专利名称：生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法
技术领域：
本发明属于一种药物制备方法，具体地说是一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药 物的方法。
背景技术：
丙型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病，难以治愈。丙型肝炎是由人体感染丙 型肝炎病毒引起的疾病。由于丙型肝炎病毒复制能力极强，病毒表面有一层坚硬外壳，一般 的药物难以渗透进病毒体内，所以病毒难以杀灭，丙型肝炎也就难以治愈。现有技术是用抗 病毒西药治疗，但是由于丙型肝炎病毒构造的特殊性，只能使患者短时期减轻症状，无法根 治疾病。所以发明一种从植物中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，生产对人体无副作用， 能够有效杀灭丙型肝炎病毒的药物是一个重要的任务。生姜是大众日常生活中喜爱的食品，长期以来被认为有抗病防病作用。但是对于 从生姜中提取杀灭丙型肝炎病毒的物质则没有见报道；对于用什么方法提取生姜中含有的 杀灭丙型肝炎病毒物质没有见报道。经检索国内外专利文献，查阅国内外公开出版物均未 见有从生姜中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法的报道。本发明利用安全、经济和便捷的 生姜原料来提取杀灭丙型肝炎病毒的药物，对于治疗丙型肝炎具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法。本发明的目的是这样实现的从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下a生姜洗净晾干，准确称取20重量份，破碎，加入110重量份的95%乙醇浸泡2h ；b用索氏提取器对上述样品进行80°C热回流4h ；c将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释。生姜为姜科姜属多年生宿根草本植物的地下肉质根茎。DMEM培养液为含氨基酸和葡萄糖的培养基。本发明的要点是将生姜粉碎，经95%乙醇浸泡、80°C热回流、过滤、浓缩、除菌、 用DMEM培养液稀释制成。临床使用时根据需要配制成不同浓度药物。本发明的具体实施如下；将Huh-7. 5. 1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37°C、5% C02 (CO2)饱 和湿度的培养箱中培养，细胞培养液中添加100μ g/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。此 细胞为贴壁细胞，培养3天后，用0. 25%胰蛋白酶消化进行传代培养。HCVcc滴度为每毫升 培养上清IO5感染单位，保存于-80°C冰箱备用。生姜购于农贸市场，洗净、晾干。称取生姜20g，粉碎后用95%乙醇120ml (110克) 浸泡2h。随后用索氏提取器对样品分别进行80°C热回流4h，再过滤，将样品液用旋转蒸发仪浓缩至20ml，此为提取原液即1ml提取液含lg原材料的提取物(浓度为lg/ml)。在细 胞室内将4份提取原液进行过滤除菌后，分别用DMEM培养液进行1 10、1 50,1 100、 1 200,1 1000 稀释，得到浓度分别为 100mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、lmg/ml 的生
姜提取液。生姜提取液处理HCVcc具有一定的直接杀灭效果，其机制是影响病毒RNA的合成。本发明的优点是1、原料便宜，成本低。2、方法简单，提取方便。3、对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
对本实用新型做进一步说明。实施例1 提取液对Huh-7. 5. 1细胞毒性测定用胰酶消化Huh-7. 5. 1细胞，按2X104/孔的密度接种至96孔细胞培养板，置5% C02培养箱37°C培养6h，待细胞贴壁后，在每孔中分别加入不同浓度的各类提取液lOiil， 37°C培养过夜，在每孔中加入lOiUCCK-8试剂，继续培养4h。同时设立阴性对照(未加提 取液的细胞孔，加CCK-8)、空白对照(没有细胞，加DMEM培养液，加CCK-8)。用酶标仪测定 各孔450nm吸光度值(0D值)。实施例2 为筛选提取液有无抗HCV活性及其作用的强弱，以及发挥抗病毒作用的途径，设 计以下三组平行实验第一组杀灭病毒取20mg/ml、5mg/ml、lmg/ml 3个浓度的生姜提取液各10 u 1首先和10 u 1 HCVcc 等量混合，37°C作用4h后，再接种到96孔板内(其中H6h-7. 5. 1细胞密度为3X104/孔， 下同)，培养72h后，进行IFA实验，检测细胞内HCV蛋白表达。以HCVcc直接感染的一个孔 为阳性对照、以未加提取液、病毒的一个孔为阴性对照。第二组阻断病毒感染将lOiU不同浓度提取液首先加到含有Huh-7. 5. 1细胞的96孔板内，培养过夜， 弃培养液，用PBS洗涤3次，每孔添加100 u 1培养液后再加10 u 1 HCVcc进行病毒感染，同 时设立阳性、阴性对照。培养72h后进行IFA检测。第三组抑制病毒增殖将10 ill HCVcc感染96孔板内的Huh_7. 5. 1细胞，培养6h，弃培养液，用PBS洗 涤3次，每孔添加100 yl培养液后再加10 yl不同浓度提取液，同时设立阳性、阴性对照， 培养72h后进行IFA检测。实施例3 IFA检测将96孔板中的培养上清吸掉，每孔加入lOOiU甲醇，置_20°C固定 20min，PBS洗涤3次，每次3min。每孔加入0. 1% TritonX-100 (用PBS配制)100 yl，室温 透化30min，PBS洗涤(3minX3次)。每孔加入含3% BSA的PBS 100 yl封闭液，室温封闭1小时。吸掉封闭液，每孔加入丙型肝炎患者血清50μ1 (用封闭液做1 50稀释的血清， 作为第一抗体)，室温孵育2h，PBS洗涤(10minX3次)。每孔加入荧光素FITc标记的抗人 IgG作为第二抗体，避光孵育1小时，PBS洗涤(3minX3次)。实施例4 FQ-PCR检测细胞总RNA的提取和纯化将100 μ 1 HCVcc感染6孔板内的 Huh-7. 5. 1细胞，培养6h后，弃培养液，用PBS洗涤3次，每孔添加2ml培养液后，分别加入 浓度为lmg/ml、5mg/ml、20mg/ml的丁香液(醇提)，培养72后分别收集消化后的细胞，以 3000rpm离心5min去上清。使用RNArose Reagent,按其操作步骤提取总RNA，用DEPC水溶 解，再用酚·氯仿抽提法纯化RNA，再用DEPC水溶解总RNA并测定浓度。RNA的逆转录纯化后的总RNAl μ g，随机引物(0. 5 μ g/ml) 1 μ 1，DEPC处理水补足 至11 μ 1,混勻，于65°C水浴5min，立即冰浴2min，然后加入5XM-MLV buffer 5μ 1，IOMm dNTP 1. 5 μ 1，逆转录酶M-MLV 1 μ 1，DEPC水补足至25 μ 1，混勻，于37°C水浴Ih以合成 cDNA模板。FQ-PCR检测cDNA模板2 μ 1，2X SYBR GreenI 10 μ 1，HCV特异的正向引物和反向 引物(10 μ M)各0.2 μ 1，双蒸水7.6 μ 1，混合后在Smart Cycler定量PCR仪上按以下程序 扩增95°C预变性Imin ；94°C变性5s，60°C退火20s，72°C延伸10s，在延伸步骤末采集荧光 信号，共35个循环；融解曲线分析72°C 95°C，0. 1°C /秒。按标准曲线法进行定量HCV 检测的标准品是含有全长HCV cDNA的质粒pGEM-J4 (浓度梯度为7 X IO3 IO8拷贝/ μ 1) 绘制的标准曲线，实验组样品的Ct值与标准曲线相对照计算检测样品的浓度。再换算成 每 1 μ g 细胞；总 RNA 中的 HCV 基因组当量(genome equivalents per μ g total RNA, GE/ μ gRNA)。实施例5 提取液对HCVcc的杀灭效果第一组IFA实验结果显示，姜液20mg/ml孔为阴性，5mg/ml、lmg/ml两孔阳性细胞 分别为1%、3%。表1生姜提取液对Huh-7. 5. 1细胞的毒性测定(0D值/45(1) 以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进 等，均应包括在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下a生姜洗净晾干，准确称取20重量份，破碎，加入110重量份的95％乙醇浸泡2h；b用索氏提取器对上述样品进行80℃热回流4h；c将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释。
2.根据权利要求1所述的从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，其特征在于生 姜为姜科姜属多年生宿根草本植物的地下肉质根茎。
3.根据权利要求1所述的从香辛植物提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，其特征在 于DMEM培养液富含氨基酸和葡萄糖的培养基。
全文摘要
本发明属于一种药物制备方法，具体地说是一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法。由于丙型肝炎病毒复制能力极强，药物难以渗透进病毒体内，病毒难以杀灭，丙型肝炎也就难以治愈。现有技术是用抗病毒西药治疗，只能使患者短时期减轻症状，无法根治疾病。本发明方法是准确称取生姜20重量份，粉碎至100目，加入110重量份95％乙醇浸泡2h；用索氏提取器对上述样品80℃热回流4h；将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释。本发明的优点是原料便宜，成本低；方法简单，提取方便；对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。
文档编号A61P31/14GK101926975SQ20101026682
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者姚传凤, 杨宇 申请人:姚传凤