专利名称：生物牙根支架材料的构建方法
技术领域：
本发明公开了一种生物牙根支架材料的构建方法。
背景技术：
目前，各种原因所致的牙齿缺失患病率随年龄增长而增加，到中老年患病率约为 80%。牙齿缺失与牙发育异常严重妨碍患者的咀嚼、语言等功能，并引起患者容貌畸形、认 知缺陷、心理障碍，从而极大地危害了患者的身心健康，因此，寻求有效的治疗途径是迫切 而艰巨的任务。目前的牙齿缺失均采用人工材料赝复体修复，存在着生理功能恢复有限、使用寿 命短、损伤正常组织等缺陷，缺乏真正生理意义的修复。种植体修复缺失牙是目前治疗牙缺 失的热点和重点，但种植体与牙周组织只能实现骨性结合，无法获得新生的牙周膜等缺点。 如何有效地在目前的修复方法基础上，获得新生的牙骨质、牙周膜和牙槽骨，是治疗牙缺失 的关键。支架材料和诱导微环境问题是进行牙根再生组织工程的重要问题。近年来，随着 对各种支架材料研究的深入，采用生物有机材料作为支架材料应用于牙根组织工程已成为 研究热点，肠系膜、煅烧牛骨、牙本质基质等均有应用报道。对牙本质的组织学和蛋白组学 的研究表明在牙本质中存在多种对于牙齿发育和牙齿受到损伤后修复过程中重要的蛋白 和因子，其中很多都有很强的表达或者较高的含量。Guo等以大鼠的牙本质为研究对象， 在牙本质周围成功的诱导了牙骨质、牙周膜以及神经血管的再生(Weihua Guo, Yong He, Xiaojun Zhang, et al, The use of dentin matrix scaffold and dental follicle cells for dentin regeneration, Biomaterials 2009 ；30: 6708-6723)。Guo 等的研究显示相 对于其他生物支架材料，牙本质基质可以更好的诱导分化为成牙骨质细胞样细胞、成骨细 胞样细胞以及成纤维细胞样细胞，形成类似天然的牙周膜样结缔组织和牙周膜/牙骨质复 合体的结构，有利于生物牙根的重建，这是区别于其他生物支架材料的重要特征之一。但该 研究中所制备的牙本质基质为老鼠牙本质，与人类等其他物种的牙本质存在一定不同，构 建出的组织为牙本质、无法设计成为牙根形的支架材料，并且，生物牙根材料在不能破坏牙 本质基质中的重要生物活性物质，以保证这些生物活性物质可以持续的从材料中释放到周 围环境中的同时，需尽量保持牙根的形状、保持该材料具有一定的力学强度并且充分脱矿， 以利于牙髓和牙周组织的软组织和硬组织的共同构建。同时，Guo的研究中使用的异位的 牙本质的再生，对于牙槽骨内的再生情况并没有进行相应的讨论。综上所述，该研究并未实 现真正意义上的生物牙根支架材料的重建。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种生物牙根支架材 料的构建方法。本发明的构建方法容易掌握、安全可行、成本低廉。为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案一种生物牙根支架材料的构建方法，包括以下步骤
(1)将供体新鲜的牙齿在无菌状态下，用PBS缓冲液冲洗；
(2)将步骤(1)所得牙齿在有喷水装置的牙科用慢速涡轮机上磨除牙冠部分，保留牙根 部分，所述牙科用慢速涡轮机的转速为1000-10000转/分，所得牙根部分保存于含有PBS 缓冲液的培养瓶或其他器皿中；
(3)用牙科用拔髓针拔出步骤(2)所得牙齿牙根内的牙髓组织，用生理盐水反复冲洗牙 齿根管内部3-8次，每次10-30毫升；
(4)使用牙科用扩大机器将步骤(3)所得牙齿内部逐渐扩大，去除牙髓组织和前期牙本 质等组织，此过程中使用5%-17%的EDTA溶液反复冲洗根管内部3-8次，每次10-30毫升；
(5)使用牙科用涡轮机按照生物牙根外形磨除部分牙齿组织，以去除牙周组织和牙骨 质等组织。最终得到的材料厚度l_3mm，长度1-2. 5cm ；
(6)将步骤(5)处理好的牙齿保存于PBS缓冲液中，于超声震荡器中处理3-8次，每次 处理 10-30min ；
(7)在转速为100-500转/分的磁力搅拌器中，使用不同浓度的EDTA对牙本质进行梯 度脱矿，得到牙本质基质。将步骤(7)处理好的牙本质基质保存于含有双抗的PBS缓冲液中备用，所述含双 抗的PBS中青霉素浓度为50-500unit/mL，链霉素浓度为50_500unit/mL。上述生物牙根支架材料的构建方法中，步骤(4)中所述使用牙科用扩大机器将步 骤(3)所得牙齿内部逐渐扩大的方法为首先使用15号牙科手用普通镍钛锉扩大牙齿根管 内部，20号普通镍钛锉扩大牙齿根管内部，然后从小号到大号使用号牙科用扩大针扩大 牙齿根管口部分，即依次用Sl号、S2号、Fl号、F2号牙科用扩大针扩大牙齿根管口部分，必 要时用F3号牙科用扩大针扩大牙齿根管口部分。步骤(5)所述使用牙科用涡轮机将步骤 (4)所得牙根外侧磨除的方法为使用金刚砂车针，按照生物牙根外形磨除部分牙齿组织， 最终得到的材料厚度l_3mm，长度1-2. 5cm。上述生物牙根支架材料的构建方法中，步骤(7)中所述梯度脱矿的方法为
首先使用17%-25%的EDTA溶液脱矿处理5-15min，然后使用7%_15%的EDTA溶液脱矿 处理5-15min，最后使用5%的EDTA溶液脱矿处理5_15min。牙本质作为一种生物材料，由于其本身具有一定的机械强度，可以作为一种新型 的实现牙根再生的支架材料；而且牙本质本身来源于牙源性细胞，存在一些牙齿发育过程 中重要的蛋白和因子，又可以做为一种细胞牙向分化的诱导微环境。同时，由于各种临床需 要而拔除的牙齿除了用于细胞培养外，牙齿的硬组织部分几乎都被当做医疗废物处理，而 且牙本质又是牙齿的主要组成部分，这就很好的解决了来源问题。但是，利用牙本质基质作 为生物牙根支架材料，需要尽量保持牙根的形状、并且充分脱矿，但又不能破坏牙本质基质 中的重要生物活性物质，保证这些生物活性物质可以持续的从材料中释放到周围环境中， 此外，还要保持该材料具有一定的力学强度。因而，本发明采用从小号到大号、逐渐使用牙 科用扩大机将牙齿根管内部扩大，并采用梯度脱矿的方法对牙齿进行脱矿处理。经上述方 法，在没破坏牙本质基质中的重要生物活性物质的同时，尽量保持了牙根的形状、保持该材 料具有一定的力学强度并且充分脱矿，有利于于牙髓和牙周组织的软组织和硬组织的共同 构建，最终构建出具有生物活性的牙根支架材料。
本发明构建的牙本质基质支架材料的评价①将处理好的牙本质基质至于培养基 中、37°C孵育3天后，培养基清亮、无混浊，证明该材料可以使用，消毒过关，对该培养基进 行分析，发现里面含有大量具备成牙相关的蛋白和因子，如TGF-β 1、DMP-I、DSPP等。②扫 面电镜观察发现材料表面牙本质小管通畅，管间牙本质胶原充分暴露，细胞在材料表面生 长良好。③细胞活性检测，发现该材料有利于细胞的增殖和生长。本发明的生物牙根支架材料的构建方法，可从废弃的人健康牙齿中获得大量的人 牙本质基质，建立组织工程技术生物支架材料，充分利用有效资源。根据本发明的方法，制 备的生物牙根支架材料及诱导微环境，经复合细胞处理后可以诱导种子细胞分化为牙骨 质、牙周膜、牙本质以及牙髓组织，实现真正意义的生物牙根的重建。与已有其他一些支架 材料相比，本材料的构建操作简单容易掌握，安全可行，成本低廉，并且可以提供种子细胞 诱导分化的微环境。此外，该方法中所使用的牙齿均为因各种原因被拔除废弃的牙齿，这大 大的节约了医疗资源。因此，该生物牙根支架材料及诱导微环境的制备有广泛的应用前景。本发明的生物牙根支架材料，首先具备牙根样的外形，更加接近天然牙齿的外形； 其次，本发明制备的牙根支架材料中含有大量具备成牙相关的蛋白和因子，如TGF-βΙ、 DMP-1、DSPP，牙槽骨内部对于细胞、材料的成牙能力具有一定的诱导性，支架材料本身也具 有一定的牙向诱导能力，两者相辅相成，可以更好的解决诱导微环境的问题，有利于将该生 物牙根支架材料进行牙槽骨内移植。总之，牙本质基质的制备为实现生物牙根的重建提供 了新思路，对治疗牙齿缺失具有重要意义，而对牙本质基质的研究及临床应用则需要大量 的牙本质基质这种支架材料。
图1为本发明实施例1构建的人前牙牙本质基质支架材料； 图2为本发明实施例1构建的人前牙牙本质基质支架材料的电镜扫描图； 图3为本发明实施例1构建的人前牙牙本质基质支架材料的细胞生长图； 图4为本发明实施例1构建的人前牙牙本质基质对细胞活性的影响； 图5、6本发明实施例1构建的人前牙牙本质基质分泌的相关的蛋白和因子； 图7为本发明实施例2构建的人前牙牙本质基质支架材料； 图8为本发明实施例2构建的人前牙牙本质基质支架材料的电镜扫描图； 图9为本发明实施例2构建的人前牙牙本质基质支架材料的细胞生长图；图10为本发 明实施例3构建的人前牙牙本质基质支架材料；
图11为本发明实施例3构建的人前牙牙本质基质支架材料的电镜扫描图； 图12为本发明实施例3构建的人前牙牙本质基质支架材料的细胞生长图。
具体实施例方式下面结合试验例及具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解 为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本 发明的范围。实例中操作均在严格无菌环境中进行，为保证细胞不受污染，在所有使用的 PBS, DMEM中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。实施例1、人前牙生物牙根支架材料及诱导微环境的制备 本实施例列举的生物牙根支架材料的制备方法包括以下步骤(1)取健康前牙四颗，用PBS液冲洗三遍，保存于含有PBS的培养瓶或其他器皿中，封口 膜密封瓶口并储存于4°C冰箱；
(2)在有喷水装置的牙科用慢速涡轮机上安装金刚砂片，调整转速为3000转/分，使用 金刚砂片磨除步骤(1)所得牙齿的牙冠部分，保留牙根部分并保存于含有PBS的培养瓶或 其他器皿中，封口膜密封瓶口并储存于4°C冰箱；
(3)使用牙科用拔髓针完整拔出步骤(2)所得牙齿牙根内的牙髓组织，并使用生理盐水 反复冲洗根管内部3次，每次约20mL ；
(4)使用牙科用扩大机器对步骤(3)所得牙齿进行牙齿内部处理，首先使用15号牙科 手用普通镍钛锉扩大牙齿根管内部，20号普通镍钛锉扩大牙齿内部，然后从小号到大号使 用号牙科用扩大针扩大牙齿根管口部分，即依次用Sl号、S2号、Fl号、F2号牙科用扩大 针扩大牙齿根管口部分，并反复使用10%的EDTA溶液冲洗根管内部3次，每次IOmL ；
(5)使用牙科用涡轮机对步骤(4)所得的牙齿按照前牙牙根外形磨除部分牙齿组织，以 去除牙周组织和牙骨质等组织。最终得到的材料厚度1mm，长度1. 5cm ；
(6)将步骤(5)处理好的牙齿保存于PBS缓冲液中，并于超声震荡器中处理4次，每次 处理IOmin ；
(7)在转速为100转/分的磁力搅拌器中，使用不同浓度的EDTA对牙本质进行梯度脱 矿，首先使用15%的EDTA溶液脱矿处理5min，然后使用10%的EDTA溶液脱矿处理5min，最 后使用5%的EDTA溶液脱矿处理5min ；
将步骤(7)处理好的牙本质基质保存于含有双抗(青霉素浓度为100imit/ml，链霉素 浓度为100imit/ml)的PBS缓冲液中，使用时将上述所制作的牙本质基质按照临床要求和 实际应用进行使用即可。本实施例构建的牙本质基质支架材料的评价
D处理好的牙本质基质至于DMEM培养基中、37°C孵育3天后，检验发现培养基清亮、
无混浊，证明该材料可以使用，消毒过关。收集上述浸泡材料的培养基，并对该培养基进行 分析，采用ELISA试剂盒检测相关蛋白和因子。结果发现培养基里面含有大量具备成牙相 关的蛋白和因子，如TGF-β 1、DMP-1、DSPP等，而未浸泡过材料的培养基中无上述相关蛋白 和因子。②将本实施例所构建的牙本质基质支架材料置于扫面电镜观察下观察，发现材料 表面牙本质小管通畅，管间牙本质胶原充分暴露，细胞在材料表面生长良好。③细胞活性检测，采用CCK-8实验方法，即收集使用了该材料进行培养的细胞和 未使用该材料、只是用正常培养基培养的细胞，制备成细胞悬液，接种在96孔板中，每板 IOOy 1，同时加入 ομ 1CCK-8溶液，37°C孵育2小时后在450nm处使用酶标仪检测吸光度， 检测细胞活性。发现该材料有利于细胞的增殖和生长。实施例2、人前磨牙生物牙根支架材料及诱导微环境的制备 本实施例列举的生物牙根支架材料的制备方法包括以下步骤
(1)取前磨牙四颗，用PBS液冲洗三遍，保存于含有PBS的培养瓶或其他器皿中，封口膜 密封瓶口并储存于4°C冰箱。(2)在有喷水装置的情况下，在牙科用慢速涡轮机上安装金刚砂片，调整转速6500转/分，使用金刚砂片磨除步骤(1)牙冠部分，保留牙根部分并保存于含有PBS的培养瓶或 其他器皿中，封口膜密封瓶口并储存于4°C冰箱。(3)使用牙科用拔髓针完整拔出步骤(2)所得牙齿牙根内牙髓组织，并使用生理盐 水反复冲洗根管内部5次，每次约15ml。(4)使用牙科用扩大机器进行牙齿内部处理，首先使用15号牙科手用普通镍钛锉 扩大牙齿根管内部，20号普通镍钛锉扩大牙齿内部，然后从小号到大号使用号牙科用扩 大针扩大牙齿根管口部分，即依次用Sl号、S2号、Fl号、F2号牙科用扩大针扩大牙齿根管 口部分，并反复使用10%的EDTA溶液冲洗根管内部5次，每次20mL ；
(5)使用牙科用涡轮机对步骤(4)所得的牙齿按照前磨牙牙根外形磨除部分牙根组织， 以去除牙周组织和牙骨质等组织。最终得到的材料厚度1. 5mm，长度1. 5cm ；
(6)将步骤(5)处理好的牙齿保存于PBS缓冲液中，并于超声震荡器中处理4次，每次 处理20min。(7)在转速为200转/分的磁力搅拌器中，使用不同浓度的EDTA进行梯度脱矿， 20%的EDTA溶液脱矿处理5min，然后使用12%的EDTA溶液脱矿处理5min，最后使用5%的 EDTA溶液脱矿处理5min。将步骤(7)处理好的牙本质基质保存于含有双抗(青霉素浓度为100imit/ml，链 霉素浓度为100imit/ml)的PBS中，使用时将上述所制作的牙本质基质按照临床要求和实 际应用进行使用即可。本实施例构建的牙本质基质支架材料的评价
I:处理好的牙本质基质至于DMEM培养基中、37°C孵育3天后，检验发现培养基清亮、 无混浊，证明该材料可以使用，消毒过关。②将本实施例所构建的牙本质基质支架材料置于扫面电镜观察下观察，发现材料 表面牙本质小管通畅，管间牙本质胶原充分暴露，细胞在材料表面生长良好。实施例3、人磨牙(多根牙)生物牙根支架材料及诱导微环境的制备 本实施例列举的生物牙根支架材料的制备方法包括以下步骤
(1)取健康磨牙四颗，用PBS液冲洗三遍，保存于含有PBS的培养瓶或其他器皿中，封口 膜密封瓶口并储存于4°C冰箱；
(2)在有喷水装置的牙科用慢速涡轮机上安装金刚砂片，调整转速为4000转/分，使用 金刚砂片磨除步骤(1)所得牙齿的牙冠部分，保留牙根部分并保存于含有PBS的培养瓶或 其他器皿中，封口膜密封瓶口并储存于4°C冰箱；
(3)使用牙科用拔髓针完整拔出步骤(2)所得牙齿牙根内的牙髓组织，并使用生理盐水 反复冲洗根管内部7次，每次约20mL ；
(4)使用牙科用扩大机器对步骤(3)所得牙齿进行牙齿内部处理，首先使用15号牙科 手用普通镍钛锉扩大牙齿根管内部，20号普通镍钛锉扩大牙齿内部，然后从小号到大号使 用号牙科用扩大针扩大牙齿根管口部分，即依次用Sl号、S2号、Fl号、F2号牙科用扩大 针扩大牙齿根管口部分，并反复使用10%的EDTA溶液冲洗根管内部7次，每次20mL ；
(5)使用牙科用涡轮机对步骤(4)所得的牙根按照磨牙牙根外形磨除部分牙齿组织，以 去除牙周组织和牙骨质等组织。最终得到的材料厚度1mm，长度Icm ；(6)将步骤(5)处理好的牙齿保存于PBS缓冲液中，并于超声震荡器中处理4次，每次 处理20min ；
(7)在转速为300转/分的磁力搅拌器中，使用不同浓度的EDTA对牙本质进行梯度脱 矿，首先使用20%的EDTA溶液脱矿处理lOmin，然后使用10%的EDTA溶液脱矿处理lOmin， 最后使用5%的EDTA溶液脱矿处理IOmin ；
将步骤(7)处理好的牙本质基质保存于含有双抗(青霉素浓度为100imit/ml，链霉素 浓度为100imit/ml)的PBS缓冲液中，使用时将上述所制作的牙本质基质按照临床要求和 实际应用进行使用即可将上述所制作的牙本质基质按照临床要求和实际应用进行使用即 可。 ①将处理好的亚本质基质至于培养基中、37°C孵育3天后，培养基清亮、无混浊， 证明该材料可以使用，消毒过关。②扫面电镜观察发现材料表面牙本质小管通畅，管间牙本 质胶原充分暴露，细胞在材料表面生长良好。
权利要求
1.一种生物牙根支架材料的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)将供体新鲜的牙齿在无菌状态下，用PBS缓冲液冲洗；(2)将步骤(1)所得牙齿在有喷水装置的牙科用慢速涡轮机上磨除牙冠部分，保留牙根 部分，所述牙科用慢速涡轮机的转速为1000-10000转/分，所得牙根部分保存于含有PBS 缓冲液的培养瓶或其他器皿中；(3)用牙科用拔髓针拔出步骤(2)所得牙齿牙根内的牙髓组织，用生理盐水反复冲洗牙 齿根管内部3-8次，每次10-30毫升；(4)使用牙科用扩大机器将步骤(3)所得牙齿内部逐渐扩大，去除牙髓组织和前期牙本 质等组织，此过程中使用5%-17%的EDTA溶液反复冲洗根管内部3-8次，每次10-30毫升；(5)使用牙科用涡轮机按照生物牙根外形磨除部分组织，以去除牙周组织和牙骨质组 织，得到厚度为l_3mm、长度1-2. 5cm的支架材料；(6)将步骤(5)处理好的支架材料保存于PBS缓冲液中，于超声震荡器中处理3-8次， 每次处理10-30min ；(7)在转速为100-500转/分的磁力搅拌器中，使用不同浓度的EDTA对牙本质进行梯 度脱矿，得到生物牙根支架材料。
2.根据权利要求1所述的生物牙根支架材料的构建方法，其特征在于步骤(4)中所述使用牙科用扩大机器将步骤(3)所得牙齿内部逐渐扩大的方法为，首 先使用15号牙科手用普通镍钛锉扩大牙齿根管内部，20号普通镍钛锉扩大牙齿根管内部， 然后从小号到大号使用号牙科用扩大针扩大牙齿根管口部分，即依次用Sl号、S2号、Fl 号、F2号牙科用扩大针扩大牙齿根管口部分，必要时用F3号牙科用扩大针扩大牙齿根管口 部分。
3.根据权利要求1或2所述的生物牙根支架材料的构建方法，其特征在于步骤(7) 中所述梯度脱矿的方法为，首先使用17%-25%的EDTA溶液脱矿处理5-15min，然后使用 7%-15%的EDTA溶液脱矿处理5-15min，最后使用5%的EDTA溶液脱矿处理5_15min。
全文摘要
本发明公开了一种生物牙根支架材料的构建方法，包括以下步骤牙齿在无菌状态下，用PBS液冲洗三遍；用金刚砂片磨除牙冠部分，保留牙根部分；拔出牙根内牙髓组织，用生理盐水反复冲洗根管内部；使用牙科用扩大机器将牙齿内部逐渐扩大，用5%-17%的EDTA溶液反复冲洗根管内部；使用牙科用涡轮机磨除牙根外侧部分组织按照需要构建的生物牙根外形制备出特定形状的支架；将牙齿保存于PBS缓冲液中，于超声震荡器中处理3-8次；在转速为100-500转/分的磁力搅拌器中，使用不同浓度的EDTA对牙本质进行梯度脱矿，得到牙本质基质；将牙本质基质保存于含有双抗的PBS中。本发明的生物牙根支架材料，具备牙根样的外形，界定为厚度1-3mm，长度1-2.5cm，含有大量具备成牙相关的蛋白和因子，并可持续释放这些蛋白和因子，具有一定的牙向诱导能力，可以更好的解决诱导微环境的问题，有利于将该生物牙根支架材料进行牙槽骨内原位移植。
文档编号A61C8/00GK102068318SQ201010597640
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者李锐, 杨波, 田卫东, 盛磊, 郭维华, 陈岗 申请人:四川大学