii M和50 ii M预处理2天导致这一比例下 降至4. 8 士0. 84%和0. 8 士0. 2% (P < 0. 05)，而在Nordy 50 y M预处理体系中分别添加 LTB4 0. liiM和0. 4iiM同时作用，则可以使成球比例上升至1. 5士0. 3%和8. 7士0. 8% (P < 0. 05)；同时，Nordy持续作用于干细胞培养基中生长的单个U87移植瘤细胞也导致其成 球能力显著下降(图9B)，分别以Nordy 10 y M和50 y M持续作用14天导致成球比例下降 至 3. 4 士 0. 6% 和 0. 8 士 0. 2% (P < 0. 05)，而 Nordy 50yM 分别与 LTB4 0. 1 ii M 禾口 0. 4 ii M 同时作用则使成球比例上升至3. 7 士0. 6%和9. 0 士 1. 6% (P < 0. 05)。4、NDGA促进胶质瘤CSC向成熟的星形细胞表型分化(1) NDGA促进胶质瘤CSC表达GFAP 以含有质量分数为10 %的胎牛血清的DMEM培养基重悬胶质瘤CSC，将细胞悬液滴 于多聚赖氨酸包被的载玻片上，在温度为37°C、C02气体体积分数为5%的条件下贴壁培养 4小时，以PBS洗净含血清培养基，换用干细胞培养基并加入Nordy 10 y M或Nordy 50 u M 培养3天，结束后以PBS清洗，体积分数为4%的多聚甲醛溶液固定，正常山羊血清封闭，加 入兔抗人GFAP多克隆抗体，正常小鼠IgG代替一抗作为阴性对照，4°C孵育过夜，再加入异 硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗，用碘化丙啶(PI)复染胞核，缓冲甘油封片，激光扫描共 聚焦显微镜下观察，在400倍镜下随机选取10个视野，计算阳性细胞所占比例。结果显示 (图10)，在干细胞培养基中培养的胶质瘤CSC保持低分化的状态，仅有3 % 4%的细胞表 达成熟的星形细胞标志物GFAP (Medium Control)；在相同的培养条件下，Nordy可以促进 胶质瘤CSC表达GFAP，且此效应与Nordy浓度和处理时间呈正相关，分别以Nordy 10 u M 和50 ii M处理胶质瘤CSC 3天，GFAP细胞阳性比例达到56. 3士2. 1 %和84. 7士3. 5%，与 Medium Control 相比差异显著(P < 0. 05)。(2) NDGA导致胶质瘤CSC目的基因mRNA表达变化提取胶质瘤CSC以及经Nordy 10 u M分别处理2天和4天的胶质瘤CSC的总RNA，使用半定量RT-PCR试剂盒并按照试剂盒说明书的反应条件，将总RNA反转录为cDNA，再 以其为模板、GAPDH为内参进行半定量RT-PCR，目的基因引物序列见表1，PCR循环29次， 产物进行质量分数为1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，结果用Quantity One软件进行分析，计算 目的基因与GAPDH的灰度比值。结果显示(图11)，自我更新状态的胶质瘤CSC表达若干 与干细胞相关的特异性转录因子如CD133、Melk、OCT-4、SOX-2、Nanog、Nestin等(Medium Control), Nordy在诱导GFAP表达的同时降低了这些基因的mRNA表达水平，说明其可能使 这些基因表达水平降低。表1引物序列、产物长度和退火温度 (3) NDGA诱导胶质瘤CSC细胞周期动态改变以Nordy 10 y M分别处理胶质瘤CSC 2天和4天，收集细胞，用体积分数为70%的 乙醇溶液固定，PI染色，用流式细胞仪检测细胞周期。结果显示(图12)，Nordy在调节胶 质瘤CSC基因表达的同时诱导了 CSC细胞周期的动态改变，在干细胞培养基中培养的胶质 瘤CSC超过60%处于细胞静止期(G0/G1期)(MediumControl)，而Nordy 10 u M处理2天 导致了约8%的静止期细胞进入增殖期(G2/M+S期)(P < 0. 05)，延长处理时间至4天，反 而有约10%的增殖期细胞重新进入静止期(P < 0. 05)。三、NDGA抑制胶质瘤CSC始动的移植瘤的发生和生长1、NDGA体外预处理胶质瘤CSC抑制胶质瘤CSC始动的移植瘤的发生(1)药物预处理方案及胶质瘤CSC始动的移植瘤模型的构建分别以Nordy 50 y M和100 u M处理来源于前述U87移植瘤的CSC 48小时，以未 处理CSC为对照(Medium Control)，苔盼蓝染色计数活细胞比例，再将2 X 104个胶质瘤CSC
9接种入BALB/c nu/nu裸小鼠左腋下，按标准条件饲养，建立胶质瘤CSC始动的移植瘤模型。(2)NDGA体外预处理使胶质瘤CSC体内成瘤能力显著降低，所形成的移植瘤呈分 化成熟的免疫表型第5周取小鼠移植瘤组织，测量移植瘤体积，并用免疫荧光染色法观察移植瘤 细胞CSC标记物⑶133和星形细胞标记物GFAP的表达情况。移植瘤体积分析结果显示 (图13)，Nordy 50yM组和100 y M组的移植瘤在第5周时体积分别为940 士 150mm3和 90士20mm3，与 Medium Control 组移植瘤(2250士460mm3)相比差异显著(P < 0. 05)；实验 还发现，经Nordy预处理的胶质瘤CSC形成移植瘤的潜伏期较对照组长，Nordy 50 u M组和 100 PM组分别在第14天和第19天出现可触及的皮下结节，而Medium Control组移植瘤第 10天肉眼可见。上述结果说明使用Nordy处理体外培养的胶质瘤CSC可以降低其在裸鼠体 内的成瘤能力和移植瘤的生长速度。免疫荧光染色结果显示(图14)，不同组移植瘤细胞 CSC标记物⑶133和星形细胞标记物GFAP的表达强度不同，Nordy 100 y M组⑶133和GFAP 阳性细胞比例分别为1. 4士0. 5%和38. 2士2. 4%，而Medium Control组CD133和GFAP阳 性细胞比例分别为6. 2 士 1. 3 %和21. 2 士 1. 9 %，二者差异显著(P < 0. 05)，说明Nordy处理 组移植瘤中CSC比例低而分化细胞比例高。2、NDGA体内治疗抑制胶质瘤CSC始动的移植瘤的生长(1)胶质瘤CSC始动的移植瘤模型的构建及药物治疗方案将2 X 104个来源于前述U87移植瘤的CSC接种入BALB/cnu/nu裸小鼠左腋下，按 标准条件饲养，建立胶质瘤CSC始动的移植瘤模型，再将其分为Nordyl3. 5mg/kg组、Nordy 27mg/kg组、BCNU 20mg/kg组和PBS (vehicle control)组，从第10天开始分别给予4个周 期的药物治疗，每个周期为4天，腹腔注射给药，Nordy 13. 5mg/kg组和27mg/kg组每2天 给药1次，BCNU 20mg/kg组每4天给药1次，PBS对照组每4天给药1次。(2) NDGA对移植瘤生长的抑制效应比BCNU具有更好的持续性在每个治疗周期的第4天以游标卡尺测量移植瘤最长径(L)和最宽径(W)，按如下 公式计算移植瘤体积(V) :V = LXW2/2，绘制移植瘤生长曲线。结果显示(图15) vehicle control组的移植瘤在前2周内生长速度缓慢，第10天出现肉眼可见的肿瘤结节，第14天 肿瘤结节体积为120士30mm3，随后肿瘤生长迅速，至第26天肿瘤结节体积达650士70mm3， 第 34 天达 2140士 170mm3 ；Nordy 13. 5mg/kg 组、27mg/kg 组及 BCNU 20mg/kg 组均可抑制 胶质瘤CSC移植瘤的生长，第26天治疗结束时，Nordy 13. 5mg/kg组、27mg/kg组及BCNU 20mg/kg组的移植瘤体积分别为380士80mm3、290士50mm3和50士 10mm3，显著低于vehicle control组(P < 0. 05)，且BCNU 20mg/kg组的移植瘤体积明显低于Nordy 13. 5mg/kg组 (P < 0. 05)，说明给药期间BCNU抑制移植瘤生长的效应优于Nordy ；延长观察时间发现， 停药后BCNU 20mg/kg组移植瘤迅速长大，而Nordy组移植瘤增速相对较缓。至第34天监 测截止，BCNU 20mg/kg组移植瘤体积已达1500 士 110mm3，显著大于Nordy 13. 5mg/kg组(P < 0. 05)，说明Nordy治疗CSC移植瘤比BCNU具有更好的停药后持续效应。(3) NDGA选择性降低而BCNU富集移植瘤细胞中CSC比例移植瘤细胞中CD133+细胞比例检测为分析BCNU停药后移植瘤生长异常迅速 的机制，在第4个治疗周期末即皮下接种胶质瘤CSC第26天，每组各取4只裸鼠麻醉 处死，取皮下移植瘤，剪碎消化获得单细胞悬液，用干细胞培养基短暂培养6小时，收集细胞，采用流式细胞术检测停药时移植瘤细胞中CD133+细胞比例。结果显示(图16)， vehicle control 组 CD133+细胞比例为 6. 4士0. 5% ；BCNU 20mg/kg 组 CD133+细胞比例为 32. 9士3. 3%，显著高于 vehicle control 组(P < 0. 05) ；Nordy 13. 5mg/kg 组禾口 27mg/kg 组CD133+细胞比例分别为1. 6士0. 5%和0. 9士0. 1%，均显著低于vehicle control组(P < 0. 05)。移植瘤细胞成球能力检测取“移植瘤细胞中CD133+细胞比例检测”中所述单细 胞悬液，采用梯度稀释法检测移植瘤细胞成球能力。结果发现(图17)，vehiclecontrol组 有5. 4士0.9%的移植瘤细胞具有成球能力；BCNU 2011^/1^组有26.4士4.2%的移植瘤细胞 具有成球能力，显著高于 vehicle control 组(P < 0. 01) ；Nordy 13. 5mg/kg 组和 27mg/kg 组成球生长的细胞比例分别为3. 1 士0.6%和1. 3士0.6%，均显著低于vehicle control组 (P < 0. 01)。(4)NDGA导致移植瘤增殖指数下降，诱导肿瘤细胞分化治疗结束后取小鼠移植瘤组织，立即用冰冻包埋剂包埋，于-20°C冰冻切6 y m组 织片，贴附于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，4°C丙酮固定20分钟，室温晾干，正常山羊血清 封闭，加入一抗(小鼠抗人CD133多克隆抗体、小鼠抗人nestin多克隆抗体、小鼠抗人 Ki-67多克隆抗体或兔抗人GFAP多克隆抗体)，正常小鼠IgG作为阴性对照，4°C孵育过夜， 再加入FITC或四乙基罗达明异硫氰酸盐(TRITC)标记的二抗，PI复染胞核，缓冲甘油封 片，激光扫描共聚焦显微镜下观察，在400倍镜下随机选取测定10个视野，计算阳性细胞 所占比例。结果显示(图18)，vehicle control组CD133、Nestin、Ki-67阳性细胞比例 分别为 6. 3士0. 9%、25. 6士2. 3%、35. 8士3. 4% ；Nordy 27mg/kg 组 CD133、Nestin、Ki-67 阳性细胞比例分别为1. 5士 1. 3 %、7士3. 2 %、4. 8士 1. 9 %，均显著低于vehicle control 组(P < 0. 05) ；BCNU 20mg/kg 组 CD133、Nestin 阳性细胞比例分别为 32. 3士4. 5
36. 6士4. 7%，较 vehicle control 组增高(P < 0. 05)，而 Ki-67 比例降低为 6. 8士2. 2% (P < 0. 05)；同时，GFAP阳性细胞比例在Nordy 27mg/kg组升高至66. 6士7. 7%，在BCNU 20mg/kg 组降低至 14. 8士2. 8%，与 vehicle control 组 24士2%差异显著(P < 0. 05)。上 述结果说明Nordy和BCNU治疗分别导致肿瘤细胞干细胞标记物和增殖指数发生不同变化。传统抗癌药物筛选主要是通过检查肿瘤病灶的消退程度，这种办法能够获得对绝 大部分肿瘤细胞具有杀伤力的药物，但这些药物不一定能够靶向CSC。因此，本发明采用的 评价方法是检测药物对CSC标记物和成球能力的影响。CD133是目前较为公认的CSC标志 物之一。由于有证据表明部分⑶133_细胞也具有CSC特性，因此本发明同时引入了另一个 评价指标，即干细胞培养基中自我更新式的成球生长能力。成球生长是CSC的重要细胞生 物学特性，同时也可以作为肿瘤患者临床预后的判断指标之一。综合上述两个评价指标，本 发明认为靶向CSC的药物不一定会在短期内使得肿瘤体积迅速减小，但是会有较好的远期 治疗效应。实验发现，BCNU虽然能够在短期内迅速抑制肿瘤生长，但是停药后却导致移植瘤 异常的迅速复发，这一现象与BCNU治疗显著富集了 CSC有关，而Nordy虽然在治疗期间抑 瘤效果不如BCNU明显，但是停药后抑瘤效应持续时间更长，肿瘤增殖缓慢，这可能与Nordy 治疗降低了 CSC比例有关。因此，综合评价二者抗癌效果，本发明认为Nordy治疗胶质瘤优 于 BCNU。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
去甲二氢愈创木酸在制备抗肿瘤干细胞的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述去甲二氢愈创木酸的应用，其特征在于所述抗肿瘤干细胞的 药物为抗胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌或胶质瘤干细胞的药物。
3.根据权利要求2所述去甲二氢愈创木酸的应用，其特征在于所述抗肿瘤干细胞的 药物为抗胶质瘤干细胞的药物。
4.根据权利要求3所述去甲二氢愈创木酸的应用，其特征在于所述抗胶质瘤干细胞 的药物为诱导胶质瘤干细胞分化的药物。
5.根据权利要求4所述去甲二氢愈创木酸的应用，其特征在于所述诱导胶质瘤干细 胞分化的药物是通过抑制花生四烯酸-5-脂氧化酶的活性诱导胶质瘤干细胞分化。
6.根据权利要求1至5任一项所述去甲二氢愈创木酸的应用，其特征在于所述去甲 二氢愈创木酸为外消旋去甲二氢愈创木酸。
全文摘要
本发明涉及化合物的新应用，特别涉及去甲二氢愈创木酸在制备抗肿瘤干细胞的药物中的应用，去甲二氢愈创木酸通过抑制花生四烯酸-5-脂氧化酶的活性抑制胶质瘤干细胞增殖并诱导其向星形细胞表型分化，对胶质瘤的体内治疗效果好于经典的胶质瘤化疗药物卡莫司汀；同时，去甲二氢愈创木酸还能够显著抑制胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌等肿瘤干细胞的增殖。
文档编号A61K31/05GK101869557SQ20101019074
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者余时沧, 卞修武, 平轶芳, 王斌 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院