专利名称：转录因子FOXO1调控人肝脏特异性小RNA miR-122的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学分子生物学研究中的真核基因表达调控领域。具体而言，本发明涉及转录因子对小RNA的表达调控领域。
背景技术：
microRNA (miRNA)是一类长度约20 非编码的单链小分子RNA，它们通过与目标mRNA分子的3，端非翻译区(3' -untranslated region，3，UTR)互补匹配导致该 mRNA分子的翻译受到抑制，从而调控下游的生物学过程。miR-122是一个人肝脏特异性小RNA。它的初始转录本来源于her基因转录本的剪切，定位于人类18号染色体18q21. 31上。miR-122在肝脏发育过程中持续表达，并在进化过程中高度保守。研究表明在病理状态下，miR-122促进丙型肝炎病毒(HCV)在肝细胞内复制，另外miR-122与肝细胞肝癌(HCC)发生、发展及转移等过程密切相关；在生理状态下，miR-122参与肝细胞表型，肝脏的分化，发育与代谢，以及肝细胞应急应答等基本生命活动过程。在研究miR-122调控肝脏脂类代谢的实验中，沉默miR-122可导致血浆胆固醇和甘油三酯水平的显著降低，推测其可能与胆固醇和甘油三酯的生物合成基因表达降低有关，说明miR-122是肝脏脂肪代谢的重要调控者。F0X01是哺乳动物叉头蛋白家族0亚族四个成员之一，R)x0家族蛋白成员的潜在功能都紧密地被病生理状态下复杂的信号通路所控制。叉头蛋白家族中，特别是F0X01在整个机体的能量代谢中起着至关重要的作用。在饥饿状态下，肝脏通过F0X01在促进糖异生酶类表达中的关键作用维持糖量的水平。而在进食后，胰脏β细胞分泌胰岛素，促进外周组织包括骨骼肌和脂肪组织对糖的摄入，同时通过PII-Akt途径磷酸化F0X01使其出核，从而部分地抑制糖异生酶类在肝脏中的表达。除了直接调控代谢，F0X01还在骨骼肌和脂肪组织这两大维系能量稳态平衡的重要器官的形成过程中起作用。另外，通常由于胰岛素需求的增高导致的胰脏β细胞数量增多的变化也会由于细胞核内F0X01的表达而变得迟钝。然而，在这些相同的病理生理学条件下，F0X01的表达会促进抵抗氧化应激的基因表达，从而保护细胞功能。F0X01也能促进碳水化合物向脂肪酸的转换，使其在饥饿状态下成为主要的能量来源。但是，关于F0X01是否与miR-122的表达和功能有关未见报道。因此本领域中需要对F0X01是否调控miR-122的表达进行深入研究，进一步明确它在miR-122上游转录调控中的功能。
发明内容
根据上述需要，发明人发现在miR-122核心启动子区存在一个F0X01的潜在结合位点。发明人证明F0X01可作为miR-122新的调节因子，通过结合到miR-122核心启动子区的IRE位点来调控miR-122初始转录本的转录，从而可参与miR-122的功能的调节。这种调节受营养状态密切相关的信号通路的影响，同时也受到HNF4对该位点的结合的竞争，可最终参与到脂代谢的精细调控过程中。因此，本发明的一方面涉及转录因子F0X01在制备调控人肝脏特异性小RNA miR-122的制剂中的用途。具体而言，通过制备调控人肝脏特异性小RNA miR-122的制剂， 可以应用于科学研究，也可通过调节miR-122的功能从而应用于医疗领域。在本发明的一个实施方案中，转录因子F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元
件结合。在本发明的一个实施方案中，IRE元件的序列为AGMTTGTTTACTTT(SEQ ID NO 1)。在本发明的一个实施方案中，转录因子F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件的结合受到营养状态的调节。在本发明的一个实施方案中，F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件的结合以及HNF4对该位点的结合是互逆的。在本发明的一个实施方案中，转录因子F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件的结合受到HNF4对该位点的结合的竞争。在本发明的一个实施方案中，转录因子F0X01对人肝脏特异性小RNA miR-122的调控受到胰岛素的调节。优选地，胰岛素的浓度为ΙΟηΜ。
图1 :UCSC Genome Browser预测F0X01在miR-122上游的潜在结合位点。图2 =ECR Browser对miR-122及其上游51Λ进行进化保守性分析。图3 :rVista 2. 0预测miR-122核心启动子区的转录因子结合位点。图4 对miR-122核心启动子区的F0X01潜在结合位点做WebLogo分析。图5 利用胰岛素刺激验证F0X01表达质粒在Huh7细胞中的有效表达。图6 瞬时转染F0X01质粒后检测pri-miR-122的转录。图7 瞬时转染F0X01质粒后梯度增加的胰岛素对pri-miR-122转录的影响。图8 =FOXOl稳定克隆中pri-miR-122的转录变化。图9 双荧光素酶报告基因实验聚焦F0X01在miR-122上游51Λ范围内的潜在调控区域。图10 双荧光素酶报告基因实验检测F0X01在miR-122核心启动子区胰岛素应答元件(IRE)的转录调控作用。图11 利用Huh7细胞核蛋白提取物进行凝胶迁移速率实验检测F0X01与miR-122 核心启动子区IRE位点的结合1、生物素标记探针；2、生物素标记探针+核蛋白提取物；3、 生物素标记探针+核蛋白提取物+F0X01抗体；4、生物素标记探针+核蛋白提取物+过量冷探针。图12 利用过表达F0X01的细胞核蛋白提取物进行凝胶迁移速率实验检测 F0X01与miR-122核心启动子区IRE位点的结合1、生物素标记探针；2、生物素标记探针+ 核蛋白提取物；3、生物素标记探针+核蛋白提取物+F0X01抗体；4、生物素标记探针+核蛋白提取物+过量冷探针。图13 染色质免疫共沉淀实验检测内源F0X01在miR-122核心启动子区IRE位点
的结合。
图14 营养状态改变时染色质免疫共沉淀实验检测内源F0X01在miR-122核心启动子区IRE位点的结合。图15 干扰HNF4后染色质免疫共沉淀实验检测内源F0X01在miR-122核心启动子区IRE位点的结合。图16 过表达F0X01后染色质免疫共沉淀实验检测内源HNF4在miR-122核心启动子区的结合。
具体实施例方式1.利用生物信息学工具分析F0X01在miR-122核心启动子区存在的潜在结合位点在用实验方法验证F0X01是否在miR-122核心启动子区结合并调控其转录之前， 先利用现在比较成熟的对转录因子结合位点进行预测的在线工具，如UCSC，ECR Browser等对miR-122核心启动子区进行预测，将焦点适当缩小后再进行实验验证。1. IUCSC Genome Bioinformatics 分析对于miR-122上游5kb调控区域利用在线工具UCSC GenomeBrowser http:// genome, ucsc. edu/预测F0X01的潜在结合位点。如图1所示，有两个F0X01的潜在调控位点，一个是距离miR-122成熟本上游4870bp的远端调控位点I (site I) (chr!8 54264417-54264430)，另一个是距离miR-122成熟本上游914bp的近端调控位点II (site II) (chr!8 :54268372-54268385)。在位点I，同时还预测到同属于叉头(forkhead box)转录因子家族的F0X03，FOXJ2, HNF3B (F0XA2)的结合，结合位点的碱基序列为 5' -GAATTGTTTACTTT-3 ‘；与此类似，在位点II也预测到同属于叉头转录因子家族的 F0X03、F0X04的结合，结合位点的碱基序列为5 ‘ -GAGTTGTTAACATC-3 ‘。1. 2ECR Browser 保守性分析为进一步从生物信息学角度分析F0X01在miR-122上游最有可能的结合位点，对 miR-122及其上游51Λ调控区域利用另一个在线工具ECR Browser http//ecrbrowser. dcode. org/进行进化保守性分析。如图2所示，在把人的基因组与鱼到灵长类的七个物种进行比对时，除miR-122自身形成成熟本的茎环区域在各物种中均保守的，并对应右侧红色峰(red peak)所对的粉红色短棒(pink bar)外，只有miR-122上游约51Λ有另一个从禽类到灵长类保守的区域，对应左侧红色峰所对的粉红色短棒，这段区域即是本室李振亚博士实验鉴定的mir-122的启动子区。对比1. 1中分析得出的F0X01在miR-122上游潜在结合的两个位点，只有远端调控位点I处于图2中左侧红色峰所对的进化保守区域，而近端调控位点II不位于保守区域内，预示着位点I更有可能被调控因子F0X01作为关键的结合位点来结合从而调节miR-122初始转录本pri-miR-122的转录。1. 3rVista 2. O预测转录因子结合位点(TFBS)进一步的，对于上述位点I所在的mir-122上游51Λ处的核心启动子区利用ECR Browser网站内嵌的软件rVista2. O进行转录因子结合位点的预测，共得到44个保守的转录因子结合位点，如图3所示。可见其中F0X01或其叉头转录因子家族成员结合位点的预测值都为100. 00，这样的位点有10个，分别是18V$HNF3B_01+179-193 agaATTGTTTACTTt 187-201cgaATTGTTTACTTt 100.00
19V$F0XJ2_01-179-196 agaatTGTTTACttttaa 187_204cgaatTGTTTACttttaa 100.0021V$F0X01_02+180-193 gaaTTGTTTACttt 188-201gaaTTGTTTACttt 100.0022V$F0X03_01+180-193 gaaTTGTTTACttt 188_201gaaTTGTTTACttt 100.0023V$F0X04_02+180-193 gaaTTGTTTACttt 188_201gaaTTGTTTACttt 100.0024V$F0X04_01-180-190 gaatTGTTTac 188-198 gaatTGTTTaclOO. OO29V$F0XD3_01+181-192 aatTGTTTACTt 189_200aatTGTTTACTt 100.0030V$F0X_Q2+181-193 aatTGTTTACTTt 189-20IaatTGTTTACTTt 100.0032V$F0X01_01-182-191 atTGTTTact 190-199 atTGTTTactlOO. OO33V$HNF3_Q6-182-194 atTGTTTactttt 190-202 atTGTTTacttttlOO. OO将这十个与FOXOl及其家族有关的转录因子结合位点归纳起来，它们实际都位于相似的位点(从这段启动子区的179bp到204bp范围)，也即UCSC预测的FOXOl在距离 miR-122成熟本上游4870bp的远端调控位点I (chr!8 :54264417-54264430)所在的位置， 并包含了同一保守结合序列，即agaATTGTTTACTTt，其中红色部分为IRE (insulinresponse element)元件保守序列。而F0X01可以通过结合IRE元件对靶基因进行转录调控，如 Jennifer Altomonte和同事所做的F0X01对ApoC3的转录调控工作中，F0X01就是通过结合到ApoC3上游启动子区的IRE元件上对其进行调控的。保守序列用WebLogo工具作图后如4所示。2. F0X01的过表达和突变对miR-122的转录发挥不同调控作用2. 1瞬时转染F0X01对miR-122转录的影响2. 1. 1F0X01系列表达质粒在Huh7细胞中的有效性鉴定*艮据文献(Biggs, W. H. ,3rd, Meisenhelder, J.，Hunter, Τ.，Cavenee, W. K.， andArden, K. C. (1999). Protein kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclearexclusion of the winged helix transcription factor FKHR1. Proc Natl Acad Sci U S A 96,7421-7426 ；Kamagate, Α. ， and Dong, H. H. (2008). FoxOl integrates insulin signalingto VLDL production. Cell Cycle 7，3162-3170.)，在胰岛素刺激的情况下，野生型F0X01蛋白受胰岛素激活的PII-Akt途径磷酸化后出核，而组成型的F0X01 蛋白因为磷酸化位点的突变而无法被磷酸化出核，始终定位在细胞核内。构建F0X01的野生型表达质粒pEGFP-F0X01-WT和三个磷酸化位点(Thr-M， Ser-253, Ser-316)突变的表达质粒 pEGFP_F0M)l-CA F0X01-WT质粒构建将F0X01基因编码区357bp 2343bp片段经过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到产物后通过上游B10 I位点，下游pst I位点连接到PEGFP-N2载体 (PEGFP-N2:购自clotech公司，货号(Catalog#6081-1))的多克隆位点中。F0X01-CA质粒构建将F0X01基因编码区162bp 2346bp片段经过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到产物后通过上游B10 I位点，下游Kpn I位点连接到PEGFP-N2载体的多克隆位点中，其中F0X01-CA较F0X01-WT对于F0X01的基因编码区有如下括号所对应区域的三个下划线碱基的突变Thr-24 :ACC-GCC (455-457)Ser-253 :TCC-&CC (1151-1153)
Ser-316 :TCA-GCA (1340-1342)将F0X01的野生型表达质粒pEGFP-F0X01-WT和三个磷酸化位点(Thr_24， Ser-253, Ser-316)突变的表达质粒pEGFP-FOXOl-CA及对照质粒pEGFP_N2在肝癌细胞系 Huh7中瞬时转染后66小时加入IOOnM胰岛素，转染后68小时在荧光显微镜下观察。结果如图5所示，加胰岛素的这组细胞里野生型的F0X01有出核现象，而磷酸化位点突变的F0X01 没有出核，说明F0X01表达质粒在Huh7细胞系中可以正常工作。2. 1. 2瞬时转染F0X01质粒后对miR-122转录的影响用Engreen公司的转染试剂Enhancer-D瞬时转染野生型质粒pEGFP-FOXOl-WT与核内组成型质粒pEGFP-FOXOl-CA和对照质粒pEGFP_N2于Huh7细胞系中。完成转染66小时后分为两组，一组加IOOnM胰岛素，另一组不加，两小时后(即转染6 后)用Trizol收集样品提取RNA，进行反转录，后利用miR-122的初始转录本pri-miR-122来检测miR-122 转录情况的变化。这里之所以用初始转录本pri-miR-122来检测miR-122的转录变化，是因为在2009年DavidGatfield和他的同事所做的关于miR-122节律性变化的研究工作中发现，miR-122的初始转录本pri-miR-122和前体pre-miR-122这两种转录的中间产物由于半衰期很短，比成熟本更能真实的反映miR-122的转录情况(如果前两者的半衰期是几分钟，那么后者的半衰期就至少是M小时)。如图6所示，野生型的F0X01使miR-122转录增加，在有胰岛素的情况下，miR-122转录增强的作用更加明显，约为不加胰岛素时的8倍。 而组成型的F0X01使miR-122的转录减少，并且这种减少不受胰岛素的影响。2. 1. 3不同浓度的胰岛素对瞬时转染F0X01质粒后miR-122转录的影响同2. 1. 2方法，在瞬时转染F0X01两种质粒48小时后，分别加入梯度浓度的胰岛素于已转染的细胞Huh7中，两小时后(转染后50h)收集样品提取RNA，反转录后利用 Realtime-PCR检测pri-miR-122的变化，如图7所示。不论胰岛素是何种浓度，核内组成型表达的质粒F0X01-CA都使miR-122的转录水平低于对照；而野生型的F0X01对miR-122 的转录促进作用随着胰岛素浓度的增加而增强，但浓度到达一定阈值后这种作用反而减弱 miR-122的转录。2. 2稳定转染F0X01对miR-122转录的影响在2. 1中瞬时转染F0X01质粒实现过表达后，其中组成型表达F0X01-CA的样品中 F0X01的表达量与野生型F0X01-WT及对照相比高出200多倍(图6A)，这一实验重复了多次均是该结果。那么这种异常高表达F0X01蛋白于核内的条件下，靶基因的改变是生理状态下的情况吗？基于这个问题，发明人后续筛选了 F0X01稳定转染的Huh7细胞克隆，并再次检测了 F0X01的表达情况和对pri-miR-122的转录影响。首先，从Realtime-PCR 结果和 Western blot 结果显示(图 8A)，F0X01-WT 稳定克隆中F0X01自身表达量较对照略有增高，但并不明显；而F0X01-CA稳定克隆中F0X01自身表达量比对照有明显增高，且增高的幅度在生理范围内，此时对靶基因的影响应该更接近真实的情况。在稳定转染F0X01的克隆内，发明人利用Realtime-PCR检测miR-122的初始转录本pri-miR-122的转录情况，如图8B所示，miR-122在F0X01-WT稳定克隆中转录被激活，而在F0X01-CA稳定克隆中转录被抑制。虽然miR-122在两种稳定克隆中的转录变化不显著，但趋势与之前2. 1中的瞬时转染结果一致，即miR-122受野生型表达的F0X01蛋白转录激活作用，而受核内组成型表达的F0X01蛋白转录抑制作用。
3. F0X01调控miR-122转录的机制研究确定miR-122的转录受到F0X01蛋白的调控之后，发明人需要进一步鉴定F0X01 调控miR-122的具体机制。作为转录因子F0X01调控基因表达有两种方式一种是通过结合特异的DNA序列来调控靶基因的转录过程，另一种是作为不依赖DNA结合的核受体的辅因子来起作用。发明人也分别从这个两个方面来鉴定F0X01在miR-122核心启动子区的具体作用模式。3. 1通过截短实验来聚焦F0X01在miR-122上游的相应顺式调控区域发明人选取miR-122成熟本上游约51Λ区域进行短截，并构建了带以下三种片段的报告基因载体从上游_5181bp至-2944bp的片段Del 1，从上游_2944bp至_842bp的片段Del2，从上游-1646bp至+Ibp的片段Del3。然后将它们和带全长51Λ片段的载体分别与F0X01表达质粒共转染细胞，转染M小时后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测，结果如图9所示。首先，相对全长而言，截短片段Dell和Del2均能使报告基因的活性显著增加，截短片段Del3虽然也能部分增加报告基因活性，但增幅不显著，由此可知片段Dell与Del2 比Del3更具有作为启动子区的潜力。这一结论也与发明人之前1. 2中利用生物信息学软件分析miR-122上游51Λ区域的结论一样，即保守的启动子区也位于这个51Λ片段靠前部分。接着考虑F0X01对不同片段的调控作用，与对照相比，在Dell与Del2这两组中，F0X01 仅对Dell的转录激活有抑制作用，而对Del2的转录激活没有影响，也就是说F0X01的调控靶点位于Dell，这也与之前1. 1中UCSC网站预测的位点位置范围一致。同时观察到F0X01对于非保守启动子区的Del3也有一定的转录抑制作用，那么是否F0X01也有调控靶点位于Del3呢？发明人将与F0X01有相同DNA结合结构域的R)x0家族成员F0X03a转染各组细胞后看报告基因表达情况。结果发现，对于F0X01潜在的两个调控靶点Dell与Del3，F0X03a只对Dell的转录激活有抑制作用，而对Del3的转录激活没影响；如果同时共转染F0X01与F0X03a，它们对Dell转录激活的抑制作用比单独转染F0X01 或F0X03a都更显著，与此同时它们的联合也没有对Del3的转录激活起到任何影响。综合分析生物信息学和这一阶段报告基因实验结果，发明人得出结论F0X01最为保守和最能介导其调控功能的靶位点在miR-122成熟本上游-5181bp至_2944bp的约 2kb区域，由此排除了 1. 1中提到的F0M)1两个潜在结合位点中的近端调控位点II。那么接下来，发明人根据生物信息学预测的位点，看能否将F0X01的结合位点精确定位到miR-122 核心启动子区的IRE位点(即1. 1中预测的位点I)。3. 2通过突变实验来精确定位F0X01在miR-122核心启动子区内调控 pri-miR-122转录的结合位点那么在miR-122核心启动子区(成熟本上游_5181bp至_4563bp的618bp)内， F0X01的具体结合位点究竟位于什么地方呢？之前1. 3中利用生物信息学工具rVista2. 0 进行预测得知，F0X01的结合位点在距离miR-122成熟本上游4870bp 的远端调控位点I (chr!8 :54264417-54264430)，其保守的结合序列为agaATTGTTTACTTt，其中红色部分即为IRE (insulin responseelement)元件的基序。于是发明人针对该位点设计了 IRE-mutant的报告基因载体，将其与miR-122正常的启动子报告基因载体分别与F0X01组成型表达载体F0X01-CA共转染Huh7细胞，24小时后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测。如图IOB所示，当miR-122核心启动子区未突变IRE元件时，组成型表达的F0X01 蛋白能显著抑制miR-122启动子对报告基因的转录激活作用；当miR-122核心启动子区突变了 IRE元件时(如图10A)，这种抑制作用将消失，可见F0X01对miR-122启动子区的转录抑制作用是通过I结合IRE元件来实现的。为了进一步说明F0X01通过结合IRE元件调控miR-122启动子的转录，发明人用一种能够阻断三磷酸酰肌醇蛋白激酶(Phosphotidylinsitol-3-Kinase，PI3K)细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂LY^4002来代替F0X01-CA质粒，加到三组报告基因细胞中。得到与表达组成型F0X01蛋白一致的结果，即与对照相比，蛋白激酶抑制剂能使未突变的mir-122启动子的转录激活作用下降，而在突变IRE组则没有这种效应。可见F0X01 通过IRE元件结合并调控miR-122转录的过程受PII-Akt信号转导通路的调控，即在有 LY294002时，内源F0X01被磷酸化出核的途径被阻断了，因此留在细胞核内的F0X01增多， 其通过结合IRE元件对miR-122的转录抑制作用也体现出来，但此时若IRE元件被突变，核内虽然有F0X01蛋白的增多，但无法行使结合并调控miR-122转录的功能。以上均说明，F0X01通过结合mir-122核心启动子区上的IRE元件(上游-4870 至-4856)来抑制miR-122的转录。4. F0X01作为miR-122上游转录因子的体外和体内鉴定那么F0X01蛋白是否具有结合miR-122核心启动子区上IRE元件的能力呢？它在行使功能时在这个位点上是否有结合呢？接下来发明人对F0X01作为miR-122上游的转录因子做了体外的凝胶迁移率实验EMSA来验证F0X01蛋白是否可以在体外与这段特异的DNA 片段结合，并通过做体内的染色质免疫共沉淀实验ChIP来验证生理状态下细胞内的F0X01 蛋白是否能结合这段DNA行使特定的功能。4. 1F0X01作为miR-122上游转录因子的体外实验鉴定发明人利用Pierce的核蛋白提取试剂盒抽提过表达了 F0X01蛋白的Huh7细胞的核蛋白，并设计了两对生物素标记的WT-IRE和Mutant-IRE探针，依照EMSA的protocol进行转录因子结合的体外实验。如图11所示，箭头所指shift带即为F0X01蛋白与含IRE的探针结合的滞后带， 加入F0X01特异抗体后，不论突变还是未突变的探针其3号泳道都显示这条带的消失；如果加冷探针竞争结合核蛋白抽提物，突变与否的探针对应的4号泳道也都显示该条带的减弱或完全消失。另外相对未突变IRE元件的探针，2号泳道中突变IRE后的探针与F0X01结合的特异条带明显减弱了，也证明了这一突变使F0X01蛋白与该特异DNA片段的结合随着特异基序的部分改变而降低。因为推测利用Huh7细胞核蛋白提取物没有出现super shift是由于肝细胞系 Huh7细胞核内有多种相互作用的蛋白复合体，单独的F0X01抗体不足以结合并滞后相互结合的IRE片段与蛋白复合体。故发明人利用试剂盒抽提过表达F0X01蛋白量更大，组成更单一的细胞的核蛋白，来重复上述实验。如图12所示，箭头所指“shift”带即为核蛋白提取物与含IRE的探针结合的滞后带，加入F0X01特异抗体后，未突变的探针其3号泳道显示这条带的减弱，并在这条带位置上方出现两条大小相近的“supershift”带；如果加冷探针竞争结合核蛋白抽提物，未突变的探针对应的4号泳道显示shift带减弱至近乎消失。另外对于突变IRE元件的的这组， 2号泳道中突变IRE后的探针与F0X01几乎没有特异结合的条带，3号泳道中也显示了加入 F0X01抗体后无任何变化，而4号泳道加入冷探针竞争结合核蛋白抽提物后无任何条带。以上体外实验证明，F0X01蛋白在体外可以直接与miR-122核心启动子区的IRE元件结合。4. 2F0X01作为miR-122上游转录因子的体内实验鉴定进一步的，发明人需要在生理条件下原位鉴定Huh7细胞内的F0X01蛋白是否能结合这段DNA行使特定的功能。考虑到功能型F0X01蛋白受多种信号转导途径的影响和调控， 并多数通过出核和入核来行使其生理功能，发明人通过两种营养状态来鉴定这种原位的结合是否存在，这两种营养状态为高营养状态下的含10% FBS的培养基培养M小时(Mn) 和低营养状态下的不含FBS的培养基培养M小时Oht)，同时收取细胞样品，进行ChIP实验。如图13 所示，A 图为 semi-quantity PCR 结果，B 图为 Realtime-PCR 结果。相似的，在高营养状态下培养24小时的Huh7细胞样品Mn中，F0X01抗体特异结合的DNA 片段的量与IgG非特异结合的DNA量基本无差异，而在低营养状态下无血清培养M小时后的样品Mst中，F0X01抗体特异结合的DNA片段信号显著高于IgG组，这一结果用灵敏的Realtime-PCR来检测时差异更明显。可见在完全去除血清后，其中的胰岛素成分激活 PI3K-Akt通路的效应被阻断，F0X01蛋白无法被磷酸化出核，而更多的滞留于细胞核内，也因此增强了结合于miR-122核心启动子区中IRE元件的潜力。以上用体内实验证明了，Huh7细胞在完全去除血清的低营养状态下培养M小时后，内源的F0X01蛋白能增强入核而结合miR-122核心启动子区中IRE元件。为进一步证明这种结合是有功能的，发明人对Huh7细胞进行了从高营养状态 (24η)到低营养状态Oht)再回复到高营养状态培养的过程。即模拟去除胰岛素又回复胰岛素的效应。结果如图14所示，A图可见F0X01在miR-122启动子区的结合的确是随着营养状态的改变而改变，即在去除胰岛素激活的磷酸化途径时，F0X01与IRE的结合增多，而在回复含有胰岛素的血清12小时后这种结合完全消失了。有趣的是，此时检查之前本室李振亚博士鉴定的miR-122转录因子HNF4在 miR-122核心启动子区的结合位点，发现检测该位点所使用的ChIP引物扩增片段中包含了 F0X01结合的IRE元件。于是使用HNF4特异抗体做针对其结合位点的ChIP实验，结果如图 14B所示，血清剥夺后的低营养状态下HNF4在IRE元件附近的结合有微弱的减少趋势但不显著，然而当从低营养状态回复到高营养状态后，HNF4在该区域的结合显著增多。4. 3F0X01和HNF4在miR-122核心启动子区上相同区域的结合呈互逆状态由于在不同营养状态下检测有着相同区域靶位点的转录因子F0X01与HNF4的结合情况时发生了有趣的互逆情况，发明人要进一步确证这种互逆的状态是由于营养状态改变时体内第三方改变的效应还是F0X01与HNF4对相同区域的结合相互拮抗引起的。于是发明人首先利用RNA干扰技术敲低了 HNF4在细胞内的表达，并用ChIP实验检测在对其表达进行干扰后HNF4自身在mir-122核心启动子区的结合是否降低。如图15，首先A图和B图通过RT-PCR和Western blot两种方法分别从mRNA水平和蛋白水平验证了 Huh7细胞中的确实现了 HNF4的干扰。接下来，图C中也用ChIP实验证明了与对照株相比，干扰细胞株中HNF4蛋白在miR-122核心启动子区上的结合的确显著减少。此时图D显示了 F0X01在与HNF4同样区域的结合显著增多了。可见，HNF4在该区域结合的减少是导致F0X01在该区域结合增多的直接原因。然后反过来，发明人改变F0X01的表达状态，在Huh7细胞中进行F0X01的过表达， 并用ChIP实验检测过表达后F0X01自身在miR-122核心启动子区的结合是否增高。如图16所示，A图和B图通过RT-PCR和Western blot两种方法分别从mRNA水平和蛋白水平的来验证了 Huh7细胞中的确实现了 F0X01的过表达。接下来，图C中也用ChIP 实验证明了与对照株相比，过表达组成型质粒F0X01-CA细胞株中的F0X01蛋白在miR-122 核心启动子区上的结合的确比其余两组细胞株多。此时图D显示了 HNF4蛋白在与F0X01 蛋白同样区域的结合显著减少了。可见，F0X01在该位点结合的增多是导致HNF4在该位点结合减少的直接原因。综合以上两个方面的结果，更进一步确证了 F0X01和HNF4在miR-122核心启动子区上相同区域的结合呈拮抗状态。
权利要求
1.转录因子F0X01在制备调控人肝脏特异性小RNAmiR-122的制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的转录因子F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件结合。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的IRE元件的序列为SEQID NO :1。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的转录因子F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件的结合受到营养状态的调节。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件的结合以及HNF4对该位点的结合是互逆的。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的转录因子F0X01与miR-122核心启动子区的IRE元件的结合受到HNF4对该位点的结合的竞争。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于转录因子F0X01对人肝脏特异性小 RNAmiR-122的调控受到胰岛素的调节。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的胰岛素的浓度为ΙΟηΜ。
全文摘要
本发明涉及转录因子FOXO1调控人肝脏特异性小RNA miR-122的用途。发明人的实验数据证明FOXO1可作为miR-122新的调节因子，通过结合到miR-122核心启动子区的IRE位点来调控miR-122初始转录本的转录，从而可参与miR-122的功能的调节。这种调节受营养状态密切相关的信号通路的影响，同时也受到HNF4对该位点的结合的竞争，可最终参与到脂代谢的精细调控过程中。
文档编号A61K38/17GK102309742SQ20101022180
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者习杨, 刘德培, 吕湘, 曾超, 朱文楠, 李振亚 申请人:中国医学科学院基础医学研究所