抑制mbd2表达的抑制剂及其应用的制作方法

专利名称：抑制mbd2表达的抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体为以甲基化CpG结合域蛋白 2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein 2，MBD2，以下简称为 MBD2)为靶点，抑制 MBD2 表 达的抑制剂及其应用。
背景技术：
血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，它不仅调节营养物质、多种生物 活性分子和血液细胞的运输，而且是一个重要的自我平衡器官，正常的内皮细胞能对多种 生理及化学讯号产生应答，释放一群自分泌和旁分泌物质如一氧化氮(nitric oxide,NO), 环前列腺素和内皮源性超极化因子等，调节血管的张力，抑制血小板聚集、细胞粘附、平滑 肌细胞增生，在血管功能调控中扮演着关键的角色，同时在血管疾病及其初始防御中发挥 重要作用。但是，当内皮细胞暴露于心血管风险因子如吸烟、糖尿病、高血压、血脂异常、肥
胖及慢性系统炎症等，其将处于一种活化状态------内皮细胞功能障碍，表达大量化学因
子、细胞因子和粘附分子及eNOS合成NO减少、生物活性降低等，导致心血管疾病的发生、发 展，常致病人死亡和残疾。因此血管内皮功能障碍是心血管疾病的主要原因。由于血管疾 病的病因包括遗传的和后天的多种因素，所使用的药物多针对不同的病因，及其繁多，因此 确立一个针对多种病因、最佳的、副作用最少的治疗目标是一个巨大的挑战。作为一个主要的表观遗传学组成部分，DNA甲基化模式的改变在动物和人类血管 疾病中是非常常见的。最近的研究表明，DNA甲基化可以作为一个“足迹”反映环境暴露 对不同类型细胞的后果。这种DNA甲基化模式可以由保守的甲基化CpG结合域蛋白家族 (MBD) “阅读”，其中包括MBD1，MBD2, MBD3, MBD4和MeCP2。他们与其蛋白伴侣在DNA甲基 化介导的转录抑制和/或异染色质的形成中发挥积极的作用。每种MBD蛋白与甲基化DNA 的亲和力是不同的，亲和力最高的是MBD2蛋白，但哺乳动物中MBD3不能选择性识别甲基化 DNA。目前能建立MeCP2，MBD1，MBD2和MBD4缺陷的动物模型，但MBD3缺陷导致胚胎死亡。 研究表明MeCP2或MBDl缺陷小鼠与特定神经学缺陷有关；而MBD4被发现能抑制CpG突变 和肿瘤发生。相比之下，MBD2缺陷小鼠显示一个几乎正常的表型，仅观察到微小的异常母 性行为(Hendrich B,Guy J,Ramsahoye B,Wilson VA,Bird A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Dev 2001 March 15 ； 15 (6) :710_23)，目前的研究显示应用RNA干扰技术抑制MBD2的表达能 够抑制肿瘤的生长，MBD2已成为人们研究治疗多种肿瘤的新靶点(W0/2004/001027)。这表 明MBD2可能成为一个合适的表观遗传治疗目标，通过抑制MBD2的表达，达到预防和治疗血 管内皮细胞功能障碍相关疾病的目的。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的 基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导 入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默(Fire A, Xu S, Montgomery Μ, Kostas S, Driver S, Mello C. Potent and specific genetic
3interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1998 391(6669) :806-11)。RNAi机制普遍存在于动植物，尤其是低等生物中。因此被认为是进 化上相对保守的基因表达调控机制。研究表明，RNAi机制可能是作为在RNA水平上抵御病 毒入侵的防御机制而存在的。RNAi在基因沉默方面具有高效性和简单性，19个核苷酸的双链RNA几乎可以完全 抑制基因的表达，而且还具有很高的特异性，与靶mRNA之间一个碱基的错配都会显著削弱 基因沉默的效果，所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于标靶基因(或疾病基 因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个 重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成 为RNAi药物。基因敲除(knock-out)小鼠是一种遗传工程技术下利用基因剔除技术所做出的 一或多个特定基因被剔除的小鼠。此技术为用来观察并研究活体内基因表现的工具之一。 此外，更可借由基因剔除后对小鼠所产生的变化，精确地了解人类先天基因缺损所造成疾 病的致病机转，也是此技术的重大优点之一。我们利用RNA干扰技术及基因敲除小鼠，了解MBD2基因沉默或敲除对动物和人类 血管内皮细胞功能障碍所起的作用，从而确定MBD2是否可以成为一种全新的预防和治疗 血管内皮细胞功能障碍相关疾病靶点。对发明一个针对多种病因、最佳的、副作用最少的治 疗药物或制剂有着极其重要的意义。

发明内容
本发明的目的在于提供预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾病的新靶点 MBD2。涉及抑制MBD2的表达抑制剂，实现上述目的的技术方案如下它是一种核酸分子、遗 传结构、siRNA分子以及包含以上一个或多个的复合物，能在体内或/和体外抑制MBD2的 表达，并在制备预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾病药物和制剂中的应用。本发明涉及的一种siRNA，与MBD2的mRNA序列同源互补，特征是，其核苷酸序列为 正义链5' -GCAAGAGCGAUGUCUACUA-3‘；反义链5' -UAGUAGACAUCGCUCU UGC-3‘。它能 够导入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。上述双链RNA分子的3'末端可以加上两个悬挂碱基tt，以增加siRNA活性， 其核苷酸序列为正义链5 ‘ -GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3 ‘；反义链5 ‘ -UAGUAGACAUCG ⑶CUUGCtt-3'。它能够导入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。本发明所涉及的一种抑制MBD2表达的SiRNA，与MBD2的mRNA序列同源互补，但其 序列不同于以上序列1、2、3、4，能够导入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。上述双链RNA分子的3'末端可以加上两个悬挂碱基tt，以增加siRNA活性，能够 导入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。本发明所涉及的siRNA分子，是上述siRNA分子经化学修饰的双链RNA分子。所述化学修饰为磷酸骨架修饰，包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部分修饰或用 其他化学键取代，如硫代修饰。硫代修饰最初广泛用于反义技术中提高寡聚核苷酸对核酸 酶的抗性。硫代磷酸是用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子，即P-S键替代P-O键， 提高了 SiRNA抗核酸酶的能力，增加它的稳定性。
化学修饰为核糖修饰，包括对这些SiRNA分子核酸戊糖2位上的OH作的化学修 饰和改变，如在核糖的2'位置引入某些取代基如甲基、氟，使siRNA具有更强的抵抗核 酸酶水解的性能。第一种核糖修饰是在siRNA戊糖的2'位置引入一个或多个烷基，如 2' -0-甲基；第二种修饰2'-氟嘧啶是将siRNA上嘧啶核苷酸的2' -OH用2' -F替代， 2' -F使RNA酶不易识别siRNA，从而增加了 siRNA的稳定性。化学修饰包括对siRNA分子碱基的修饰，siRNA与mRNA通过碱基互补形成氢键， 发挥RNAi的作用，因此可以对碱基进行修饰。在尿嘧啶的5位点引入溴或碘是常使用的碱 基修饰方法，如5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶可加强腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)之间的连接，提 高碱基的相互作用。其他修饰如引入亲脂性基团，加强siRNA的亲脂性，增加其透过细胞膜的能力；用 2'脱氧胸腺嘧啶核苷酸代替3'突出的尿嘧啶核苷酸，其RNA干扰的效果相同，更能抵抗 核酸酶的消化。这些修饰能够增加siRNA的稳定性，同时增强其生物学活性，能够导入哺乳 动物细胞，抑制目的基因的表达。本发明涉及的一种核酸分子，包含7个或以上与哺乳动物MBD2mRNA同源互补的连 续核苷，能进入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。本发明涉及的一种遗传结构，包含以上核酸分子，如RNA分子、DNA分子、质粒、载 体、病毒等，能进入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。本发明涉及的、包含以上一个或多个抑制剂的复合物，能进入哺乳动物细胞，抑制 MBD2的表达。本发明涉及的上述MBD2抑制剂在制备预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾 病药物和制剂中的应用。本发明涉及的是MBD2被作为靶点，在预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾 病中的应用。如用于糖尿病心血管并发症、动脉粥样硬化等的预防和治疗。本发明的优越性在于运用RNA干扰技术及相关技术探明了 MBD2基因沉默或敲 除能够治疗和预防动物和人类血管内皮细胞功能障碍所引起的疾病，从而确定MBD2可以 成为一种全新的预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾病靶点，对发明一个针对多种病 因、最佳的、副作用最少的治疗药物或制剂有着极其重要的意义，为制备相关药物或制剂提 供了新的选择，有着广阔的应用前景。


图1:MBD2 siRNA抑制人类脐带静脉血管内皮细胞MBD2蛋白的表达。MBD2 siRNA 剂量依赖性抑制内皮细胞MBD2蛋白的表达。当MBD2 siRNA浓度为IOOnM时，MBD2蛋白的 表达减少了 70% (η = 4)。图2 :MBD2表达的抑制促进了血管生成，保护内皮细胞免于过氧化氢诱导的内皮 细胞凋亡。图2A，MBD2基因knockdown促进成管。左侧为成管的代表性图像，右图示管的平均 长度(η = 4例)。图2B，MBD2的抑制促进了 HUVEC的增生。结果以mean 士 SEM表示(η = 3)。图2C，MBD2 knockdown保护内皮细胞免于H2O2诱导的凋亡。左一个代表性的流式细 胞仪数据。右图示结果来自4个独立的实验。Ctl，Control ；#，ρ < 0. 001 ;*，ρ < 0. 01.表达及小鼠缺血后肢灌流恢复。图3A，在MBD2缺陷小鼠血管中没有MBD2的表达。图3B，后肢缺血损伤后MBD2表 达的时空变化。用Western blotting对后肢MBD2蛋白的表达进行了检查(左)，以MBD2 蛋白与β-肌动蛋白的比值表示MBD2的相对含量(右，η = 5)。图3C，缺血性和非缺血后 肢切片MBD2和内皮细胞共免疫组化染色。细胞核以DAPI染色(a&e)，内皮细胞以抗-CD31 抗体染色(b&f)，MBD2染色为绿色(c&g)。合并后的图像(d&h)由DAPI、抗-CD31和MBD2 染色重叠产生。图d和h中插入的高分辨率影像显示MBD2和内皮细胞的共定位。图3D，后 肢缺血损伤后后肢血流的恢复。激光多普勒成像系统用来测量血流量(left panel)，平均 后肢血流以缺血侧与非缺血侧讯号的比值表示(right panel, η = 6)。图3Ε，缺血性损伤 7天后MBD2缺陷小鼠毛细血管形成与野生型相比明显增加。左为后肢切片(Χ200)，以内皮 细胞(CD31阳性细胞)的数量作为毛细血管的形成指标。右侧的条形图代表各组的平均微 血管密度(η = 5)。图3F，缺血性损伤7天后小动脉形成。后肢切片(Χ200)中平滑肌细胞 (anti-α smooth muscle actin阳性细胞)的数量作为小动脉的形成指标。右侧的条形图 代表各组的平均小动脉密度(η = 5)。*，ρ < 0. 01.图4，MBD2缺陷小鼠抵抗糖尿病引起的血管内皮功能障碍。图4Α，氯化钾(KC1，120mM)诱导的血管收缩。图4B，苯肾上腺素(PE)引起的血 管收缩。图4C，乙酰胆碱引起的内皮依赖性血管舒张。图4D，L-NAME(10-4M)阻断内源性 eNOS后，SNP诱导的内皮依赖性血管舒张。MBD2缺陷和对照小鼠在生理和糖尿病状态下(A 和B)血管收缩活动没有差异，但是，野生型糖尿病小鼠血管舒张功能明显受损，而MBD2缺 陷糖尿病小鼠与非糖尿病对照组(C)相似，且表现为内皮依赖性(D)。数据以mean士SEM表 示，η = 4。氺，ρ < 0. 01。图5，:MBD2的丢失活化内皮细胞生存及促血管生成信号。图5A，MBD2的抑制增强了 ERK1/2的活性。左代表性的总ERK1/2和ρ ERK1/2免 疫印迹结果；右P ERK1/2在被转染MBD2siRNA的HUVEC中表达的定量分析(η = 3)。图 5Β, MBD2siRNA的转染增加了 HUVEC中BCL-2的水平，约为对照组的2. 2倍。图5C, HUVEC 中MBD2的抑制增加了 eNOS和VEGF-R2的表达，eNOS表达的增加和磷酸化的eNOS的增加 有关(左)，右图示总eNOS和VEGF-R2的定量分析结果(η = 3)。图5D，MBD2缺陷小鼠血 管也显示出与HUVEC相似的结果(η = 3)。图5Ε，抑制HUVEC细胞MBD2的表达促进了 ρ38 的活化，活化的Ρ38高于对照组1. 3倍。图6，MBD2结合于eNOS非翻译区和VEGF-R2启动子高GC含量区。图6A，高GC含量区位于eNOS非翻译区。图6B，eNOS的ChIP分析结果，PCR扩增 纯化的总输入DNA、MBD2抗体及对照抗体所得免疫沉淀物、HUVEC基因组DNA (阳性对照)。 图6C, VEGF-R2启动子上2个CpG岛。图6D, VEGF-R2的ChIP分析结果。图7，MBD2抑制eNOS的表达被限定于内皮细胞。图7A，TSA消除了 MBD2siRNA对eNOS表达的影响。图7B，MBD2的抑制不能诱导 Hela细胞eNOS的表达，MBD2siRNA的转染及对照组没有探测到eNOS的表达，然而TSA却能 诱导这两组细胞eNOS的表达。图7C，从MBD2缺陷小鼠分离的脾细胞不能表达eNOS JSTSA 能诱导MBD2缺陷小鼠和野生型小鼠分离的脾细胞表达eNOS。
具体实施例方式发明人采用SiRNA设计法则，设计并筛选出一段能够抑制MBD2基 因表达的siRNA序列，正义链5 ‘ -GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3 ‘；反义链 5 ‘ -UAGUAGACAUCGCUCUUGCtt-3 ‘，由Santa cruz生物技术公司化学合siRNA,成并成功转 染人类脐带静脉血管内皮细胞；利用基因敲除技术得到了 MBD2缺陷小鼠用于发明。以下实 施例并不仅仅局限于本发明的范围，还对本发明的相关机制现进行了扩展。实施例一 MBD2siRNA抑制人类脐带静脉血管内皮细胞MBD2蛋白的表达人类脐带静脉血管内皮细胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)培养于EBM-2上皮细胞培养基中，置于5%C02、37°C培养箱中培养。转染前24小时 将细胞接种于12孔培养板，接种密度为4X 104，第二天，根据Lipofectamineanvitrogen， Carlsbad, CA)试剂操作指南进行转染，设50、100nmOl/LMBD2SiRNA及对照组。收集转染后 24-48小时的细胞，提取蛋白行免疫印迹检查。蛋白在8% SDS-PAGE胶中分离后转到PVDF 膜上。在5%脱脂牛奶TBS-T溶液中封闭，膜在4°C MBD2抗体溶液中孵育16小时，再在室 温下与二抗孵育1小时，TBS-T洗涤后，加入ECL试剂，胶片显影。结果显示MBD2siRNA以 剂量依赖的方式抑制MBD2的表达(图1)。实施例二 MBD2siRNA在体外实验中促进血管生成，保护内皮细胞免于H2O2诱导的 凋亡为检测成管，基质胶被置于96孔板(100yL/Well)，37°C至少30分钟，再将已转染 siRNAdOOnmo 1/L) 24小时的内皮细胞接种于96孔板中(培养液为含2%胎牛血清的EBM-2 培养液)，密度为2X IO4ceIls/孔，于5% C02、37°C培养箱中孵育24小时。每4小时于光 学显微镜下检查成管情况，结果发现，在接种4小时后在MBD2siRNA转染组即可观察到典型 的成管，而对照siRNA组却几乎没有发现成管；24小时后MBD2siRNA转染组的平均成管长 度(10. 4士0. 8謹)显著高于对照组(3. 3 士0. 5謹，图2A)。为检测MBD2siRNA对HUVEC增殖的影响，转染siRNA24小时的内皮细胞被胰酶消 化后接种于96孔板，密度为5 X IO3细胞/孔，与标记3H的胸苷孵育16小时，收获细胞于 1450 MicroBeta TriLux Microplate Scintillation and Luminescence Counter上计数。 结果表明，与对照组相比，MBD2siRNA的应用显著促进了 HUVEC的增生9(图2B)。为证实MBD2在细胞凋亡中所起的作用，转染siRNA24小时的内皮细胞被0. 2 % mmol/L H2O2处理24小时来引导细胞凋亡，随后用annexin-V及propidium iodide (PI)染 色，以流式细胞仪计数，MBD2siRNA组的凋亡细胞数明显低于对照组(图2C)。从以上结果看出，MBD2负调节血管的生成，促进H2O2诱导的凋亡。实施例三以后肢缺血实验检测MBD2基因敲除对小鼠后肢灌流恢复的影响后肢缺血模型的建立小鼠麻醉后在左腹股沟处暴露、分离股动脉近端，用7-0丝 线在股动脉近端打两个结，并用剪刀从两个结之间剪断股动脉，缝合切口。缺血部位MBD2的表达取不同时段左后肢股动脉，提取蛋白行免疫印迹检测，观 察MBD2的表达情况。同时缺血组织及对侧非缺血组织包埋于OCT中、切片(10 μ m)，行免疫 组化染色，检测MBD2在血管中的定位。免疫印迹实验表明，在MBD2缺陷小鼠MBD2蛋白没有表达(图3A)；而野生型小鼠 在生理状态下仅有低水平的MBD2被检测到，然而缺血诱导缺血区域MBD2的表达逐渐增加，到术后第四天达到高峰，然后逐渐降低，第十四天降到一个相对低的水平(图3B)。免疫染 色发现，在非缺血区MBD2主要位于内皮细胞(⑶31阳性细胞)，但在缺血区，随着新生血管 的形成，大量MBD2表达于增多的内皮细胞中(图3C)。小鼠后肢灌流恢复的评估用PIM 3scanning Laser Doppler imaging system(Perimed, Stockholm, Sweden)在术后0、2、4、7和14天检查左后肢灌流恢复的情况。 平均后肢血流以缺血侧与非缺血侧讯号的比值表示。MBD2缺陷和野生型小鼠在术后当天都 没有血流讯号，但MBD2缺陷小鼠左后肢在术后第二天即可检测到部分血流恢复讯号，第七 天血流恢复到50%，第14天血流完全恢复；而野生型小鼠左后肢在第四天才观察到血流恢 复，第7和14天血流仅恢复到30%和60% (图3D)。。缺血部位新生血管的形成缺血组织及对侧非缺血组织包埋于OCT中、切片 (ΙΟμπι)，行免疫组化染色，检测毛细管(⑶31)和小动脉(平滑肌α-actin)的形成 情况。在MBD2缺陷小鼠缺血区毛细管(⑶31)(图3Ε)和小动脉(平滑肌α -actin) (图3F)的形成明显多于野生型小鼠。抗MBD2、⑶31、平滑肌α-actin抗体分别来自于 Millipore(Bedford, MA)> BD pharmingen(San Diego, CA)> Abeam(Cambridge, MA)从以上实验看出，MBD2的丢失促进了缺血区血管的再生和动脉的形成，改善了左 后肢的灌流恢复。实施例四MBD2缺陷小鼠能够完全免于糖尿病诱导的内皮细胞功能障碍糖尿病模型的建立采用小剂量多次腹腔注射STZ法(STZ，每天50mg/kg，连续5 天)，诱导8-10周左右大小的MBD2基因敲除小鼠和野生型小鼠，使发生糖尿病。年龄和性 别匹配的对照小鼠则每天给予腹腔注射柠檬酸盐溶液。每隔一天小鼠尾部采血，用血糖计 检测血糖水平。只有血糖水平超过250mg/dl的小鼠将被用于下一步的研究。患糖尿病6周的动物被处死后，迅速取出胸主动脉，并切为两段长度为3毫米 的动脉环，以避免损害内皮细胞层。然后主动脉片段孵育于新鲜的Krebs溶液中(NaCl 115mmol/l, KCl 4. 6mmol/l, KH2P04 1. 2mmol/l, MgS04 1. 2mmol/l, CaC12 2. 5mmol/l, NaHC03 25mmol/l, glucose 11. lmmol/1 and EDTA 0. 02mmol/l ；pH7. 4)，并通以 95% 02 和 5% C02。随后主动脉片段被固定在四通道肌动描记系统(Catamount，St. Albans，Vermont) 行等距收缩测量。通过它们对血管收缩剂及舒张剂的反应能力来评估内皮细胞的功能。氯 化钾(120mmOl/L)和苯肾上腺素(10_9到10_5mol/L)被用作为血管收缩剂，乙酰胆碱(ACh) (10_9到lO-W/L)和钠硝普盐(SNP) (10-9到10-5mol/L)被用作为苯肾上腺素(lO^mol/ L)预处理过的动脉血管舒张剂。L-nitroarginine-methylester (L-NAME, l(T4mol/L)， L-arginine的竞争者，被用于抑制内源性eNOS的活性。在生理和糖尿病状态下，氯化钾或苯肾上腺素引起的血管收缩没有显着差别 (图4A&B)；但是，野生型糖尿病小鼠与非糖尿病小鼠相比，其对乙酰胆碱(ACh，lX10_9至 lX10_5mol/L)诱导的舒张反应明显受损；与此形成鲜明对比，MBD2缺陷糖尿病小鼠却显示 出最大限度的舒张(图4C)。不过，用L-NAME阻断内源性一氧化氮后，对硝普钠诱导的舒张 反应，MBD2缺陷与野生型糖尿病小鼠及其相似(图4D)，这表明野生型糖尿病小鼠松弛能力 的下降是由内皮功能受损引起的。因此，MBD2的缺失能够完全保护动物免于糖尿病诱导的 内皮细胞功能障碍。实施例五MBD2表达的抑制活化内皮细胞生存及促血管生成信号
为检测MBD2表达的抑制是否活化内皮细胞生存信号通路，转染了 MBD2和对照 siRNA的HUVEC用浓度为0. 2mmol/L的H2O2处理24小时，其裂解产物被用于免疫印迹来检 测两种主要的内皮细胞生存信号 extracellular signal-regulated kinase l/2(ERKl/2) 和 serine-threonine kinase Akt，及 ERK1/2 相关蛋白 BCL-2 的表达(ERK1/2 磷酸化BCL-2 而阻止其降解)。结果表明，Akt，及总ERKlA在转染MBD2siRNA组和对照组的表达没有显 着差异，但磷酸化的ERKl/2(图5A)及BCL-2(图5B)的表达在转染MBD2siRNA组明显升高。 与野生型糖尿病小鼠相比，MBD2缺陷小鼠血管也显示出同样的趋势。这表明MBD2调节内 皮细胞凋亡可能是通过调节ERK1/2及BCL-2信号来实现的。为研究MBD2调节血管生成的 机制，转染了 MBD2和对照siRNA的HUVEC裂解产物被用于免疫印迹来检测两种关键的促血 管生成信号eNOS和VEGF-R2及p38丝裂原活化蛋白激酶的表达。eN0S、VEGF_R2表达在转 染MBD2siRNA组明显升高(图5C)，与野生型小鼠相比，MBD2缺陷小鼠血管也显示出同样的 趋势(图5D)。活化了的p38在转染MBD2siRNA组也明显升高，但p38的总量在两者之间没 有差另U (图5E)。由此可见，MBD2的丢失可能活化细胞生存及促血管生成信号来提高内皮细胞生存 及血管生成能力。实施例六，MBD2结合于eNOS和VEGF-R2启动子高GC区为弄清MBD2是否结合于eNOS和VEGF-R2启动子高GC区，染色质免疫沉淀 (Chromatin immunoprecipitation, ChIP)用来拖下MBD2/DNA复合物，按照染色质免疫沉 淀分析试剂盒说明进行相关操作。结果表明MBD2结合于eNOS和VEGF-R2启动子高GC区 (图6A、B、C、D)，进而抑制eNOS和VEGF-R2的转录。实施例七MBD2对eNOS转录的抑制涉及染色质重塑，被限定于内皮细胞。为探讨MBD2对eNOS转录的抑制是否涉及染色质重塑，加入TSA (HDAC抑制剂)到 转染了 MBD2和对照siRNA的HUVEC，加入DMSO为对照，48小时后，检测eNOS的表达。MBD2 的抑制促进了 eNOS的表达，而这种作用被TSA完全消除了(图7A)。这表明MBD2对eNOS 转录的抑制涉及染色质重塑。为研究MBD2的抑制是否能促进非内皮细胞eNOS的表达，Hela细胞和脾细胞(从 野生型和MBD2缺陷小鼠分离而来)被用来进行类似实验。在Hela细胞中，MBD2的抑制没 有诱导eNOS的表达，而TSA处理后，转染了 MBD2和对照siRNA的Hela细胞都能检测到eNOS 的表达(图7B)；在脾细胞上也得到了相似结果(图7C)。这说明MBD2对eNOS转录的抑制 涉及染色质重塑，且被限定于内皮细胞。
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权利要求
抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于它是一种核酸分子、遗传结构、siRNA分子以及包含以上一个或多个的复合物，能导入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。
2.根据权利要求1所述的抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于抑制MBD2表达 的抑制剂是siRNA，其核苷酸序列为正义链5 ‘ -GCAAGAGCGAUGUCUACUA-3 ‘；反义链 5 ‘ -UAGUAGACA UCGCUCUUGC-3 ‘；或其3 ‘末端有两个悬挂碱基tt，核苷酸序列为正义链 5' -GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3‘；反义链5' -UAGUAGACA UCGCUCUUGCtt-3‘。
3.根据权利要求1所述的抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于抑制MBD2表达的抑 制剂是siRNA，与MBD2的mRNA序列同源互补，但其序列不同于序列1、2、3、4 ；或前述siRNA 分子3'末端有两个悬挂碱基tt。
4.根据权利要求1所述的抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于抑制MBD2表达的抑 制剂是siRNA，其特征为权利要求2和3所述的siRNA经化学修饰的双链siRNA分子，所述 化学修饰包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部分修饰或用一个硫原子取代磷酸二酯键的 非桥氧原子；化学修饰包括对这些siRNA分子核酸戊糖2位上的OH作的化学修饰和改变， 化学修饰包括对siRNA分子碱基的修饰或其他亲脂性基因修饰。
5.根据权利要求1所述的抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于抑制MBD2表达的抑 制剂是一种核酸分子，包含7个或以上与哺乳动物MBD2mRNA同源互补的连续核苷，能抑制 MBD2的表达。
6.根据权利要求1所述的抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于抑制MBD2表达的抑 制剂是一种遗传结构，包含RNA分子、DNA分子、质粒、载体、病毒以上核酸分子，能抑制MBD2 的表达。
7.根据权利要求1所述的抑制MBD2表达的抑制剂，其特征在于抑制MBD2表达的抑 制剂是包含以上一个或多个抑制剂的复合物，能抑制MBD2的表达。
8.一种应用权利要求1所述MBD2抑制剂，其特征是在预防和治疗血管内皮细胞功能 障碍相关疾病药物和制剂的制备上的应用。
9.一种应用权利要求8所述MBD2抑制剂，其特征是所制备的药物或制剂在预防和治 疗血管内皮细胞功能障碍相关疾病中的应用。
全文摘要
抑制MBD2表达的抑制剂及其应用，本发明涉及能在体内及体外抑制甲基化CpG结合域蛋白2表达的抑制剂，包括核酸分子、遗传结构、siRNA分子以及包含以上一个或多个的复合物，能导入哺乳动物细胞，抑制MBD2的表达。抑制MBD2表达的抑制剂是siRNA，其核苷酸序列为正义链5′-GCAAGAGCGAUGUCUACUA-3′；反义链5′-UAGUAGACAUCGCUCUUGC-3′；或其3′末端有两个悬挂碱基tt，核苷酸序列为正义链5′-GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3′；反义链5′-UAGUAGACAUCGCUCUUGCtt-3′。本发明在预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾病中的应用，为制备以MBD2为作用靶点的、预防和治疗血管内皮细胞功能障碍相关疾病的药物或制剂提供了新的选择。
文档编号A61K48/00GK101914541SQ201010248718
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者余其林, 王从义 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院