专利名称：融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
流感是由流感病毒引起的一种呼吸道传染病。几乎每年的流感流行都会造成世界 范围内大约25 50万人的死亡，并带来很大的经济负担。流感病毒属于正粘病毒科，是 一种分节段的RNA病毒，具有3个膜蛋白分别是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白 2(M2)。目前应用的人流感疫苗是针对甲型流感病毒的Hmi亚型、H3N2亚型和乙型流感病 毒的三联灭活疫苗，包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和纯化的病毒表面抗原亚单位疫苗。这 些疫苗主要是针对病毒的膜蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA) ；HA和NA是流感病毒主要 的跨膜蛋白，具有较好的免疫原性，但是由于其经常发生抗原漂移和抗原转变，其抗原性发 生很大变异，必须不断更换制备疫苗用的毒株，给流感的预防和控制带来很大困难。基质蛋白是流感病毒的第三种跨膜蛋白，具有离子通道的功能，可以改变 感染细胞内部的PH，以促进病毒的增殖。当M2通道被金刚烷胺阻塞后，可以影响HA的正常 转运，从而抑制病毒复制(Protein Engineering 1993，6 :65-74)。M2蛋白非常保守，在已 发现的几乎所有甲型流感病毒中均无明显变化，特别是其胞外区，历经三次流感大流行仍 未发生变化(J Virol 1991,65 =5491-5498) 0研究证实，M2蛋白的单克隆抗体能够在细胞 培养中抑制流感病毒的复制(J Virol 1988,62 :2762-2772)，并且在小鼠体内也能够抑制 流感病毒的复制(J Virol 1991,65 =5491-5498) 0目前利用乙肝病毒核心抗原与iCe形成 的M2e-HBc融合蛋白可以诱导小鼠产生足够的抗体，并能增强T细胞反应，大大降低流感病 毒的致病率、致死率(Vaccine 2006,24 :544-551 ；Virology 2005,337 :149-161)。铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)是由假单胞菌属铜绿假单胞菌分泌的细胞毒性外毒素。成熟的毒素分子是由613个氨基酸(66kD)组成的单链蛋白，包含 三个不同的结构域，分别为I区、II区和III区；其中，I区包括Ia区(1-252)和让区 (365-404)，Ia区是其受体识别功能结构域，Λ区与PEA的生物学活性无明显关系；II区 (253-364)为跨膜区；III区(405-613)为细胞毒性区。PEA可以与呼吸道粘膜上皮细胞和抗原递逞细胞表面的巨球蛋白受体或低密度脂 蛋白受体结合(Drug Discovery Today 2002,7 :247-258 ；Biochemica et Biophysica Acta2005,1741 :234-239 ；The Journal of Biological Chemistry 1992,267 1M20-1M23)，通过N端(la区)结合到细胞表面特异的受体上。然后，通过受体介导的 内吞作用形成胞吞泡，泡内质子泵迅速使泡内酸化，低PH环境引起毒素伸展而被细胞蛋白 酶裂解。裂解后，II区一部分、Λ区，III区由C末端特异的氨基酸序列REDLK介导转位 入胞浆。III区通过其ADP核糖基转移酶活性将NAD (辅酶I)上的ADP核糖基转移至延伸 因子2 (EF-幻上，使EF-2失活从而导致蛋白质合成中断致使细胞死亡(The Journal of Biological Chemistry,2002, 277 :46669-46675)。
需要说明的是，将III区中的第553位谷氨酸缺失突变后，PEA失去了 ADP核 糖基酶活性，变成无毒性形式(ntPE)，但突变的毒素仍能与天然毒素竞争细胞膜上的受 体。因此，ntPE可以作为分子佐剂，以增强疫苗的免疫原性(Biochimica et Biophysica Actal992,1138 :162-166 ；Vaccine, 1999，17 :1425-1433)。
发明内容
本发明的目的是提供一种能刺激机体产生M2多克隆抗体并产生针对M2e的细胞 免疫应答的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的融合蛋白，是铜绿假单胞菌外毒素A的非必需区或羧基末端与 1-3个拷贝的甲型流感病毒M2蛋白胞外区融合获得的融合蛋白；所述铜绿假单胞菌外毒素 A的氨基酸序列为序列表中的序列15自氨基末端第1-392位及第407-657位。本发明的融合蛋白，其中所述2或3个甲型流感病毒M2蛋白胞外区通过连接肽串 联连接。本发明的融合蛋白的氨基酸序列可为序列表中的序列15自氨基末端第1-651位 或者为序列表中的序列15。序列表中的序列15含有组氨酸标签，组氨酸标签便于蛋白的纯 化。本发明的融合蛋白的氨基酸序列可为序列表中的序列16自氨基末端第1-511位 或者序列表中的序列16。序列表中的序列16含有组氨酸标签，组氨酸标签便于蛋白的纯 化。本发明所述的融合蛋白可用来制备甲型流感病毒疫苗。编码所述融合蛋白的基因包括序列表中的序列17或序列表中的序列18。本发明的融合蛋白还可与佐剂混合制备成甲型流感病毒疫苗，佐剂能够增强对疫 苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应。佐剂可以选用多种，如不完全福氏佐剂。所述甲型流感病毒为Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5W流感病 毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。甲型流感病毒疫苗可以通过皮下注射或者粘膜途径免疫动物。本发明的融合蛋白能刺激机体产生M2多克隆抗体，并且能刺激机体产生针对M2e 的细胞免疫应答。本发明的具体实施方式
由以下实施例及其附图详细给出。
图1为重组融合蛋白的表达载体的结构示意图。图2为pET/PEA-M2载体酶切及PCR鉴定结果的电泳图；图3为pET/PEA-3M2载体酶切及PCR鉴定结果的电泳图；图4为PEA-M2和PEA-3M2重组蛋白的表达与鉴定；图5为PEA-M2H和PEA-3M2H重组蛋白的表达与鉴定；图6为ELISA检测PEA-M2H和PEA-3M2H重组蛋白免疫小鼠血清中抗iCe抗体；图7为ELISP0T法检测PEA-M2H和PEA-3M2H重组蛋白免疫小鼠的脾细胞中分泌 IFN-Y的细胞斑点数；
图8为免疫小鼠感染病毒后动物肺病毒载量测定。
具体实施例方式实施例1、铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆铜绿假单胞菌(保藏编号ATCC27583)来源于卫生部临床检验中心。采用肉汤培 养基培养铜绿假单胞菌，培养温度为37°C。收获菌体并提取铜绿假单胞菌基因组DNA。采用PCR方法从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增外毒素A基因序列。PCR 弓丨 物5，CGGAATTCATATGCACCTGACAC 3，(SEQ ID NO 1)； 5，AACTGCAGTTACTTCAGGTCCTC 3，(SEQ ID NO 2)。PCR 反应体积为 50ul，反应条件首先 94°C，5min ；然后 94°C，4kec，56°C Imin 72°C 2min ；30个循环周期后，72°C延伸IOmin0获得PCR产物，将PCR产物连接到pGEM_T载体获得克隆载体pGEM_PEA，转化大肠 杆菌DH5 α。挑取单菌落，用PCR法进行鉴定，然后将阳性克隆作DNA测序，测序结果表明阳性 克隆中的插入片段为外毒素A基因序列。2、用PCR方法对铜绿假单胞菌外毒素A基因进行修饰为了去除铜绿假单胞菌外毒素A的毒性，采用PCR方法，用四对引物将该蛋白第 553位氨基酸缺失。引物序列NTF 5’ GCGGCGGGCGAGGTCCGGCTGATCGGCCATC 3’ (SEQ ID NO 3)；NTR 5’ GATGGCCGATCA GCCGGACCTCGCCCGCCGC 3’ (SEQ ID NO 4)；ΝΤΡ15，GGCAAGATCTACCGGGTGCTC3，(SEQ ID NO 5)；ΝΤΡ25，TCCAACGCGTTGGGAGCTCTC 3，(SEQ ID NO 6)。以质粒pGEM-PEA为模板，分别以NTF和NTPl为一对引物，以NTR和NTP2为另一 对引物进行PCR扩增。将得到的两个PCR产物分别回收，纯化；将纯化后的两种PCR产物 等摩尔数混合，以混合物为模板，NTF和NTP2为引物再做PCR扩增。回收PCR产物，连接到 PMD18-T载体(TaKaRa)上，测序。将获得的突变产物命名为nt_PE，其核苷酸序列为序列表 中的序列20。3、pET/PEA-M2表达载体的构建表达载体pET/PEA-M2的结构如图1所示，用限制性内切酶方法将PEA基因中的Λ 区换成流感病毒的M2e基因，并将此融合基因连接到表达载体pET-30 (a)上。用限制性内切酶)(cm I和Apa I酶切pMD_ntPE克隆载体，回收大片段，与同样酶 切的化学合成的Mk基因片段(SEQ ID NO 7)连接，构建成PEA-M2。将PEA-M2用核酸内切 酶Nde I和HindIII酶切，电泳后回收1967bp片段，连接到表达载体pET-30 (a)上，得到表 达载体PET/PEA-M2，用PCR法和限制性内切酶对该质粒作鉴定，鉴定结果如图2，图2中泳 道1是Marker DL2000 (TaKaRa)；泳道2是PCR检测产物；泳道3是Nde I和HindIII酶切 PET/PEA-M2质粒结果；泳道4是pET/PEA_M2质粒对照；结果表明构建的pET/PEA_M2含有 PEA-M2融合基因，PEA-M2的核苷酸序列为序列表中的序列18。
4、PEA基因I、II区的克隆和pET/PEA_3M2表达载体的构建表达载体pET/PEA-3M2的结构见图1。首先，用PCR方法扩增PEA基因I、II区， 再将三个串联的M2e基因与之连接，并将此融合基因连接到表达载体pET-30 (a)上。以克隆载体 pGEM-PEA 为模板，用引物 CGGAATTCATATGCACCTGACAC(SEQ ID NO 8) 和 GCGTCGACACCACCACCGAACTCCGCGCCAGTG (SEQ ID NO 9) PCR 扩增，获得 PCR 产物命名为 PEAI-II，克隆到 pGEM-T Vector (Promega)上。化学合成3个串联的M2e基因，3个M2e基因之间由连接肽相连，其核苷酸序列见 SEQ IDNO 10，命名为 3M2e。用限制性内切酶切回收然后用连接酶连接的方法将PEA I-II与3M&连在一起， 获得PEA-3M2。PEA-3M2插到表达载体pET_30 (a)上，得到表达载体pET/PEA_3M2，用PCR法 和限制性内切酶法对表达载体进行鉴定。鉴定结果如图3，图3中泳道1是Marker DL2000 (TaKaRa)；泳道2是PCR检测产 物；泳道3是Nde I和HindIII酶切pET/PEA_3M2质粒结果；泳道4是pET/PEA_3M2质粒对 照，结果表明构建的pET/PEA-3M2含有PEA-3M2融合基因，PEA-3M2的核苷酸序列为序列表 中的序列17。5、pET/PEA-M2H 和 pET/PEA_3M2H 表达载体的构建为了便于纯化，我们又在上述融合基因的末端加上了组氨酸(His)标签，其结构 见图1。首先采用PCR方法将融合基因的翻译终止信号TAA去掉。以pET/PEA-M2表达载体为模板；以 弓丨物 5，CAAGATCTACCGGGTGCTCGCCG 3，(SEQ ID NO 11)禾口 5，GCTCGAGCTTCAGGTCCTCGCGC 3，(SEQ ID NO 12)为一对引物；进行 PCR 扩增。以pET/PEA-3M2表达载体为模板；以 弓丨物 5，CAAGATCTACCGGGTGCTCGCCG 3，(SEQ ID NO 13)禾口 5，GCTCGAGATCGCTAGAATCGTTGC 3，(SEQ ID NO 14)为一对引物；进行 PCR 扩增。将两个PCR产物分别插到pET-30 (a)上，构建成能够表达带有His标签的重组蛋 白的载体 PET/PEA-M2H 和 pET/PEA_3M2H。重组蛋白PEA-M2H的氨基酸序列见SEQ ID NO 15，重组蛋白PEA-3M2H的氨基酸序 列见 SEQ ID NO 16。6、重组蛋白PEA-M2和PEA-3M2的表达和鉴定将pET/PEA-M2和pET/PEA_3M2分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。转化菌在含卡 那霉素的LB琼脂培养板上37°C培养。挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基中(含50 μ g/ mL卡那霉素)，37°C培养12h，然后1 50接种IOOmL LB液体培养基，37°C摇床培养。当 培养物生长至OD6tltl = 0.6时加入终浓度为lmmol/L的IPTG诱导剂，继续培养4h。8000rpm 离心10分钟收集菌体，用超声液QOmM Tris-Cl pH8. 0,150mM NaCl)重悬菌体，400W超声 破碎30分钟，然后IOOOOrpm离心10分钟收集包涵体。取少量包涵体与2 X上样缓冲液混 合煮沸后作SDS-PAGE。SDS-PAGE 结果如图 4A，其中泳道 1 是 Marker (Fermentas)；泳道 2 是含 pET-30 (a) 空载体的菌体对照；泳道3是PEA-M2包涵体；泳道4是PEA-3M2包涵体；泳道5是PEA-M2上清；泳道6是PEA-3M2上清。SDS-PAGE后，在恒流220mA的条件下将胶上的蛋白电转至0. 45um的硝酸纤维素膜 上，用]\Ce单克隆抗体(abeam)做狗8丨6111 Blot鉴定。Western Blot鉴定结果如图4B，其中泳道1是Marker (Fermentas)；泳道2是 PEA-3M2包涵体；泳道3是PEA-M2包涵体；泳道4是pET_30 (a)空载体对照。结果表明重组蛋白PEA-M2和PEA-3M2以包涵体的形式表达。7、重组蛋白PEA-M2H和PEA-3M2H的表达和纯化将含有质粒pET/PEA-M2H和pET/PEA_3M2H的大肠杆菌在LB液体培养基中37°C培 养至0. D.约为0. 6时，加入IPTG(终浓度ImM)诱导四小时，然后8000rpm离心10分钟收 集菌体。用超声液(20mM Tris-Cl pH8. 0,150mM NaCl)重悬菌体，400W超声30分钟，然后 IOOOOrpm离心10分钟收集包涵体，包涵体洗涤后置于_20°C保存。将包涵体用裂解液(50mMTris-Cl ρΗ7· 4，IOOmM NaCl，8Μ尿素，IOmM咪唑)裂解， 在摇床上轻摇3h，IOOOOrpm离心十分钟收集上清。将上清过Ni-NTA Agroase(Invitrogen) 柱层析，以洗脱液(50mM Tris-Cl pH7. 4, IOOmM NaCl，8M尿素，50mM咪唑)洗脱目的蛋白。 取少量纯化的样品做SDS-PAGE，然后用ICe单克隆抗体(abeam)做狗计吐！！ Blot检测。SDS-PAGE结果如图5A，其中泳道1是Marker (Fermentas)；泳道2是重组蛋白 PEA-3M2H ；泳道3是重组蛋白PEA-M2H。Western Blot鉴定结果如图5B，其中泳道1是Marker ；泳道2是重组蛋白 PEA-M2H ；泳道3是重组蛋白PEA-3M2H ；泳道4是pET_30空载体对照。结果表明制备的重组蛋白PEA-M2H和重组蛋白PEA-3M2H具有甲型流感病毒Mk 蛋白的抗原性。8、用重组蛋白PEA-M2H和重组蛋白PEA-3M2H免疫小鼠购买60只6周龄雌性BALB/c小鼠(中国医科院动物所)，将小鼠随机分成三组， 第一组为PBS对照组，第二组为PEA-M2H免疫组，第三组为PEA-3M2H免疫组，每组20只。重组蛋白PEA-M2H稀释至2μ g/μ 1，取1. 5mL加入等体积弗氏不完全佐剂，充分混 勻，获得PEA-M2H免疫原。重组蛋白PEA-3M2H稀释至2μ g/μ 1，取1. 5mL加入等体积弗氏不完全佐剂，充分 混勻，获得PEA-3M2H免疫原。PBS对照组用50 μ 1 PBS与等体积弗氏不完全佐剂混合物皮下接种免疫小鼠；ΡΕΑ-Μ2Η免疫组用ΡΕΑ-Μ2Η免疫原皮下接种免疫小鼠，每只100 μ 1 ；ΡΕΑ-3Μ2Η免疫组用ΡΕΑ-3Μ2Η免疫原皮下接种免疫小鼠，每只100 μ 1 ；隔三周加强免疫一次，共加强两次；免疫前、初次免疫后两周、第一次加强免疫后两周和第二次加强免疫后两周从小 鼠眼眶采血，分离血清用于测定抗体水平。ELISA检测小鼠血清抗体效价采用间接ELISA法检测小鼠血清中的抗Mk抗体。首先用包被液稀释化学合成的Mk多肽，使其终浓度为Ing/ μ 1，IOOul/孔包被 ELISA板，封闭过夜后加入用含1 % BSA的PBS倍比稀释的动物血清，再依次加入HRP标记 羊抗鼠IgG，ELISA A、B显色剂显色，用酶标仪读取结果。
ELISA结果见附图6，PBS组的抗体滴度平均为1 80 ；PEA-M2H组初次免疫后抗 体滴度为1 620，第一次加强免疫后抗体滴度为1 2300，第二次加强免疫后抗体滴度达 到1 7800 ;PEA-3M2H组初次免疫后抗体滴度为1 1500，第一次加强免疫后抗体滴度为 1 13000，第二次加强免疫后抗体滴度达到1 40000。PEA-M2H免疫组和PEA-3M2H免疫 组的抗体效价明显高于PBS组。上述的结果表明，PEA-M2H和PEA-3M2H都能诱导小鼠产生抗Mk抗体。ELISP0T检测小鼠细胞免疫应答末次免疫5天后无菌取脾，制备脾细胞悬液，用于ELISP0T实验。用ELISP0T检测试剂盒(BD ELISPOT Mouse IFN- y Set)检测在体外培养的小鼠 脾细胞中，用化学合成的Mk刺激后，能够分泌IFN-Y的脾细胞数量。ELISP0T结果见图7，每IX IO7个脾细胞中，PBS组的斑点数为4个，PEA-M2H免疫 组的斑点数为163个，PEA-3M2H免疫组的斑点数为232个。实验结果表明，PEA-M2H免疫组 和PEA-3M2H免疫组的细胞免疫反应明显高于对照组，表明融合蛋白免疫刺激了小鼠针对 M2e的细胞免疫应答。病毒攻击后小鼠肺病毒载量测定末次免疫后两周用甲型流感病毒PR8株经鼻腔感染小鼠。攻毒后第五天，每组取 5只小鼠处死、无菌取肺，制成肺悬液。将倍比稀释的肺悬液接种于体外培养的MDCK细胞 培养板中。每日观察细胞病变，当CPE达到+++ ++++时收获上清。取50ul待测样品， 加入等体积的火鸡红血球做血细胞凝集试验。观察红细胞凝集现象并记录结果。根据 Reed-Muench 方法计算 TCID50。结果见图8，在病毒感染第五天，PBS组、PEA-M2H免疫组和PEA-3M2H免疫组的 IgTCID50分别为6. 5,5. 3和5. 1，免疫组病毒载量显著低于PBS组，说明融合蛋白免疫后对 小鼠提供了一定的保护作用。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽 然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰 为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质 对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。序列表<110><120><160>16
<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>1
cggaattcat atgcacctga cac23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>2aactgcagtt acttcaggtc ctc23<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>3gcggcgggcg aggtccggct gatcggccat c31<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>4gatggccgat cagccggacc tcgcccgccg c31<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>5ggcaagatct accgggtgct c21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><230>
权利要求
1.一种融合蛋白，是铜绿假单胞菌外毒素A的非必需区或羧基末端与1-3个拷贝的甲 型流感病毒M2蛋白胞外区融合获得的融合蛋白；所述铜绿假单胞菌外毒素A的氨基酸序列 为序列表中的序列15自氨基末端第1-392位及第407-657位。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述2或3个甲型流感病毒M2蛋白 胞外区通过连接肽串联连接。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为序列表中的序列15 自氨基末端第1-651。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为序列表中的序列15。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为序列表中的序列16 自氨基末端第1-511位。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为序列表中的序列16。
7.权利要求1-6中任意所述的融合蛋白在制备甲型流感疫苗中的应用。
8.编码权利要求1-7中任意所述蛋白的基因。
9.根据权利要求8所述的融合基因，其特征在于其核苷酸序列为序列表中的序列17。
10.根据权利要求9所述的融合基因，其特征在于其核苷酸序列为序列表中的序列18。
全文摘要
本发明是关于一种融合蛋白及其编码基因与应用。本发明的融合蛋白是铜绿假单胞菌外毒素A的非必需区或羧基末端与1-3个拷贝的甲型流感病毒M2蛋白胞外区融合获得的融合蛋白；所述铜绿假单胞菌外毒素A的氨基酸序列为序列表中的序列15自氨基末端第1-392位及第407-657位。本发明还公开了编码该融合蛋白的基因。本发明的融合蛋白可以用来制备甲型流感病毒疫苗。本发明的融合蛋白能刺激机体产生M2多克隆抗体，并且能刺激机体产生针对M2e的细胞免疫应答。
文档编号A61K47/48GK102134279SQ20101030060
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者刘晓宇, 姚立红, 张智清, 徐一, 郭建强, 陈爱君 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所