专利名称：去细胞生物血管支架制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及去细胞生物血管支架的制备方法。
背景技术：
自体器官移植是治疗器官缺损最有效的医疗手段，但自体器官来源不足一直是器 官移植治疗过程中难以解决的实际问题。将种子细胞种植在可生物降解的支架材料上，体 外构建具有一定的生命活性和相应的生理医学机能的组织工程化器官，用作自体器官的替 代物，来移植修复病变或缺失的组织器官，可以从根本上解决器官移植治疗时所面临的自 体器官来源不足的矛盾。支架是构建组织工程化器官的三要素(细胞、材料和生物因子)之一。支架材料 的组份、结构、界面、孔径、强度和弹性，决定预构建组织工程化器官的生物力学特征，同时 也对种植在其上的细胞的粘附、迁移、增值和分化起着重要的调节作用。生物材料因具有良 好的组织相容性和植入安全性，以及与预构建组织器官相匹配的构型，而被广泛地用做支 架材料，并用于组织工程化器官的构建上。胶原蛋白、弹力纤维、透明质酸和蛋白多糖等既是细胞外间质成分，也是生物支架 材料的主要组成部分，决定着生物支架材料的生物力学特征和种植在其上的种子细胞的粘 附增值和分化，但生物支架材料中原先存在的细胞成分，移植后可能诱发宿主，产生免疫排 斥反应，需从中予以除去。去细胞支架材料因保留细胞外间质的主要成分和与天然组织相类似的构型，已成 为构建组织工程化器官的首选材料之一。利用去细胞支架材料构建组织工程化血管，用作 自体血管的替代物，可以从根本上解决血管移植治疗时所面临着的自体血管来源不足的矛 盾。去细胞生物支架的方法各异，效果也不尽相同。发明一种简便易行、去细胞效果可靠， 且能保留细胞外间质主要成份的去细胞血管生物支架是目前构建组织工程化血管首先解 决的技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于构建组织工程化血管的去细胞生物血管支架的 制备方法。本发明包括去污剂单独去细胞生物血管支架制备方法和去污剂_蛋白酶联合去 细胞生物血管支架制备方法，其中1.去污剂单独去细胞生物血管支架制备方法包括下列步骤①无菌条件下，取新鲜或冻存的血管管状组织(脐血管、颈血管、腹主动脉或大隐 静脉)。②用含有抗生素的生理盐水，或磷酸盐缓冲液洗去管腔内外的血液。③结扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为的 十二烷基硫酸钠和浓度为0. 02%的叠氮化钠。
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④结扎血管得另一端，将上述血管管状组织置于含有十二烷基硫酸钠 +0. 02%叠氮化钠的烧杯内。⑤在烧杯内放入搅拌棒，将烧杯置于磁力搅拌器上，启动磁力搅拌器，调整转速为 30转/分钟，室温下连续转动12小时。⑥取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残 留的十二烷基硫酸钠和叠氮化钠溶液。⑦结扎血管的一端，用注射器向血管支架注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为 0.3%的京尼平(genipin)溶液，结扎支架另一端，将血管支架置于上述京尼平溶液内，4°C 下固定4小时。⑧取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残 留的京尼平。⑨经组织学检测合格后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存于-20°C的冰箱内备用。2.去污剂_蛋白酶联合去细胞生物血管支架制备方法包括下列步骤①无菌条件下，取新鲜或冻存的血管管状组织(脐血管、颈血管、腹主动脉或大隐 静脉)。②用含有抗生素的生理盐水或磷酸盐缓冲液洗去管腔内外的血液。③结扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0. 25%的 胰蛋白酶和0. 02%的乙二胺四乙酸或其钠盐的消化液，结扎血管的另一端，无菌下，将其置 于室温下消化30分钟。④拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲走血管内残留的消化液。⑤将血管的两端与蠕动泵连接，蠕动泵的连接管内事先注入浓度为的十二烷 基硫酸钠和浓度为0. 02%的叠氮化钠。⑥启动蠕动泵，调整转速为25-30转/分钟，持续灌流3小时。⑦取出血管支架，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残留的十二烷 基硫酸钠和叠氮化钠溶液。⑧结扎血管的一端，用注射器向支架注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0. 3%的 京尼平(genipin)溶液，结扎支架另一端，将支架置于上述京尼平溶液内，4°C下固定4小 时。⑨取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残 留的京尼平。⑩经组织学检测合格后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存在-20 V的冰箱内备用。本发明用去污剂，或去污剂与蛋白酶联合，从脐血管、颈血管、腹主动脉、大隐静脉 等血管组织中除去细胞成份，从而获得保留了细胞外主要间质成分(胶原蛋白和弹力纤 维)的去细胞生物血管支架。本发明为构建具有生理医学机能的组织工程化血管或其它管状器官充足的生物 血管支架，提供了一种新的方法和来源。HE染色可见未经去细胞化处理的脐血管内含有大 量的细胞残留(见图1)，而分别经过上述去细胞化处理的脐血管内未见细胞和核残留。同 时经京尼平固定后的去细胞化的脐血管始终呈现管状结构，且组织内保留有大量的细胞外 间质成分胶原蛋白和弹力纤维(见图2和图3)。这些胶原蛋白和弹力纤维对维持血管的弹性和强度，以及种植在其上的细胞的粘附、迁移、增值、分化都将发挥重要作用。
图1为经HE染色的脐血管照片图2为经Masson染色的去细胞生物血管支架照片图3为经地衣红染色的去细胞生物血管支架照片
具体实施例方式1.去污剂单独去细胞生物血管支架制备方法包括下列步骤①无菌条件下，取新鲜或冻存的脐血管、颈血管、腹主动脉或大隐静脉。②用含有青霉素、链霉素或两性霉素的生理盐水，或磷酸盐缓冲液洗去管腔内外 的血液。③结扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为的 十二烷基硫酸钠和浓度为0. 02%的叠氮化钠。④结扎血管得另一端，将上述血管管状组织置于含有十二烷基硫酸钠 +0. 02%叠氮化钠的烧杯内。⑤在烧杯内放入搅拌棒，将烧杯置于磁力搅拌器上，启动磁力搅拌器，调整转速为 30转/分钟，室温下连续转动12小时。⑥取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残 留的十二烷基硫酸钠和叠氮化钠溶液。⑦结扎血管的一端，用注射器向血管支架注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为 0. 3%的京尼平溶液，结扎支架另一端，将血管支架置于上述京尼平溶液内，4°C下固定4小 时。⑧取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残 留的京尼平。⑨经组织学检测合格后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存于-20°C的冰箱内备用。2.去污剂_蛋白酶联合去细胞生物血管支架制备方法包括下列步骤①无菌条件下，取新鲜或冻存的脐血管、颈血管、腹主动脉或大隐静脉。②用含有青霉素、链霉素或两性霉素的生理盐水或磷酸盐缓冲液洗去管腔内外的 血液。③结扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0. 25%的 胰蛋白酶和0. 02%的乙二胺四乙酸或其钠盐的消化液，结扎血管的另一端，无菌下，将其置 于室温下消化30分钟。④拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲走血管内残留的消化液。⑤将血管的两端与蠕动泵连接，蠕动泵的连接管内事先注入浓度为的十二烷 基硫酸钠和浓度为0. 02%的叠氮化钠。⑥启动蠕动泵，调整转速为25-30转/分钟，持续灌流3小时。⑦取出血管支架，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残留的十二烷 基硫酸钠和叠氮化钠溶液。
⑧结扎血管的一端，用注射器向支架注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0. 3%的 京尼平溶液，结扎支架另一端，将支架置于上述京尼平溶液内，4°C下固定4小时。⑨取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残 留的京尼平。⑩经组织学检测合格后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存在-20 V的冰箱内备用。由图1可以看出经HE染色的脐血管内有大量的细胞核残留。由图2可以看出经Masson染色的去细胞生物血管支架内留有大量的胶原蛋白。由图3可以看出经地衣红染色的去细胞生物血管支架内留有大量的弹力纤维。
权利要求
去细胞生物血管支架制备方法，其特征在于包括去污剂单独去细胞生物血管支架制备方法和去污剂-蛋白酶联合去细胞生物血管支架制备方法，其中(1)去污剂单独去细胞生物血管支架制备方法包括下列步骤①无菌条件下，取新鲜或冻存的血管管状组织。②用含有抗生素的生理盐水，或磷酸盐缓冲液洗去管腔内外的血液。③结扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为1％的十二烷基硫酸钠和浓度为0.02％的叠氮化钠。④结扎血管得另一端，将上述血管管状组织置于含有1％十二烷基硫酸钠+0.02％叠氮化钠的烧杯内。⑤在烧杯内放入搅拌棒，将烧杯置于磁力搅拌器上，启动磁力搅拌器，调整转速为30转/分钟，室温下连续转动12小时。⑥取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残留的十二烷基硫酸钠和叠氮化钠溶液。⑦结扎血管的一端，用注射器向血管支架注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.3％的京尼平溶液，结扎支架另一端，将血管支架置于上述京尼平溶液内，4℃下固定4小时。⑧取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残留的京尼平。⑨经组织学检测合格后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存于-20℃的冰箱内备用。(2)去污剂-蛋白酶联合去细胞生物血管支架制备方法包括下列步骤①无菌条件下，取新鲜或冻存的血管管状组织。②用含有抗生素的生理盐水或磷酸盐缓冲液洗去管腔内外的血液。③结扎血管的一端，用注射器向管腔注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙二胺四乙酸或其钠盐的消化液，结扎血管的另一端，无菌下，将其置于室温下消化30分钟。④拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲走血管内残留的消化液。⑤将血管的两端与蠕动泵连接，蠕动泵的连接管内事先注入浓度为1％的十二烷基硫酸钠和浓度为0.02％的叠氮化钠。⑥启动蠕动泵，调整转速为25-30转/分钟，持续灌流3小时。⑦取出血管支架，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残留的十二烷基硫酸钠和叠氮化钠溶液。⑧结扎血管的一端，用注射器向支架注入以磷酸盐缓冲液配制的浓度为0.3％的京尼平溶液，结扎支架另一端，将支架置于上述京尼平溶液内，4℃下固定4小时。⑨取出血管支架，拆除结扎线，用磷酸盐缓冲液或生理盐水冲洗整个管腔，洗去残留的京尼平。⑩经组织学检测合格后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存在-20℃的冰箱内备用。
2.按权利要求1所述的去细胞生物血管支架制备方法，其特征在于所述的血管管状组 织为脐血管、颈血管、腹主动脉或大隐静脉。
全文摘要
去细胞生物血管支架制备方法属生物技术领域，本发明包括去污剂单独去细胞生物血管支架制备方法和去污剂-蛋白酶联合去细胞生物血管支架制备方法，经去细胞化处理的血管管状组织内未见细胞残留，同时经京尼平固定后的去细胞化的血管管状组织始终呈现管状结构，且组织内保留有大量的细胞外间质成分胶原蛋白和弹力纤维，这些胶原蛋白和弹力纤维对维持血管的弹性和强度，以及种植在其上的细胞的粘附、迁移、增值、分化都将发挥重要作用，本发明为构建具有生理医学机能的组织工程化血管或其它管状器官充足的生物血管支架，提供了一种新的方法和来源。
文档编号A61L31/00GK101879333SQ201010201440
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者刘晋宇, 李玉林 申请人:吉林大学