黄腊果皂苷类成分及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：黄腊果皂苷类成分及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种药物原料的提取制备方法及其应用，具体涉 及黄腊果皂苷类成分的制备方法及其应用。
背景技术：
黄腊果(Stauntonia brachyanthera Hand-Mazz)为木通科野木瓜属植物，在我国 贵州、广西等省(区)有分布，为常绿木质藤本，其茎在民间主要作木通药用，具有清热利 尿、通经活络、镇痛排脓、通乳等功效，与木通功效相同；果实形态与预知子基本相同，不同 点在于预知子成熟后开裂，故又名八月扎、羊开口，黄腊果成熟后不开裂，色黄，民间也把其 当作预知子药用；果皮含有众多石细胞，民间用于结石。叶在民间亦入药，用于外感风寒，头 痛胸闷，吐泻腹胀，黄腊果整个植物都具有一定的药用价值。(谢宗万、余友芩.全国中草药 名鉴(上册)[M].北京人民卫生出版社，1996:176.)有关黄腊果的开发与利用近年来越来越受到人们的重视。因为它不仅具有很好的 药用价值，而且其果实也是一种有高营养价值的美味水果。目前以有报道将其果实开发成 黄腊果醋，其茎作为木通入药(汪冶，陈超，梅树模。侗药猪腰子(黄腊果)藤茎的生药学 鉴定。)但迄今为止，其在化学研究领域仍是一片空白，本专利将是首次对该植物进行化学 成分分离，分析和研究。

发明内容
本发明的目的是提供一系列以齐墩果烷型、降甲基齐墩果烷型和羽扇豆烷型为母 核的三萜苷元及其糖苷类化合物，其母核结构如下
齐墩果烷型降甲基齐墩果烷型羽扇豆烷型本发明的另一个目的在于应用简便、安全、价廉和实用的方法制备黄腊果皂苷类 成分，并说明其应用，该方法能制备纯度较高的一系列以齐墩果烷型和降甲基齐墩果烷型 为母核的三萜类化合物。本发明目的的实现方式如下(1)黄腊果原料粗粉1千克，用12倍，10倍和8倍的20% 95%的乙醇溶液80°C 下温浸提取三次(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)或超声提取，过滤，合并滤 液，浓缩至1升总提取液。(2)将总提取液采用下述a)或b)方法之一对有效部位进行富集
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a将上述总提取液按大孔吸附树脂药材为1 1的比例上已处理好的非极性或 弱极性大孔吸附树脂柱层析分离，采用梯度洗脱法，依次用水、40%、70%、90%的含水乙醇 或甲醇洗脱，每个梯度洗脱4 10个柱床体积，合并洗脱液，过滤，浓缩至1升，得黄腊果乙 醇洗脱液。b.将上述总提取液按药材正丁醇为1 1的比例，用0. 5-3倍体积的水饱和正
丁醇萃取3-8次，合并正丁醇，得黄腊果正丁醇萃取液。(3)将上述乙醇洗脱液或正丁醇萃取液经氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回 流脱色1小时，过滤，滤液经减压浓缩、真空干燥得黄腊果总皂苷。(4)将上述黄腊果总皂苷经正相硅胶柱色谱法、反相柱色谱法、制备高效液相色 谱法中的一种方法或多种方法联合使用，可除去杂质，纯化，得到所需的三萜类单体化合物 及其纯度更高的总皂苷混合物。一般以不同比列的氯仿-甲醇或丙酮-甲醇作为洗脱剂 洗脱，可得到部分三萜单体及三萜混合物，如将黄腊果总皂苷提取液经正丁醇萃取、氧化 镁脱色后，用硅胶柱色谱法以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，在二氯甲烷甲醇 =100 5得到一新天然产物3-0- α -L-吡喃阿拉伯糖_3_0去甲齐墩果-12 20 (29) - 二 稀-28-羧酸，在二氯甲烷甲醇=100 8得到一单体化合物胡萝卜苷。(5)将从黄腊果中分离得到的皂苷类单体或混合物单独或与其它药物组合作为原 料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。上述浓缩操作可采用常规浓缩和减压浓缩，干燥可采用50°C下常规干燥、真空干 燥、喷雾干燥或冷冻干燥。步骤⑵中的大孔吸附树脂选用非极性树脂(XAD-4，Diaion HP-20，D101、D102、 D401，Dl、D2、D3、D4，HPD-100，X-5)、弱极性树脂(D-201，HPD-300，AB-8)和中等极性 (XAD-6、XAD-7、XAD-8 等)的吸附树脂。步骤(4)中正相硅胶色谱柱所使用的流动相可以是氯仿或二氯甲烷和甲醇，采用 氯仿或二氯甲烷甲醇=50 1 1 1的比例梯度洗脱；反相色谱柱的填料可为RP-18， RP-8或RP-2.；所述的高效液相制备方法所使用的流动相为5% 95%的含水甲醇；高效 液相色谱柱的填料为八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶。本方法为首次对黄腊果植物中的化学成分进行分离、纯化和医药用途等方面的研 究，应用本方法得到的黄腊果总皂苷提取物的收率为23%以上，总皂苷的含量大于35%， 含量测定方法可采用香草醛_硫酸法。本发明采用水或是含水乙醇提取、经大孔树脂或正丁醇富集、纯化和氧化镁脱色 这样一套完整的工艺方法实现黄腊果总皂苷提取物的制备，同时，还可使用正相硅胶柱色 谱法、0DS、和制备高效液相色谱法中的一种或几种，对其总皂苷进一步分离和纯化，以提高 皂苷纯度，进一步得到一系列以齐墩果烷型、降甲基齐墩果烷型和羽扇豆烷型为母核的三 萜苷元单体及其糖苷类的皂苷类混合物以及单体化合物。提取物可以单独或与其它药物组 合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。另外，本发明步骤(2)中有两种不同的方法从黄腊果中提取黄腊果总皂苷，每种 方法都有各自的特点和适用情况，提取时可根据已有的设备条件和提取量的多少尽量选择 价廉，安全，适合的提取方法。本发明黄腊果皂苷类成分制备方法的提取分离效率高，黄腊果总皂苷含量高，还可进一步得到单体化合物并保持高的生理活性，方法简单易行、可操作性强，易于实现工业 化大生产。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例一黄腊果根粗粉1公斤，用12倍，10倍和8倍的70%醇80°C下温浸提取三次，(第 一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至1升， 根据大孔吸附树脂与药材量按1 1的比例上大孔吸附树脂(HPD100)柱层析分离，采用梯 度洗脱法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脱，每个梯度洗8个 保留体积，合并乙醇洗脱液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小时，过滤， 滤液经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷170g(收率17% )，将上述富集的黄腊果总皂苷采用 正相硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作为洗脱剂 洗脱，可得到部分三萜单体及三萜混合物。如以氯仿一甲醇进行梯度洗脱，在氯仿甲醇= 5 1处得到一单体化合物，为一已知化合物，白色粉末，易溶于甲醇，紫外灯下无荧光也无 暗斑，硫酸显色后为紫红色，在1H-NMR的高场区出现五个单峰甲基信号δ 0. 85，0. 93，1. 07， 1. 14，1. 19 (5 X CH3) ,13C-NMR中，出现29个碳信号，其中含有降齐墩果烷型特征的两组双键 碳信号以及一个羰基信号，经1H-NMR和13C-NMR鉴定为3_0_ α -L-吡喃阿拉伯糖_30_去甲 齐墩果-12 20 (29)-二稀-28-羧酸-28-0-β-D-吡喃葡萄糖(1_6) - β-D-吡喃葡萄糖酯。 将上述三萜混合物进一步采用反向色谱柱(以RP-IS(ODS)，RP-8或RP-2. RP为填料)或高 效液相制备柱(以RP-18或RP-8为填料)以含水甲醇为流动相进一步进行分离和纯化，以 得到具有活性的一系列以齐墩果烷型和降甲基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物。将黄腊 果皂苷类单体成分或其化合物单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利 尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例二黄腊果茎粗粉1公斤，用10倍，8倍和6倍的60%醇60°C下温浸提取三次，(第一 次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至1升， 将上述总提取液按药材正丁醇为1 1的比例，用0.5-3倍体积的水饱和正丁醇萃取3-8 次，合并正丁醇，得黄腊果正丁醇萃取液。用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱 色1小时，过滤，滤液经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷182g(收率18. 2% )，将上述富集 的黄腊果总皂苷采用正相硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙 酮-甲醇作为洗脱剂洗脱，可得到部分三萜单体及三萜混合物。如将黄腊果总皂苷提取液 经正丁醇萃取、氧化镁脱色后，用硅胶柱色谱法以二氯甲烷_甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱， 在二氯甲烷甲醇=100 5得到一新化合物，白色粉末，溶于氯仿和甲醇的混合液，紫外 灯下无荧光也无暗斑，硫酸显色后为紫红色，在1H-NMR中出现五个单峰甲基信号δ 0. 90， 0. 97，1. 10，1. 22，1. 28 (5 X CH3)，13C-NMR中，出现29个碳信号，其中含有降齐墩果烷型特征 的两组双键碳信号以及一个羰基信号，经1H-NMR和13C-NMR鉴定为3_0_ α -L-吡喃阿拉伯 糖-3-0去甲齐墩果-12,20(29)-二稀-28-羧酸，在二氯甲烷甲醇=100 8得到一单体 化合物，白色粉末，Molish反应阳性，Liebermann-Burchard反应呈阳性，经与已知化合物对照比较为胡萝卜苷，将二氯甲烷甲醇=100 5的一个流分再次用硅胶柱色谱法以石 油醚-丙酮为流动相进行梯度洗脱，在石油醚丙酮=100 5处得到一单体化合物，为一 已知化合物，白色针状结晶(CHC13)，mp. 252 253°C，Liebermann-Burchard反应呈阳性， 1H-NMR (400MHz, CDCl3) d 4. 68 (1H, s，H_29)，4· 58 (1H, s，H_29)，3· 18，(1H, dd, J = 11. 5Hz, H-3)，3. 81 (1H, ABdd, J = 10. 8Hz, H-28)，3. 33 (1H, ABdd, J = 10. 8Hz, H-28)，2. 38 (1H, m, H-19), 1. 68 (3H, s，30_Me)，0. 75，0. 82，0. 98，0. 99，1. 02 (3HX 5，s，23，24，25，26，27_Me)； 13C-NMR(75MHz, DMS0_d6)谱中，共给出 30 个碳信号，其中 79. 0 (C-3) 60. 5 (C-28)，δ 150. 5, 109. 8为一对双键碳信号，综合以上理化性质和波谱数据分析，鉴定为白桦脂醇。在石油 醚丙酮=100 6处得到一单体化合物，为一已知化合物，褐色无定形粉末。硫酸显 色后为紫红色，。ESI-MS给出准分子离子峰m/z456 ([M]+, 5) 1H-NMR (500MHz，C5D5N) d 谱 中给出 5. 45 (1H, m, H-12)，3· 47(1，t, J = 7. 8Hz, Η-3), 3. 30 (1Η, dd, J = 4· 5，13. 9Hz, Η-18)，1. 30 (3Η, s, Me-27) ,0. 86，0· 97，1. 02，1. 04，1. 20(3ΗΧ6, s，23，24，25，26，29， 30Me) 13C-WR (125MHz，C5D5N) d 30个碳信号，包括8个季碳信号、9个CH碳信号、12个CH碳 信号、6个CH3碳信号。δ 180. 1为连氧羰基碳信号。δ144.8、122.6构成烯键。结合结核 碳谱、氢谱化学位移，综合分析其核磁数据鉴定为齐墩果酸。将上述三萜混合物采用反向色 谱柱(以RP-18 (ODS)，RP-8或RP-2. RP为填料)或高效液相制备柱(以RP-18或RP-8为 填料)以含水甲醇为流动相进一步进行分离和纯化，以得到具有活性的一系列以齐墩果烷 型和降甲基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独 或与其它药物组合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例三黄腊果叶粗粉1公斤，用8倍，6倍和6倍的65%醇80°C下温浸提取三次，(第一次 3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至1升，根据 大孔吸附树脂与药材量按1 1的比例上大孔吸附树脂(HPDlOO)柱层析分离，采用梯度洗 脱法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脱，每个梯度洗9个保留 体积，合并乙醇洗脱液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小时，过滤，滤液 经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷120g(收率12% )，将上述富集的黄腊果总皂苷采用正相 硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，以不同比列的氯仿-甲醇或丙酮-甲醇作为洗脱剂洗脱， 可得到部分三萜单体及三萜混合物。将上述三萜混合物采用反向色谱柱(以RP-IS(ODS)， RP-8或RP-2. RP为填料)或高效液相制备柱(以RP-18或RP-8为填料)以含水甲醇为流 动相进一步进行分离和纯化，以得到具有活性的一系列以齐墩果烷型和降甲基齐墩果烷型 为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独或与其它药物组合作为 原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例四黄腊果果皮粗粉1公斤，用12倍，10倍和6倍的70%醇60°C下温浸提取三次， (第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至 1升，根据大孔吸附树脂与药材量按1 1的比例上大孔吸附树脂(HPD100)柱层析分离，采 用梯度洗脱法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脱，每个梯度洗 9个保留体积，合并乙醇洗脱液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小时，过 滤，滤液经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷143g(收率14. 3% )，将上述富集的黄腊果总皂
7苷采用正相硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作为 洗脱剂洗脱，可得到部分三萜单体及三萜混合物。将上述三萜混合物采用反向色谱柱(以 RP-18 (ODS)，RP-8或RP-2. RP为填料)或高效液相制备柱(以RP-18或RP-8为填料)以 含水甲醇为流动相进一步进行分离和纯化，以得到具有活性的一系列以齐墩果烷型和降甲 基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独或与其它 药物组合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例五黄腊果果肉粗粉1公斤，用12倍，10倍和6倍的70%醇60°C下温浸提取三次， (第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至 1升，根据大孔吸附树脂与药材量按1 1的比例上大孔吸附树脂(HPD100)柱层析分离，采 用梯度洗脱法，依次用水、40%的含水醇、70%的含水醇、90%的含水乙醇洗脱，每个梯度洗 9个保留体积，合并乙醇洗脱液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小时，过 滤，滤液经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷150g(收率15% )，将上述富集的黄腊果总皂苷 采用正相硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作为洗 脱剂洗脱，可得到部分三萜单体及三萜混合物。将上述三萜混合物采用反向色谱柱(一般 以RP-18 (ODS)，RP-8或RP_2. RP为填料)或高效液相制备柱(一般以RP-18或RP-8为填 料)以含水甲醇为流动相进一步进行分离和纯化，以得到具有活性的一系列以齐墩果烷型 和降甲基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独或 与其它药物组合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例六黄腊果种子中皂苷类成分、制备方法及其应用黄腊果种子1公斤，用12倍，10倍和8倍的70%醇80°C下温浸提取三次，(第一 次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至1升， 用正丁醇萃取，按药材量与正丁醇用量比例为1 1的比例萃取5次，黄腊果总皂苷主要富 集于正丁醇层，合并正丁醇萃取液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小 时，过滤，滤液经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷80g(收率8% )将上述富集的黄腊果总皂 苷采用正相硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲醇作为 洗脱剂洗脱，可得到部分三萜单体及三萜混合物。将上述三萜混合物采用反向色谱柱(以 RP-18 (ODS)，RP-8或RP-2. RP为填料)或高效液相制备柱(以RP-18或RP-8为填料)以 含水甲醇为流动相进一步进行分离和纯化，以得到具有活性的一系列以齐墩果烷型和降甲 基齐墩果烷型为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独或与其它 药物组合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例七黄腊果粗粉1公斤，用10倍，8倍和8倍量的水40°C下温浸，75%的醇提取三次，每 次2小时，过滤，合并滤液，静止12小时，滤取上清液，浓缩至1升，上大孔吸附树脂AB8柱， 依次用水、30 %的含水醇、60 %的含水醇、90 %的含水乙醇洗脱，每个梯度洗8个保留体积， 合并乙醇洗脱液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小时，过滤，滤液经减 压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷180g(收率18% )，将上述富集的黄腊果总皂苷采用正相硅胶 柱色谱法进一步分离和纯化，一般以不同比列的氯仿-甲醇或丙酮-甲醇作为洗脱剂洗脱， 可的到部分三萜单体及三萜混合物。将上述三萜混合物采用反向色谱柱(以RP-IS(ODS)，RP-8或RP-2. RP为填料)或高效液相制备柱(以RP-18或RP-8为填料)以含水甲醇为流 动相进一步进行分离和纯化，以得到具有活性的一系列以齐墩果烷型和降甲基齐墩果烷型 为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独或与其它药物组合作为 原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例八黄腊果粗粉1公斤，用12倍，10倍和8倍的70%乙醇80°C下温浸提取三次，(第一 次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至1升，用 正丁醇萃取，按药材量与正丁醇用量比例为1 1的比例萃取4次，黄腊果总皂苷主要富集 于正丁醇层，合并正丁醇萃取液，用氧化镁脱色，按每升80克加入氧化镁回流脱色1小时， 过滤，滤液经减压浓缩、干燥得黄腊果总皂苷165g(收率16. 5% )将上述富集的黄腊果总 皂苷采用正相硅胶柱色谱法进一步分离和纯化，一般以不同比列的氯仿_甲醇或丙酮_甲 醇作为洗脱剂洗脱，可的到部分三萜单体及三萜混合物。将上述三萜混合物采用反向色谱 柱(以RP-18 (ODS)，RP-8或RP_2. RP为填料)或高效液相制备柱(以RP-18或RP-8为填 料)以含水甲醇为流动相进一步进行分离和纯化，以一系列以齐墩果烷型和降甲基齐墩果 烷型为母核的三萜类化合物。将黄腊果皂苷类单体成分或其化合物单独或与其它药物组合 作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的药剂中。实施例九从黄腊果中分离的总皂苷及部分三萜类化合物的体外抗肿瘤活性的测 定取对数生长期的六种人体肿瘤细胞(人急性髓性白血病细胞株(HL-60)、人前列 腺癌细胞株(PC-3MIE8)、人胃癌细胞株(BGC-823)、人乳腺癌细胞株(MDA-MB-435)、人肝癌 细胞株(Bel-7402)、人宫颈癌细胞株(HeLa))，以内含10% (ν/ν)胎牛血清(fetal bovine serum)的RPMI-1640培养液稀释为5 X IO4个/L的细胞悬浮液，接种于96孔板中，100 μ L/ 孔，置于37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养24h。样品用DMSO溶解后，用含10% (ν/ν) 胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释。将上述含药培养液加入96孔板中，放置于与细胞培养 相同条件的培养箱中培养48h。MTT法操作流程如下接种细胞预培养(24h)，药物处理(48h)，加MTT染色(4h)， 离心除去上清液，加DMSO溶解，酶标仪570nm下测定OD值。数据分析按照以下方法计算细胞生长抑制率=[1-给药组OD值/对照组OD 值]X100%。采用LOGIT法计算药物半数抑制浓度(IC5tl)。试验结果如表1中所示。表 1
9 备注样品为不同纯度的总皂苷。包括大孔吸附树脂不同洗脱部位和柱层析不同 洗脱部位的皂苷(齐墩果烷型、降甲基齐墩果烷型和羽扇豆烷型)。实施例十从黄腊果中分离的总皂苷及部分三萜类化合物的体外抗炎活性的测定小鼠腹腔注射15mg/ml玉米淀粉盐水溶液1. 5ml/只，3天后取腹腔巨嗜细胞，以内 含10% (ν/ν)胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液稀释为IX IO6个/ml的细胞悬液，接种 于96孔平底培养板中，100μ Ι/well，置于37°C、饱和湿度、0.050)2培养箱中培养。2h细胞 贴壁后，去除未贴壁的细胞，加入20 μ 1/ml脂多糖(LPS)IOy 1/well，然后再加入不同浓度 的待测药物0. lml/well，每浓度3个复孔，以及空白对照组(LPS)。之后置于37°C、饱和湿 度、0. 05C02培养箱中培养48h后，取上清液，待测。(1)对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NO合成与释放的抑制作用取待测上清夜接种于96孔平底培养板中，100 μ 1/well ；ΙΟΟμΜ的NaNO2等倍稀 释于96孔平底培养板中为标准品对照(阳性对照)；以含10% (ν/ν)胎牛血清(FCS)的 RPMI-1640培养液为阴性对照。均设两个复孔。0.2%的N-I-萘基乙二胺双氯化物溶液 (NED)与0. 2%的磺胺溶液(SA)等体积混合配成Gress试剂，每孔中加入0. ImlGress试剂， 混合均勻，IOmin后于550nm波长下测OD值。试验结果按下面公式计算抑制率(IR)。实验结果见表2。Inhibition rate (IR) %= (0DLPS-0Dsample) / (0DLPS-0Dnegative control) X 100% ；表 2
10
备注样品为不同纯度的总皂苷。包括大孔吸附树脂不同洗脱部位和柱层析不同 洗脱部位的皂苷(齐墩果烷型、降甲基齐墩果烷型和羽扇豆烷型)。(2)对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α合成与释放的抑制作用取对数生长期的L929细胞，用0. 1 %胰蛋白酶及0. 02% EDTA混合液消化。用含 10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2 X IO5个/ml的细胞悬液，接种于96孔 平底培养板中，100 μ 1/well，置于37°C、饱和湿度、0. 05C02培养箱中培养24h后，吸去上清 液，每孔分别加入0. Iml倍比稀释后的各浓度TNF标准品及待测上清夜，各设3个复孔，阴 性对照组为1640培养液，空白对照组为磷酸盐缓冲液(PBS)，同时向各孔加入0. 05ml的放 线菌素D(0. 5-1 μ g/ml)，37°C、饱和湿度、0. 05C02培养箱中培养。培养24h后离心弃上清 液，润洗、MTT染色，570nm下测OD值。试验结果按下面公式计算抑制率(IR)。实验结果见表3。Inhibition rate (IR) % = (0DLPS_0Dsample) / (0DLPS_。Dnegative control) X 100 %表 3 备注样品为不同纯度的总皂苷。包括大孔吸附树脂不同洗脱部位和柱层析不同 洗脱部位的皂苷(齐墩果烷型、降甲基齐墩果烷型和羽扇豆烷型)。实施例十一从黄腊果中分离的总皂苷体内抗炎活性
(1)黄腊果总皂苷对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，分别为空白对照 组、总皂苷、吲哚美辛组；实验各组给药剂量见Table 4. 9，分别ig给药，连续7天，第7天 给药后lh，于小鼠右耳两面涂二甲苯25 μ 1，左耳不涂为正常耳，2h后，脱颈椎处死，用直径 Srarn打孔器打下左耳和右耳同一部位的圆片，于扭力天平上称重，计算耳肿胀率及抑制率。 结果见表 4Edema Rate (ER) (%) = [Right Ear (mg) -Left ear (mg) ] /Left Ear (mg) X100% Inhibitory Rate(IR) (% ) = (ERcontrol-ERsamples) /ERcontrol X 100%表4 *P < 0. 05，**P < 0. 01 vs control, Duncan test(2)黄腊果总皂苷对小鼠棉球肉芽肿增生的抑制作用昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，分组及给药剂量 见Table 4. 10 ；实验各组分别ig给药，连续7天，在给药第一日手术植入IOmg灭菌棉球 (每个棉球含1000U青霉素和1000U链霉素)，第8天脱颈椎处死小鼠，剥离肉芽组织，并于 60°C烘箱中烘12h，称重，计算肉芽肿重。试验结果见表5表 5 **P < 0. 01, ***P < 0. 001 vs control, Duncan test(3)黄腊果总皂苷对增高小鼠腹腔毛细血管通透性的作用昆明种小鼠60只，18_22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，按Table4. 11 分组和给药；实验各组分别ig给药，连续7天，第7天给药后lh，iv伊文思兰NS溶液 0. lml/10g(2 % )，立即ipO. 6 %醋酸0. 2ml/只，20min后，脱颈椎处死小鼠，剪开腹腔，用 5mlNS溶液冲洗腹腔数次，收集洗涤液，定容为10ml，离心IOOOrpmX 5min，在721分光光度 计590nm处测定吸光度值。试验结果见表6表6
**P < 0. 01，***P < 0. 001 vs control, Duncan test实施例十二从黄蜡果中分离的总皂苷利尿活性取180 200g雄性大鼠，预试，选取经水灌胃(2. 5mL/100g)后2h内排尿量达到 灌胃量40%以上的大鼠40只，随机分为生理盐水组、药物高、中、低剂量组，将各组大鼠分 别放入代谢笼中，每笼2只，体重相近。实验前禁食24h，生理盐水组和各个给药组的灌胃水 负荷量均为2. 5mL/100g体重。给药后在代谢笼下放置量筒，连续收集6h尿量，记录尿量体 积(mL)，结果见表7。 表7黄腊果总皂苷大鼠的利尿作用(η = 10，χ士s)
P < 0. 0权利要求
一类黄腊果皂苷类成分，其特征在于该成分是一系列以齐墩果烷型、降甲基齐墩果烷型和羽扇豆烷型为母核的三萜苷元及其糖苷类化合物，其母核结构如下FSA00000136474700011.tif
2.根据权利要求1所述的一类黄腊果皂苷类成分，其特征在于若母核为齐墩果 烧型时，R1 是 α -OH, β -OH, α -OAC 或 β -OAC, R2 是-CH3, -CHO, -CH2OH,或 _C00H，R3 是-CH3, -C00H, -CH2OH, R4是-H或α / β -OH ； 11、12位形成环氧结构；13位与28位形成内酯结构。
3.根据权利要求1所述的一类黄腊果皂苷类成分，其特征在于若母核为降甲基齐 墩果烷型时，R1 是 α -0Η, β -OH, α -OAC 或 β -OAC, R2 是-CH3, -CHO, -CH2OH,或-C00H，R3 是-CH3, -COOH,或-CH2OH。
4.根据权利要求1所述的一类黄腊果皂苷类成分，其特征在于若母核为羽扇豆烷型 时，R1 是 α -0Η, β -OH, α -OAC, β -OAC,或在 3 位形成酮羰基，R2 是 _CH3，-CHO, -CH2OH, 或-C00H，R3 是-CH3, -COOH,或 _CH20H。
5.根据权利要求2或3或4所述的一类黄腊果皂苷类成分，其特征在于在C-3，C-23， C-24，C-28位连接糖片段成苷，糖的数目为1-7个，糖的种类为呋糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖， 阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，甘露糖，阿洛糖，来苏糖，核糖，果糖，糖的类型是呋喃糖或 吡喃糖，糖之间的连接方式有1-2位连接，1-4位连接，1-3位连接和1-6位连接的一种或多 种；呋糖上可有一个或二个酰基取代，酰基取代类型主要为乙酰基和/或当归酰基和/或惕 恪酰基。
6.一种如权利要求1所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于所述的黄腊 果总皂苷的制备方法如下(1)将新鲜或干燥的黄腊果原料，粉碎成粗粉，用10%-95%的含水乙醇溶液热提取或 乙醇溶液超声提取，过滤、浓缩、得总提取液。(2)将总提取液采用下述a)或b)方法之一对有效部位进行富集a.将上述总提取液过以处理好的非极性或弱极性大孔吸附树脂，依次用水和不同浓度 的含水乙醇溶液或含水甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱4-10个柱床体积，合并洗脱液， 浓缩，得乙醇洗脱液；b.将上述总提取液用0.5-3倍体积的水饱和正丁醇萃取3-8次，合并正丁醇，得正丁醇 萃取液；(3)将上述乙醇洗脱液或正丁醇萃取液经氧化镁脱色，过滤，滤液经减压浓缩、真空干 燥得黄腊果总皂苷；(4)将上述黄腊果总皂苷经正相硅胶柱色谱法、反相柱色谱法、制备高效液相色谱法中 的一种方法或多种方法联合使用，可除去杂质，纯化，得到所需的三萜类单体化合物及其混合物。
7.根据权利要求6所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于黄腊果原料包括 黄蜡果的根、茎、叶、果实和种子。
8.根据权利要求6所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(1)所用 的有机溶剂包括甲醇、乙醇、含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(1)所用的 提取方法有加热提取和超声提取。
10.根据权利要求6所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法及其应用，其特征在于步骤 (2)大孔吸附树脂选自 XAD-4, Diaion HP-20，DlOl、D102、D401, Dl、D2、D3、D4, HPD-100, X-5、D-201, HPD-300, AB-8XAD-6、XAD-7、XAD-8、HPD400、HPD 600 中的一种。
11.根据权利要求6所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(3)中所 选用的氧化镁为轻质氧化镁。
12.根据权利要求6所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(4)中正 相硅胶色谱柱所使用的流动相可以是氯仿或二氯甲烷和甲醇，采用氯仿或二氯甲烷甲醇 =50 1 1 1的比例梯度洗脱。
13.根据权利要求2所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(4)中反 相色谱柱的填料可为RP-18，RP-8或RP-2.
14.根据权利要求2所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(4)中所 述的高效液相制备方法所使用的流动相为5% 95%的含水甲醇。
15.根据权利要求2所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于步骤(4)中高 效液相色谱柱的填料为八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶。
16.根据权利要求6所述的黄腊果皂苷类成分的制备方法，其特征在于浓缩可采用常 规浓缩和减压浓缩，干燥可采用50°C下常规干燥、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
17.权利要求1所述的黄腊果皂苷类成分在制备抗肿瘤、抗炎、利尿和相关疾病治疗的 药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及黄腊果皂苷类成分、制备方法及其应用。本发明所述的方法是指通过用水或不同浓度的有机溶剂对黄腊果进行提取，过滤，回收溶剂得浓缩液，浓缩液经大孔吸附树脂，用水和有机溶剂进行洗脱，回收溶剂得总皂苷，或采用萃取的方法从正丁醇层中到总皂苷，再进一步使用正相硅胶柱、反相柱和制备高效液相系统对总皂苷进行分离和纯化，最终得到具有显著活性的单体或化合物。应用本发明所制备的黄腊果皂苷类成分可以单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗肿瘤、抗炎、利尿及其相关疾病治疗的药剂中。本方法所制备的皂苷类成分纯度高，药理作用显著，方法简便、实用、廉价、安全、适合工业化生产。
文档编号A61P29/00GK101880306SQ20101019651
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者孟大力, 李宁, 李铣, 耿剑亮, 陈超 申请人:沈阳药科大学