专利名称：Hiv-1病毒膜融合抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的预防与 治疗领域，特别涉及HIV病毒膜融合抑制剂。
背景技术：
(Acquired Immunodefeciency Syndrome, AIDS), 艾滋病，是一种后天获得性人免疫缺陷疾病，给中国和全世界都带来了严重的社会和经济 问题。从前对付艾滋病最有效的方法是被称为“鸡尾酒疗法”的“高活性抗逆转录病毒疗 法”(HAART)，而现在HIV病毒进入靶细胞的过程成为抗击HIV病毒战胜艾滋病的热门靶点 (Jiang，S.，Lin, K.，Strick, N. & Neurath, A. R. HIV-Iinhibition by a peptide. Nature 365,113 (1993) ；Liu, S., Wu, S. & Jiang, S.HIV entry inhibitors targeting gp41 :from polypeptides to small-molecule compounds. Curr Pharm Des 13，143-162 (2007))。 HIV-I病毒表面的膜蛋白gp41在感染靶细胞的过程中起着介导膜融合的关键作用，而 且还介导了病毒和一些宿主细胞蛋白的相互作用。这些相互作用可能影响病毒感染进 禾呈(Moore，P·L et al· Nature of nonfunctional envelope proteins on the surface of human immunodeficiency virus type LJ Virol 80，2515-2528 (2006) ；Jiang，S. et al. N-substituted pyrrole derivatives as novel human immunodeficiency virus type 1 entry inhibitors that interfere with the gp41 six-helix bundle formation and block virus fusion. Antimicrob Agents Chemother 48，4349-4359 (2004))。国内外对于gp41的蛋白结合性质和功能的研究一直没有中断过。早期的研究集 中在人工合成NHR(N末端七肽重复序列)或者CHR(C末端七肽重复序列)多肽上面。在2003 年，类似于gp41 CHR区域的DP178(T20)作为膜融合抑制剂类药物Enfuvotide (Roche)成功 上市，标志抗HIV的新时代的来临。T20对HIV-I的不同毒株具有广泛的中和活性，尤其是 那些对传统治疗手段具有抗药性的突变毒株。然而，T20的抗药突变株也不断被发现(Wei， X. et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20)monotherapy. Antimicrob Agents Chemother 46， 1896-1905 (2002) ；Lu，J. et al. Rapid emergence of enfuvirtide resistance in HlV—l—infected patients :results of a clonal analysis. JAcquir Immune Defic Syndr 43，60-64(2006))，因此需要更好的新颖的膜融合抑制剂的问世。发明概述本发明提供了一种分离的肽，其抑制HIV-I病毒介导的膜融合，其特征在于所述 肽包含氨基酸序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO :3)。在一个方面，所述肽包含选自如下一组中的氨基酸序列(a) SEQ ID N0:1所示的 氨基酸序列；(b) SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；(c)与(a)或(b)具有至少95%同源性 的氨基酸序列。在另一个方面，所述肽(a)由SEQ ID NO 1或2所示的氨基酸序列组成；或者(b) 由(a)中的氨基酸序列经过修饰的氨基酸序列组成且具有抑制HIV-I病毒介导的膜融合的活性。本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明所述分离的肽。本发明还提供了 一种表达载体，其包含本发明所述分离的核酸分子。本发明还提供了一种分离的重组细胞，其包含本发明所述的表达载体。本发明还提供了一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的分离的肽、分离的核酸 分子、表达载体和/或重组细胞以及任选存在的药物可接受的载体或赋形剂。本发明还提供了本发明所述分离的肽、分离的核酸分子、表达载体或重组细胞在 制备用于抑制或预防HIV-I病毒感染的疫苗或药物组合物中的应用。本发明还提供了本发明所述的分离的肽、分离的核酸分子、表达载体或重组细胞 作为药物的应用。本发明还提供了一种抑制或预防HIV-I感染的方法，包括给予被HIV-I病毒感染 或有被HIV-I病毒感染风险的对象施用本发明所述的分离的肽、分离的核酸分子、表达载 体、重组细胞或药物组合物或疫苗。本发明还提供了制备具有SEQ ID NO :1或2所示氨基酸序列的肽的方法，包括步 骤(a)在宿主细胞中表达权利要求4的肽，裂解细胞，收集上清，任选将上清过滤；(b)将 上清流经亲和柱；(c)加入PreScission蛋白酶溶液，反应一段时间；(d)用酶切缓冲液洗 脱并收集洗脱液。附图简述
图1 纯化后的P20蛋白，SDS-PAGE显示其分子量、浓度和纯度。图2 利用gp41介导膜融合的细胞模型来检测P20的抑制活性，GST蛋白、ADS-Jl 和C 34作为对照蛋白。图3 检测P20蛋白的细胞毒性，其中MT-2细胞和TZM_bl细胞是活病毒抑制实验 中用到的细胞。 图4 :P20以及突变蛋白P20-A、P20-G、P20-H和P20-I抑制HIV实验室适应株Bal
的结果。发明详细描述除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含 义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通 常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参 %白勺 Sambrook et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))所述。本文弓丨用的所有参 考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部援引 加入本文。本发明人通过筛选众多gp41结合蛋白，发现一种由32个氨基酸组成的肽P20 (SEQ ID NO 1)以及其氨基末端突变体P20-A(SEQ ID NO :2)可以强烈地和HIV-I gp41核心区 域6螺旋结构相互作用，并且在低浓度下阻止HIV-I介导的膜融合细胞模型，广泛抑制各种 类型HIV-I实验室适应株和原代病毒株。通过对P20的氨基酸序列进行突变，本发明人发 现P20中的氨基酸序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO 3)对于P20抑制HIV-I的活性是重要的。因此，在一个方面，本发明提供了一种抑制HIV-I病毒介导的膜融合的分离的肽，其包含氨基酸序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO :3)。或者，所述肽(a)由SEQ ID NO :3所示氨基 酸序列组成，或者(b)由(a)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个 氨基酸的氨基酸序列组成。本文所用术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其 包含经肽键结合的9个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的，分枝的或环状的，可包含天 然存在的和/或氨基酸类似物，它可被非氨基酸间断。通常，若氨基酸聚合物是长的(例如 超过50个氨基酸残基)，其优选称为多肽或蛋白质，但是若其是50个氨基酸长或更短，优选 称为“肽”。在另一个方面，本发明提供了一种抑制HIV-I病毒介导的膜融合的分离的肽，其 包含(1)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；(3)与SEQ ID NO 1-2具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性的氨基酸序 列。在另一个方面，本发明提供了一种抑制HIV-I病毒介导的膜融合的分离的肽，所 述肽(a)由SEQ ID NO :1或2所示的氨基酸序列组成；或者(b)由(a)中的氨基酸序列经 过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有抑制HIV-I病 毒介导的膜融合的活性。本文中所述肽可以由任何合适的现有技术方法制备，例如化学合成、重组表达等 等。对此可以参见例如 Sambrook et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))以及 Blackwell Scientific Publications 出版、Nicholson 编辑的 “P印tide Synthesis” 中 Atherton 和 Sh印pard 的第 9 章 “P印tide Synthesis” 所述。在本文中，所述“修饰”优选是本领域所熟知的保守序列修饰，包括氨基酸取代、添 加或缺失。氨基酸修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如在编码蛋白的核酸中进 行定点诱变、分子克隆、寡核苷酸指导的诱变和随机PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括 其中氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基取代的那些。本领域已经确定 了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、 精氨酸、组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷的极性侧链氨基酸 (例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链氨基 酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分 支的侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯 丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员已知也可以使用除了上述之外的其他类别氨基酸家族。 相似的较小变化也包括氨基酸缺失或插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可 以找到关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除其免疫学活性的指导。 本领域技术人员已知的计算机算法例如Gap或者Bestfit可用于优化对比氨基酸序列以对 比及限定相似或相同的氨基酸残基。例如，本文上述取代一或多个氨基酸可以是将SEQ ID NO :1、2或3中氨基酸残基 取代为具有相似结构或化学性质的氨基酸残基，例如将SEQ ID NO :1中第5位的氨基酸残 基Gly取代为Ala，将SEQ ID NO 2中第位5的氨基酸残基Gly取代为Ala，或者将SEQ ID NO :3中第6位的氨基酸残基Gly取代为Ala。
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或者，本文上述缺失一或多个氨基酸可以是缺失SEQ ID NO :1中第1位的氨基酸 残基，SEQ ID NO 2中第1位的氨基酸残基，或者SEQ ID NO 3中第9位的氨基酸残基。或者，本文上述添加一或多个氨基酸可以是在SEQ ID NO :1中第1位添加氨基酸 残基Ala，在SEQ ID NO :2中第1位添加氨基酸残基Ala，或者在SEQ ID NO :3中第9位添 加氨基酸残基Ala。本文所用术语“抑制HIV-I病毒介导的膜融合”是指抑制HIV-I病毒与靶细胞融 合的活性。本文所用术语“同源性”是指对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同 氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62阵列计算同源性百分比，该算法可在NCBI 网站(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)获得。优选所述同源物是功能性同源物，即其显示 显著的相似性(例如在氨基酸水平大约50%序列相同性)并且如其相应蛋白质一样执行相 同功能。至少大约60 %，至少大约70 %，至少大约80 %、至少大约90 %、至少大约95 %、至 少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或更高的序列相同性的功能性 同源物是优选的功能性同源物。在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明所述分离的 肽。在一个实施方案中，所述核酸分子具有SEQ ID NO :4或5所示序列或其简并序列。在本文中，术语“核酸”，“核酸分子”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，定 义任何长度的多聚物，如聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA，基因组DNA，质粒，载体，分离 的DNA和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA)或混合的聚核糖-聚脱 氧核糖核苷酸。它们包含单链或双链，线性或圆形，天然或合成的多核苷酸。对于指定的核酸而言，“编码”或者“被编码的”是指包含用于翻译为指定蛋白的信 息。编码蛋白质的核酸在核酸的翻译区内可包含非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺少 这种插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。编码蛋白的信息由使用密码子而指定。本文所用术语“分离的”是指如核酸或者蛋白质等材料，其与其天然存在的环境相 分离。所述分离的材料任选包含在其天然环境中未发现的材料。在另一个方面，本发明还提供了一种表达载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、 粘粒或人工染色体中。如本文所用，“表达载体”是重组或者合成产生的核酸构建体，其具有 一系列指定核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在宿主细胞中转录，例如表达载体除了 编码要表达的核酸序列以外还可包括衍生自与用于表达的宿主相容的复制和控制序列以 及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。所述核酸构建体可以被掺入质粒、染色体、线粒 体DNA、质体DNA、病毒或者核酸片段中。本领域已知且可商购许多合适的表达载体，例如原 核表达载体、酵母表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫细胞表达载体、植物细胞表达载体。在 一个实施方案中，本文所述表达载体是pGEX-6p-2 (Amersham Biosciences)。“宿主细胞”是指含有载体且支持该载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是 原核细胞如大肠杆菌细胞，或者真核细胞如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或者哺乳动 物细胞。在另一个方面，本发明还提供了一种分离的重组细胞，其包含本发明所述表达载 体。
如本文所用，“重组细胞”是指通过导入异源核酸而修饰的细胞，或者所述细胞源 于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞内未以相同 形式发现的基因，或者由于有意的人为干预而表达天然基因，否则该天然基因会异常表达、 低表达或者根本不表达的。如本文所用的术语“重组”不涵盖细胞通过天然发生的事件(例 如自发突变、天然转化/转导/转位)所产生的改变，例如那些没有有意的人为干预而发生 的改变。本文所述重组蛋白表达宿主细胞可以是本领域使用的任何真核细胞或原核细胞， 例如HEK293，HEK293T，CHO, S2，大肠杆菌细胞等。在一个实施方案中，所述宿主是表达P20 或P20A基因的重组质粒转化的重组蛋白表达细菌如R0SSETA菌株。在另一个方面，本发明还提供了一种药物组合物或疫苗，其包含本发明所述分离 的肽、分离的核酸分子、表达载体和/或重组细胞以及任选存在的药物可接受的载体或赋 形剂。在另一个方面，本发明还提供了本发明所述分离的肽、分离的核酸分子、表达载体 或重组细胞在制备用于抑制或预防HIV-I病毒感染的疫苗或药物组合物中的应用。在另一个方面，本发明还提供了本发明所述分离的肽、分离的核酸分子、表达载体 或重组细胞作为药物的应用。本发明的药物组合物或药物包括例如适于口服、直肠、鼻、局部、腹膜和胃肠外 (包括肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物。或者通过吸入或吹入给予的那些组合物。 可以局部或全身性给予。优选通过口服或静脉内途径给予。本发明的药物组合物包括本领 域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、 多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、 悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。本发明的所述药物组合物或药物可以包含药物可接受的载体、赋形剂和/或稀释 剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、刺槐橡胶、 藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯 甲酸甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、甘油、海藻酸钠、盐水和水，也可以包含添加 剂如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂及另外的溶剂或者增溶剂或 者实现储存效应的物质。对于口服施用，药学上可接受的载体可包括粘合剂、润滑剂、崩解 剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂以及芳香剂。对于注射制剂，药学上可 接受的载体可包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部施用制剂， 药学上可接受的载体可包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。将肽或核酸分子配制为药物组合物可参见Gennaro，A. L. and Gennaro， A. R. (2000)Remington :The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed. , Lippincott Williams & Wilkins， Philadelphia， PA ;Crowder， Τ· Μ· et al. (2003)A Guide to Pharmaceutical Particulate Science. Interpharm/CRC, Boca Raton, FL ；禾口 Niazi, S. K. (2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,CRC Press,Boca Raton, FL0在另一个方面，本发明还提供了一种抑制或预防HIV-I感染的方法，包括给予被 HIV-I病毒感染或有被HIV-I病毒感染风险的对象施用本发明的分离的肽、分离的核酸分 子、表达载体、重组细胞、药物组合物或疫苗。
本发明使用的术语“施用”表示通过合适的方法将预定量的物质导入病人。本发 明的分离的肽、分离的核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物或疫苗可以通过任何通 常途径施用，只要其能到达所希望的组织。可以考虑多种施用方式，包括腹膜内、静脉内、肌 内、皮下、透皮、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内，但是本发明不限于这些举例说明的施用方 式。在另一个方面，本发明还提供了制备本发明所述肽例如具有SEQ ID NO :1或2所 示氨基酸序列的肽的方法，包括步骤(a)在宿主细胞例如R0SSETA菌株中表达所述肽，裂 解细胞，收集上清，任选将上清过滤，例如使用0. 45 μ m滤膜过滤上清；(b)将上清流经亲和 柱，例如谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione-S印harose)4B亲和柱；(c)加入PreScission 蛋白酶(PP)酶溶液，反应一段时间(例如在1. 5ml PP酶切缓冲液中加入10 μ g PP酶配制 PP酶溶液(浓度为6. 67 μ g/ml)，在室温反应2h或在4°C反应过夜)；(d)用酶切缓冲液洗 脱并收集洗脱液。本领域技术人员已知各种细胞培养以及表达、收集、纯化以及检测重组蛋白的技 术，其均可以用于本发明。对此可参见例如J. Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)和 F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988), Ed Harlow andDavid Lane(editors)。
实施例本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发 明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领 域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本 发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改 变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。实施例1、P20和P20-A的制备1. 1 材料PCR扩增的酶及dNTP 购自Takarra公司；PCR扩增引物由上海生工公司合成，经HAP方法纯化；Takara限制性内切酶(BamH I、Xho I)购自大连宝生物公司；TakaraT4连接酶购自大连宝生物公司；18% Tris-glycine 凝胶购自 Invitrogen 公司(Carlsbad，CA)；谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱购自Amersham公司(Sweden)；原核表达载体pGEX-6p-2，PreScission 蛋白酶(PP 酶)购自 Amersham Biosciences (瑞典)。大肠杆菌DH5和BL21购自Invitrogen。其余常规化学试剂均为国产分析纯，除非 另外指明。1. 2实验步骤1. 2. 1质粒构建
为获得重组蛋白P20(HPSSGINAEWPLWPGEAGWGRLEGRRTYEAEI(SEQ ID N0:1))禾口 P 20-A (AAASGINAEffPLffPGEAGffGRLEGRRTYEAEI (SEQ ID NO 2)),我们构建了 pGEX_6p_P20 和 pGEX-6p-P20-A重组质粒，它们均为将PCR扩增的P20和P20-A的DNA序列经BamH I和Xho I酶切后连接入用相同酶切的pGEX-6p-2载体后获得。合成P20和P20-A的DNA序列，分别如下所示P20 DNA cacccaagcagtggtatcaacgcagagtggccattatggccgggggaagccgggtggggcaggctggaa ggaagacgaacctacgaagcagagatc(SEQ ID NO 4)P20-A DNA gcagcagcaagtggtatcaacgcagagtggccattatggccgggggaagccgggtggggcaggctggaa ggaagacgaacctacgaagcagag(SEQ ID NO 5)用于P20DNA的PCR引物为P20-P1 :aga ggatcc cacccaagcagtggtatc(SEQ ID NO 6)P20-P2 :aga ctcgag gatctctgcttcgtaggt(SEQ ID NO 7)用于P20-A DNA的PCR引物为P20-A-P1 :aga ggatcc gcagcagcaagtggtatc(SEQ ID NO 8)P20-A-P2 :aga ctcgag gatctctgcttcgtaggt(SEQ ID NO 9)使用P20或P20-A的DNA序列为模板，分别以引物对P20-P1和P20-P2、或 P20-A-P1 和 P20-A-P2 通过常规 PCR (PCR 条件-MV IOmin, 30 个循环 94°C、30s，55°C、30s， 72°C、30s，最后72°C 5min)扩增基因片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR扩增 片段，所述片段的上游带BamHI酶切位点，下游带有XhoI酶切位点。PCR得到的P20或P20-A 片段通过BamH I+Xho I双酶切，然后连接到同样利用BamH I+Xho I双酶切的pGEM_6p-2 载体，获得pGEM-6p-P20或pGEM-6p-P20_A重组表达质粒。 3.2.2重组蛋白的表达提纯将重组质粒pGEM-6p_P20或pGEM-6p-P20_A加入感染态Rosseta菌株 (Invitrogen)中，冰水浴30min后放入42°C水浴热激1. 5min，然后直接涂布在LB培养基 平板中37°C培养过夜。然后挑取单斑，在LB培养基中37°C 220rpm振荡培养过夜，第二天 以1 50转接到新鲜的LB培养基中进行诱导表达。表达条件为在细菌生长到0D600约 0. 6，加入IPTG至终浓度为0. ImM, 30°C诱导6h，10，OOOrpm离心收获细菌，用PBS洗涤一次， 菌沉淀于-20°C冻存(冰冻有利于细菌的裂解)。GST融合蛋白纯化步骤如下1). 500ml LB培养基中的细菌沉淀可以在20ml冰冷的PBS(pH7. 2)中重悬，加入 溶菌酶粉末 20mg，加入 2ml 10% Triton X-100 PBS 溶液，力口入 100 μ 1 5mg/ml DNase 和 RNase，冰浴，快速搅拌30min至溶液不再粘稠。2).冰浴超声裂解，超30s，停30s，共十次。20，OOOrpm离心20min，收集上清。3). 0. 45 μ m滤膜(江晨生物)过滤上清，滤液用于亲和纯化重组蛋白。4).准备谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱，用Triton X-100 PBS (pH7. 2)溶液 洗涤1. 5ml柱材后，将步骤3中过滤的上清流过亲和柱，流速为30ml/h。重复上样一次。5). 50ml 0. 8M NaCl PBS(pH7. 2)溶液洗柱，去除大部分非特异性吸附的蛋白，最后用1倍柱床体积的PBS除去高盐溶液。6).换用 PreScission 蛋白酶(PP)酶切缓冲液(50mM Tris HCl, 150mMNaCl, ImM DTT, ImM EDTA，pH7. 0)平衡亲和柱。然后用1. 5ml该缓冲液稀释10 μ g PP酶，加入放干溶 液且底端封闭后的亲和柱中，吹打均勻，室温反应2h，或4°C过夜。7).打开亲和柱底部端口，收集反应液，并加入1倍柱床体积的酶切缓冲液洗柱一 次，收集洗液。反应液和洗液中就是切下的蛋白P20或者P20-A。PP酶也是GST融合蛋白， 没有酶切位点，因此它可以结合在亲和住上不被洗下。8).使用18% Tris-glycine凝胶，经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白(结果见图1)， 然后可以透析到不同需求的溶液中，4°C可以长期放置。9).再生亲和柱(按照产品说明书)。可用6M的盐酸胍冲洗或浸泡15min。处理 后的柱材用20%乙醇保存。实施例2 :P20抑制细胞融合2. 1 材料细胞系3T3. Τ4. CXCR4细胞系可稳定表达⑶4和CXCR(HIV包膜蛋白的受体和辅 助受体)。CHO-WT细胞系稳定转染HIV-1HXB2 Env表达质粒ρΕΕ14，可表达HIV-1HXB2 Env gpl60o 所述细胞系购自 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。GMEM-S选择性培养基的配制。1升GMEM培养基包含914ml去离子水，40g MEM w/o L-谷氨酰胺(Gibco)，36ml 7. 5%碳酸氢钠(Gibco)，20ml 50倍浓缩的核苷贮液，IOml 100倍浓缩的谷氨酸+天冬酰胺 贮液，IOml IOOmM丙酮酸钠(Gibco)，IOml非必需氨基酸(Gibco)。50倍浓缩的核苷贮液配制方法如下分别称取35mg腺苷、35mg鸟苷、35mg胞苷、 35mg尿苷、12mg胸苷，加入IOOml去离子水，搅拌溶解，分装冻存于_4(TC冰箱中。100倍浓缩的谷氨酸+天冬酰胺贮液配置方法如下分别称取600mg L-谷氨酸 (Gibco), 600mg L-天冬酰胺(Gibco)，加入IOOml去离子水溶解，分装冻存于_40°C冰箱中。GMEM培养基配好以后，无菌条件下过滤，避光保存于4°C冰箱中。GMEM-S培养基 需要在配好的GMEM培养基中加入400 μ M蛋氨酸亚砜酰亚胺(methionine sulfoximine, MSX)；建议预先配制18mg/ml的MSX贮液，溶于GMEM培养基中，过滤后保存于_20°C冰箱中。以上所用实验试剂除特别说明外，均为Sigma公司产品。CHO-WT细胞培养于含10%胎牛血清的GMEM-S培养基中，培养环境为37°C恒温，含 5% CO2的细胞培养箱。2.2实验步骤3T3. T4. CXCR4细胞用EGTA消化液(0. 5mM)消化收集，并用GMEM-S培养基洗涤充 分分散，转移到96孔细胞培养板，5 X IO4个细胞/孔，30分钟后细胞贴壁铺单层。经丁酸钠(ImM)刺激22小时的CHO-WT细胞用EGTA消化液(0. 5mM)消化收集，并 用GMEM-S培养基洗涤充分分散，计数后分装到无菌的1. 5ml离心管中，每管3 X IO4个，加 入适当稀释度的重组蛋白/肽，终体积150μ 1，37°C温育30分钟。CHO-WT细胞与样品(P20或其它对照抑制剂例如GST蛋白、ADS-Jl和C 34(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program))温育后将混合物力口入已铺满 3T3. T4. CXCR4的96孔细胞培养板上，37°C，5% CO2培养箱中培养。
培养24小时后，在显微镜下计数并拍照。每孔计数2次，取平均值。重复两次实验 取平均值。样品抑制率=(1-样品孔中合胞体的数目/阴性孔中合胞体的数目)X100%。2.3实验结果P20在此方法下检测，IC50 = 0. 108 μ Μ,具有很高的抑制率(见图2)。IC50是指样 品抑制率为50%时抑制剂的浓度。实施例3 :Ρ20和Ρ20-Α抑制HIV-1病毒株3. 1 材料HIV-I 实验室适应株(NL4-3、ΙΙΙΒ、Bal)及检测用细胞(TZM-bl、MT-2)购自 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。焚光素酶检测试齐Ll盒购自 Promega。 HIV-I 原代病毒株(94UG103 (A, X4R5)，92RW008 (A, R5)，92US657 (B, R5)，92BR014 (B, X4R5)， 93MW959(C, R5)，92IN101(C，R5)，92BR025 (C，R5)，94UG118 (D，R5)，92UG001 (D，X4R5)， 92TH009(A/E, R5)，92TH023 (E，R5)，93BR020 (F，X4R5)，RU570 (G, R5)，BCF02 (0, R5))根据 Li, L. et al. , "3-hydroxyphthalic anhydride-modified chicken ovalbumin exhibits potent and broad anti—HIV—l activity :a potential microbicide for preventing sexual transmission of HIV-1，，，Antimicrob Agents Chemother 54:1700-11(2010)所 述方法分离并检验。3.2实验室适应株的检测方法取状态良好的TZM-bl细胞100μ 1，浓度约为IX IO5个/ml，在DMEM培养基中 37°C,5% CO2条件下培养过夜。将100倍TCID5tl (50%的组织感染剂量)的病毒感染细胞，同时加入指定浓度的抑 制剂(P20, P20-A或者T-20)，然后37°C,5% CO2继续培养。在感染的第四天后收集细胞，然后用50μ 1的细胞裂解液(sigma)裂解。利用荧 光素酶检测试剂盒检测。用荧光计测定读数。利用CalcuSyn 软件(BI0S0FT)计算 IC5tl 的值。3. 3原代病毒株的检测方法RPMI 1640培养基加10%血清(Sigma)来培养MT-2细胞。利用100倍TCID5tl (50%的组织感染剂量)的原代病毒来感染在96孔板中200 μ 1 培养基中密度为IX IO4个/ml的MT-2细胞。接着加入指定浓度的抑制剂(P20，P20-A或 者 T-20) ,37°C,5% CO2 培养过夜。去掉培养上清，加入新鲜培养基，继续培养。感染后的第四天，从孔中吸出100μ 1培养上清，加入5%体积的Triton-XlOO，然 后利用ELISA方法(威格拉斯)检测其中的p24抗原量。利用CalcuSyn软件计算IC5tl的值。结果见表1_3。表1 :P20和P20-A蛋白的抑制实验室适应株的结果。对3株广泛研究的病毒株， P20和P20-A均表现出了低微摩量级的抑制力。
多肽抑制HIV-I不同病毒株IC50 (μΜ)
0.68±0.37 表2 :P20和P20-A对T20抗性病毒株的抑制结果。可以看出，这2个多肽对T20 无法抑制的病毒株都表现出了更强的抑制力。
HIV-I毒株
表型
HIV-1 NL4-3(36G) N42S HIV-1NL4-3(36G) V38A/N42D HIV-1 NL4-3(36G) V38E/N42S
T20 敏感株 0.02±0.01 1.32±0.80 0.81±0.08 T20 抗药株 0.32士0.05 1.11±0.30 0.73±0.09 T20 抗药株 9.62±2.60 2.31士0.70 0.95士0.05 表3 :P20和P20-A对不同的HIV-I病毒株抑制结果。可以看出，这2个多肽对于 不同的HIV-I亚型毒株都存在广泛的抑制活性。
HIV-I毒株(亚型，
辅受体嗜性)
IC50 (μΜχ平均值±标准差)
94UG103 (A, X4R5)5.24±0.052.19 土 0.080.027±0.00792RW008 (A, R5)9.33 士 1.514.96±0.350.021±0.0192US657 (B, R5)4.20±0.831.89 士 0.160.105±0.0192BR014 (B, X4R5)3.79±0.531.63 士 0.120.058士 0.1293MW959 (C, R5)2.99±0.071.57±0.040.009±0.00292IN101 (C, R5)4.79 士 0.192.94±0.110.022士 0.00592BR025 (C, R5)4.86±0.851.72±0.170.011±0.00794UG118(D’R5)32.9 土 17.613.1±0.520.927±0.06192UG001 (D,X4R5)10.5 土 1.734.43±0.280.123 士 0.07292TH009 (A/E, R5)4.69±0.482.79±0.090.087±0.01292TH023 (E, R5)41.5±10.923.2 士 0.330.487±0.07893BR020 (F, X4R5)13.6 士 2.347.25±1.690.093±0.025RU570 (G, R5)16.2±4.107.87±2.010.116±0.021BCF02 (0, R5)10.2±1.124.52±0.140.063±0.015
实施例4 :Ρ20的细胞毒性 4. 1材料 ΜΤ-2 细胞和 TZM-bl 细胞均购自 NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram。4. 2方法步骤细胞毒性利用经典的XTT比色法进行检测(参见Jiang，S. B.，et al.， “Enhancement of human immunodeficiency virus type 1 infection by antisera to peptides from the envelope glycoproteins gpl20/gp41，，· J Exp Med 174 1557-63(1991))。简而言之，在96孔板中将100 μ 1不同浓度的P20蛋白加入到100 μ 1靶 细胞中(IO5细胞/ml)。在37°C孵育4天之后，加入50μ 1的XTT溶液(lmg/ml的XTT和 0. 02μ M的硫酸甲酯吩嗪)。4小时之后，检测450nm波长下的吸光度，然后计算细胞毒性。4.3 结果如图3所示，P20没有细胞毒性。实施例5 确定P20的核心9肽序列为了确定9个氨基酸残基序列WGRLEGRRT(SEQ ID NO :3)是P20中发挥抑制作用 的核心序列，构建了 3个突变蛋白P20-G、P20-H和P20-I，其序列分别是P20-G=HPS SGI NAE WPL WPG EAG AAA LEG RRT YEA EI(SEQ ID NO 10)P20-H :HPS SGI NAE WPL WPG EAG WGR AAA RRT YEA EI(SEQ ID NO 11)P20-I :HPS SGI NAE WPL WPG EAG WGR LEG AAA YEA EI(SEQ ID NO 12)然后如实施例3 "3. 2实验室适应株的检测方法”所述，利用实验室适应株Bal检 测P20、P20-A、P20-G、P20-H和P20-I抑制病毒的能力。5.3 结果如图4所示，与P20和P20-A明显不同，在核心9肽序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO 3) 中具有突变的P20-G、P20-H和P20-I都丧失了抑制病毒侵染的能力，即丧失了抑制活性，而 在末端具有突变的P20-A没有丧失抑制活性，证明这9个氨基酸残基对于蛋白抑制病毒的 能力起着至关重要的决定作用。本发明所述肽(例如P20和P20-A)具备作为新型抑制剂的优势。首先，其由32 个氨基酸组成，本身分子量很小，且部分和人体蛋白同源(其和人体自身蛋白TNNI3K具有 同源性)，因此在人体中的免疫原性很低，不会被人体的免疫系统快速清除。第二，它具有非 常好的水溶性，也极易制备和纯化，利用最简单的大肠杆菌原核表达体系就可以达到每克 菌体提取5毫克纯蛋白的制备水平，极易工业化推广应用。第三，它稳定性非常强，包括反 复冻融和室温长期放置都不会导致蛋白大量降解、变性或者失活。这些性质对P20和P20-A 在实际中的应用提供了很大的方便。当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步 骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。
权利要求
一种分离的肽，其抑制HIV 1病毒介导的膜融合，其包含氨基酸序列WGRLEGRRT(SEQ ID NO3)，优选所述肽长度少于50个氨基酸。
2.权利要求1的肽，其中所述肽(a)由SEQID NO :3所示的氨基酸序列组成，或者(b)由(a)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸的氨 基酸序列组成。
3.权利要求1的肽，其包含(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；(b)SEQID NO 2所示的氨基酸序列；(c)与(a)或(b)具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性 的氨基酸序列。
4.一种抑制HIV-I病毒介导的膜融合的分离的肽，其中所述肽(a)由SEQID NO :1或2所示的氨基酸序列组成；(b)由(a)中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸的氨 基酸序列组成且具有抑制HIV-I病毒介导的膜融合的活性。
5.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项的肽。
6.权利要求5的核酸分子，其具有SEQID NO :4或5所示序列或其简并序列。
7.—种表达载体，其包含权利要求5或6的核酸分子。
8.一种分离的重组细胞，其包含权利要求7的表达载体。
9.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求1-4任一项的肽、权利要求5或6的核酸分 子、权利要求7的表达载体和/或权利要求8的重组细胞以及任选存在的药物可接受的载 体或赋形剂。
10.权利要求1-4任一项的肽、权利要求5或6的核酸分子、权利要求7的表达载体或 权利要求8的重组细胞在制备用于抑制或预防HIV-I病毒感染的疫苗或药物组合物中的应用。
11.权利要求1-4任一项的肽、权利要求5或6的核酸分子、权利要求7的表达载体或 权利要求8的重组细胞作为药物或疫苗的应用。
12.—种抑制或预防HIV-I感染的方法，包括给予被HIV-I病毒感染或有被HIV-I病 毒感染风险的对象施用权利要求1-4任一项的肽、权利要求5或6的核酸分子、权利要求7 的表达载体或权利要求8的重组细胞或权利要求9的药物组合物或疫苗。
13.制备权利要求1-4任一项的肽的方法，包括步骤(a)在宿主细胞中表达权利要求1-4任一项的肽，裂解细胞，收集上清；(b)将上清流经亲和柱；(c)加入PreScission蛋白酶(PP)酶溶液，反应一段时间；(d)用酶切缓冲液洗脱并收集洗脱液。
14.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞是R0SSETA菌株。
15.权利要求13或14的方法，其中所述亲和柱是谷胱甘肽琼脂糖凝胶 (Glutathione-Sepharose) 4B 亲禾口柱。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中步骤(c)中PP酶溶液浓度为6.67μ g/ml，在室温反应2h或在4°C反应过夜。
全文摘要
本发明涉及一种抑制HIV-1病毒介导的膜融合的分离的肽，其特征在于所述肽包含氨基酸序列WGRLEGRRT(SEQ ID NO3)。所述肽可以和gp41相互作用，有效阻止病毒包膜蛋白介导的细胞融合，中和HIV-1病毒。
文档编号A61K39/00GK101914143SQ201010261250
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者徐利玲, 朱赟, 杨恒文, 陆路, 陈应华 申请人:清华大学