专利名称：人用狂犬疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗预防领域，具体来说，涉及一种人用的狂犬疫苗。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒感染所致的急性传染病，是一种人畜共患急性传染病。每年有超过5万人因狂犬病死亡，99%的死亡时发生在亚洲、非洲和南美洲。狂犬病毒(RV)是高度嗜神经病毒，是弹状病毒科弹状病毒属中的不分段负链RNA 病毒，外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA，是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒具有两种主要抗原一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用； 另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。RV的病毒包膜组分由跨膜糖蛋白G和基质M蛋白组成。糖蛋白形成大约400个三聚刺突，这些刺突紧密地排列于病毒表面上。狂犬病疫苗是目前预防狂犬病发生唯一有效的药品。目前使用的狂犬疫苗主要有三类经动物脑组织培养的灭火疫苗、经鸭胚培养的灭活疫苗和经细胞(人二倍体细胞、鸡胚细胞、地鼠肾原代细胞和Vero传代细胞)培养的灭活疫苗。狂犬疫苗大部分是用于暴露后的免疫，因此要求疫苗在人体中产生较快的免疫应答反应。但现有的狂犬疫苗无论是采用何种病毒培养体系，最终都是制成含全病毒颗粒的疫苗。其含有与抗原无关的成分，如病毒杂蛋白、病毒核酸及脂质和培养病毒的组织蛋白的残余蛋白，当增加病毒的抗原含量时，这些杂蛋白也随之增加，因此疫苗的副反应就加大了。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中的缺陷，提供一种能够在人体内产生更快、更高的免疫应答反应，且副反应少的的人用新疫苗。一种人用狂犬疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有狂犬病全病毒颗粒经裂解后的外膜片段及破伤风类毒素。所述的裂解是狂犬病全病毒颗粒通过化学法裂解。所述的外膜片段包括糖蛋白形成的刺突和基质蛋白。破伤风类毒素对狂犬病毒VLP具有快速增强免疫的作用，可以在短期内获得高中和抗体的作用，而且中和抗体维持时间较长，为狂犬中毒咬伤及潜伏期短的患者，提供一种更为安全有效的人用狂犬病疫苗。所述的人用狂犬疫苗是由狂犬病病毒固定毒株CTN-1V、aGV株或其他经细胞适应的狂犬病病毒固定毒株中任选一株制备的。本发明中，人用狂犬疫苗每剂量为含有病毒蛋白10-150 μ g，破伤风类毒素的用量为 3Lf/剂-IOLf/ 剂。所述的狂犬疫苗包括狂犬病病毒外膜、基质蛋白和刺突上的糖蛋白组成。一种制备人用狂犬疫苗的方法，该方法的步骤包括
(1)分别制备裂解的狂犬裂解病毒颗粒的外膜片段和破伤风类毒素；(2)将这两种成分按照一定比例进行混合；(3)将混合后的疫苗按照液体剂型或冻干剂型疫苗剂型分装或冻干；(4)将分装后的产品经过成品检定后进行包装，即得到所需的人用狂犬病疫苗。所述的两种成分按照抗原含量的混合比例为病毒蛋白10-150 μ g/剂；破伤风类毒素的用量为3Lf/剂-IOLf/剂。所述的步骤(1)的制备裂解的狂犬裂解病毒颗粒的外膜片段，包括如下步骤A、制备纯化的狂犬病全病毒液；B、将Triton-IOO按照0. 2-1. 0%终浓度加入纯化后的病毒液中裂解病毒颗粒；C、裂解后的病毒液进行二次纯化，用10-60%蔗糖密度梯度离心或柱层析方法收集病毒外膜片段部分，再次纯化抗原；D、经30KD-100KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒裂解液。本发明将狂犬病病毒固定毒株经过细胞培养、纯化获得的狂犬病毒颗粒用化学方法进行裂解，提取和纯化含有刺突和基质蛋白的病毒外膜片段，再混合一定量的破伤风类毒素，配置成一种狂犬病病毒裂解疫苗。本发明还提供了制备这种裂解疫苗的方法。这种病毒裂解疫苗用于预防人因狂犬病病毒感染引发的狂犬病。本发明的狂犬裂解疫苗对现有的狂犬病全病毒疫苗进行了改造和升级使之达到更好的免疫效果和安全性。本发明是将经纯化后的狂犬病全病毒加入裂解剂，提取和纯化含有刺突和基质蛋白的病毒外膜片段，再混合一定量的破伤风类毒素经配置成为狂犬病病毒裂解疫苗。使这种疫苗中，除含有免疫原性的外膜抗原存在外，极大地降低了其它有可能性引起不良反应的病毒内源性毒性物质，如病毒核酸及脂质。从而能克服现行的全病毒商品疫苗具有免疫局限性及接种后的不良反应。本发明所用的狂犬病病毒固定毒株为CTN_lV，aGV株。中国药品生物制品检定所负责制备和发放上述病毒毒种。当然，本发明的的疫苗也可以采用其它经细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。本发明的狂犬病疫苗配置的方法，包括根据纯化病毒液的病毒浓度，将 Triton-IOO加入纯化后的病毒液中，使全病毒颗粒充分彻底裂解。裂解后的病毒液进行二次纯化，用蔗糖密度梯度离心或柱层析方法，收集含有病毒包膜和刺突的片段。经过滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒裂解液。用缓冲液稀释，加入1 %硫柳汞，经过二次除菌过滤制备出疫苗原液，加入适宜的抗原稳定剂后，经过无菌试验、蛋白浓度及纯度测定、效力试验等检定合格后，分装即为疫苗。本发明提供了一种人用狂犬疫苗及其制备方法，和现有的病毒纯化原液相比，其含有的杂蛋白大大减少降低了副作用，且具有更高的免疫原性和效力，使用更加安全。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例对本发明作进一步阐述。实施例1狂犬病全病毒颗粒裂解和提取纯化将Vero细胞于37°C培养，并经连续传4代。第4代细胞培养3_5天后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为不低于7.5LgLD5(1/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-IV株。并加入细胞维持液于35°C培养M小时。换入新鲜细胞维持液，按照上述条件继续培养2-4天，当细胞病变CPE达到++ +++时，收获、合并病毒液。按照1 4000加入β-丙内酯，置于 22°C、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用100KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0. lmg/ml，SOOOrpm离心后，上清液除菌过滤。再经kphar0Se4FF凝胶柱层析，收集全病毒峰液体，根据纯化的全病毒液的病毒蛋白浓度，将Triton-IOO按照0. 2%终浓度缓慢加入纯化后的全病毒液中并轻微搅拌均勻。于 2-8°C温和振荡60分钟，使病毒颗粒充分彻底裂解。裂解后的病毒液进行二次纯化，先用 10-60%蔗糖密度梯度离心，收集富含有刺突和基质蛋白的病毒外膜片段的液相。再次纯化，用PBS稀释，调PH7. 2。经IOOKD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收含有刺突和基质蛋白的病毒外膜片段。用磷酸盐缓冲液稀释，加入1 %硫柳汞，经0. 45 μ g和0. 22 μ g 二次除菌过滤制备出疫苗原液。经无菌试验、蛋白浓度及纯度测定、效力试验等检定合格后后，加入抗原稳定剂人血白蛋白，调PH7. 0，按照每剂含病毒蛋白10-150 μ g/0. 5ml/剂，分装备用。实施例2取上述制备的人狂犬病病毒颗粒裂解蛋白(主要含有裂解病毒颗粒的外膜片段)、破伤风类毒素原液(武汉生物制品研究所)，按照抗原含量的混合比例为病毒蛋白 10-150 μ g/剂；破伤风类毒素的用量为3Lf/剂-IOLf/剂；分别组合制成液体疫苗，然后封装，最后检定包装。实施例3取人用狂犬病纯化原液(二倍体细胞)(中国药品生物制品检定所)，狂犬病病毒颗粒裂解蛋白和破伤风类毒素原液(武汉生物制品研究所)按照表1的比例分别组合制成液体疫苗。设人用狂犬病疫苗为对照组，其中只在对照组中加入人血白蛋白为保护剂， 按照中国药典三部的方法分别进行四种组合疫苗的特异性实验。实验结果均合格，说明加入破伤风类毒素的狂犬病病毒颗粒裂解蛋白的疫苗是安全有效的。实施例4用上述实施例3的5种组合的疫苗分别免疫小鼠，每次免疫0. 5ml，0天、7天分别免疫两次，观察14天后采血，检测血清中和抗体和效价。表 权利要求
1.一种人用狂犬疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有狂犬病全病毒颗粒经裂解后的外膜片段及破伤风类毒素；所述的外膜片段包括刺突和基质蛋白。
2.根据权利要求1所述的人用狂犬疫苗，其特征在于，所述的人用狂犬疫苗每剂量为含有病毒蛋白10-150 μ g，破伤风类毒素的用量为3Lf/剂-IOLf/剂。
3.根据权利要求1所述的人用狂犬疫苗，其特征在于，所述的人用狂犬疫苗是由狂犬病病毒固定毒株CTN-1V、aGV株或其他经细胞适应的狂犬病病毒固定毒株中任选一株制备的。
4.一种人用狂犬疫苗的制备方法，该方法的步骤包括(1).分别制备裂解的狂犬裂解病毒颗粒的外膜片段和破伤风类毒素；(2).将这两种成分按照一定比例进行混合；(3).将混合后的疫苗按照液体剂型或冻干剂型疫苗紧系分装或冻干；(4).将分装后的产品经过成品检定后进行包装，即得到所需的人用狂犬病疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤O)中两种成分混合比例为病毒蛋白10-150 μ g/剂；破伤风类毒素的用量为3Lf/剂-IOLf/齐U。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)的制备裂解的狂犬裂解病毒颗粒的外膜片段，包括如下步骤A、制备纯化的狂犬病全病毒液；B、将Triton-IOO按照0.2-1. 0%终浓度加入纯化后的病毒液中裂解病毒颗粒；C、裂解后的病毒液进行二次纯化，用10-60%蔗糖密度梯度离心或柱层析方法收集病毒外膜片段部分，再次纯化抗原；D、经30KD-100KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒裂解液。
全文摘要
本发明提供了一种人用狂犬疫苗，所述的疫苗含有狂犬病全病毒颗粒经裂解后的外膜片段及破伤风类毒素；外膜片段包括刺突和基质蛋白。其中，人用狂犬疫苗每剂量为含有病毒蛋白10-150μg，破伤风类毒素的用量为3Lf/剂-10Lf/剂。本发明的人用狂犬病疫苗，相比现有的病毒纯化原液含有的杂蛋白大大减少，具有更高的免疫原性和效力，使用更加安全。
文档编号A61K39/39GK102526722SQ20101060773
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者张高峡, 沈琼 申请人:上海泽润生物科技有限公司