专利名称：重组人Prx-6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，涉及重组人I^rx-6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途。
背景技术：
烧烫伤是常见病，多发病，也是致残率较高的创伤性疾病。轻者也给伤者带来很大痛苦，重者常常损害器官功能，给患者的工作和生活造成很大的不便，同时因为烧烫伤较多发生在人的暴露部位，愈合后的疤痕毁坏伤者的容貌，还会给患者的心理造成不良影响，因此，对中轻度的烧/烫伤则要尽量缩短愈合期，减少病人痛苦，并尽量减少疤痕形成。对严重烧烫伤者应尽量减少再灌注引起的各种脏器损伤及继发感染等并发症。目前临床治疗烧伤常采用的方法，一般是在进行创面早期处理后，采用包扎疗法或采用暴露疗法进行治疗。无论采用哪种方法，在早期清创时，都要进行创面抗感染处理， 清创所选用的抗感染药物主要有三类一是中草药制剂，如四季青、毛冬青、黄连、黄柏等； 二是化学药物制剂，如双氧水、新洁尔灭、甲磺灭脓；三是抗生素制剂如青霉素、庆大霉素。 由于大多数药物均可从创面吸收，大面积使用这些药物，尤其浓度过大或使用粉剂时常常可引起中毒或内脏损害。再者这些药物一般都有一定的刺激性，在使用时常常会给患者增加痛苦。Peroxiredoxins(Prxs)是新近发现的一类非硒依赖过氧化物酶家族蛋白，广泛存在于各种生物体内。根据I^rxs蛋白保守cys个数的不同(1个或2个)，可分为I-Cys或 2-Cys亚类。迄今，已在哺乳动物组织中发现了 6种I^rxs蛋白。其中I^rxl-5为2_Cys酶， 以硫氧还蛋白作为电子供体；Prx-6蛋白是哺乳动物中唯一的I-Cys酶，以谷胱苷肽(GSH) 为电子供体(还原剂)。Prx-6蛋白首先是在牛眼睫状体中被分离获得的，又名LTW4、抗氧化蛋白2、Clara 细胞蛋白26、p67吞噬细胞氧化酶(phox)结合蛋白、角质化细胞生长因子(KGF)调节基因 1等，由2M个氨基酸组成，分子量为25. IKDa0分析该蛋白的晶体结构，发现了一个由80 个氨基酸组成的硫氧还蛋白折叠，其中包含四个β折叠和两个α螺旋。大量研究表明，硫氧还蛋白折叠结构在一些参与氧化还原反应的蛋白(如硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、GPxl蛋白、谷胱甘肽S-转移酶等)中普遍存在。另外，尽管和 GPxl蛋白的一级结构只有17%的同源性，但是它们的三级结构具有极高的同源性。这种结构上的相似性，预示着这两种蛋白在功能上的相关。从初期细胞实验到近年来动物体内实验，越来越多的研究证明了 Prx-6蛋白具有抗氧化损伤功能。细胞水平的研究表明，过表达蛋白能明显减少脂质过氧化作用，降低细胞质膜损伤；抑制Prx-6蛋白的表达，可观察到明显的脂质过氧化、脂膜损伤及细胞凋亡。活体水平研究表明，Prx-6转基因小鼠对高氧损伤有显著的保护作用；Prx-6敲除小鼠的抗氧化损伤能力明显降低。但是，这些研究主要是关于蛋白在心脏、肺或皮肤组织中的抗氧化损伤作用，并未涉及到蛋白在治疗烧烫伤方面的用途。
综上所述，目前尚缺乏令人满意的治疗烧烫伤的药物，因此本领域迫切需要开发新的能够用于治疗烧烫伤的药物。
发明内容
本发明的目的是提供重组人蛋白在治疗烧伤和烫伤方面的应用。在本发明的第一方面，提供了一种蛋白在制备治疗烧烫伤的药物中的用途。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的蛋白或其与表达标签(如6-His)形成的融合蛋白。在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗烧烫伤的药物组合物，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为外用制剂。在另一优选例中，所述的蛋白是人蛋白。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。在另一优选例中，所述的外用制剂是膏剂、喷雾剂、或滴剂。在另一优选例中，所述的药物组合物还含有其他治疗烧烫伤的药物。在本发明的第三方面，提供了一种治疗烧烫伤的方法，包括步骤对需要治疗的对象，在烧烫伤的创面上施用Prx-6蛋白蛋白或本发明第二方面中所述的药物组合物。在另一优选例中，所述的治疗包括促进伤口愈合和减少创面的炎症反应。在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。在另一优选例中，所述的施用包括施涂或喷涂。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。
图1显示了 Prx-6基因PCR扩增结果。泳道1 空白对照；泳道2 :Prx_6 ；M 分子
量标准品。图2显示了 Prx-6蛋白亲和纯化色谱图。峰1 杂蛋白；峰2 :Prx_6目的蛋白。图3显示了 Prx-6蛋白纯化电泳图(12% SDS-PAGE)。泳道1 蛋白分子量标准品 (Fermentas)；泳道2 亲和层析纯化并脱盐后的I^rx-6蛋白；泳道3 峰1 ；泳道4 上样穿出蛋白；泳道5 破菌上清(上样的样品)。图4显示了重组蛋白对HEF细胞的抗氧化保护作用(P < 0. 05)。图5显示了重组Prx-6蛋白对H9C2细胞的抗氧化保护作用(P < 0. 05)。图6显示了重组Prx-6蛋白治疗小鼠烫伤的结果。图中，各图片从左至右依次为对照组O只)；Prx-6组O只)；美宝组O只)；美宝组O只)。
具体实施例方式
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本发明人经过广泛而深入的研究，除了发现蛋白具有抗氧化作用可保护 HEF等细胞之外，还首次发现蛋白居然具有促进烧伤和烫伤愈合的作用，因此可用于治疗烧烫伤。在此基础上完成了本发明。 具体地，本发明的重组人Prx-6蛋白可直接涂覆于伤口表面，对于烧/烫伤创面可立即收敛，抑制渗出。涂后即刻成膜，杜绝内外感染，能加快新生肉芽组织生长，促进烧烫伤组织愈合，同时具有刺激性小、可有效控制感染、疗程短等优点。Prx-6 蛋白如本文所用，术语“本发明蛋白”、“Peroxiredoxins蛋白” “prdx6蛋白”、“Prx_6 蛋白，，“过氧化氧化还原蛋白”等可互换使用，都指具有人Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。 它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。应理解，这些术语既包括人(源)的蛋白，也包括在其他哺乳动物(如狗、牛、羊、猴、啮齿动物(如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。此外，该术语包括野生型和突变型Prx-6蛋白。人prx-6 基因的 cDNA 序列 GenBank 登录号NM_004905. 2，如 SEQ ID NO 1 所示。 人的氨基酸序列的登录号为NP_004896，如SEQ ID NO 2所示。应理解，由于人等哺乳动物的prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的， 可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。一类特别优选的蛋白是prx-6类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中prx-6的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据prdx6的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。药物组合物和施用方法本发明还提供了药物组合物，它含有安全有效量的本发明prx-6蛋白药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其组合。例如，可将本发明蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中PH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)局部给药、口服、肌内、静脉内。一种优选的方式是直接施涂在烧烫伤的创面和周围。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如膏剂、滴剂、喷雾剂、片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、 片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/ 千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的蛋白还可与治疗烧烫伤的其他治疗剂一起使用。在优选例中，可将本发明蛋白按0. 1-0. 5mg/cm2创面的用量直接施涂或喷涂在烧烫伤的创面。本发明的主要优点包括(1)开发了人蛋白新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。烧烫伤创面涂覆蛋白后可立即收敛，抑制渗出，杜绝内外感染，能加快新生肉芽组织生长，促进烫伤组织愈合，同时具有刺激性小、可有效控制感染。O)Prx-6蛋白是源自人的蛋白，使用安全安全无毒副作用，有很好的药用前景。(3)人蛋白做成注射剂型、喷雾剂、滴剂、膏剂等，使用方便。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。实施例1. pET32b (+) /Prx-6表达载体构建根据编码成熟蛋白的基因序列设计并合成了一对特异引物(上游引物 5，-tatccatatgcccggaggtctgcttc-3，(SEQ ID NO :3),下游弓丨物5，-ttactcgagaggctgggg tgtgtagcg-3，(SEQ ID NO :4))，酶切位点分别为 NdeI 及 Xhol，以常规方法抽提的人附睾mRNA为模板，进行RT-PCR扩增。结果见图1，检测到与理论值相符的688bp的扩增片段。分离扩增片段，用NdeI及B10I进行双酶切。然后，将经过双酶切的片段连接到已用NdeI和B10I切成线性的pET32b (+)表达载体(购自Novagen)中，转化常规的大肠杆菌 T0P10F'(购自hvitrogen)。通过菌落PCR的方法筛选阳性克隆，并测序进一步证实序列及表达阅读框的正确性，得到重组表达质粒pET32b (+) /Prx-6。该表达载体所表达的Prx-6 蛋白在C端附加8个氨基酸LEHHHHHH，以便于分离纯化。实施例2. Prx-6蛋白的表达将质粒pET32b (+) /Prx-6 转化大肠杆菌 Origami B (DE3)(购自 Novagen)，将阳性克隆接种于含lOOug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37度摇床培养过夜。次日按1 100 转接于含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37度摇床培养至菌密度0D600 = 0. 6 0. 8 后，加入IPTG至终浓度0. 4mM以诱导目的蛋白Prx_6的表达，3_4h后离心收集菌体。实施例3. Prx-6蛋白的纯化将离心收集的菌体重悬于缓冲液A中OOmM磷酸盐缓冲液，150mM氯化钠，pH7. 2)， 冰浴中超声破碎，20000g低温0度)离心15min取上清为待纯化的样品。使用缓冲液A平衡镍亲和层析柱后，将样品上柱，然后用含50mM咪唑的缓冲液A冲洗柱子去除杂蛋白(峰 1)，用含300mM咪唑的缓冲液A将目的蛋白洗脱下来(峰2)(见图2)。最后用G-25脱盐柱将洗脱的蛋白置换于缓冲液A中以去除咪唑，SDS-PAGE电泳检测。经分析，获得了纯度在95%以上蛋白，分子量约沈.11^)。(见图3)。实施例4.蛋白的抗氧化活性(HEF细胞氧化损伤实验)HEF细胞为常用的人胚胎成纤维细胞(Zavada et al.，Nature New Biology, 240 124-125(1972)；或 US 7，811，817)。用培养基(高糖 DMEM+5% FBS)复苏细胞，培养 48h，待细胞长至90%汇合后，按照下面实验方法先将实施例3中获得的Prx-6蛋白(ftxlx-6-His 融合蛋白)加入培养体系中，再加入H2O2，作用30min后，MTT方法检测细胞存活率。实验设计正交试验因素 1 : 水平(lmM、0. 5mM、0. 25mM、0. 125mM、0mM)
因素 2 :Prdx-6-His 水平(0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. 125mg/ml、0mg/ml)各实验组的H2A和I^rdx-e-His浓度如表1所示。表 权利要求
1.一种蛋白在制备治疗烧烫伤的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白是重组蛋白。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白包括氨基酸序列如SEQID NO :2所示的蛋白或其与表达标签形成的融合蛋白。
5.一种用于治疗烧烫伤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为外用制剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人蛋白。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。
8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的外用制剂是膏剂、喷雾剂、或滴剂。
9.一种治疗烧烫伤的方法，其特征在于，包括步骤对需要治疗的对象，在烧烫伤的创面上施用Prx-6蛋白蛋白或权利要求5所述的药物组合物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的治疗包括促进伤口愈合和减少创面的炎症反应。
全文摘要
本发明提供了重组人Prx-6蛋白在治疗烧烫伤方面的用途。具体地，本发明提供了人Prx-6蛋白在制备治疗烧烫伤的药物中的用途。本发明的实验表明，Prx-6蛋白在治疗烧烫伤过程中有重要的促进伤口愈合作用。
文档编号A61P17/02GK102485272SQ20101057359
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者李建远 申请人:李建远