微RNA-34a在制备抗肿瘤药物中的用途的制作方法

专利名称：微RNA-34a在制备抗肿瘤药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微RNA在制备抑制DNA断裂修复活性的药物或抗肿瘤药物中的用途。 本发明还涉及微RNA-3^与化疗药物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
DNA损伤修复对维持基因组稳定性具有重要意义虽然遗传是一个相对稳定的过程，但作为遗传物质一种的DNA分子却几乎无时无刻不受到来自各种途径的损伤的威胁，而在漫长的进化过程中，细胞同样进化出了应对各种损伤的修复途径。现在我们知道，即使在正常的细胞生存环境中，DNA的一级结构也会由于和其他化学分子作用而产生种类繁多的改变。在人类细胞功能正常且生存旺盛的适宜温度37°C下，平均每个细胞每天会发生多达18，000次脱嘌呤事件，这一过程是由于连接碱基和磷酸戊糖骨架的化学键被水解断裂而产生[1，2]，而这些受损的核苷酸必须被替换掉。另一类在生理温度和PH情况下常见的自发DNA结构异常是胞嘧啶残基通过脱氨基转换为尿嘧啶。这一事件平均每个哺乳动物细胞每天发生500到1，000次[3，4]，因此自然界就需要进化出相应的手段进行修复。另外，代谢过程中产生的氧自由基也会和DNA反应从而改变或者破坏相应的碱基。S-腺苷蛋氨酸是必需的代谢中间物，同时又是一种弱的烷基化物质，能与DNA反应从而使腺嘌呤残基的第3位氮原子发生甲基化修饰，这类反应平均每个人类细胞每天发生约1，200次[5]。同样，DNA复制的过程中会累积错误，这些错误也必须得到修复，否则对细胞将是灾难性的打击。除此以外，外来的物质和各种刺激也会破坏遗传物质的完整性。来自太阳光中的紫外线、天然存在的放射性物质和地球能够接受的宇宙射线都会产生种类不同的DNA结构异常。随着工业和科技的发展，人类制造出的某些新型化学物质和其他导致环境污染的废弃物都对DNA这种遗传物质产生了巨大的威胁。如果损伤的 DNA不能被及时正确的修复，基因组的稳定性就会受到影响，从而使得肿瘤的发生率增加， 因此研究DNA损伤修复对理解肿瘤发生和治疗有重要的意义。DNA双链断裂的发生、识别和信号转导在多种DNA损伤当中，DNA双链断裂最为危险，因为它可以导致染色体重排或缺失，并与人类肿瘤的发生密切相关[6]。细胞进化了两种保守的途径完成双链断裂修复(DSB r印air，DSBR)，g卩非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组修复 (homologous recombinational repair, HRR) [7] NHEJ 过程主要为 DNA 连接酶 IV 及辅因子XRCC4完成断裂末端的直接连接，这一过程为DSBR的主要途径，并且由于不需要长的同源模板，所以可以在细胞周期的任何时相发生。但NHEJ同时具有错误倾向性，所以有引入突变的可能。另外，在哺乳动物细胞中，存在着程序化的NHEJ过程发生，即免疫球蛋白基因座位的基因重排，这一过程是通过NHEJ完成的。与NHEJ不同，HRR需要一定长度以上的相同序列或接近相同的序列作为模板，才能完成对断裂的修复。这一过程在正常的减数分裂中发生，可以通过重组来增加胚系细胞的遗传多样性，催化反应的相关酶类也和参与损伤修复的过程相同。因为使用了同源或相同序列作为模板，HRR没有错误倾向性。但同时，对体细胞而言，细胞必须经过复制才能具有姐妹染色单体，才能提供修复的模板，所以一般地说，HRR主要发生在细胞周期的S-G2期。需要指出的是，在DNA复制和转录的过程中，拓扑异构酶也会引入双链断裂，但因为拓扑异构酶直接结合断开的末端，并不引起DNA损伤应答反应，在完成功能后，拓扑异构酶又可以直接将断端连接。双链DNA断裂的一个严重后果是在不正确的修复时容易发生染色体重排，这是肿瘤发生的一个重要起始因素，因此，DSB (双链断裂，Double Strand Break)的修复是生物学多个领域中非常重要的研究内容。DSB有两种来源一种是外源性途径，包括离子辐射(放疗、医用放射性核素和宇宙射线等)以及环境中和治疗用化学物质；另一种是内源性途径， 包括代谢产生的活性氧、DNA复制叉破坏、减数分裂重组和V(D) J重组。在外源性途径中，由离子辐射产生的DSB具有重要的意义，因为可控制剂量的离子辐射是该领域广泛使用的研究工具，大量实验数据是在这一系统中得到的。对Gl期的二倍体细胞，每一 Gy的离子辐射可以产生约35个DSB，而一个Gy的离子辐射在相同的细胞中可以产生约1000个单链断裂。另外，某些抗肿瘤药物也可以有效地引起DSB，如依托泊苷可特异性抑制拓扑异构酶II，从而使细胞累积双链断裂；类似的药物还包括阿霉素等。针对DSB的形成，细胞具有复杂而高效的检测机制并将信号传递到修复与复制装置。到目前为止，对于识别DSB断端的蛋白被募集到断裂位点之前的细胞事件所知甚少，而细胞如何在最短的时间内准确地定位断裂的发生仍然是这一领域极具挑战性的课题。不过，在各类研究模型中积累的大量数据依然使我们能够认识到DSB修复的基本过程。两个大分子量的蛋白激酶 ATM(ataxia telangiectasia mutated)禾PATR(AT and Rad3-related)是损伤早期被募集到断裂位点的关键信号传递者[8]。这两个功能相关的蛋白可以磷酸化一系列下游底物，并且它们所在的大的蛋白质复合物可能包含其它损伤应答因子。在接受离子辐射后，细胞内的ATM立即被激活，其激活机制是分子间自身磷酸化， 即ATM 二聚体内分子间相互磷酸化kr-1981，从而改变分子间的相互作用而使二聚体解离，这样单分子的磷酸化ATM激酶活性大大增强。在被激活后，ATM磷酸化H2AX (其磷酸化状态称为γ H2AX)，DNA-PK。ATM磷酸化的下游底物在核内往往呈现焦点(foci)状分布，这些底物蛋白包括5!3ΒΡ1，MDC1/NFBD1, Chkl, Chk2, NBSl, BRCAl 和 FANCD2。总之，ATM 有超过20个底物分子，因而在细胞周期的不同阶段，ATM都作为主要调控和协调因子参与非复制相关的DSB损伤的早期应答。尽管目前并不清楚第一个被募集识别DSB位点的蛋白是什么，ATM仍然是一个主要的候选分子。ATM可以单独或者和诸如53BP1及MDCl的分子共同作用并在数分钟之内定位到DSB位点。作为信号转导分子，自身磷酸化激活的ATM进一步磷酸化Chk2，后者继而磷酸化激活Cdc25A，从而激活细胞周期检定点，为DNA损伤修复提供时间。同时Chk2也可以磷酸化P53，磷酸化的p53可以通过反式激活依赖或非依赖的方式调节损伤修复，细胞周期进程，凋亡以及和DNA损伤相关的细胞衰老。非同源末端连接的修复机制整个NHEJ修复过程是在一套复杂而协调控制的条件下完成的。首先，在DSB形成后，通过上游的识别蛋白传递信号，具有强的双链DNA结合能力的KU70/80 二聚体形成环状结构结合到断裂的末端，并将断裂的末端留出一段很短的游离DNA，为下面的连接提供底物。第二，DNA-PKcs被募集，使Ku复合物发生内向转位，将DNA断端在空间上拉近形成联会结构并且激酶活性被激活。第三，Artemis和DNA-PKcs —起或者在DNA-PKcs之后被募集。第四，DNA-PKcs通过磷酸化激活Artemis，DNA末端发生修饰，同时DNA-PKcs在自身磷酸化后从所结合的DNA上释放出来。第五，Ku复合物募集DNALigaSeIV/XRCC4复合物使得 Ku复合物发生进一步内向转位，并且DNA末端发生进一步加工，最后通过DNA连接酶将断端连接。到目前为止，我们并不知道Ku复合物在连接完成后是如何离开DNA的，因为其强的双链DNA结合活性提示Ku可能不会自发地从DNA链上释放。这里描述的五个步骤是对已知数据的综合，但实际的修复过程绝非如此简单，修复过程中的很多相互作用尚需更深入的研究。一般认为，在NHEJ的最早阶段发生的事件是KU70/80异二聚体和DNA-PKcs激酶的募集，而最近的文献表明Ku70/80和DNA-PKcs可以在数秒钟内结合到活细胞中人为引入的DSB [9，10]。可能Ku70/80对DNA末端极强的亲和性以及它们在核内高丰度的表达使得此二聚体能够在断裂发生后立即结合上去。实际上，对活细胞中DSB位点处KuSO分子动力学的进一步考察发现，Ku复合物并不牢固地结合DNA末端，而是在DNA结合状态的Ku以及游离的Ku之间发生动态交换[10]。另外，在NHEJ过程中一个重要的辅助因子是DNA-PKcs，这是一个DNA依赖的蛋白激酶，它与DNA的相互作用是通过KuSO介导的，电子显微镜的图像显示，DNA-PKcs可以在 DNA分子间起到桥接的作用，将DNA末端拉近并形成联会结构[11-14]。DNA-PKcs与DNA 末端和Ku 二聚体的相互作用是其丝氨酸/苏氨酸激酶活性必须的，但该激酶活性在NHEJ 中的作用却并不十分清楚，尽管这一活性是NHEJ得以顺利进行需要的。体外实验鉴定出了多个DNA-PKcs的底物，包括XRCC4，Ku70/80和细胞周期调节蛋白p53，DNA-PKcs可以磷酸化这些底物，这提示其可能在细胞周期阻滞和NHEJ本身的调节中起到作用，然而在体内实验中这些底物并未最终确定或者不同实验室尚有争议[15-19]。而研究得最为深入的 DNA-PKcs底物是其本身，研究表明DNA-PKcs的自身磷酸化对NHEJ顺利进行非常重要，而自身磷酸化可能改变了 DNA-PKcs与NHEJ其他修复蛋白形成的复合物构象[20]。除了上面提到的经典的参与NHEJ的蛋白质因子外，2006年两个研究小组同时发现了一个对NHEJ有重要作用的新的分子一个小组将其命名为Cerrumnos，另一个命名为类XRCC4因子(XRCC4-likefactor，XLF)，从后一个名称可以看出，这个33kD的蛋白质因子与XRCC4具有序列和结构上的同源性[21，22]。XLF/Cernunnos因子是在一株DSB修复和 V(D) J重组缺陷的细胞被报道后发现的，因为已知的NHEJ基因不能补偿功能缺陷，而XLF/ Cernunnos可以补偿该细胞株的缺陷，说明XLF/Cernunnos参与NHEJ介导的DSB修复。XLF/ Cernunnos可以和连接酶IV/XRCC4复合物相互作用，提示XLF/Cernurmos可能加强或调节 DNA末端的连接效率。目前被广泛接受的NHEJ工作模式的假说主要涉及了上述的五个连续发生的步骤，虽然更多的蛋白质相互作用以及复合物晶体结构的解析数据不断增加，该领域仍有几个关键的开放性问题需要解决如修复结束后结合在断端的KU70/80复合物的命运如何， DNA-PKcs的自身磷酸化引起构象改变的意义是什么。这些都需要更为深入的研究[23]。同源重组修复的机制在DSB形成后，有两类保守的机制修复，一类是上面详细讨论了的NHEJ途径，另一类是同源重组介导的修复。同源重组的基本过程从概念上可以粗略地分为三个大的阶段，即联会前、联会和联会后；而从整个过程连续发生的事件分，包括DSB末端的处理、游离单链的侵入、同源配对、Holliday junction的形成、分支的迁移和Holliday junction 的解离。具体地说，在联会前阶段，DSB末端首先被识别并加工成以3’ -OH为末端的单链尾巴结构。在联会阶段由RAD51-SSDNA复合物介导链侵入至同源模板DNA形成D-环结构，在D-环中间体形成后至少可能通过三种结构完成重组一种是合成依赖的链退火 (synthesis-dependent strand annealing, SDSA), BP jfA Wljl^^j^ir^ DNA 从模板链脱离，与DSB的另一个末端退火配对，从而形成局部的DNA序列转换但不发生链交叉，这一过程可能会发生多次的链侵入，合成和脱离；另一种途径是断裂诱导的复制 (break-induced replication, BIR)，即D-环结构被装配成完整的复制叉，拷贝另一条染色体远端的完整序列，最终发生杂合性丢失(loss-of heterozygosity, LOH)；而第三种DSBR 途径则形成Holliday junction, Holliday junction可最终被解离酶以不同方式加工产生非交叉(non-crossover)和交叉(crossover)产物，或者通过BLM介导的分支迁移和 TOPOIII-alpha催化的解离而最终形成非交叉的产物[24，25]。DNA损伤修复活性在多种肿瘤中异常升高从上面的叙述中知道有效的DNA修复活性对于维持基因组稳定性和预防肿瘤发生具有重要意义。但是，在肿瘤的发生过程中，癌基因产物会导致DNA复制叉位置的DNA损伤[26，27]，而为了保证肿瘤细胞的基因组的完整，肿瘤细胞会通过不同的机制加强某一种或几种修复的通路来保证其自身的异常增殖。例如同源重组修复通路中的核心蛋白RAD51 被发现在多种肿瘤中表达水平异常升高，同时与肿瘤的预后负相关，而RAD51的异常升高发生在转录水平，因此有研究使用RAD51的启动子区介导肿瘤抑制基因的表达以实现肿瘤治疗的作用[28]。另外在临床上广泛使用的抗肿瘤药物依托泊苷(VP16)对肺癌的治疗具有良好的效果，但是同样发现某些肺癌细胞对该药物具有明显的抗药性，而研究发现这类肺癌细胞中RAD51的表达异常升高，促使肿瘤细胞对DNA损伤的修复能力增加[29，30]。除了 RAD51外，还有多种已被发现的DNA修复通路中的蛋白在肿瘤细胞的增殖过程中促进DNA 损伤的修复，比如ATM、PARP、DNA-PK、DNA-PKcs，这些蛋白均参与DNA双链断裂的修复，而多项研究正在开发针对这些蛋白的肿瘤治疗药物[31]。微RNA在DNA双链断裂修复中具有潜在的调控作用微RNA(microRNA)是一类长度在21_23个核苷酸的单链RNA分子，参与基因表达的调控。microRNA最早由Lee及同事于1993年在秀丽线虫中发现，而直到2001年才正式命名为microRNA[32，33]。在2008年的早期通过使用IBM计算机系统计算分析提示在哺乳动物细胞基因组上可能存在多至5万个不同的microRNA分子，而每一个可能有上千个靶基因(Genetic Engineering & Biotechnology News,Mary Ann Liebert, Inc. . Retrieved on 2008-05-16.)。最近的研究表明，microRNA功能广泛，在生物体内的多种生物学过程和调控途径中扮演着关键角色，如发育进程控制、细胞生长与凋亡、细胞分裂、细胞分化与器官发育、病毒感染和机体生理活动稳态维持等[34，35]。而且，一些重要的microRNA的失调会导致细胞调控事件的异常，甚至诱发肿瘤。microRNA与其靶分子以及调控其自身表达的转录因子组成了一个复杂的调控网络，使我们对于基因表达调控网络的认识更加全面和深入。通过生物信息学方法的分析发现，多种DNA双链断裂修复基因的3’ -非翻译区都有微 RNA的可能结合位点，因此微RNA在DNA双链断裂修复的过程中有潜在的调控功能。
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微RNA-34a 的序列为 5，-UGGCA⑶⑶CUUAGCUGGUU⑶U-3，(SEQ ID NO :1)，其编码基因于2003年由Bartel博士等人通过生物信息学方法在人类基因组中发现，其序列及相关信息可于微RNA数据库(http://www.mirbase.org)中获得。现在发现其在某些细胞中调节细胞周期或引起细胞凋亡，尚未有关于其在调节细胞修复双链断裂活性以及针对DNA修复活性增加的肿瘤的抗肿瘤治疗中的相关研究。

发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题在于探究微RNA-3^在调节DNA损伤修复中的活性及在治疗肿瘤疾病中的用途。因此，本发明的第一方面涉及微RNA-3^在制备抑制DNA断裂修复活性的药物中的用途，优选地，所述微RNA-3^为纯化的分离表达物、合成产物或可复制转录的重组表达载体形式，优选地，所述微RNA-3^为可复制转录的重组表达载体形式，最优选地，所述微 RNA-34a为重组腺病毒表达载体。本发明的第二方面涉及微RNA-3^在制备抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述肿瘤的细胞中DNA断裂修复活性增强，优选地，所述肿瘤为实体瘤，优选地，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌。优选地，所述微RNA-3^为纯化的分离表达物、合成产物或可复制转录的重组表达载体形式，优选地，所述微RNA-3^为可复制转录的重组表达载体形式，最优选地，所述微RNA-3^为重组腺病毒表达载体。本发明的第三方面涉及微RNA-3^与化疗药物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述化疗药物选自依托泊苷、阿霉素、阿柔比星、硫巴妥苯胺或右丙亚胺。优选地，所述微RNA-3^为纯化的分离表达物、合成产物或可复制转录的重组表达载体形式， 优选地，所述微RNA-3^为可复制转录的重组表达载体形式，最优选地，所述微RNA-3^为重组腺病毒表达载体。优选地，所述肿瘤的细胞中DNA断裂修复活性增强，优选地，所述肿瘤为实体瘤，优选地，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌。优选地，上述方面中所涉及的抗肿瘤药物的剂型为任何适用于RNA药物使用的剂型，优选地，所述剂型为注射剂。换言之，本发明人构建了表达微RNA-3^的重组腺病毒载体并将其转染宫颈癌细胞系HeLa细胞中，发现过表达微RNA-3^可以抑制非同源末端连接途径对双链断裂DNA的修复活性，而这一抑制作用主要是通过靶向关键修复相关蛋白SIRTl完成的。另外，在相同的细胞中微RNA-3^还抑制同源重组途径对HceI诱导的DNA双链断裂的修复活性，进一步的实验确定这一抑制作用主要是通过对SIRTl和同源重组核心因子RAD51的抑制实现的。因此，本发明人首次证实过表达微RNA-3^可以抑制肿瘤细胞对DNA双链断裂的修复。本发明人还使用表达微RNA-3^的腺病毒或对照空病毒感染宫颈癌细胞系HeLa 细胞，进而使用依托泊苷处理细胞产生DNA双链断裂，通过彗星实验发现过表达微RNA-3^ 显著抑制了细胞对依托泊苷诱导的DNA双链断裂的修复活性。因此，本申请的实验结果表明，微RNA-3^可以用于制备抑制DNA断裂修复活性的药物或抗肿瘤药物，微RNA-3^和化疗药物的组合物可以用于制备抗肿瘤药物。同时，根据微RNA-3^的作用机理可知，可以用微RNA-3^或其与化疗药物的组合物进行治疗的肿瘤是其细胞中DNA损伤修复活性增加的任何肿瘤，例如宫颈癌和肺癌。
本申请公开的微RNA-3^及其与化疗药物的组合物的用途为抗肿瘤药物的研发提供了一种能减轻或消除耐药性的新途径。


图1.微RNA-3^表达腺病毒的制备及鉴定。图IA显示了荧光显微镜观察到的微 RNA-34a腺病毒和对照空病毒表达的绿色荧光蛋白。图IB显示了通过Northern杂交确定了微RNA-3^的正确表达。图2.微RNA_3^抑制细胞内非同源末端连接介导的DNA双链断裂的修复。图3.微RNA-3^抑制细胞内同源重组途径对HceI诱导的DNA双链断裂的修复。图4.微RNA-3^抑制细胞对依托泊苷诱导的基因组DNA双链断裂的修复活性。图 4A显示了通过彗星实验确定不同剂量依托泊苷处理一个小时引起HeLa细胞DNA双链断裂的程度。图4B显示了过表达微RNA-3^的情况下细胞对依托泊苷诱导的基因组DNA双链断裂的修复活性与对照组比明显下降。其中Olive尾矩代表了损伤的程度。图5.微RNA_34a下调靶基因SIRTl和RAD51的表达。图5A为Western杂交检测各相关蛋白的表达。图5B和C为通过定量PCR方法检测SIRTl和RAD51的信使RNA相对表达量。图5D和E检测了微RNA-3^对SIRTl和RAD51的3’非翻译区活性的影响。图6.感染SIRTl表达腺病毒可以部分恢复微RNA_3^对DNA双链损伤修复活性的抑制作用。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例1实验材料1.实验用细胞系、菌株和质粒实验所用的HeLa细胞购买自ATCC，293A细胞购买自hvitrogen公司。大肠杆菌感受态细胞BJ5183购买自Mratagene公司。pl-Scel为表达归巢核酸内切酶HceI的载体，pDR-GFP为同源重组修复报告系统质粒，这两个质粒在Maria Jasin博士等的论文中已有描述[36]。腺病毒穿梭质粒Ad-Track以及相关的腺病毒构建、包装及扩增的方法由Tong-Chuan He博士的论文描述[37]。荧光素酶报告基因质粒pGL2Luc购买自Promega公司。以下质粒由本发明人构建表达微RNA-3^的腺病毒穿梭载体Ad-TraCk-miR-34a以及重组后的腺病毒质粒 DNAAd-miR-34a ；SIRTl及RAD513’ UTR野生型和突变型荧光素酶报告基因质粒。2.限制性内切酶及其他修饰酶限制性内切酶分别购自New England Biolabs公司和TaKaRa公司；PrimeMar、 T4DNA Ligase^Proteinase K>T4PNK 为 TaKaRa Γ^a ；Taq DNAPolymerase 为 MBI &司
3.抗体Anti-SIRT l、anti_Ku70 抗体禾口 normal IgG购自 Santa Cruz 公司；anti-β actin 抗体购自Sigma公司；anti-RAD51抗体购自Merk公司；anti_HRP标记的IgG购自北京中杉生物技术有限公司。实施例2实验结果1.微RNA_3^腺病毒的制备和表达鉴定腺病毒载体在基因治疗的临床试验中广为应用，因为该病毒载体可以实现高效的转导从而有效表达治疗基因，并且目前应用的腺病毒载体为复制缺陷型，不会在受体细胞内复制。另外，腺病毒可以通过局部注射而转导靶组织的细胞，实现治疗作用。因此，本发明人构建并制备了微RNA-3^的腺病毒载体。成熟的微RNA-3^的序列为5 ’-UGGCAGUGUCUU AGCUGGUUGUU-3，(SEQ ID NO :1)，为表达该成熟序列，需要从基因组DNA中扩增包括前体序列在内的相关序列。首先，通过PCR方法从HeLa细胞的基因组DNA中扩增包含微RNA_3^ 的前体及其上下游各约200bp左右的片段。上游引物序列为5’-GACTgtcgacGCACCCACGAGC AGGCT-3，(SEQ ID NO :2)，下游引物序列为5，-GACTagatctAGTTGCCTGGGCTGGTCTT_3，(SEQ IDNO :3)，扩增产物的长度为406bp。纯化后的DNA片断通过Mll/Bglll位点克隆入腺病毒穿梭载体AcKTrack，得到AcKTrack-miR-IMa。进一步用AcKTrack-miR-IMa质粒转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞得到重组腺病毒载体Ad-miR-34a，然后转染细胞包装该病毒。在转染后约7天时收取细胞，然后于液氮中冻结细胞，37°C水浴中融化，剧烈振荡。此冻融步骤共进行4次。离心，取上清。此为第一代的病毒，可保存于-80°C，短期使用可放在 4°C。进一步可以通过使用第一代病毒继续感染细胞以扩增该病毒，其表达可以通过观察绿色荧光蛋白作为指标(图1A)，而仅表达绿色荧光蛋白的空病毒作为对照。同时，微 RNA-34a的表达还通过了 Northern杂交的经典方法得到确认，5S RNA作为内参(图1B)。2.微RNA-3^抑制非同源末端连接介导的DNA双链断裂修复DNA双链断裂主要通过上面讨论的两种途径完成修复，因此首先检测微RNA-3^ 是否影响非同源末端连接介导的DNA双链断裂修复。为了回答这一问题，本发明人通过质粒重连报告系统检测非同源末端连接活性是否变化。通过转染限制性内切酶EcoRI线性化的荧光素报告基因质粒pGL2_Luc，然后感染微RNA-3^的腺病毒或对照病毒，进而通过荧光素报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，以评价质粒重连修复的效率。实验结果表明， 微RNA-3^组修复的效率与对照组比降低约40% (图2)，说明微RNA-3^可以抑制细胞内非同源末端连接活性。3.微RNA-3^抑制同源重组介导的DNA双链断裂修复接下来要检测微RNA_3^是否影响同源重组介导的DNA双链断裂修复。为了回答这一问题，本发明人使用了 DR-GFP报告基因系统[36]，在转染表达限制性内切酶的质粒 PkeI诱导整合的基因片段上发生位点特异的双链断裂后，细胞可以通过同源重组的途径将断裂修复从而恢复绿色荧光蛋白的表达。通过流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白的细胞的比例可以评价同源重组修复的效率。实验结果显示，在表达微RNA-3^的实验组中，同源重组的效率较对照组明显下降(图3)，说明微RNA-3^抑制细胞内同源重组途径介导的 DNA双链断裂的修复。4.微RNA_3^抑制细胞对依托泊苷诱导的基因组DNA双链断裂的修复
依托泊苷是临床上广泛使用的抗肿瘤药物，其作用机制是可以诱导肿瘤细胞发生双链DNA断裂，进而引起肿瘤细胞的凋亡以实现治疗作用。其他可以使用的抗肿瘤药物还有阿霉素、阿柔比星、硫巴妥苯胺、右丙亚胺。根据前面的讨论知道，临床上发现很多肿瘤细胞DNA损伤修复能力异常增加，因此对包括依托泊苷在内的多种化疗药物具有耐药性，这已成为目前肿瘤治疗中亟待解决的问题。根据上面的结果可以预期微RNA-3^可能会抑制肿瘤细胞对依托泊苷诱导的基因组DNA双链断裂的修复。为了回答这个问题，本发明人使用50 μ M依托泊苷处理宫颈癌HeLa细胞，并通过彗星实验确认处理后发生了 DNA双链断裂 (图4Α)，断裂程度与文献报道的相当[38]。继而，对感染了微RNA-3^腺病毒或对照空病毒的相同细胞使用依托泊苷处理，结果表明过表达微RNA-3^的实验组细胞中DNA双链断裂的修复能力明显下降(图4B)。因此，可以得出结论，即微RNA-3^可以抑制细胞对依托泊苷诱导的基因组DNA双链断裂的修复。5.微RNA-3^对DNA双链断裂修复的抑制作用是通过靶向关键修复蛋白SIRTl和 RAD51完成的为进一步明确微RNA-3^对DNA双链断裂修复的抑制作用是如何实现的，本发明人通过生物信息学分析、3’ -非翻译区报告基因实验以及定量PCR和Western杂交方法检测可能的靶基因表达的改变。首先，本发明人通过微RNA靶位点分析预测软件 TargetScan5. 1 (http://www. targetscan. org,具体使用参数参照其帮助文件设定)分析微RNA-3^可能调控的DNA双链断裂修复相关基因，这些基因来自人类DNA修复基因数据库(http //sciencepark. mdanderson. org/labs/wood/DNA Repair Genes, html)。分析发现微1 嫩-343可能调控以051、1^05比3、乂1 02、乂1 03、1^050、1^052、咄51丄]\^1 以及 SIRTl。 通过3’ -非翻译区报告基因实验筛选发现，微RNA-3^对RAD51和SIRTl的3’ -非翻译区有调节作用。进一步的实验结果显示在过表达微RNA-3^后，促进双链断裂修复的关键蛋白SIRTl表达明显下调，同时参与同源重组修复的蛋白RAD51表达也略微下降(图5A)， 而非同源末端连接的关键蛋白Ku70表达没有变化。定量PCR结果表明SIRTl和RAD51的 mRNA水平在过表达微RNA-3^后也发生下调(图5B和C)，而3’ -非翻译区报告基因实验确定了微RNA-3^可以直接结合到SIRTl和RAD51的3’-非翻译区(图5D和E)。为了验证微RNA-3^主要通过作用于SIRTl而抑制DNA双链断裂修复，本发明人在依托泊苷处理的HeLa细胞中共同感染微RNA_3^和SIRTl腺病毒，结果表明在共表达SIRTl的情况下， 双链断裂修复的活性与仅感染微RNA-3^的对照组比发生明显升高，说明SIRTl可以部分弥补微RNA-3^引起的对双链断裂修复的抑制作用(图6)。参考文献1. 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权利要求
1.微RNA-3^在制备抑制DNA断裂修复活性的药物中的用途，优选地，所述微RNA_3^ 为纯化的分离表达物、合成产物或可复制转录的重组表达载体形式，优选地，所述微 RNA-34a为可复制转录的重组表达载体形式，最优选地，所述微RNA-3^为重组腺病毒表达载体。
2.微RNA-3^在制备抗肿瘤药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的微RNA-3^在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述肿瘤的细胞中DNA断裂修复活性增强，优选地，所述肿瘤为实体瘤，优选地，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌。
4.根据权利要求2所述的微RNA-3^在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述微 RNA-34a为纯化的分离表达物、合成产物或可复制转录的重组表达载体形式，优选地，所述微RNA-3^为可复制转录的重组表达载体形式，最优选地，所述微RNA-3^为重组腺病毒表达载体。
5.微RNA-3^与化疗药物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述化疗药物选自依托泊苷、阿霉素、阿柔比星、硫巴妥苯胺或右丙亚胺。
6.根据权利要求5所述的微RNA-3^与化疗药物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述微RNA-3^为纯化的分离表达物、合成产物或可复制转录的重组表达载体形式，优选地，所述微RNA-3^为可复制转录的重组表达载体形式，最优选地，所述微RNA-3^ 为重组腺病毒表达载体。
7.根据权利要求5所述的微RNA-3^与化疗药物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述肿瘤的细胞中DNA断裂修复活性增强，优选地，所述肿瘤为实体瘤，优选地，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌。
8.根据上述权利要求任一项所述的用途，其中抗肿瘤药物的剂型为任何适用于RNA药物使用的剂型，优选地，所述剂型为注射剂。
全文摘要
本发明涉及微RNA-34a在制备抗肿瘤药物中的用途。更具体地，本发明涉及微RNA-34a在制备抑制DNA损伤修复活性的药物及抗肿瘤药物中的用途。本发明还涉及微RNA-34a与化疗药物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明发现的微RNA-34a的用途为增强现有抗肿瘤药物的活性及研发新抗肿瘤药物提供了新的选择。
文档编号A61P35/00GK102406947SQ201010288409
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者刘德培, 吕湘, 李雷, 陆璐 申请人:中国医学科学院基础医学研究所