专利名称：一种高纯度牛磺熊去氧胆酸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医药原料药及其制备方法，具体涉及一种高纯度牛磺熊去氧胆酸及其制备方法。
背景技术：
牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholicacid)化学名为2_[ [ (3 α，5 β，7 β )-3， 7-二羟基-24-氧代胆留烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物，1902年自熊胆中发现，其为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。牛磺熊去氧胆酸可增加胆汁酸的分泌，导致胆汁酸成分的变化，使其在胆汁中含量增加。牛磺熊去氧胆酸还可以抑制肝脏胆固醇的合成，降低胆汁中胆固醇及胆固醇酯的量和胆固醇的饱和指数，从而有利于胆汁中胆固醇逐渐溶解。牛磺熊去氧胆酸最早由意大利Bruschettini S. r. 1.大药厂研制，于1991年首次在意大利上市，2007年以商品名滔罗特(taurolite)获准在中国销售，临床主要用于治疗
胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。
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ηοΛΑΑοη杂质的研究是药品研发的一项重要内容，这一研究贯穿于药品研发的整个过程。 由于药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，有时与药品中存在的杂质也有很大关系。因此规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，将直接关系到上市药品的质量及安全性。2005年3月由国家食品药品监督管理局发布的《化学药物杂质研究的技术指导原则》中明确规定，对于最大日剂量< 2g的原料药，最大单杂量的质控限度为0. 15%，对于最大日剂量在IOOmg到2g的药物制剂，最大单杂量的质控限度为0. 2%。目前，市售的滔罗特胶囊质量标准中没有对最大单杂量进行限制，仅仅是以薄层色谱法限制韬罗特中除牛磺酸、熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸外的其他总单杂量不得过0.5%。目前制备牛磺熊去氧胆酸所使用的起始原料为熊去氧胆酸，一般通过两种途径获
得一是动物体内提取，主要是熊胆汁提取，这种方法因来源限制，成本很高且成分复杂，一
般采用较少。另一种方法是化学合成，主要以动物胆酸类物质，比如猪去氧胆酸，鹅去氧胆
酸为原料进行合成。其中，以鹅去氧胆酸为原料合成熊去氧胆酸是目前市场上纯度较高的
熊去氧胆酸的主要来源。但是，通过这样途径制备的熊去氧胆酸不可避免的含有一定量的
鹅去氧胆酸，同样在牛磺熊去氧胆酸的制备过程中，会产生一定量的牛磺鹅去氧胆酸，而牛
3磺鹅去氧胆酸在小肠内可部分水解回复为游离型鹅去氧胆酸。鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸虽然也具有一定的药理作用，但同时也具有一定的毒性，能使人体内谷氨酰转移酶(ALT) 升高，引起细胞凋亡而造成严重的肝组织损伤，最终发展成肝硬化(郑兴等《熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸的对比研究》)。国外试验进一步证明，胆汁酸的毒性作用取决于它们的疏水性， 一般说来，疏水性越强，对肝细胞的毒性越大。牛磺鹅去氧胆酸疏水性指数HI为0. 46，而牛磺熊去氧胆酸是亲水性的，HI为一 0. 4，是无毒的(何秀玲等《牛磺鹅去氧胆酸研究进展》)。 因此，严格控制牛磺熊去氧胆酸中牛磺鹅去氧胆酸的含量，避免肝毒性的出现，是十分重要的。
现有技术中与牛磺熊去氧胆酸化学合成技术有关的报道及被普遍采用用于合成牛磺熊去氧胆酸的方法主要包括
US5565587报道了用熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯或特戊酰氯在二氧六环作溶剂的反应条件下反应形成混合酸酐，再在碱性条件下与牛磺酸反应，得到的相品经离子交换柱纯化制得牛磺熊去氧胆酸。但该法使用二氧六环作为溶剂，二氧六环又称二恶烷，毒性较大， 有致癌性，并且能够在体内积蓄。同时，本法采用离子交换柱纯化，操作复杂，成本高，不利于工业化生产。王海龙等(《中国医药工业杂志》2009，40)报道了该法的改进方法，即以熊去氧胆酸与2，2 ‘ - 二硫二苯并噻唑反应制得熊去氧胆酸-2-苯并噻唑硫酯，再经丙酮-水 (12 1)重结晶得纯品，无需离子交换柱纯化。但该法放大试验后收率低下，导致能耗很高，其成本是工业化生产所不能承受的。
Dayal B等(Bioorg Med Chem, 1996，4)报道了熊去氧胆酸和牛磺酸在碱性条件下分别在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)或氰基磷酸二乙酯(DEPC)作用下直接缩合得牛磺熊去氧胆酸，但此法试剂价昂贵。
US536^91报道了熊去氧胆酸和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，与对羟基苯丙酮缩合，得熊去氧胆酸的活性酚酯，再与牛磺酸反应制得牛磺熊去氧胆酸，但此法反应步骤较多，总收率较低。
而且现有技术中的牛磺熊去氧胆酸合成方法，均不能有效去除原料中带入的牛黄鹅去氧胆酸，为牛磺熊去氧胆酸的使用带来了一定的安全隐患。发明内容
本发明的目的之一是获得一种牛磺鹅去氧胆酸含量极低的牛磺熊去氧胆酸。
本发明的另一目的是在保证牛磺熊去氧胆酸中牛磺鹅去氧胆酸含量极低的前提下，控制除牛磺酸、熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸外的其他最大单杂的含量。
本发明的再一目的是提供一种高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备方法。
本发明的又一个目的是提供一种以高纯度牛磺熊去氧胆酸作为活性成分的药物组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种高纯度的牛磺熊去氧胆酸，其特征在于该牛磺熊去氧胆酸所含的牛磺鹅去氧胆酸以液相色谱条件和方法测定不大于0. 7% ；优选所含的牛磺鹅去氧胆酸以液相色谱条件和方法测定不大于0.5%，更优选为前述牛磺熊去氧胆酸中除牛磺酸、熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸外的最大单杂以液相色谱条件和方法测定少于0. 15% ；最优选为前述牛磺熊去氧胆酸中除牛磺酸、熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸外的最大单杂以液相色谱条件和方法测定少于0. 1 %。本发明还提供了一种高含量牛磺熊去氧胆酸的制备方法，是由熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的成混合酸酐，再与牛磺酸进行反应得牛磺熊去氧胆酸粗品，粗品再进行重结晶而得，其特征在于整个工艺只使用丙酮、水两种溶剂；其中混合酸酐的制备方法优选为在反应釜中，加入熊去氧胆酸和丙酮，搅拌下加入三乙胺，开启制冷，降温至-10-5°C，流加氯甲酸乙酯，控制加入速度使反应液温度不超过5°C，约15-30分钟加完，继续保温搅拌20-40分钟；其中重结晶工艺优选为(1)将牛磺熊去氧胆酸粗品投入反应釜中，加入丙酮和水，加热搅拌至全部溶解；(2)搅拌下冷却至-5-5 °C，析晶30-48小时；(3)放料至过滤器中抽滤，抽干后用冰水(_5-5°C )淋洗滤饼，再次抽干。其中，丙酮和水的体积/重量比为1 7 1 12，优选为1 10。本发明还提供了一种药物组合物，其含有高纯度牛磺熊去氧胆酸和药学上可以接受的载体或赋形剂。其中载体或赋形剂可以为乳糖、微晶纤维素、淀粉、硬脂酸镁、PVP、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮、羟丙纤维素、二氧化硅和乙醇，该药物组合物可以为用于口服的胶囊；优选为每1000粒中含有以下组分高纯度牛磺熊去氧胆酸250g、乳糖36g、微晶纤维素 20g、淀粉10g、硬脂酸镁4g、以及适量的聚维酮K30和95%乙醇。本发明与现有技术相比其优势在于1、本发明的牛磺熊去氧胆酸纯度高，所含牛磺鹅去氧胆酸及最大单杂量极少，因此，在临床使用中安全性更高，几乎无任何毒副反应。2、高纯度牛磺熊去氧胆酸的工艺简单、成本低、环境友好，更适于工业化生产。发明人通过大量的实验研究得知在熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯形成的混合酸酐的过程中，如果流加氯甲酸乙酯前的起始反应温度在-10°c以下，将使得反应难以进行，当起始温度大于-5°c时，将使得反应出现较多的反应副产物和杂质。在流加氯甲酸乙酯时，反应会释放出大量热量，如果流入氯甲酸乙酯速度过快，使得反应液温度超过5°C，或流加氯甲酸乙酯的速度过慢，反应时间超过70分钟，均会导致反应出现较多的副产物和杂质。在牛磺熊去氧胆酸的精制中，因为牛磺熊去氧胆酸在水和丙酮中均有一定的溶解性，现有技术一般均采用离子交换柱纯化或采用以丙酮为主的溶剂体系重结晶牛磺熊去氧胆酸得纯品。但发明人经过大量研究得知，在牛磺熊去氧胆酸的精制中，如果采用以水为主的溶剂体系，在丙酮加入量为一定比例时，会使牛磺熊去氧胆酸以较好的晶形大量析出， 并且析晶所需的时间较短，仅需要重结晶一到二次即能有效去除杂质，提高纯度，去除无机盐，大大节省了精制纯化所需的工业原料丙酮以及纯化时间和纯化步骤，使得工业化精制变得更加简便、可行。发明人通过大量的实验研究得知，在丙酮的比例高于1 7或者低于1 12时， 牛磺熊去氧胆酸会很难析出来，且晶体非常细小(收率< 50%，析晶时间大于50小时)，非常不利于工业化大生产。但是，在丙酮/水=1 7 1 12之间，优选1 10的时候， 牛磺熊去氧胆酸会以较好的晶体形态析出来，而且收率也相当高(》80% )，同时，仅需重结晶一到二次，即可得到纯度大于99. 0%的牛磺熊去氧胆酸终产物，大大节省了工业原料丙酮，简化了对牛磺熊去氧胆酸粗品精制的处理工艺。
图1测定市售滔罗特及批号为100801、100901、100902的含有牛磺熊去氧胆酸的胶囊中有关物质的HPLC色谱图。
图2测定批号为100702的牛磺熊去氧胆酸原料药中有关物质的HPLC色谱图。
图3测定批号为100801的牛磺熊去氧胆酸原料药中有关物质的HPLC色谱图。
图4测定批号为100802的牛磺熊去氧胆酸原料药中有关物质的HPLC色谱图。
参考实施例
在相同的试验条件下分别检测了一批市售滔罗特胶囊以及以批号100801的牛磺熊去氧胆酸为原料药所制备的胶囊批号100801 ；以批号100702为原料药所制备的胶囊 批号100901 ；以批号100802为原料药所制备的胶囊批号100902 (三批胶囊的制备方法均是按实施例七制备的)。
三批自研的牛磺熊去氧胆酸原料药(批号100702、100801、100802)，其HPLC谱图见图2、图3、图4。
测定方法为
取样品适量(含牛磺熊去氧胆酸约25mg)，精密称定，加乙腈-水(1 1)溶解并定量稀释制成每Iml中约含牛磺熊去氧胆酸5mg的溶液，作为供试品溶液；取该溶液20 μ 1， 注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3. 5倍；供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按而积归一化法计算。(注牛磺熊去氧胆酸峰保留时间约为21min。)
权利要求
1.一种高纯度的牛磺熊去氧胆酸，其特征在于该牛磺熊去氧胆酸具有以下特征以液相色谱条件和方法测定，该牛磺熊去氧胆酸所含的牛磺鹅去氧胆酸量少于0. 7% ；
2.根据权利要求1所述高纯度的牛磺熊去氧胆酸，其特征在于该牛磺熊去氧胆酸具有以下特征以液相色谱条件和方法测定，该牛磺熊去氧胆酸所含的牛磺鹅去氧胆酸量少于0. 5% ；
3.根据权利要求1或2所述高纯度的牛磺熊去氧胆酸，其特征在于该牛磺熊去氧胆酸具有以下特征以液相色谱条件和方法测定，除牛磺酸、熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸外的最大单杂量少于0. 15% ；
4.根据权利要求3所述高纯度的牛磺熊去氧胆酸，其特征在于该牛磺熊去氧胆酸具有以下特征以液相色谱条件和方法测定，除牛磺酸、熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸外的最大单杂量少于0. 1% ；
5.权利要求1-4中所述高含量牛磺熊去氧胆酸的制备方法，是由熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯制成混合酸酐后，再与牛磺酸进行反应完全后重结晶而得，其特征在于整个工艺只使用丙酮、水两种溶剂。
6.根据权利要5的所述的制备方法，其特征在于混合酸酐由以下方法制备在反应釜中，加入熊去氧胆酸和丙酮，搅拌下加入三乙胺，开启制冷，降温至-10-5°C，流加氯甲酸乙酯，控制加入速度使反应液温度不超过5°C，约15-30分钟加完，继续保温搅拌20-40分钟。
7.根据权利要求5所述高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于重结晶工艺如下(1)将牛磺熊去氧胆酸粗品投入反应釜中，加入丙酮和纯化水，加热搅拌至全部溶解；(2)搅拌下冷却至-5-5°C，析晶30-48小时；(3)放料至过滤器中抽滤，抽干后用-5-5°C的冰水淋洗滤饼，再次抽干。
8.根据权利要求7所述高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于丙酮和水的体积/重量比为1 7 1 12，优选为1 10。
9.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-4所述的高纯度牛磺熊去氧胆酸和药学上可以接受的载体或赋形剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于每1000粒中含有以下组分权利要求1-4所述的高纯度牛磺熊去氧胆酸250g、乳糖36g、微晶纤维素20g、淀粉10g、硬脂酸镁4g、以及适量的聚维酮K30和95%乙醇。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度牛磺熊去氧胆酸及其制备方法。本发明的牛磺熊去氧胆酸中牛磺鹅去氧胆酸量低于0.7％，在临床应用中安全有效，无毒副作用；本发明还提供了一种以丙酮为溶剂进行熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的成混合酸酐的反应，通过反应条件和反应溶剂的控制，不但实现工艺简单、成本低、环境友好，适于工业化生产的优势，而且能够获得高纯度的牛磺熊去氧胆酸。
文档编号A61P31/14GK102477059SQ201010552339
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者徐开辉, 郭礼新 申请人:成都国为医药科技有限公司