专利名称：一种低温木聚糖酶xyngr40及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温木聚糖酶XYNGR40及其 基因和应用。
背景技术：
半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是陆生植物中继纤维素之后含量最丰富的 碳水化合物，约占植物干重的35%。其中木聚糖是半纤维素中的代表性组分，是自然界中含 量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews. 2005，29 :3_23·)。瘤胃是反刍动物复胃的组成部分之一，而瘤胃微生物则是指栖息在瘤胃中的微 生物，主要包括细菌，真菌和原生动物，经过长期进化，瘤胃细菌能分泌多种糖苷水解酶， 对各种多聚糖有较强的降解能力，以提高食物中营养成分的利用效率(Flintand Bayer. Annals ofthe New York Academy of Sciences. 2008，1125 :280_288.)。故瘤胃微生物 纤维素酶在降解纤维素、半纤维素、开发新饲料，食品加工等方面有广阔的应用前景。对植 物细胞壁的降解是微生物获取营养的第一步，需要多种纤维素酶和半纤维素酶的共同作 用。饲料中含有多种多聚糖，在饲料中添加木聚糖酶，可显著降低消化道中的食糜粘度，提 高动物内源性消化酶活性地发挥，其酶解产物还具有调节动物肠道微生态环境、降低动物 结肠炎的发生率和减少抗生素等兽药用量的功效(Beg et al. Applied Microbiology and Biotechnology. 2001,56 :326_338)。低温木聚糖酶由于其在低温环境中具有较高的酶活，相对于中温或高温木聚糖酶 有其特有的应用优势(Gerday et al. Trends Biotechnology. 2000，18 103-107)。比如水 产动物由于水体环境影响其肠道温度偏低，因此低温木聚糖酶更适合作为水产饲料添加剂 使用以提高养殖鱼类对饲料中营养成分的吸收。同时，在食品工业中，低温木聚糖酶与果胶 酶及纤维素酶同时在低温作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味。因此开发新型的 低温木聚糖酶将对推动木聚糖酶在各种工业中应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的低温木聚糖酶。本发明的再一目的是提供编码上述低温木聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述低温木聚糖酶的基因工程方法。本发明的另一目的提供上述低温木聚糖酶的应用。本发明提供了一种低温木聚糖酶XYNGR40，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。Mkkrilsvltvplsmcaamsaqglkdaykdyfkigvavnnrnvadpdqikvvlrefnsitaeriamkpqp tepkkgefnwedadkiadfcrangikmrghtlmwhsqigswmyqdekgnlIskeefyanmkhhiqaivnrykdvvyc
3wdvvneavadspvypgrpelrnspmyqiageefiykafeyaheadpdalIfyndyndaepaksqriynlvkrmkdag vpidgigmqahynvygptmkevddaiklystvvdhihlteldirinedmggglrfnqgqatvsdwertlqqdqyvql fkvlrkhkdvidcvtfwnvsdkdswlgvrnypllfdenykpkqaynavknfdpkmdnaviledfkpselnqpgqeyp mvnsqgyarfkvnapkatsvivslglggsggtvlhkaedgswmgttdgpmdegfhyyhltidggvfndpgtnnyygs trwesgieipahdadfyamknvphgnv该酶包括481个氨基酸，N端21个氨基酸预测为信号肽序列。因此，成熟的木聚糖酶XYNGR40的序列如SEQ ID NO. 2所示。qglkdaykdyfkigvavnnrnvadpdqikvvlrefnsitaenamkpqptepkkgefnwedadkiadfc rangikmrghtlmwhsqigswmyqdekgnlIskeefyanmkhhiqaivnrykdvvycwdvvneavadspvypgrpe Irnspmyqiageefiykafeyaheadpdallfyndyndaepaksqriynlvkrmkdagvpidgigmqahynvygp tmkevddaiklystvvdhihlteldirinedmggglrfnqgqatvsdwertIqqdqyvqlfvlrkhkdvidcvtf wnvsdkdswlgvrnypllfdenykpkqaynavknfdpkmdnaviledfkpselnqpgqeypmvnsqgyarfkvna pkatsvivslglggsggtvlhkaedgswmgttdgpmdegfhyyhltidggvfndpgtnnyygstrwesgieipah dadfyamknvphgnv信号肽序列为Mkkrilsvltvplsmcaamsa (SEQ ID NO. 3).本发明提供了编码上述低温木聚糖酶的基因XynGR40，具体地，该基因的基因组序 列如SEQ ID NO. 4所示。ATGAAAAAAAGAATTCTTAGTGTATTGACAGTACCGCTGTCAATGTGTGCAGCAATGTCCGCGCAGGGT CTGAAGGATGCCTACAAGGACTACTTCAAGATCGGTGTCGCCGTCAACAACCGCAACGTCGCGGATCCTGACCAGAT CAAGGTCGTCCTCCGCGAGTTCAACAGCATCACCGCCGAGAACGCGATGAAGCCCCAGCCGACCGAGCCCAAGAAGG GCGAGTTCAACTGGGAGGACGCCGACAAGATCGCGGACTTCTGCCGCGCCAACGGCATCAAGATGCGTGGCCACACC CTGATGTGGCACAGCCAGATCGGCTCCTGGATGTACCAGGACGAGAAGGGCAACCTCCTCTCCAAGGAGGAGTTCTA CGCCAACATGAAGCACCACATCCAGGCCATCGTGAACCGCTACAAGGATGTCGTGTACTGCTGGGACGTGGTCAATG AGGCCGTCGCCGACAGCCCCGTGTACCCGGGC CGTCCGGAGCTCCGCAACTCCCCGATGTACCAAATCGCCGGTGA GGAGTTCATCTACAAGGCTTTCGAGTACGCCCACGAGGCCGACCCGGACGCCCTCCTCTTCTACAACGACTACAATG ACGCCGAGCCCGCCAAGAGCCAGCGCATCTACAACCTCGTCAAGCGCATGAAGGACGCCGGCGTGCCTATCGACGGT ATCGGCATGCAGGCCCACTACAACGTGTACGGCCCGACGATGAAGGAAGTGGACGACGCCATCAAGCTCTACTCCAC GGTCGTGGACCACATCCACCTCACCGAGCTGGATATCCGCATCAACGAGGACATGGGCGGCGGTCTCCGCTTCAACC AGGGCCAGGCCACGGTCTCCGACTGGGAGCGCACCCTGCAGCAGGACCAGTATGTCCAGCTCTTCAAGGTGCTCCGC AAGCACAAGGACGTGATCGACTGCGTCACCTTCTGGAATGTCTCCGACAAGGATTCCTGGCTGGGCGTGCGCAACTA CCCGCTCCTCTTCGACGAGAACTACAAGCCCAAGCAGGCCTACAACGCCGTCAAGAATTTCGATCCCAAGATGGACA ACGCCGTGATCCTCGAGGACTTCAAGCCGTCTGAGCTCAACCAGCCCGGCCAGGAGTACCCGATGGTCAACTCCCAG GGCTACGCCCGCTTCAAGGTCAACGCCCCCAAGGCTACGTCCGTGATCGTCAGCCTCGGTCTCGGCGGTTCCGGCGG CACCGTCCTCCACAAAGCCGAAGACGGCTCCTGGATGGGCACCACCGACGGACCGATGGACGAGGGCTTCCACTACT ATCACCTCACCATCGACGGCGGCGTGTTCAACGACCCCGGCACCAACAACTACTACGGCTCCACCCGTTGGGAGAGC GGTATCGAGATCCCGGCCCACGACGCCGACTTCTATGCTATGAAGAACGTTCCTCACGGCAATGTGTGA其中，信号肽的基因序列如SEQ IDN0. 5所示。atgaaaaaaa gaattcttag tgtattgaca gtaccgctgt caatgtgtgc agcaatgtccgcg本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶xynGR40的重组载体，优选为pET22b-xynGR40o本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶xynGR40的重组菌株，优选所述菌株为大 肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。本发明还提供了一种制备低温木聚糖酶XYNGR40的方法，包括以下步骤1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNGR40。本发明还提供了上述低温木聚糖酶XYNGR40的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良 的、适合于在水产饲料、食品工业中应用新的木聚糖酶。本发明获得一种低温木聚糖酶 XYNGR40，最适pH6.5。这些性质符合水产动物消化生理特点，能提高饲料消化能和代谢能， 降低配方成本，减少环境污染。此低温木聚糖酶的理论分子量为52. 4kDa。该木聚糖酶XYNGR40的最适pH为 6. 5，在pH5. 0 7. 5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶在pH 4. 0-8. 0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50%以上，这说明此酶 具有较好的PH稳定性。本发明还提供了编码上述低温木聚糖酶XYNGR40的基因xynGR40。 本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因xynGR40，DNA全序列分析结 果表明，木聚糖酶XYNGR40结构基因xynGR40全长1446bp编码481aa和一个终止密码子， N端21个氨基酸预测为信号肽序列。蛋白理论分子量为52. 4kDa，等电点为5. 24，中间为 一个第十家族的催化结构域，末端为E set超家族结构域。在GenBank中的比对结果表明 它与做过功能验证的来自于Prevotella ruminicola 23的低温木聚糖酶的最高一致性为 57%，表明XYNGR40是一个新的木聚糖酶。通过进化树的构建，利用临位相接法构建的进化 树(MEGA 4.0)，选取得序列包括XynGR40的蛋白序列以及它的相似性比较高的木聚糖酶蛋 白序列和六个低温木聚糖酶序列。来自于Thermotoga lettingae TMO的极端嗜热酶序列 作为进化树的根。发现直接从瘤胃微生物宏基因组DNA克隆得到的与瘤胃和人肠道来源的 细菌处在一个分枝上，表明该基因为一个细菌来源的木聚糖酶基因。本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组载体，优选为pET22b-xynGR40。将 本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可 操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将木聚糖酶 基因插入到质粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒 pET22b-xynGR40o本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株BL21/ xynGR40，其保藏编号为 CGMCC No. 4023。本发明还提供了一种制备低温木聚糖酶的方法，包括以下步骤1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；3)回收并纯化所表达的木聚糖酶。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21/xynGR40。本发明还提供了上述低温木聚糖酶的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、食品工业中应用新的木聚糖酶。低温木聚糖酶在室温有非常高的活性，因其 不需要外加能量供酶促反应，所以在工业和农业上的应用可以节省大量的能源。本发明的 木聚糖酶最适pH为6. 5，在pH4 10都有较高的酶活性；在低温下有很高的催化活性，催 化效率要比其它的低温木聚糖酶高；比活高比已知的细菌来源的其它低温木聚糖高2-7 倍；同时在中温条件下的热稳定性要好30°C放置一个月酶活几乎不变，而其它的低温酶 在30°C的热稳定性很差，限制了其应用。因此本发明的低温木聚糖酶可作为水产饲料添加 剂使用，降低饲料的黏度，增加营养物质的吸收。同时此酶可与果胶酶、纤维素酶在低温下 共同用于果汁的澄清。在面包的发酵过程中添加低温木聚糖酶(面包发酵一般在20°C度左 右)可以改善面包的品质，增加面包的口感。此酶的对各种来源的木聚糖的降解产物主要 是木糖和木二糖，木糖和木寡聚糖在食品行业中广泛地作为增稠剂、脂肪代替物和抗冻食 品添加剂，同时在制药工业中与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。
图1 在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白 质Marker ；1 诱导的含有空载体的大肠杆菌培养上清液；2 未诱导的含有木聚糖酶基因载 体的大肠杆菌培养上清液；3 诱导的含有木聚糖酶基因的大肠杆菌培养上清液浓缩液；3 通过镍柱纯化的达到电泳纯的XynGR40蛋白。图2 重组木聚糖酶的最适pH。图3 重组木聚糖酶的pH稳定性。图4 重组木聚糖酶的最适温度。图5 重组木聚糖酶的热稳定性。重组大肠杆菌菌株大肠埃希氏菌XynGR40 (Escherichia coli)(保藏编号 CGMCCNo. 4023，保藏日期2010年7月20日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，100101)。
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3)购自于 Novagen 公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公 司。燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚，PNPC(邻硝基苯基-beta-D-纤维二糖)， pNP-xyloside (邻硝基苯基-beta-D-木糖)，大麦β -葡聚糖、羧甲基纤维素钠、微晶纤维 素购自Sigma公司，其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(I)LB 培养基(g/Ι)酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 10. 0，ρΗ7· 0。(2)平板筛选培养基(g/1)酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10. 0，琼脂15. 0， ρΗ7· 0。
6
4、瘤胃液瘤胃液取自三岁雄性的内蒙古波尔山羊。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。实施例1瘤胃微生物宏基因组DNA的提取瘤胃液取自三岁雄性的内蒙古波尔山羊，首先将采取的瘤胃液在4 °C下 17，OOOXg高速离心30分钟以收集瘤胃微生物菌体。然后将离心得到的沉淀(含有微生 物)在研钵中液氮研磨成粉末，按照Brady (2007)提供的方法进行宏基因组DNA的提取。将 提取得粗D N A进行琼脂糖凝胶电泳，把含有D N A的胶块切下用试剂盒纯化备用。实施例2山羊瘤胃来源的木聚糖酶编码基因xynGR40的克隆根据第十家族木聚糖酶基因的保守(YDWDVVNE和DGIGMQSH)序列设计合成了简并 引物 XlO-F 禾口 XlO-R XlO-F 5' -CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA-3‘；XlO-R 5' -GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT-3‘ (Wang et al. ,2010)以上述的瘤胃微生物宏基因组总DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为 94°C变性5min ；94°C变性30sec，56-50°C退火30sec, 72°C延伸lmin，10个循环(每个循环 降落0. 5°C )，然后94 V变性30sec，50 V退火30sec，72 V延伸lmin，30个循环，72 V保温 IOmin0得到一约260bp片段，将该片段回收后与pEASY_T3载体相连送三博生物技术有限 公司测序。根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各四条mTAIL-PCR特异性引物设 计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧， sp4位于sp3的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退 火温度在 63°C。并将它们分别命名为 GR40-uSPl，GR40_uSP2，GR40_uSP3，GR40_uSP4，(上 游特异性引物)；GR40-dSPl，GR40-dSP2，GR40-dSP3，GR40-dSP4(下游特异性引物)见表1。 按照改进的TAIL-PCR(Huang et al. ,2010)中的程序对两端侧翼序列进行扩增。表1.木聚糖酶XynGR40mTAIL_PCR特异性引物 通过改进的TAIL-PCR (Huang et al.，2010)得到已知基因序列的侧翼序列，扩增 得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。通过序列拼接获得该片段的上下游侧翼序 列，全序列共长1. 8kb，找到一个完整的开放阅读框(ORF)。木聚糖酶基因xynGR40 (GenBank accession no. HM156498)由1446个碱基组成，编码481个氨基酸和一个终止密码子，在 GenBank中的比对结果表明它与来源于Bacteroides eggerthiiDSM 20697的假想木聚糖 酶基因全序列相似性为72%，其次是来源于Bacteroidesintestinalis DSM 17393的木聚 糖酶基因，相似性为69%，与做过功能验证的来自于Prevotella ruminicola 23的低温木 聚糖酶的最高一致性为57%。xynGR40编码蛋白预计分子量为52. 4kDa，等电点为5. 24。 经预测，XYNGR40前21个氨基酸为信号肽序列，中间为一个第十家族的催化结构域，末端为 E set超家族结构域。通过进化树的构建，发现直接从瘤胃微生物宏基因组DNA克隆得到的与瘤胃和人 肠道来源的细菌处在一个分枝上，表明该基因为一个细菌来源的木聚糖酶基因。实施例3重组木聚糖酶的制备。将表达载体pET22b(+)进行双酶切(NcoI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因 xynGR40双酶切(NcoI+NotI)，切好的编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET22b (+)连接，获得含有木聚糖酶基因xynGR40的重组质粒pET22b-XynGR40并转化大肠杆菌 BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/xynGR40(保藏编号CGMCCNo. 4023，日期2010年 7月20日，保藏地址中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC)。取含有重组质粒的BL21菌株，接种于3mL LB (100 μ g/mL的氨苄青霉素)培养液 中，37°C培养过夜。接菌于20mL LB (加有100 μ g/mL的氨苄青霉素)，37°C振荡培养约 2 3h (OD600达到0. 6)后加入终浓度0. 8mmol/L的诱导剂IPTG，30°C 180rpm震荡培养12h。 12000rpm离心5min，收集培养基上清。DNS法测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达 量为45. 6U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达。所 表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95%以上。实施例4重组木聚糖酶的活性分析DNS法具体方法如下在pH6. 5，60°C条件下，ImL的反应体系包括100 μ L适当的 稀释酶液，900 μ L底物，反应lOmin，加入1. 5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm 测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出Iymol还原糖的酶量。实施例5重组木聚糖酶XYNGR40的性质测定1、重组木聚糖酶XYNGR40的最适pH和pH稳定性的测定方法如下将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。 底物木聚糖用不同PH的0. lmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中30°C下进行木聚糖酶活力 测定。结果(图2)表明，XYNGR40的最适pH为6. 5，在pH5. 0 7. 5的范围内，酶活性均维 持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37°C处理60min，再 在PH6.5缓冲液体系中30°C下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，木聚糖 酶在pH 4.0-8.0之间均很稳定，在此？!1范围内处理601^11后剩余酶活性在50%以上，这 说明此酶具有较好的PH稳定性。2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6. 5)缓冲液体 系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在 30°C下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为30°C。酶的 热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在45°C时稳定性非常好。50°C下保温60min，剩余酶活 性为25%，551处理51^11酶活全部丧失。3、木聚糖酶的Km值测定方法如下用不同浓度的三种木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6. 5)缓冲液 体系中，分别在4和30°C下测定酶活性，计算出km值。经测定，XYNGR40对三种木聚糖底物 在4和30°C的动力学常数如表2.表2.木聚糖酶XYNGR40对三种底物的动力学常数
9SubstrateTemperature「maxKmkcat众cat/Km(0C)(μηιο mirfi mg_1)(mg mL_1)(S-1)(mL S-1 mg"1)山毛榉木聚糖30674.11.8584324.64141.92.212354.9桦木木聚糖30647.93.2562175.44128.33.611130.8燕麦木聚糖30884.74.6767163.74173.84.715132.14、不同金属离子化学试剂对XYNGR40酶活的影响测定如下在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为l，5mmol/L。在30°C、pH6. 5条件下测定酶活性。结果(表3) 表明，Zn2+、Na+、Ca2+在高浓度和低浓度时对酶活都有轻微的促进作用，浓度高时促进作用稍 有升高；Cr3+、Cu2+、Mn2+在低浓度时对酶活抑制不强，但随着浓度的升高，其作用转变为大幅 度的抑制；SDS对酶活的抑制随浓度增加而加强；EDTA在高浓度下都会轻微的抑制酶活；而 Co2+和β -Met的促进作用在高浓度时得到更好的体现；重金属离子Hg2+、Ag+和pb2+在低浓 度时即可强烈抑制酶活，高浓度时甚至会出现沉淀现象。其它离子对该酶的作用不明显。表3.各种化学试剂对木聚糖酶XYNGR40活力的影响离子和化学试相对剩余活力(％)° 离子和化学试剂相对剩余活力(％广 注“_”代表无法检测。5、重组木聚糖酶XYNGR40的底物特异性。该酶除了可作用于不同来源的木聚糖，对pNPC(邻硝基苯基-beta-D-纤维二糖) 也具有微弱的活性，但对于大麦葡聚糖、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素等由葡萄糖聚合 而成的底物没有活性(表3)。此外，该酶对pNP-xyloside (邻硝基苯基-beta-D-木糖)也 没有活性，说明该酶不具有木糖苷酶的活性。表3.木聚糖酶XYNGR40底物特异性分析 6、木聚糖酶XYNGR40降解燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖产物的分析如 下在500 μ L 0.2%的木聚糖底物(燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖)中加 入6. 5U(IOOyL)纯化的酶液，最适温度30°C下保温12h。用3kD的超滤管去掉酶蛋白，上 清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产 物中糖种类的分析。分析结果表明木聚糖酶XYNGR40降解的三种底物的产物主要是木糖， 木二糖，降解燕麦木聚糖产物中木糖含量为31. 6%，木二糖含量为57. 2%;降解桦木木聚糖 的产物中木糖含量为28. 8%，木二糖含量为61. 3% ；降解山毛榉木聚糖的产物中木糖含量 为28. 9，木二糖含量为62. %。
权利要求
一种低温木聚糖酶XYNGR40，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的低温木聚糖酶XYNGR40，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—种低温木聚糖酶基因xynGR40，其特征在于，其编码权利要求1或2所述的低温木 聚糖酶XYNGR40。
4.如权利要求3所述的低温木聚糖酶基因xynGR40，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4。
5.如权利要求3所述的低温木聚糖酶基因XynGR40，其特征在于，所述低温木聚糖酶基 因xynGR40的信号序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.包含权利要求3或4所述低温木聚糖酶基因xynGR40的重组载体。
7.包含权利要求3或4所述低温木聚糖酶基因xynGR40的重组菌株。
8.如权利要求7的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌 或乳酸杆菌。
9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组大肠杆菌菌株 BL21/xynGR40，其保藏编号为 CGMCC No. 4023。
10.权利要求1或2所述低温木聚糖酶XYNGR40的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温木聚糖酶XYNGR40及其基因和应用。本发明提供了一种来源于瘤胃的低温木聚糖酶XYNGR40，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因组编码基因xynGR40。本发明的木聚糖酶的具有以下性质最适pH6.5，最适温度30℃，较好的pH稳定性和在低温下具有较高活性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于水产饲料、食品工业等。
文档编号A61K47/42GK101921739SQ20101023856
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者史秀云, 姚斌, 孟昆, 杨培龙, 柏映国, 王亚茹, 王国增, 石鹏君, 罗会颖, 袁铁铮, 黄火清 申请人:中国农业科学院饲料研究所