专利名称：夏枯草及其提取物在制备抑制血管生成产品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及夏枯草及其提取物抑制血管生长(血管新生)的新用途，特别涉及夏枯草及其提取物在制备抑制血管生成产品中的应用。
背景技术：
血管新生是指由原已存在的毛细血管通过出芽形成新的毛细血管的过程。它不仅是机体正常发育、生殖和组织修复等生理过程的基础，也在多种病理过程中起重要作用。若血管新生过度，与类风湿、肿瘤、视网膜眼底病和牛皮癣等疾病有关，血管新生抑制剂潜在及广泛的用途使其成为当前药物研发热点。(Judah Folkman. Angiogenesis :an organizing principle for drug discovery ？ Drug Discovery,2007,6 (4) :273-286.)
夏枯草(Prunella vulgaris Linn.)为常用传统中药，始载于《神农本草经》，性寒味苦，具有清火明目、散结消肿的功效，历代医家多用于治疗瘟病、乳痈、目痛、黄疸、淋病和高血压等病症。现代药理学研究证明夏枯草具有广泛的药理作用，如具有降压、降糖、抗菌、 抗炎、抗过敏、抗氧化、清除自由基及抗病毒等作用，国外夏枯草作为一种自我康复药物，在缓解咽喉疼痛、发热及加速伤口愈合等方面得到广泛的应用并受到重视。
筛选血管生成活性物质可利用内环境与人体相似，且血管新生过程易于观察的动物模型来检测，其中鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoie membrane, CAM)是研究血管形成与抗血管形成的理想体内模型。血管新生主要发生在胚胎发育过程中，鸡胚孵育第3-5 天、7-10天血管生长最活跃，12天以后CAM血管逐渐萎缩，故选取8-12天为药物刺激最佳时间，利用立体显微镜，观察并计算血管的数量。该技术不仅可用于定性、定量研究体内血管新生，还具有实验材料易得、操作简便、实验周期短、不需要特殊设备、结果易于观察和适合大样本重复等优点而得到广泛应用。最早将CAM作为肿瘤转移和侵蚀模型开展研究也正是基于其丰富和直观的血管生长特性(Leighton，J. Invasion and metastasis of heterologous tumors in the chick embryo. In "Progress. Experimental Tumor Research"1964 ；14 :98.)。目前CAM模型用于评价新药的作用已经得到了美国食品和药品管理局的认可(Vargas A, Zeisser-Labouebe Μ, Lange N, et al. The chick embryo and its chorioallantoic membrane(CAM)for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev,2007,59(11) :1162-1176.)。
基于CAM模型评价中药对血管生成活性的影响和作用，不但能进一步挖掘传统中药的价值，还能对血管生成性疾病的治疗，延长人类寿命作出贡献。发明内容
本发明的目的是提供夏枯草及其提取物的新用途。表现在制备抑制血管生成的药物及保健品中单独使用或与其他药物和有效成分配伍使用。
上述夏枯草提取物可为夏枯草水或醇提取物。夏枯草水提取物也可按照常规方法进行制备，如可用下述方法得到选取药材夏枯草(唇形科植物夏枯草I^imella vulgarisLinn.的花、果穗及全草)加入5 10倍纯水，加热，煮沸后保持微沸状态继续加热0. 5 1小时，然后过滤收集滤液1 ；接着在滤渣中再加入5 10倍纯水，加热，煮沸后保持微沸状态继续加热0. 5 1小时，然后过滤收集滤液2 ；将滤液1与滤液2混勻，干燥得到夏枯草水提取物。
夏枯草醇提取物可按照常规方法进行制备，如可用下述方法得到粉碎的夏枯草和无水乙醇或50%乙醇以1 10 (体积分数)混合，沸水回流证，收集提取液，粗滤后残渣再次沸水回流池，合并2次提取液，旋转蒸发得到夏枯草醇提浓缩液。
用夏枯草或提取物制备的药物可以制成片剂、胶囊、口服液、粉剂、颗粒剂、膏剂、 霜剂、注射剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
用夏枯草或提取物制备的保健品可以制成片剂、胶囊、口服液、粉剂、颗粒剂、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明采用CAM这一模式生物，以整体动物实验作为检测手段，采用血清药理学方法观察夏枯草对血管生成的影响，发现夏枯草可显著抑制血管生成，药效作用比西药反应停更明显，CAM视野下无密集血管生成，未能见到清晰的血管脉络状网络，为该药的作用机制研究提供了新的内容和方向，也为中药开发利用研究提供了新的思路和手段。
图1为夏枯草提取物以及反应停抑制CAM血管生成图。 图2.为夏枯草提取物以及反应停对血管数量影响的结果
实验研究、夏枯草抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的试验
1 材料
1.1 鸡胚
购于种鸡或养鸡场。
1.2药物和试剂
夏枯草水提取物按照下述方法进行制备选取药材夏枯草(唇形科植物夏枯草 Prunella vulgaris Linn.花、果穗及全草)水煎两次，煎液过滤，混合后加热浓缩至Ig/ mL，此为夏枯草水提取物。
夏枯草醇提取物按照下述方法进行制备粉碎的夏枯草和无水乙醇或50%乙醇以1 10 (体积分数)混合，沸水回流证，收集提取液，粗滤后残渣再次沸水回流池，合并 2次提取液，旋转蒸发得到夏枯草醇提浓缩液lg/mL。
反应停(化学名α-苯酞茂二酰亚胺，通用名沙利度胺，酞胺哌啶酮。Sigma公司)。
混合纤维素酯微孔滤膜(0.45 μ m，上海兴亚净化材料厂)；定性滤纸(杭州富阳特种纸厂)；其余试剂均为国产。
1. 3 仪器
MIR-553恒温培养箱(日本SANYO公司)，S6E体视显微镜(德国Leica公司)， XTS30-D体视显微镜(北京泰克仪器有限公司)，台式离心机(上海安亭公司)、MLS-3780 高压灭菌锅(日本SANYO公司)等。
2 方法
2. 1试验分组及含药血清制备
雄性昆明种小鼠随机分成夏枯草水提取物组、夏枯草无水乙醇提取物组、夏枯草 50%乙醇提取物组、西药反应停阳性对照组和生理盐水对照组，两个药物组常规按体重灌胃给与相当于人临床用药剂量5倍的药物，生理盐水组采用等剂量的生理盐水，一日1次， 于第5d最后1次灌服药物后lh，摘眼球取血，离心制备血清约0. 5mL，置于无菌试管中， 56°C灭活30min，密封_20°C冰箱中冻存。
2. 2鸡胚培养
种蛋以1%。新洁尔灭水溶液浸洗揩干，气室朝上，置于(37士0. 5) °C恒温箱中孵化培养，内置湿盘保持相对湿度在65%，每天翻蛋2次，3d后于透射灯下观察种蛋生长情况， 剔除未受精卵。
2. 3鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验
取7d龄鸡胚，随机分组，碘伏消毒蛋气室表面，用砂轮和解剖针启开约lcm2的窗口，暴露CAM，无菌胶带封口，继续孵化。隔日，取直径约0. 5cm,经预先高压灭菌的混合纤维素微孔滤膜片作为载体置于CAM上，并分别滴加不同组别的含药血清20 μ L于载体上，密封后继续孵育72h，加1 1甲醇和丙酮混合液室温固定15min，以载体为中心剪下CAM约 3cm2，展膜于滤纸上，凉干。
2. 4结果观察
以滤纸为背景，体视显微镜下查看载体周围的血管数，比较各组血管生成情况。
2. 5统计学分析
采用ANOVA方差检验分析寿命实验结果，定量资料以又士S表示；采用两样本t检验方法比较组间血管数量差异。
3 结果
3. ICAM血管生成表现形式
图1.药物影响血管生成的镜检结果
由图1可见，CAM自然状态的血管生成呈叶脉状，给药组在载体周围呈现不同程度放射状生长的血管网，其中西药反应停组、夏枯草醇提取物组和夏枯草50%醇提取物组视野中的血管数量少于生理盐水对照组，但仍可见到清晰的血管网络，而夏枯草水提取物组不仅无密集血管生成，视野下未能见到清晰的血管脉络状网络。
3. 2血管计数
表1.各组血管生长数量(X士 SD，η = 9)
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组别血管数量
生理盐水组
反应停组
夏枯草水提取物组
夏枯草醇提取物组
夏枯草50 %醇提取物组114. 33 士 17. 5 71. 89 士 11. 72= 25. 00 士 7. 58*# 75. 11 士 8. 81* 77. 89 士 8. 10*
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与生理盐水组相比P < 0. 01，#与反应停组相比P < 0. 01
上述实验结果从形态和数量两方面定性、定量地表明夏枯草提取物具有显著的抑制血管生长作用，其中夏枯草水提取物抑制效果比西药反应停更显著，醇提取物的抑制作用与西药反应停相当。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法适用于药品和保健品制备，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、夏枯草提取物的片剂制备
夏枯草加入5 10倍纯水，分2次煎煮，合并药液浓缩至药液比1 1，加入过 100目筛的辅料混勻，选用乳糖，淀粉，糊精为稀释剂，CMS-Na为崩解剂，乙醇为润湿剂，外加的硬脂酸镁为润滑剂，制备合适软材，经16目筛网制粒，80°C干燥，整粒，上机压片， 包薄膜衣，即得成品，平均片重约为每片0. ^g，剂量为每片0. 125g。
实施例2、夏枯草提取物的胶囊制备
夏枯草水提物或醇提物，加入过100目筛的辅料混勻，选用乳糖，淀粉，糊精为稀释剂，乙醇为润湿剂，挤压过40目筛制粒，于60°C干燥，过筛整粒，灌注1号胶囊，制得成品， 剂量为每胶囊0. 125g，每胶囊重约0. 3g。
实施例3、夏枯草提取物的口服液制备
夏枯草加入5 10倍纯水，分2次煎煮，合并2次煎煮液，浓缩成药液比1 1，经澄清剂处理工艺去除鞣质、蛋白质、蜡质等胶体不稳定成分，沉淀后取上清液，加纯化水至规定体积煮沸，冷却后分装成IOml/支，100°C灭菌30分钟即得成品，每支剂量为0. 125g。
本发明中，夏枯草提取物对血管生长具有极显著的抑制作用，提示该药物及其提取物在血管生成性疾病方面的潜在价值。
权利要求
1.夏枯草或夏枯草提取物在制备抑制血管生成产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述产品为药物或保健品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述夏枯草提取物为夏枯草水或醇提取物。
全文摘要
本发明公开了夏枯草或其提取物的新用途。夏枯草或其提取物的新用途为抑制血管生成，在类风湿性疾病、肿瘤、视网膜眼底病和牛皮癣等血管异常增生性疾病治疗中具有广阔的应用前景。本发明不仅为该药的开发应用研究提供了新的内容和方向，也为中药治疗血管异常增生性疾病研究提供了新的手段。
文档编号A61P35/00GK102526182SQ20101061067
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者宋军, 王闽慧 申请人:宋军, 王闽慧