专利名称：犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒i型三联活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及兽用三联活疫苗，尤其涉及犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒I型三联 活疫苗及其制备方法，属于兽用三联活疫苗领域。
背景技术：
犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒是当前对我国养犬业危害严重的3种病毒性传染 病。犬瘟热是一种犬类等动物的急性传染病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动 物可呈慢性持续性感染，临诊以双相热型、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫肿胀为主要特 征。该病自1926年被发现以来几乎呈世界性分布，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业 和野生动物保护业危害最大的疾病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，经济损失惨 重。近年来，包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的 称猴属和鳍足目海豹科等多种动物均有CD自然发病的报道，甚至人也有CDV感染的病例， 并且CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害也越来越大(蔡宝祥.家畜传 染病学(第三版)·北京中国农业出版社.2001,347-351.)。犬细小病毒于1978年首次被发现后(AppelM J, Scott Fff, CarmichaelL E.Isolation and immunization studies of a canine parco-like virus from dogs with haemorrhagic enteritis. Vet Rec，1979，105 (8) : 156-159.)，本病流行于世界各地， 我国于1982年证实存在犬细小病毒感染(梁士哲，渠川玫，魏喜仁，等.犬传染性肠炎的研 究I-腹泻犬粪便中检出的细小病毒颗粒.上海畜牧兽医通迅，1982，2 (4) :172.)，次年徐 汉坤等正式报道了本病的流行(徐汉坤，郭保发，金淮，等.血凝和血凝抑制试验在犬群暴 发犬细小病毒肠炎中的应.中国畜禽传染病，1983 (4) :43-45.)。犬细小病毒是引起犬急 性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的病原(A fshar A. . Canine Parvovirus infection-a review. Vet Bull，1981，51 :605_612.)，主要危害幼犬，特别是2 6月龄犬。该病发病急， 病程短，死亡率高，传染性强，对实验犬，军犬，警犬等犬群以及宠物犬均具有很大的危险 性。I型犬腺病毒于1925年首次被发现。1984年，在我国首次分离到该病毒，证实了 我国犬中也有犬腺病毒I型的感染(殷震，刘景华.动物病毒学(第二版).北京科学出 版社，1997,757-762.). I型犬腺病毒在临床上可导致犬传染性肝炎(Webe J. DNA vaccine. BusinessWeek, 1996, 2 6.)、狐狸和熊脑炎的发生(夏咸柱，范泉水，扈荣良，等.II型犬 腺病毒自然弱毒YCA18株的实验免疫研究.中国兽药杂志，2001，35 (2) :1_4)。国外为预防与控制这几种传染病，已研制出多种商品用单苗与联苗；国内已有解 放军农牧大学犬用五联苗(狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒2型病和细小病毒病)研 制成功的报道。联苗是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗，联苗的使用剂量与单苗相当，
3但其效力与单苗相同，而且联苗可简化接种程序，减少接种动物应急反应的次数，达到一针 多防的目的。本发明在犬瘟热单苗研究基础上，先后又分离获得犬细小病毒、犬腺病毒I型 病毒株，并进行了犬瘟热、犬细小病毒病及犬腺病毒病I型三联活疫苗的研制。
发明内容
本发明目的之一是提供一种犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒I型三联活疫苗；本发明目的之二是提供一种制备上述犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒I型三联活 疫苗的方法；本发明目的是通过以下技术方案来实现的一种犬癌热(Canine distemper virus)、犬细小病毒(Canine parvovirus)禾口 I 型犬腺病毒(Canine adenovirus)三联弱毒活疫苗，包括微生物保藏号是CGMCC No. 3810 的犬瘟热弱毒疫苗株，微生物保藏号是CGMCC No. 3841的犬细小病毒弱毒疫苗株和微生物 保藏号是CGMCC No. 3809的I型犬腺病毒弱毒疫苗株。优选的，所述犬瘟热弱毒疫苗株，犬细小病毒弱毒疫苗株或I型犬腺病毒弱毒疫 苗株的毒价彡IO4-5TCID50/头份。本发明犬瘟热病毒弱毒株(CDV-YBR)的培育将分离的犬瘟热病毒(CDV-YB株) 通过连续接种鸡胚成纤维细胞(CEF)传代至70代，之后转在Vero细胞上传20代，然后继 续在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传至105代。在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来 越适应CEF和Vero细胞。但病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态 学鉴定、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验，结果验证了培育的CDV-YB弱 毒株(CDV-YBR)具有典型的副粘病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。本发明将所分离的犬瘟热病毒弱毒株(CDV-YBR)提交专利认可机构保藏，其微生 物保藏号是=CGMCC No. 3810 ；分类命名为犬瘟热病毒；保藏时间是2010年5月14日；保 藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。将本发明分离的犬细小病毒(CPV-YN株)通过连续同步接种CRH(细胞传代至110 代，在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CRH(细胞。与之相反，病毒对犬 的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和 外源病毒检验等试验结果验证了培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒 子特征，纯净无外源病毒污染。本发明将所分离的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)提交专利认可 的机构保藏，其微生物保藏号是=CGMCC No. 3841 ；分类命名为犬细小病毒；保藏时间是 2010年5月14日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地 址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明I型犬腺病毒弱毒株CAV-HR的培育将上述分离的犬腺病毒(CAV-H株) 通过连续接种MDCK细胞传代至120代，在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适 应MDCK细胞。与之相反，病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学 鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了培育的CAV-H弱毒株 (命名为CAV-HR)具有典型的腺病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。本发明将所分离的CAV-H弱毒株(命名为CAV-HR)提交专利认可的机构保藏，其微生物保藏号是=CGMCC No. 3809 ；分类命名为犬腺病毒；保藏时间是2010年5月14日； 保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明的另一目的是提供一种制备上述犬瘟热(Canine distemper virus)、犬细 小病毒(Canine parvovirus)禾口 I型犬腺病毒(Canine adenovirus)三联弱毒活疫苗的方 法，包括(1)分别培养微生物保藏号是CGMCC No. 3810的犬瘟热弱毒疫苗株，微生物保藏 号是CGMCC No. 3841的犬细小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏号是CGMCC No. 3809的I型犬 腺病毒弱毒疫苗株，得到病毒液；(2)对病毒液进行病毒滴定，混合，过滤，加入冻干保护剂，冻干，即得。其中，所述犬瘟热弱毒疫苗株的培养包括选择经无菌，支原体检测阴性的生长良 好的CEF单层，倒去培养液后，换以含2%毒种的细胞维持液，调整pH值7. 2 7. 4，置33°C 培养；当CPE达到70%时收获。所述犬细小病毒弱毒疫苗株的培养包括将毒种按细胞维持液量的3%同步接种 于经无菌，支原体检测阴性的生长良好的CRH(单层，调整pH值为7. 2 7. 4，置37°C培养； 待70%细胞出现CPE即可收获。所述犬腺病毒I型弱毒疫苗株的培养包括选择经无菌，支原体检测阴性的生长 良好的MDCK单层，倒去培养液后，换以含2%毒种的细胞维持液，调整pH值7. 2 7. 4 ；置 37°C培养；当CPE达到70%时收获。所述的冻干保护剂的配制包括(1)明胶8g ；蔗糖40g ；无离子水100ml ；调整 PH 值为 6. 8 7. 0 ； (2) 116°C灭菌 40min,即得。上述制备方法中，优选的，将病毒液与冻干保护剂按9 1的比例进行混合。本发明采用分离自中国病犬的野毒并经过驯化致弱的犬瘟热病毒、犬细小病毒和 犬腺病毒I型为对象，一起配制三联苗，并加入冻干保护剂制成。该三联苗安全性可靠、免 疫效果好、且针对性强，适合中国病犬疾病的预防，可用于预防犬瘟热、犬细小病毒、犬传染 性肝炎三种传染病；制苗工艺科学，程序可操作性强，经济效益可观，适于工业化生产。本发明将所制备的犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病三联活疫苗分别免疫2 4月龄 犬15只，21天后分别攻击CDV-YB、CPV-YN、CAV-H强毒，剂量均为200TCID5(1/犬。结果表 明，5批次疫苗对三种病的保护率均达到4/5，对照犬均5/5发病。因此，本发明三联活疫苗 疫苗对预防犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病能起到很好的效果。
图1⑶V-YB 105代病毒粒子电镜照片。图2CPV-YN 90代病毒粒子电镜照片。图3CAV-H 110代病毒粒子电镜照片。图4本发明三联活疫苗的生产工艺路线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术
5人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1生产用毒种的准备1. 1犬瘟热病毒(⑶V-YB)分离株的致弱将分离的犬瘟热病毒(⑶V-YB株)通过连续接种鸡胚成纤维细胞(CEF)传代至70 代，之后转在Vero细胞上传20代，然后继续在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传至105代。在传 代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CEF和Vero细胞。但病毒对犬的致病力随 着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学鉴定、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检 验等试验，结果验证了培育的CDV-YB弱毒株(CDV-YBR)具有典型的副粘病毒粒子特征(见 图1)，纯净无外源病毒污染；从免疫效力试验结果可以看出，CDV-YBR株对同源强毒攻击的 犬可以提供很好的保护力。1. 2犬细小病毒CPV-YN)分离株的致弱将分离的犬细小病毒(CPV-YN株)通过连续同步接种CRFK细胞传代至110代，在 传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CRFK细胞。与之相反，病毒对犬的致病 力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病 毒检验等试验结果验证了培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒子特征 (见图2)，纯净无外源病毒污染；从免疫效力试验结果可以看出，CPV-YNR株对同源强毒攻 击的犬可以提供很好的保护力。1. 3犬腺病毒I型(CAV-H)分离株的致弱将分离的犬腺病毒(CAV-H株)通过连续接种MDCK细胞传代至120代，在传代过 程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应MDCK细胞。与之相反，病毒对犬的致病力随着 传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验 等试验结果验证了培育的CAV-H弱毒株(命名为CAV-HR)具有典型的腺病毒粒子特征(见 图3)，纯净无外源病毒污染；从免疫效力试验结果可以看出，致弱的CAV-HR株对同源强毒 攻击的犬可以提供很好的保护力。实施例2制苗用病毒液准备2. 1⑶V-YBR细胞毒液的制备选择生长良好的CEF单层，倒去培养液后，换以含2%毒种的细胞维持液，调整pH 值7. 2 7. 4。置33°C培养。每日观察细胞，发现生长异常或污染的细胞应立即废弃。当 CPE达到70%时收获，置-20°C保存。2. 2CPV-YNR细胞毒液的制备在CRFK传代的同时，按生长液的3%接种CPV-YNR毒种，调整pH值7. 2 7. 4，置 37°C培养。每日观察细胞，发现生长异常或污染的细胞应立即废弃。当CPE达到70%时收 获，置-20°C保存。2. 3CAV-HR细胞毒液的制备选择生长良好的MDCK单层，换以含2%毒种的细胞维持液。调整pH值7. 2 7. 4， 置37°C培养。每日观察细胞，发现生长异常或污染的细胞应立即废弃。当CPE达到70%时 收获，置-20°C保存。实施例3犬瘟热、细小病毒、腺病毒I型三联活疫苗的制备
将实施例2所制备的不同含量的病毒液与稳定剂按9 1的体积比例加入冻干 保护剂冻干后，充分摇勻后，定量分装于灭菌疫苗瓶中，分装结束后，立即移入冻干机内，先 置-36°C以下预冻3-4小时，然后开泵升华16-18小时，当温度升到26_27°C时维持4_5小 时后闭泵，抽空，并在真空状态下自动加塞、压盖，完成冻干。试验例1犬瘟热病毒、细小病毒和腺病毒病三联活疫苗免疫效力试验1材料和方法1. 1试验用疫苗犬瘟热病、细小病毒病、腺病毒病三联活疫苗；按照实施例1-3的 制备方法制备成5批，批号为9701、9702、9703、9704、9705。1. 2实验动物2 4月龄健康犬，其⑶V、CPV、CAV血清中和抗体均彡1 2。1. 3 攻击用强毒 CDV-YB (8 代)、CPV-YN (7 代)、CAV-H (8 代)。1. 4试验方法每批疫苗用注射用水稀释，肌肉接种2 4月龄犬15只，1头份/犬。 21天后15只犬分为3组，每组5只，每组犬攻击一种强毒，剂量为200TCID5(i/犬。同时每 组设对照犬5只(注射生理盐水Iml)。各组犬均隔离饲养，观察21天，记录各组犬的发病 及死亡情况。2 结果2. 1⑶V攻毒保护结果以5批疫苗对2 4月龄犬进行免疫，免疫后21天，以 200TCID50/犬剂量的CDV-YB强毒进行攻击，9701批疫苗免疫犬的保护率为4/5，其他批次 的保护率均为5/5，对照组5/5发病，发病犬中有2只在4天后死亡。结果见表1。表1⑶V攻毒保护结果 2. 2CPV攻毒保护结果对以5批疫苗对2 4月龄犬进行免疫，1头份/犬，免疫后 21天，以200TCID5(1/犬剂量的CPV-YN强毒进行攻击，9702、9704批疫苗免疫犬的保护率为 4/5，其他批次均为5/5，对照组5/5发病，有1只犬死亡，结果见表2。表2 CPV攻毒保护结果
对照5Iml盐水5/51/5—2. 3CAV攻毒保护结果对以5批疫苗对2 4月龄犬进行免疫，1头份/犬，免疫后 21天，以200TCID5(i/犬剂量的CAV-H强毒进行攻击，9701批疫苗免疫犬的保护率为4/5，其 他批次均为5/5，对照组5/5发病，发病犬中有2只犬在4-5天相机死亡。结果见表3。表3 CAV攻毒保护结果 3试验结论本发明犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病三联活疫苗对犬瘟热、细小病毒 病、腺病毒病的保护率均达到4/5，具有很好的保护效果。
权利要求
一种犬瘟热(Canine distemper virus)、犬细小病毒(Canine parvovirus)和I型犬腺病毒(Canine adenovirus)三联弱毒活疫苗，包括微生物保藏号是CGMCC No.3810的犬瘟热弱毒疫苗株，微生物保藏号是CGMCCNo.3841的犬细小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏号是CGMCC No.3809的I型犬腺病毒弱毒疫苗株。
2.按照权利要求1所述的三联弱毒活疫苗，其特征在于所述犬瘟热弱毒疫苗株，犬细 小病毒弱毒疫苗株或I型犬腺病毒弱毒疫苗株的毒价> IO4-5TCID50/头份。
3.权利要求1所述犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒I型病毒三联弱毒活疫苗的制备方 法，包括(1)分别培养微生物保藏号是CGMCC No. 3810的犬瘟热弱毒疫苗株，微生物保藏 号是CGMCC No. 3841的犬细小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏号是CGMCC No. 3809的I型 犬腺病毒弱毒疫苗株，得到病毒液；(2)对病毒液进行病毒滴定，混合，过滤，加入冻干保护 剂，冻干，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述犬瘟热弱毒疫苗株的培养包括 选择经无菌，支原体检测阴性的生长良好的CEF单层，倒去培养液后，换以含2%毒种的细 胞维持液，调整pH值7. 2 7. 4，置33°C培养；当CPE达到70%时收获。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述犬细小病毒弱毒疫苗株的培 养包括将毒种按细胞维持液量的3%同步接种于经无菌，支原体检测阴性的生长良好的 CRFK单层，调整pH值为7. 2 7.4，置371培养；待70%细胞出现CPE即可收获。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于犬腺病毒I型弱毒疫苗株的培养包 括选择经无菌，支原体检测阴性的生长良好的MDCK单层，倒去培养液后，换以含2%毒种 的细胞维持液，调整pH值7. 2 7. 4 ；置37°C培养；当CPE达到70%时收获。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂的配制包括(1) 明胶:8g ；蔗糖40g;无离子水=IOOml ；调整pH值为6. 8 7. 0 ； (2) 116°C灭菌40min，即得。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于将病毒液与冻干保护剂按9 1的 体积比例进行混合。
全文摘要
本发明公开了犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒I型三联活疫苗及其制备方法。该三联活疫苗包括微生物保藏号是CGMCC No.3810的犬瘟热弱毒疫苗株，微生物保藏号是CGMCC No.3841的犬细小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏号是CGMCC No.3809的I型犬腺病毒弱毒疫苗株。本发明采用分离自中国病犬的野毒并经过驯化致弱的犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬腺病毒I型为对象，一起配制三联苗，并加入冻干保护剂制成。该三联活疫苗安全性可靠、免疫效果好、针对性强，适合中国病犬疾病的预防，可用于预防犬瘟热、犬细小病毒、犬传染性肝炎三种传染病。
文档编号A61K39/295GK101905021SQ20101024496
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者刘大飞, 刘立奎, 张洪英, 曲联东, 王牟平 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所