专利名称：一种线性多肽及其合成方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗菌肽领域，具体涉及一种线性多肽及其合成方法和应用。
背景技术：
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽。传统抗生素类药 物一般而言，其抗菌谱一般较窄且通常只对细菌有效，对真菌、病毒等病原体无效且易产生 耐药性；抗菌肽则不仅具有高效、广谱的抗菌活性，而且具有潜在的抗病毒、抗肿瘤活性、不 易产生耐药性等缺点。因此抗菌肽在生物医学、药学、免疫学等许多方面有着光明的发展前 景。迄今为止，已经从动物、植物、微生物和人体上发现超过300多种抗菌肽。Loloatins抗菌肽家族包含4个成员，即Loloatin A、B、C和D，它们是在实验室 条件下由采集于巴布亚新几内亚南部海滩沿岸大堡礁上的海洋微生物的发酵液中分离出 来的一类环十肽抗菌素。研究发现，该家族中的Loloatin C[结构式为CyCl0-(-L-Val-L -Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Trp-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Trp)]不仅对革兰氏阳性菌(G+) 表现出和tyrocidine C—致甚至更好的抗菌活性，还对革兰氏阴性菌(G)Escherichia coli 表现出明显的抗菌活性(Gerard, J. Μ.，etal. J. Nat. Prod. 1999，62，80-85)。Chen 随 后的研究发现Loloatin C的药核结构为-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，即该四肽序列结构对 Loloatin C抑菌活性的发挥起着关键的作用(Chen H. Preparation and Evaluation of the Loloatins and Their Analogues. Ann Arbor, Mich :UMI,2003)o研究结果表明，抗菌肽是通过破坏细菌细胞膜的完整性从而使得膜的穿透性增 力口而杀死细菌(Ghadiri，M. R. et al. ，Nature, 2001,412 452-455 ；Zasloff, M. ，Nature, 2002,415 :389-395)。因此，利用计算机辅助药物设计技术，以Loloatin C的药核结构作为 模板，设计具有更多正电性和α-螺旋结构的多肽，将是寻找具有更强抗菌活性的抗菌肽 的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的抗生素类药物中存在的抗菌谱较窄，统称只对细菌 有效、对真菌和病毒等病原体无效且易产生耐药性的缺点，提供一种高效、广谱、不易产生 耐药性的线性多肽。本发明另一目的在于提供上述线性多肽的合成方法。本发明还有一个目的在于提供上述线性多肽的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现本发明线性多肽是在对来自海洋微生物代谢物Loloatin C抗菌药核序列结构研 究的基础上，以计算机辅助药物设计技术为工具设计合成的。其中，-Α1-Α2-Α3-Α4-为线性 多肽的核心结构，也即是Loloatin C的药核结构。作为一种优选方案，所述Al为L-Tyr或D-Tyr ；所述Α2为L-Pro、D-Pro、L-Piρ或 D-Pip ；所述 A3 为 L-Trp 或 D-Trp ；所述 Α4 为 L-Phe 或 D-Phe。
本发明线性多肽可以分别在N-端和C-端进一步延伸，结构式为 H-Al 〃 -Al' -A1-A2-A3-A4-A4' -0H。其中，所述 Al'为 L-Leu 或 L-Orn 中的一种或缺失； 所述Al 〃为L-Asp ；所述A4'为L-Asn。本发明线性多肽的合成方法是采用固相多肽合成法，可以采用手工操作制备，也 可以采用自动化操作制备，比如利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制 备。作为一种优选方案，所述线性多肽的具体合成步骤为氨基酸的装配从C端到N 端逐个进行，由人工控制或合成仪设定自动控制。首先称取0. Immol结合了第一个氨基酸 即Asn的Wang树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)，装柱，用20%体积比的二氯甲烷 (DCM) 二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，然后用30%体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱 保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸溶于三吡咯基膦氧 苯骈三唑六氟合磷盐(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的 溶液上柱循环偶合反应30 60min，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤 直到制备结束。制备完成后，抗菌肽经如下步骤从树脂上剪切取下反应后的树脂肽，加入 切肽试剂，一般为95%三氟醋酸，2. 5%二氯甲烷，2. 5%三乙基硅烷，室温反应2h，过滤，滤 液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得抗菌肽粗品。抗菌肽粗品的纯化一般采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0. 三 氟醋酸水溶液，收集洗脱峰，冷冻干燥，产品经质谱分析鉴定。抗菌肽的序列结构及产率见 表1。表1抗菌肽的结构及产率
本发明线性多肽可以用于制备抗菌药，特别是用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰 氏阴性菌感染的药物。利用96孔板法检测抗菌肽的抗菌活性，并以预先合成的天然抗菌肽Loloatin C为对照，进行抗菌活性检测。结果表明，本发明所设计合成的线性抗菌肽HR-I 保留了 Loloatin C的抗菌活性，线性抗菌肽HR-3和HR-5保留了一定程度的抗菌活性，线 性抗菌肽HR-I，HR-3，HR-5都具有显著的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作用。此外，本发 明还检测了合成抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本 发明所涉及的合成抗菌肽的溶血毒性很小。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明线性多肽用于制备抗菌药物，特别是治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性 菌感染的药物时，具有高效、广谱、不易产生耐药性的优点，其中线性多肽HR-1、3和5对革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抗菌作用；(2)实验证实，本发明线性多肽的溶血毒性很小，对人体的毒副作用较小；(3)本发明线性多肽的制备方法反应条件温和、容易自动化、操作简便安全、产品 纯度高、总收率高。
图1为线性多肽HR-I的质谱图。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1抗菌肽HR-I的制备及分离纯化抗菌肽HR-I的氨基酸序列见表1。本实施例采用固相多肽合成法。具体步骤如下氨基酸的装配从C端到N端逐个 进行，由人工控制。首先称取0. Immol结合了第一个氨基酸即Asn的Wang树脂(购自吉尔 生化(上海)有限公司)，装柱，用20%体积比的二氯甲烷(DCM) 二甲基甲酰胺(DMF)溶液 溶胀30min，然后用30%体积比的哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护基(Fmoc)，DMF清洗3次。 将9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸即Fmoc-D-Phe-OH溶于三吡咯基膦氧苯骈三氮唑六 氟合磷(PyBOP)，羟基苯骈三唑(HOBt)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液上柱循环 偶合反应30 60分钟，DMF清洗3次；重复以上脱保护、偶合反应、清洗等步骤，依次偶合 Trp，Pro, D-Tyr 和 Asp,制备结束。制备完成后，抗菌肽HR-I经如下步骤从树脂上剪切取下反应后的树脂肽，加入 切肽试剂(其成分为95%三氟醋酸，2. 5%二氯甲烷，2. 5%三乙基硅烷)，室温反应2h，过 滤，滤液在室温下用旋转蒸发仪蒸除易挥发溶剂，加少量水，冷冻干燥得抗菌肽HR-I粗品。抗菌肽HR-I粗品的纯化采用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脱液为甲醇-0. 三 氟醋酸水溶液，采用梯度洗脱，收集各洗脱峰馏分，室温下旋转蒸发除去甲醇，水溶液经冷 冻干燥，得20. 2mg抗菌肽HR-I纯品，产率为24%。产品经质谱分析鉴定抗菌肽HR-I的 理论分子量M值为840. 88，质谱图1中显示的分子量为841. 4，为[M+H]+峰。实施例2合成抗菌肽的抗菌活性检测以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品鉴定所。采用96孔板法对合成的抗菌肽的抗菌活性进行检测，具体步骤是将菌种复苏， 接种斜面37°C培养过夜，挑菌体于MH培养基中，37°C培养过夜，稀释菌液使其浓度为IO4
5105CFU/ml，按每孔100 μ 1菌液接种于96孔板中，随后将多肽按一定比例稀释后，每孔中加 入10 μ 1，将96孔板置于37°C培养过夜，酶标仪检测OD57tl值。检测结果列于表2。含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD57tl)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度(OD57tl)的 差值相比于后者的比值若大于90%时，其抗菌肽浓度即近似等同于最小抑制浓度(MIC)。 MIC被定义为显著抑制细菌生长的最低浓度。表2五种抗菌肽对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC) 表2中，MIC值越小，表示线性抗菌肽的抗菌能力越强。实施例3体外溶血活性检测本实施例用于检测合成线性抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，使用的血样取于正 常人血。具体的检测步骤是人血红细胞经PBS缓冲溶液(35mM磷酸缓冲液/0. 15mol/L NaCl, pH 7.0)洗涤，取100 μ 1的8%人血红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100 μ 1抗 菌肽溶液，37°C摇荡Ih后，1500rpm离心5min，转移100 μ 1上清液于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm波长下的吸收。阳性对照采用0. 1% Triton X-100,阴性对照采用PBS。 检测结果列于表3。表3五种抗菌肽的溶血活性
溶血率(％) 表3中抗菌肽的溶血率值越小，表示其溶血毒性越小。
权利要求
一种线性多肽，其特征在于所述线型多肽包含Loloatin C的药核序列结构 A1 A2 A3 A4 。
2.根据权利要求1所述的线性多肽，其特征在于所述Al为L-Tyr或D-Tyr。
3.根据权利要求1所述的线性多肽，其特征在于所述A2为L-Pro、D-Pro,L-Pip或 D-Pip。
4.根据权利要求1所述的线性多肽，其特征在于所述A3为L-Trp或D_Trp。
5.根据权利要求1所述的线性多肽，其特征在于所述A4为L-Phe或D_Phe。
6.根据权利要求1所述的线性多肽，其特征在于所述多肽分别在N-端和C-端进一步 延伸，结构式为 H-Al “ -Al' -A1-A2-A3-A4-A4' -OH0
7.根据权利要求6所述的线性多肽，其特征在于所述Al'为L-Leu或L-Orn中的一种 或缺失。
8.根据权利要求6所述的线性多肽，其特征在于所述Al"为L-Asp。
9.根据权利要求6所述的线性多肽，其特征在于所述A4'为L-Asn。
10.权利要求1 9中任意一条权利要求所述线性多肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革 兰氏阴性菌感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种线性多肽及其合成方法和应用。本发明线型多肽包含了Loloatin C药核序列结构，即包含了Tyr、Pro、Trp和Phe的序列片段，四个氨基酸残基为L-构型或D-构型。本发明线性多肽是采用固相合成法合成得到的，总收率为25～55％。本发明线性多肽的合成方法具有反应条件温和、容易自动化、操作简便安全、产品纯度高、总收率高的优点，合成的线性多肽可以用于制备抗菌药物，特别是治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。
文档编号A61K38/08GK101906149SQ20101022653
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者杨炀, 江振友, 陈河如 申请人:暨南大学