专利名称：诱导XAGE-1b特异性免疫反应的肽及其利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌疫苗疗法的开发，更详细而言，涉及诱导对肺癌中的XAGE-Ib的体液免疫及细胞免疫的肽及其利用。
背景技术：
我国癌的患病率逐年增加，如今成为死亡原因中的第1位。除作为癌的标准治疗法的外科疗法、化学疗法、放射线疗法以外，开发新的治疗法是当务之急。其中，能确切地靶向癌细胞且副作用少的免疫疗法作为新的癌治疗法而受到期待。在国内外正在努力开发将特别是对宿主免疫系统来说免疫原性高的癌特异性抗原用作疫苗的疫苗疗法。已知在被鉴定为癌抗原的抗原中，癌·睾丸(CT)抗原在各种癌组织中表达，在正常组织中仅在睾丸中表达。这样，因为CT抗原的癌特异性非常高，所以被认为有希望成为癌疫苗的靶抗原(参考非专利文献1 2等)。在国内外的很多机构进行了以CT抗原作为靶的癌疫苗的临床试验，部分显示了其有用性(参考非专利文献3 4等)。例如在冈山大学医院及大阪大学医学部附属医院， 在以食道癌患者、前列腺癌患者及恶性黑色素瘤患者为对象而实施的临床试验中，使用作为CT抗原的NY-ES0-1蛋白质的癌疫苗被认为对于肿瘤的缩小、增殖的停止等具有一定效果(参考非专利文献5)。迄今为止，本发明人等进行使用肺癌患者的血清的SEREX(Ser00giCal analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning)法，鉴定了作为新型 CT抗原的XAGE-lb。从迄今为止进行的在癌组织及正常组织中的表达解析的结果可知， XAGE-Ib若在癌组织中则在肺癌、肝细胞癌、前列腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤中特异性地表达，若在正常组织中则在睾丸中特异性地表达(非专利文献6 10)。进而，报道了在发现XAGE-Ib和HLA Class I共表达的病例中，已发现生存期的延长，XAGE-Ib与预后的关系也逐渐变得明确(参考非专利文献13)。[非专利文献][非专利文献 l]Boon T, et al. Curr Opin Immunol. 1 ；9 (5) :681-3. 1997[非专利文献 2] Scanlan MJ, et al. Immunol Rev. 188 ；22-32. 2002[非专利文献 3]Jager Ε, et al. Proc Natl Acad Sci U S Α. 26 ； 103 (39) 14453-8. 2006[非专利文献 4]Dutoit V, et al. J Clin Invest 110 :1813-22. 2002[非专利文献 5]Uenaka A, et al. Cancer Immun. 19 ；7 9. 2007[非专利文献6]Ali Eldib AM, et al. Int J Cancer. 10 ； 108 (4) :558-63. 2004[非专利文献 7]Nakagawa K，et al. Clin Cancer Res. 1 ；11(15) :5496-503. 2005[非专利文献 8] Sato S, et al. Cancer Immun. 5 ；7 :5. 2005[非专利文献 9]Kawabata R, et al. Int J Cancer. 15 ；120(10) :2178-84. 2007[非专利文献 IOjTsuji K, et al. Cancer Immunol Immunother. 57(10)1429-37. 2008[非专利文献 11] Scanlan MJ, et al. Cancer Immun. 23 ；4 1. 2004[非专利文献 12] Stockert E, et al. J Exp Med. 20 ； 187 (8) :1349-54. 1998[非专利文献 13]Kikuchi E, et al. Cancer Immun. 28 ；8 :13. 2008
发明内容
确实，CT抗原有希望作为癌疫苗的靶抗原，期待作为CT抗原的XAGE-Ib具有作为癌疫苗的靶抗原的功能。但是，并非所有的CT抗原均会诱导体液免疫反应。例如，MAGE、SSX 等CT抗原在各种癌中进行表达，但几乎没有被确认体液免疫反应(参考非专利文献11 12)。这样，以往报道的CT抗原在癌患者的血清中抗体存在的频率极低。另外，因为XAGE-Ib 由于被确认是核抗原，因此很难认为其诱导对癌的缩小、治疗有效程度的体液免疫。另外，在非专利文献13中，确实报道了在发现XAGE-Ib和HLAClass I分子共表达的肺腺癌患者中生存期延长，但在HLA Class I分子表达下降的患者中即使XAGE-Ib 进行表达也无法认定生存期的延长。因此，虽说在一部分肺腺癌患者中如果XAGE-Ib和 HLAClassI分子共表达则显示出预后良好，但很难认为在XAGE-Ib表达的所有癌中XAGE-Ib 均对癌的缩小、治疗有效。本发明鉴于上述问题而完成，其目的在于明确XAGE-Ib的功能，并且开发基于 XAGE-Ib的癌疫苗疗法。本发明是为了解决上述课题，以本发明人等的创造努力为基础而完成的。即，本发明提供XAGE-Ib的特定片段及其利用。本发明提供对诊断肺癌有用的肽、及含有该肽的组合物。上述肽的特征在于，由以下(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；和(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列。上述肺癌可以是非小细胞肺癌或肺腺癌。本发明还提供使用所述肽、或者针对该肽的抗体的肺癌诊断方法。本发明的肺癌诊断方法的特征在于，包括测定所述肽在来自受试体的试样中存在的水平的肽测定工序， 或者测定在来自受试体的试样中与所述肽特异性结合的抗体的水平的抗体测定工序。所述肽还对诱导对肺癌的体液免疫有用。即，本发明提供含有所述肽的、用于诱导对肺癌的体液免疫的组合物。本发明进一步提供用于诱导对肺癌的细胞免疫的肽、及含有该肽的组合物。所述肽的特征在于，由以下(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成(f)序列号1的1-39位的氨基酸序列；
(g)氨基酸序列，是序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号 1 的 1-25 位、15-39 位、13-36 位、13- 位、17-32 位、21-36 位、9- 位或 21- 位的氨基酸序列；(h)序列号1的四-53位的氨基酸序列；(i)氨基酸序列，是序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-48位、29-44位或33-48位的氨基酸序列(j)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(k)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、53-68位、49-64位、50-60位或51-59位的氨基酸序列。 上述肺癌可以是非小细胞肺癌或肺腺癌。本发明的进一步的其它目的、特征及优点通过如下所示的记载可充分知晓。另外， 本发明的益处可以在参考附图的以下说明中会变得清楚可见。可利用本发明，进行癌的检查或诊断、癌预防或癌治疗。
[图1]是表示非小细胞肺癌中的XAGE-I的RT-PCR解析的结果的图。(a)表示非小细胞肺癌中的、XAGE-Ib在细胞株和组织中表达的差异。(b)表示在细胞株中也存在 XAGE-Ib蛋白质。[图2]是表示非小细胞肺癌患者中的对XAGE-Ib蛋白质的抗体应答的图，(a)表示非小细胞肺癌患者中的ELISA的吸光度(0D值)，(b)表示健康人中的ELISA的吸光度 (0D 值)。[图3]是表示非小细胞肺癌患者中的对XAGE-Ib蛋白质的抗体应答的各区域的图。[图4]是表示用于表位解析的XAGE-Ib重叠多肽(才一A—，7 “ f F )的氨基酸序列的图。[图5]是表示对XAGE-Ib重叠多肽的抗体识别的图。[图6]是表示血清抗体阳性患者(n= 20)中的被抗XAGE-Ib抗体识别的XAGE-Ib 区域的图。[图7]是表示特异性T细胞的诱导步骤的图。[图8]是表示血清抗体阳性患者中诱导有XAGE-Ib特异性T细胞的图。(a)表示在血清抗体阳性患者中，对抗原特异性的CD4阳性T细胞诱导成功；(c)表示在血清抗体阳性患者中，对抗原特异性的CD8阳性T细胞的诱导成功。(b)及(d)表示在5名血清抗体阴性患者或5名健康人中未发现抗原特异性反应。[图9]是表示被特异性⑶4阳性T细胞(n= 14)识别的XAGE-Ib区域的图。[图10]是表示对XAGE-Ib重叠多肽的XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞(n= 14) 识别的主要表位区域的图。[图11]是表示被特异性⑶8阳性T细胞(n= 6)识别的XAGE-Ib区域的图。[图12]是表示被XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞(n= 6)识别的主要表位区域的图。
[图13]是表示被XAGE-Ib特异性抗体、XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞、或 XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞识别的主要表位区域的图。[图14]表示XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞及⑶8阳性T细胞识别的主要表位区域与HLA的关系。[图15]是由病例KLU187建立的克隆T细胞(8C187-1)的性质的图。(a)表示能够建立的T细胞对XAGE-Ib的氨基酸序列的45位-64位的氨基酸序列进行识别，(b)表示该T细胞是HLA class I限制性、⑶8限制性。(c)表示该⑶8阳性T细胞(8C187-1)是 HLA-A*0206 限制性。[图16]是表示被HLA-A*0206限制性的⑶8阳性T细胞识别的XAGE-Ib的最小肽区域为XAGE-Ib的氨基酸序列的50位-60位的图。(a)及(b)表示对被CD8阳性T细胞识别的最小表位进行研究的结果，(c)表示最小表位区域为XAGE-Ib的氨基酸序列的50 位-60位。[图17]是表示由病例KLU187建立的克隆T细胞(8C187-2)的性质的图。(a)表示能够建立的T细胞对XAGE-Ib的氨基酸序列的49位-64位的氨基酸序列进行识别，(b) 该T细胞是HLA class I限制性、⑶8限制性。(c)表示该⑶8阳性T细胞(8C187-2)是 HLA-Cw^O 102 限制性。[图18]是表示被HLA-Cw*0102限制性的⑶8阳性T细胞识别的XAGE-Ib的最小肽区域为XAGE-Ib的氨基酸序列的51位-59位的图。(a)及(b)表示对被CD8阳性T细胞识别的最小表位进行研究的结果，(c)表示表位区域为XAGE-Ib的氨基酸序列的51位-59 位。[图19]是表示由病例KLU187建立的克隆T细胞(8C187-4)的性质的图。(a)表示可建立的T细胞对XAGE-Ib的氨基酸序列的21位-36位的氨基酸序列进行识别，(b)表示该T细胞是HLA class I限制性、⑶8限制性。(c)表示该⑶8阳性T细胞(8C187-4)是 HLA-B*3501 限制性。[图20]是表示被HLA-B*3501限制性的⑶8阳性T细胞识别的XAGE-Ib的最小肽区域为XAGE-Ib的氨基酸序列的21位- 位的图。(a)表示对被CD8阳性T细胞识别的最小表位进行研究的结果，(b)表示表位区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的21位- 位。[图21]是表示由病例KLU237建立的克隆T细胞(8C237-22)的性质的图。(a)表示能够建立的T细胞对XAGE-Ib的氨基酸序列的21位-36位的氨基酸序列进行识别，(b) 表示该T细胞是HLA class I限制性、⑶8限制性。(c)表示该⑶8阳性T细胞(8C237-22) 是HLA-B*4002限制性。[图22]是表示被HLA-B*4002限制性的⑶8T细胞识别的XAGE-Ib的最小肽区域为XAGE-Ib的氨基酸序列的21位- 位的图。(a)表示对被CD8阳性T细胞识别的最小表位进行研究的结果，(b)表示表位区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的21位- 位。[图23]是表示得到的⑶4克隆T细胞GC187-1)识别天然表位的图。[图24]是表示得到的⑶8克隆T细胞(8C187-4)识别天然表位的图。(a)表示 8C187-4识别XAGE-Ib蛋白质及25mer的XAGE-Ib重叠多肽，(b)表示8C187-4对被转染 XAGE-Ib质粒DNA的B*3501阳性肿瘤细胞进行特异性识别。[图25]是表示根据抗原与细胞的反应时间诱导对XAGE-Ib的特异性免疫反应的图。(a)是表示IL-2及IL-7存在下的结果的图，(b)及(c)是表示IL-7及IL-15存在下的结果的图。[图26]是表示XAGE-Ib的长链肽的氨基酸序列的图[图27]是表示NY-ESO-If肽被摄入到抗原呈递细胞(U937)中的图。[图28]是表示NY-ESO-If肽被MHCclass II抗原呈递的图。[图29]是表示NY-ESO-If肽被MHCclass I抗原呈递的图。[图30]是表示在被发现反应的代表性的2个病例(KLU34和KLU38)中的2次刺激培养后的CD4阳性T细胞对XAGE-Ib肽的应答的图。(a)表示流式细胞术的结果，(b)表示患者的血清抗体效价ELISA的结果。[图31]是表示血清抗体效价阳性患者(KLU38)中的被XAGE-Ib特异性⑶4阳性 T细胞识别的XAGE-Ib区域的图。[图32]是表示被⑶8阳性T细胞识别的HLA-A*0206限制性的XAGE-Ib区域的图。(a)是表示血清存在下的结果的图，(b)是表示不存在血清下的结果的图。[图33]是表示被⑶8阳性T细胞识别的HLA-A*0206限制性的XAGE-Ib区域的图。
具体实施例方式对本发明的实施方式的说明如下所示，但本发明并不限于此。[1.本发明的肽]本发明的肽的特征在于，是由以下(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽，或者是由以下(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽。(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列；(f)序列号1的1-39位的氨基酸序列；(g)氨基酸序列，是序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该该部分序列包含序列号 1 的 1-25 位、15-39 位、13-36 位、13- 位、17-32 位、21-36 位、9- 位或 21-29 位的氨基酸序列；(h)序列号1的四-53位的氨基酸序列；(i)氨基酸序列，是序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-48位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(j)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(k)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、53-68位、49-64位、50-60位或51—59位的氨基酸序列。
应予说明，由序列号1的21-40位、21-44位、25-44位、25-48位及四-48位中任一项所示的氨基酸序列构成的肽也包括在由上述(c)表示的氨基酸序列构成的肽中。另外， 由序列号1的13-32位或17-36位表示的氨基酸序列构成的肽也包括在由上述(g)表示的氨基酸序列构成的肽中。本发明的肽能诱导对肺癌中的XAGE-Ib的体液免疫及细胞免疫。应予说明，本说明书中，有时将由小于15个的氨基酸构成的肽称为“短链肽”，将由15个以上的氨基酸构成的肽称为“长链肽”而进行区别。另外，本发明的肽可以通过以往公知的肽合成方法来制备。例如可以使用固相肽合成法等有机化学合成法、或制备编码肽的核酸而使用重组DNA技术来制备。另外，在本发明的肽中，如果能诱导对XAGE-Ib的体液免疫及细胞免疫则还包括引入有1个或多个氨基酸的缺失、取代、添加或插入等突变而得的肽。应予说明，在本说明书中，术语“肽”可与多肽及蛋白质交换使用，不受构成肽的氨基酸的数目所限定。在 International Journal of Oncology 30 :835_840，2007 (非专利文献 14)中， 作为XAGE-Ib的片段，公开了由XAGE-Ib的氨基酸序列的33-49位或25-40位的氨基酸序列构成的多肽(非专利文献14的图3(b))。另外，在Microbiol. Immunol.，51 (8)，755-762， 2007(非专利文献15)中，作为XAGE-Ib的片段，公开了由XAGE-Ib的氨基酸序列的9- 位、13- 位、17-32 位、21-36 位、25-40 位、29-44 位、49-64 位、53-68 位、57-72 位或 65-81 位的氨基酸序列构成的多肽(非专利文献15的图2A)。在本申请中并不意欲在作为“肽”而要求权利的范围内包含以上肽。即，在一个实施方式中，本发明的肽可以是上述非专利文献14及上述非专利文献15所公开的肽除外的肽。在1个方面，本实施方式的肽是由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽(但是，排除上述非专利文献14及上述非专利文献15公开的肽)，在其它方面，本实施方式的肽是由上述(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽(其中，排除上述非专利文献14及上述非专利文献15公开的肽)。另外，在上述文献中，对本发明的肽的功能既没有记载也没有启示。由此，在以下说明的本发明的肽的利用中，并不意图将上述文献中公开的肽排除在本发明的范围之外。 即，在一个实施方式中，本发明的肽是由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽、或者是由上述(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽。在1个方面，本实施方式的肽的特征在于是⑴由序列号1的15-53位的氨基酸序列构成的肽。在其它方面，本实施方式的肽的特征在于是(ii)由序列号1的15-39位(序列号20)、29-53位(序列号21) ,21-48位(序列号2) ,21-36位(序列号3)、25-40位(序列号4) ,29-44位(序列号5)或33-48位(序列号6)的氨基酸序列构成的肽。另外，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是因为由序列号1的15-39位、 29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列构成的肽维持由序列号1的15-53位的氨基酸序列构成的肽的效果，所以作为由序列号1的15-53位的氨基酸序列构成的肽的片段(部分片段)而包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36 位、25-40位、29-44位或33-48位中任一氨基酸序列的肽也包含在本发明的范围内。艮口， 本实施方式的肽也可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iii)序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48 位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列。另外，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是在由序列号1的15-53位的氨基酸序列构成的肽中，如果保持序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、 四-44位或33-48位的氨基酸序列，则除此以外的区域的氨基酸序列可以或多或少不同。 即，本实施方式的肽可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iv)由对序列号 1的15-53位的氨基酸序列缺失、取代或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列或其部分序列构成，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44 位或33-48位的氨基酸序列。应予说明，序列号1 的 15-53 位、15-39 位、29-53 位、21-48 位、21-36 位、25-40 位、 四-44位及33-48位的氨基酸序列具有“序列号1的33-36位”作为共同的氨基酸序列。 由此，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是序列号1的33-36位的氨基酸序列是上述 (i) (iv)的肽发挥功能所用的主要区域。同样地，在1个方面，本实施方式的肽的特征在于是⑴‘由序列号1的43-81位的氨基酸序列构成的肽。在其它方面，本实施方式的肽的特征在于，是(ii)‘由序列号1的 43-67位(序列号22)、57-81位(序列号23)、57-72位(序列号7)或65-81位(序列号 8)的氨基酸序列构成的肽。更进一步，本实施方式的肽也可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iii)‘序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列；可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iv)‘由对序列号1的43-81位的氨基酸序列缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列或其部分序列构成，该部分序列包含序列号1的 43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列。应予说明，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是因为序列号1的43-81位、 43-67位、57-81位、57-72位及65-81位的氨基酸序列具有“序列号1的65-67位”作为共同的氨基酸序列，所以序列号1的65-67位的氨基酸序列是上述(i)' (iv)'的肽发挥功能所用的主要区域。同样地，在1个方面，本实施方式的肽的特征在于是(i)“由序列号1的1-39位的氨基酸序列构成的肽。在其它方面，本实施方式的肽的特征在于是(ii)"由序列号1的 1-25位(序列号19)、15-39位(序列号20)、13-36位(序列号9)、13-28位(序列号10)、 17-32位(序列号11)、21-36位(序列号3)、9_M位(序列号14)或21-29位(序列号15) 的氨基酸序列构成的肽。再进一步，本实施方式的肽也可以是由如下氨基酸序列构成的肽， 该氨基酸序列是(iii)“序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号 1 的 1-25 位、15-39 位、13-36 位、13- 位、17-32 位、21-36 位、9-24 位或 21- 位的氨基酸序列；可以是由如下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iv)“由对序列号1的 1-39位的氨基酸序列缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列或其部分序列构成，该部分序列包含序列号1的1-25位、15-39位、13-36位、13- 位、17-32位、21-36 位、9-M位或21- 位的氨基酸序列。应予说明，序列号1的1-39位、1-25位、15-39位、13-36位、13- 位、17-32位、 21-36位、9- 位及21- 位的氨基酸序列具有“序列号1的21- 位”作为共同的氨基酸序列。由此，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是序列号1的21-M位的氨基酸序列是上述(i)〃 (iv)"的肽发挥功能所用的主要区域。同样地，在1个方面，本实施方式的肽的特征在于是(i)“‘由序列号1的四-53 位的氨基酸序列构成的肽。在其它方面，本实施方式的肽的特征在于是(ii)"‘由序列号 1的四-48位(序列号12)、29-44位(序列号5)或33-48位(序列号6)的氨基酸序列构成的肽。再进一步，本实施方式的肽也可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iii)"‘序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-48位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iv)"‘由对序列号1的四_53位的氨基酸序列缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列或其部分序列构成，该部分序列包含序列号1的四-48位、29-44位或 33-48 位。应予说明，序列号1的四-53位、29-48位、29_44位及33_48位的氨基酸序列具有 “序列号1的33-44位”作为共同的氨基酸序列。由此，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是序列号1的33-44位的氨基酸序列是上述(i)〃 ‘ (iv)"‘的肽发挥功能所用的主要区域。同样地，在1个方面，本实施方式的肽的特征在于是(i)““由序列号1的43-81 位的氨基酸序列构成的肽。在其它方面，本实施方式的肽的特征在于是(ii)"“由43-67 位(序列号22)、57-81位(序列号23)、53-68位(序列号13)、49_64位(序列号16)、50_60 位(序列号17)或51-59位(序列号18)的氨基酸序列构成的肽。再进一步，本实施方式的肽，也可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iii)““序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、53-68位、49-64 位、50-60位或51-59位的氨基酸序列；可以是由以下氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列是(iv)““由对序列号1的43-81位的氨基酸序列缺失、取代或添加1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列或其部分序列构成，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、53-68 位、49-64位、50-60位或51-59位的氨基酸序列。应予说明，序列号1 的 43-81 位、43-67 位、57-81 位、53-68 位、49-64 位、50-60 位及51-59位的氨基酸序列具有“序列号1的57-59位”作为共同的氨基酸序列。由此，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是序列号1的57-59位的氨基酸序列是上述(i)““ (iv)““的肽发挥功能所用的主要区域。进而，如实施例中所述，由序列号1的21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列构成的肽具有诱导对肺癌的体液免疫的功能。由此，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是关于包含序列号1的21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列的由序列号1的15-53位、15-39位、29-53位或21-48位的氨基酸序列构成的肽，也具有同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。另外，关于由序列号1的21-40位、21-44 位、25-44位、25-48位及四_48位中任一项所示的氨基酸序列构成的肽，也具有与由序列号 1的21-48位的氨基酸序列构成的肽同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。同样地，关于被证实具有诱导对肺癌的体液免疫的功能的、包含序列号1的57-72 位或65-81位的氨基酸序列的、由序列号1的43-81位、43-67位或57-81位的氨基酸序列构成的肽，也具有同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。
另外，如实施例中以下所述，由序列号1的13- 位、17-32位、21-36位、9-24位或21- 位的氨基酸序列构成的肽具有诱导对肺癌的细胞免疫的功能。由此，阅读本说明书的本领域人员容易理解的是关于包含序列号1的13- 位、17-32位、21-36位、914位或 21- 位的氨基酸序列的由序列号1的1-39位、1-25位、15-39位或13-36位的氨基酸序列构成的肽，也具有同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。另外，关于由13-32 位或17-36位表示的氨基酸序列构成的肽，也具有与由序列号1的13-36位的氨基酸序列构成的肽同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。同样地，关于被证实具有诱导对肺癌的细胞免疫的功能的、包含序列号1的四-44 位或33-48位的氨基酸序列的、由序列号1的四-53位或四-48位的氨基酸序列构成的肽， 也具有同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。同样地，关于被证实具有诱导对肺癌的细胞免疫的功能的、包含53-68位、49-64 位、50-60位或51-59位的氨基酸序列的、由序列号1的43-81位、43-67位或57-81位的氨基酸序列构成的肽，也具有同样的功能，在本发明的范围内也可以包含这些肽。[2.本发明的用于诊断肺癌的组合物]本发明的用于诊断肺癌的组合物(以下，称为“本发明的组合物1”或“组合物1”) 包含由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽。作为所述“肽”，为如在上述 “1.本发明的肽”中说明的那样。本发明的组合物1为了诊断肺癌，可以单独包含所述肽中的1种，也可以组合包含2种以上的肽。作为本发明的使用组合物1诊断肺癌的方法，例如可举出放射免疫测定法(RIA)、 ELISA法(酶免疫检测法)、Western印迹法、免疫沉降法、免疫组织化学法、抗体芯片法、 RT-PCR法、实时RT-PCR法等。因此，在本发明的组合物1中，除上述肽以外，还可以包含上述诊断方法通常使用的缓冲剂、盐类、表面活性剂等。另外，可以使用本发明的组合物1来诊断非小细胞肺癌或肺腺癌。[3.本发明的肺癌诊断方法]本发明的肺癌诊断方法是诊断肺癌的方法，包括测定由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽在来自受试体的试样中存在的水平的肽测定工序，或者测定在来自受试体的试样中，与由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗体的水平的抗体测定工序。作为所述“肽”，为如在上述“1.本发明的肽”中说明的那样。上述“受试体”没有受到特别限定，广泛地包括一般动物，但优选为人。在受试体是人时，不仅癌患者或疑似有癌患者，而且健康人也可以成为受试体。受试体的性别、年龄等没有受到特别限定。作为所述“试样”，例如可举出血液(血清、血浆、血细胞等)、尿、粪便、痰液、胸 腹水、支气管肺泡清洗液、腹腔清洗液、活检组织、经外科切除的样品等。所述 “肽在来自受试体的试样中存在的水平”意指肽在来自受试体的试样中存在的量。所述“抗体的水平”意指抗体的量。 本发明的肺癌诊断方法可通过在后述的肽测定工序或抗体测定工序中，检测在来自受试体的试样中是否存在由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽或与这些肽特异性结合的抗体从而进行确定。另外，可以通过测定由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽或与这些肽特异性结合的抗体在来自受试体的试样中存在的量，将该量与对照(例如，在来自正常的健康个体的试样中存在的量)进行比较从而诊断癌。另外，本发明的肺癌诊断方法中，在肺癌中，能优选地诊断非小细胞肺癌或肺腺癌。在此，对上述“肽测定工序”及上述“抗体测定工序”进行说明。(3-1.肽测定工序)肽测定工序是测定由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽在来自受试体的试样中存在的量的工序。作为测定肽的量的方法，可以使用本领域中公知的方法进行测定。例如可以通过使用特异性识别由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽的抗体，采用放射免疫测定法(RIA)、ELISA法(酶免疫检测法)，Western印迹法、免疫沉降法、免疫组织化学法、抗体芯片法、RT-PCR法、实时RT-PCR法等而进行测定，但本发明不限定于此。应予说明，优选上述肽的量的测定中所用的试样是血清，但如果是可以测定肽的量的试样则没有特别限定。当在来自受试体的试样中存在的上述肽的量高于对照(例如，在来自正常的健康个体(健康人)的试样中存在的上述肽的量)时，则可判定受试体具有癌。对照既可以通过与肽测定工序同时测定来自正常的健康个体的试样而得到，也可以使用作为背景数据而积累的数据。(3-2.抗体测定工序)抗体测定工序是测定与由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗体的水平的工序。作为测定抗体浓度的方法，只要是测定针对特定抗原的抗体效价水平的方法、使用针对目标抗体的抗体的方法则没有特别限定，可使用本领域中公知的方法来测定。例如可通过ELISA法、放射免疫测定法、ELISP0T法、免疫沉降法、亲和层析柱法等进行测定，但本发明不限定于此。应予说明，测定上述抗体的水平中所用的试样优选是血清，但如果是可测定抗体水平的试样则没有特别限定。抗体效价测定中所用的抗原蛋白质可以由生物体试样精制而取得，但优选作为重组蛋白质而取得。重组蛋白质例如可以通过将插入有XAGE-Ib基因或编码上述(a) (e) 中任一项所示的氨基酸序列的多聚核苷酸而成的表达载体导入到宿主中而使其表达、进行精制从而取得。当在来自受试体的试样中存在的上述抗体的量高于对照(例如，在来自正常的健康个体(健康人)的试样中存在的上述抗体的量)时，则可判定受试体具有癌。对照既可以通过与抗体测定工序同时测定来自正常的健康个体的试样而得到，也可以使用作为背景数据而积累的数据。例如，使用稀释到300倍的血清进行ELISA时，健康人(对照)没有反应。因此，如果波长490nm处的吸光度(0D值)大于1. 0，则可在统计学上判断为阳性，可判定受试体具有癌。血清的稀释倍数等的反应条件改变时能判断为阳性的OD值也发生改变， 所以可以根据反应条件而适当设定。应予说明，本发明的肺癌诊断方法可以是取得用于诊断肺癌可能性的数据的方法。这时，本发明不意图包含由医生进行的判断工序。[4.本发明的用于诱导对肺癌的体液免疫的组合物]本发明的用于诱导对肺癌的体液免疫的组合物(以下，称为“本发明的组合物2” 或“组合物2”)包含由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽。作为所述“肽”，为如在上述“1.本发明的肽”中说明的那样。上述组合物2如果包含至少一种由上述(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽，则能诱导对肺癌的体液免疫，但也可以通过组合包含多种肽从而能更有效率地诱导对肺癌的体液免疫。另外，本发明的组合物2可以进一步含有不阻碍所述肽的生理活性的、除肽以外的其它成分(例如，药学上可接受的载体等)。在本说明书中，所谓“药学上可接受的载体”(以下，简称为“载体”)，是指在制造医药、或动物药之类的农药时以辅助处方为目的而使用的物质，不对有效成分给与有害的影响。进而，在接受本发明的药学组合物的个体中没有毒性，且载体本身不诱导有害抗体的产生。作为所述载体，可使用能用作制剂材料的各种有机或无机的载体物质，可以根据后述药学组合物的给药方式和剂型而适当选择。例如可配合固体制剂中的赋形剂、润滑齐U、 粘结剂、崩解剂等；液体制剂中的溶剂、助溶剂、悬浮剂、等张剂、缓冲剂、无痛剂等；防腐剂；抗氧化剂；稳定剂；调味除臭剂等，但本发明不限定于这些。本发明的组合物2可通过在医药品领域中通常使用的佐剂的存在下或不存在下进行经口或非经口给药，从而诱导对肺癌的体液免疫。应予说明，在本说明书中，所述“非经口”，是指包括脑室内、静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及关节内的注射及注入的给药方式。本发明的组合物2在肺癌中，可以适于诱导对非小细胞肺癌或肺腺癌的体液免疫。[5.本发明的用于诱导对肺癌的细胞免疫的组合物]本发明的用于诱导对肺癌的细胞免疫的组合物(以下，称为“本发明的组合物3” 或“组合物3”)包含由上述(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽。作为所述 “肽”，为如在上述“ 1.本发明的肽”中说明的那样。包含由以下氨基酸序列构成的肽的组合物3能够诱导XAGE-Ib特异性⑶4阳性T 细胞⑴序列号1的1-39位的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，是序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的1-25位、15-39位、13-36位、13- 位、 17-32位或21-36位的氨基酸序列；(iii)序列号1的四_53位的氨基酸序列；(iv)氨基酸序列，是序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-48 位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(ν)序列号1的43-81位的氨基酸序列；或(vi)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的 43-67位、57-81位或53-68位的氨基酸序列。另外，包含由以下氨基酸序列中任一项所示的氨基酸序列构成的肽的组合物3能够诱导XAGE-Ib特异性CD8阳性T细胞(vii)序列号1的1-39位的氨基酸序列；(viii)氨基酸序列，是序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的序列号1的1-25位、15-39位、21-36位、9- 位或 21-29位的氨基酸序列；(ix)序列号1的四-53位的氨基酸序列；(χ)氨基酸序列，是序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-44位的氨基酸序列；(xi)序列号1的43-81位的氨基酸序列；或(xii)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、49-64位、50-60位或51-59位的氨基酸序列。特别地，包含由序列号1的50-60位的氨基酸序列构成的肽 (序列号17)的组合物3能够诱导HLA-A*0206限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞。 另外，包含由序列号1的51-59位的氨基酸序列构成的肽(序列号18)的组合物3能够诱导HLA-Cw*0102限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞。另外，包含由序列号1的21- 位的氨基酸序列所构成的肽(序列号1 表示的氨基酸序列构成的肽的组合物3能够诱导 HLA-B*3501限制性的XAGE-Ib特异性CD8阳性T细胞及HLA_B*4002限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞。上述组合物3如果包含至少一种由上述(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽，则能够诱导对肺癌的细胞免疫，但也可以通过组合包含多种肽从而更有效率地诱导对肺癌的细胞免疫。另外，本发明的组合物3可以进一步含有不阻碍上述的肽的生理活性的、除肽以外的其它成分(例如，药学上可接受的载体等)。对于该“药学上可接受的载体”，因为在上述“本发明的用于诱导对肺癌的体液免疫的组合物”中已说明，所以省略。本发明的组合物3可以通过在医药品领域中通常使用的佐剂的存在下或不存在下进行经口或非经口给药，从而诱导对肺癌的细胞免疫。另外，可从肺癌患者的末梢血中采集单核细胞部分，与包含由上述(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽的上述组合物共同培养，在体外诱导XAGE-Ib特异性CD4 阳性或⑶8阳性T细胞。通过将这些经诱导的XAGE-Ib特异性T细胞返回肺癌患者的血液中，从而也可以预防或治疗肺癌。应予说明，体外诱导XAGE-Ib特异性T细胞时，可以适当设定细胞的浓度、上述组合物3的浓度等培养条件。本发明的组合物3在肺癌中，可以适于诱导对非小细胞肺癌或肺腺癌的体液免疫。如后述实施例所示，在XAGE-Ib的解析中，尽管认为在被特异性抗体、特异性CD4 阳性T细胞或特异性CD8阳性T细胞识别的XAGE-Ib的部位具有特异性的倾向，但特异性抗体、特异性CD4阳性T细胞或特异性CD8阳性T细胞识别的部位遍及XAGE-Ib的全长地存在。因此，为了以低成本使用能诱导与蛋白质同等的抗原呈递的长链肽而不问HLA地施行疫苗，优选以覆盖XAGE-Ib的全长的方式将长链肽进行组合而进行给药。本发明不限定于上述的各实施方式，可以在权利要求所示的范围内进行各种改变，对于将不同实施方式所各自公开的技术方法进行适当组合而得到的实施方式，也包含在本发明的技术范围内。[实施例]以下，利用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不受其限定。[实施例1]在实施例1中对XAGE-Ib抗原进行免疫原性的详细解析，研究作为新型癌疫苗疗法的靶癌抗原的有用性。<实验材料及实验方法>[a.患者血清、胸水及末梢血单核细胞]对本发明的实施例中使用的血清、胸水及末梢血单核细胞，接受在所有样品提供者中以知情同意为基础提供的样品。
[b.细胞的分离方法]利用比重离心法从患者的末梢血中得到单核细胞部分。接着，使用抗CD4抗体结合珠、抗⑶8抗体结合珠及抗⑶19抗体结合珠(Miltenyibiotec公司制)，利用磁性细胞分离法(MACSJiltenyibiotec公司制)，依次分离出⑶8阳性部分、⑶4阳性部分、⑶19阳性部分及CD4-CD8-CD19-部分。[c. XAGE-Ib 蛋白质及肽]XAGE-Ib蛋白质(81个氨基酸，序列号1)使用由GL Biochem公司(上海，中国) 合成的蛋白质。合成的XAGE-Ib蛋白质用HPLC柱进行精制，可确认纯度为90%以上。另外，覆盖XAGE-Ib蛋白质的全长的16mer或17mer的重叠多肽(以下，也简称为 “0LP”)(1-16、5-20、9-24、13-28、17-32、21-36、25-40、29-44、33-48、37-52、41-56、45-60、 49-64、53-68、57-72、61-76、及65-81)可使用利用Fmoc固相法、使用多肽合成机(AMS422 ； ABIMED, Langenfeld Germany)、在冈山大学共同研究室合成的重叠多肽。[d.ELISA]将1 μ g/ml浓度的全长XAGE-Ib蛋白质(碳酸缓冲液，pH9. 6)在4°C过夜固相化在96孔板(Nunc公司制)上后，用清洗液(PBS/0. 1% TWEEN)清洗96孔板，添加5% FCS/ PBS，在37°C封闭(blocking) 1小时。封闭结束后，添加稀释到100倍、300倍、900倍或2700 倍的血清，在37°C反应2小时。接着，用清洗液清洗后，添加过氧化物酶结合山羊抗人IgG 抗体(稀释5000倍)(JAXS0N公司制)，在37°C反应1小时。反应结束后，用清洗液清洗， 加入添加有过氧化氢的基质溶液(将邻苯二胺溶解在0.05M柠檬酸缓冲液(pH5.0)中的溶液)，使其显色。显色后，加入6N硫酸停止反应，使用酶标仪(Bio-Rad公司制)测定吸光度 (波长 490nm)。[e. IFN-Y 捕获测定]对于IFN-Y捕获测定，参考图6进行说明。图6是表示IFN-Y捕获测定的步骤的图。(1)⑶4阳性或⑶8阳性T细胞中的XAGE-Ib特异性反应的诱导将⑶4阳性T细胞或⑶8阳性T细胞与作为抗原呈递细胞(图中，表示为“APC”) 的相同数目的X射线照射(70Gy)⑶4-⑶8-T细胞在XAGE-Ib重叠多肽(OLP)各1 μ M存在下，使用M孔板或96孔板在CO2恒温器内培养10 14天。作为用于培养T细胞的培养基，在没有特别记载时，使用5%混合血清/AIM-V(IL-225IU/ml、IL-75ng/ml)，根据需要进一步添加 IL-155y g/mL·根据需要，在培养10 14天后，将培养基的一半换成新的培养基，以成为1 μ M的方式添加XAGE-Ib重叠多肽，同样地进行第2次刺激。在第1次或第2次刺激后10 14天后，利用下述ELISA法测定由T细胞产生的抗原特异性IFN-γ的量。(2) IFN-γ ELISA 将效应细胞(⑶4阳性或⑶8阳性T细胞)的刺激培养上清液100 μ 1添加在将小鼠抗人IFN-Y单克隆抗体(1_D1K，BD公司制，500倍稀释)过夜固相化后进行封闭的板上， 在37°C反应1小时。之后，使用PBST (0. 1% Tween20-PBS)清洗板，加入兔抗人IFN-γ抗体(自制，稀释600倍)，在37°C反应1小时。
用清洗液清洗后，加入HRP结合山羊抗兔IgG抗体(MBL制，稀释2000倍)，在37°C 反应1小时。反应后用清洗液清洗，之后，加入基质溶液(邻苯二胺(o-phenylenediamine， 0PDA)(和光公司制))，使其显色。显色后，加入6N硫酸停止反应，使用酶标仪(Bio-Rad公司制)测定吸光度(波长490nm)。将与没有用重叠多肽进行刺激的孔相比IFN-γ的产生量多的孔作为阳性孔。对于阳性孔，第二天确认抗原特异性地产生IFN-Y的细胞的存在。(3) IFN- γ产生细胞的检测使添加重叠多肽而刺激培养后的细胞、和与其相同数目的自体的EBV-B细胞 (Epstein-Barr病毒感染B细胞)(用XAGE-Ib重叠多肽预刺激的细胞或未经刺激的细胞) 在CO2恒温器内于37°C反应4小时或8小时，使用人IFN- γ捕获抗体(Miltenyibiotec公司制)2 μ 1标记培养细胞。然后，悬浮在1 IOml的AIM-V培养基中，一边使用混悬器(MACSmix、 Miltenyibiotec公司制)进行悬浮一边于37°C在(X)2恒温器内使其反应45分钟。清洗细胞后，加入PE标记人IFN-Y抗体(Miltenyibiotec公司制)2 μ 1、7AAD (BD公司制)2 μ 1、 FITC标记抗人CD4抗体或FITC标记抗人CD8抗体(Miltenyibiotec公司制)1 μ 1，进行染色。染色后，加入FACS缓冲液(l^FCS/PBSJ.C^^叠氮化钠)清洗细胞，使用FACS Calibur (BD公司制)进行流式细胞术，检测IFN-γ产生细胞。使用数据解析软件(Flowjo， Tree Star公司制)解析IFN-γ产生细胞的频率。图1是表示非小细胞肺癌中的XAGE-I WmRNA的表达的图。图1(a)是调查肺腺癌的手术样品(组织)10例和肺癌细胞株12例中的作为XAGE-I的4种剪接突变体的 XAGE-la、lb、lc及Id的mRNA的表达的图。如图1(a)所示，在肺癌细胞株中，可认定所有 XAGE-I均为强表达(lc、Id处于优势)，但在肺癌组织中仅看到XAGE-Ib及Id的表达。在非专利文献7及8中证明在XAGE-Ib和Id中XAGE-Ib在肺癌方面是有意义的。因此，作为疫苗的候选者，将XAGE-Ib作为目标可以说是符合期望的。在肺癌细胞株和组织中的XAGE-I 的表达差别的原因不明，存在与XAGE-I的功能有关系的可能性。另外，图1(b)是证明肺癌细胞株中XAGE-Ib蛋白质存在的图。具体而言，在mRNA 阳性肺癌细胞株中用Western印迹证明蛋白质的存在。应予说明，对于肺癌细胞株和肺癌组织的表达量的不同，迄今为止尚未得到研究，但本发明人等首次进行明确。另外，因为与肺癌组织相比，在肺癌细胞株中XAGE-Ib蛋白质的表达量非常少，所以如果不使用免疫沉降法则无法进行该蛋白质的鉴定。[实验例1]在从2005年到2009年之间川崎医科大学附属病院接诊的非小细胞肺癌200例 (包含进展期肺腺癌69例)及作为对照组的健康人50例中，研究对XAGE-Ib的体液免疫应答的有无。具体而言，利用ELISA法确认从肺癌患者采集的血清中的XAGE-Ib特异性IgG抗体的有无。将ELISA的结果示于图2及3中。图2是表示非小细胞肺癌患者中的对XAGE-Ib 蛋白质的抗体应答的图，(a)表示以100倍、300倍、900倍及2700倍稀释非小细胞肺癌患者的血清时的ELISA的吸光度(0D值)，(b)表示以100倍、300倍、900倍及2700倍稀释健康人的血清时的ELISA的吸光度(0D值)。图3是表示非小细胞肺癌患者中的对XAGE-Ib 蛋白质的抗体应答的各区域的图。如图2及图3所示，肺癌患者被按照血清抗体效价比对照组(健康人)高的顺序分为强阳性组、阳性组、弱阳性组、临界组的4个区域。其中将弱阳性以上的肺癌患者作为血清抗体效价阳性患者。在全部非小细胞肺癌患者中，XAGE-Ib血清抗体效价阳性例是20/200例 (10.0%)。另外，如表1所示，如果限于进展期(stage 3B/4期)肺腺癌患者，则XAGE-lb 血清抗体效价阳性例是13/69例(18. 8% )0[表1]
非小细胞肺癌(n = 200)Stage3B/4 期肺腺癌(n = 69)n(% )20(10. 0% )13(18. 8% )另一方面，在50名健康人中也进行同样的实验，但如图2(b)所示，未认定对 XAGE-Ib的抗体反应。从这些结果可知，在肺癌患者中，在非小细胞肺癌患者、尤其是肺腺癌患者中，对XAGE-Ib的体液免疫被高频率地诱导。应予说明，在非专利文献13中，已报道肺腺癌中32. 5%是对XAGE-Ib的免疫组织染色阳性。据此，可预想如果进展期肺腺癌中对XAGE-Ib的免疫组织染色为阳性则能以约 60%的高频率诱导对XAGE-Ib的体液免疫。[实验例2]使用显示血清抗体效价阳性的患者的血清，调查血清中所含的抗XAGE-Ib抗体识别的XAGE-Ib的表位。图4是示出用于表位解析的XAGE-Ib重叠多肽的氨基酸序列的图。将图4表示的17种XAGE-Ib重叠多肽分别以1 μ g/ml的浓度固相化在板上，加入血清抗体效价阳性患者的血清，利用ELISA法检测抗原抗体反应的有无。血清是使用经稀释至300倍的血清。将血清抗体效价阳性患者20例的ELISA结果示于图5及图6。图5是示出对 XAGE-Ib重叠多肽的抗体识别的图。图5的图表所记载的虚线表示抗体效价(O.D. (490nm)) 为0.1。图6是示出被抗XAGE-Ib抗体识别的XAGE-Ib区域的图。图6是将图5中抗体效价为0. 1以上的患者的数目对每个肽进行标绘作图。如图5所示，虽然抗XAGE-Ib抗体识别的区域存在个体差异，但如图6所示可知， 抗XAGE-Ib抗体的主要识别部位是XAGE-Ib的全长氨基酸序列的21-48位(序列号2)、 57-72位(序列号7)、65-81位(序列号8)这3个区域。[实验例3]研究末梢血⑶4阳性T细胞中对XAGE-Ib的反应。将从16名血清抗体效价阳性患者中分离的末梢血CD4阳性T细胞(IX IO6个)在以覆盖XAGE-Ib的全长的方式汇聚而成的重叠多肽的存在下，和与其相同数目的经放射线照射的CD4-CD8-细胞一起进行10 14天刺激培养(刺激培养根据需要每10 14日实施2次)。接着，使1 X IO4个的⑶4阳性T细胞与经相同数目的XAGE-Ib重叠多肽脉冲或非脉冲的PFA处理的自体EBV-B细胞在 37°C反应4小时，进行IFN-Y捕获测定。
其结果，如图8(a)及(b)所示，对于血清抗体效价阳性患者16名中的14名 (87. 5% )，在以XAGE-Ib重叠多肽刺激的⑶4阳性T细胞中检测到XAGE-Ib特异性地产生 IFN- γ的细胞。特异性T细胞的检测以⑶4计是87. 5% (14/16)。图30是示出发现反应的代表性的2个病例中的⑶4阳性T细胞对XAGE-Ib肽的应答的图。图30(a)表示流式细胞术的结果，(b)表示患者的血清抗体效价ELISA的结果。 另外，如图30(a)所示，在病例KLU34中，检测到以净值计1. 11%的IFN-γ产生细胞。另外，在病例KLUN38中，检测到以净值计0. 94%的IFN-γ产生细胞。应予说明，所述“净值” 表示从肽⑴中的IFN-Y产生细胞的比例中减去肽㈠中的IFN-Y产生细胞的比例而得的值。[实验例4]研究在实验例3中检测到XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞的14名患者中，该特异性⑶4阳性T细胞识别的XAGE-Ib的区域。使用在之前实验中得到的1 X IO4个⑶4阳性T 细胞与作为抗原呈递细胞的、经脉冲5 μ g/ml各XAGE-Ib重叠多肽或非脉冲的PFA处理而成的同⑶4阳性T细胞相同数目的自体EBV-B细胞，在37°C反应4小时，进行IFN- γ捕获测定或ELISA。将结果示于图31。图31是表示血清抗体效价阳性患者(KLU38)的被刺激培养后的XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞识别的XAGE-Ib区域的图。如图31所示，使用肽4 (13-28 位的氨基酸区域，序列号10)或肽6 01-36位的氨基酸区域，序列号3)刺激CD4阳性T细胞时，XAGE-Ib特异性地产生IFN-Y的细胞被高频率地检测到。由此，可知病例KLU38的 ⑶4阳性T细胞识别XAGE-Ib的13-36位的氨基酸区域及21-36位的氨基酸区域。对血清抗体效价阳性患者的剩余13个病例也同样地进行解析。将结果示于图9 和图10。图9是示出被特异性⑶4阳性T细胞(n = 14)识别的XAGE-Ib区域的图。图9 中，对特异性⑶4阳性T细胞的反应特别强的肽加上星标。图10是示出对XAGE-Ib重叠多肽的XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞(n = 14)识别的主要表位区域的图。图10是将图9 的星标的数目对每个肽作图。从图9和图10示出的XAGE-Ib抗体阳性的14个病例的研究结果可知，XAGE-Ib的氨基酸序列的13-36位(序列号9) ,29-48位(序列号12) ,53-68位 (序列号13)被XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞高频率地识别。另外，可知被XAGE-Ib特异性CD4阳性T细胞识别的主要部位是13- 位的氨基酸区域(序列号10)及33-48位的氨基酸区域(序列号6)。[实验例5]为了研究⑶8阳性T细胞的XAGE-Ib识别区域，使用末梢血⑶8阳性T细胞进行 IFN-Y捕获测定和ELISA。具体而言，将从血清抗体阳性患者中采集的末梢血⑶8阳性T细胞1 X IO4个与相同数目的⑶4-⑶8-细胞在1 μ g/ml的XAGE-Ib重叠多肽存在下一起进行培养。在培养后第10 14天，利用ELISA法测定由CD8阳性T细胞产生的XAGE-Ib特异性 IFN- γ的量。IFN- γ捕获测定的结果，对血清抗体效价阳性患者9例中的6例(66. 7% ) 可确认XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞的反应。图8的(c)和(d)是表示XAGE-Ib特异性 ⑶8阳性T细胞受到诱导的图。[实验例6]为了研究XAGE-Ib中的CD8阳性T细胞的识别区域，对看到反应的6个病例，将脉冲1 μ g/ml各XAGE-Ib重叠多肽的自体EBV-B细胞用作抗原呈递细胞而进行ELISA。将结果示于图11。图11是表示被特异性⑶8阳性T细胞(n = 6)识别的XAGE-Ib区域的图。在图11中，将对特异性CD8阳性T细胞的反应特别强的肽加上星标。图12是表示被XAGE-Ib 特异性CD8阳性T细胞(n = 6)识别的主要表位区域的图。图12是将图11的星标的数目对每个肽进行作图。从图11和图12示出的XAGE-Ib抗体阳性的6个病例的研究结果可知，XAGE-Ib的氨基酸序列的9- 位(序列号14)、21-36位(序列号3)、29-44位(序列号5) ,49-64位(序列号16)被XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞高频率识别。图13是表示血清抗体效价阳性患者中的被XAGE-Ib特异性抗体、XAGE-Ib特异性 ⑶4阳性T细胞、或XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞识别的主要表位区域的图。如图13所示，在XAGE-Ib的解析中显示出，虽然可确认在被特异性抗体、特异性CD4阳性T细胞、或特异性CD8阳性T细胞识别的XAGE-Ib的部位具有特异性的倾向，但是特异性抗体、特异性 ⑶4阳性T细胞、或特异性⑶8阳性T细胞识别的部位是遍及XAGE-Ib的全长地存在。从该结果可想到，通过以覆盖XAGE-Ib的全长的方式将多个肽进行组合而进行给药，从而能不问受试体的HLA的种类地实施XAGE-Ib疫苗。图14表示XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞及⑶8阳性T细胞识别的主要表位区域与HLA的关系。图14表示能检测到XAGE-Ib特异性T细胞的15个病例中的HLA及特异性T细胞识别的重叠多肽的区域。黑色表示CD4阳性T细胞识别的区域，灰色表示CD8阳性T细胞识别的区域。我们目标的癌疫苗是可不问受试者的HLA地实施。如上所述已提出对XAGE-Ib 的特异性反应遍及XAGE-Ib全长，其中存在抗体、CD4阳性T细胞及CD8T阳性细胞识别的主要区域。另外，如后所述，这次应当已成功鉴定了限于多种HLA的表位肽，但如图14所示， 人的HLA是多种多样的，对各HLA分别鉴定表位的操作是非常地极端困难的。因此，图14 表示的各对象者的HLA与主要识别区域的对应表对新型表位肽的推测是有用的。将来，通过HLA的组合，有可能明确能非常有效率地诱导特异性的反应的区域。图15的(a)表示IFN-γ ELISA的结果，表示通过8C187-1进行肽识别的结果。如图15的(a)所示，当使用由XAGE-Ib的氨基酸序列的45-60位的氨基酸序列构成的肽(肽 45-60)或由49-64位的氨基酸序列构成的肽(肽49-64)刺激CD8阳性T细胞(8C187-1) 时，发现IFN-γ的产生。由此，可知道由病例KLU187建立的克隆T细胞(8C187-1)识别 XAGE-Ib的氨基酸序列的45-60位及49-64位的氨基酸序列。另外，图15的(b)表示添加抗⑶4抗体、抗⑶8抗体、抗classl抗体或抗classll抗体而进行IFN- y ELISA的结果。如图15的(b)所示，可知该T细胞是⑶8限制性、classl限制性地识别肽。另外，为了研究⑶8阳性T细胞识别被哪种HLA呈递的肽，使用各种EBV-B细胞作为抗原呈递细胞，对由XAGE-Ib的氨基酸序列的49-64位的氨基酸序列构成的肽(肽 49-64)进行IFN-y ELISA0将结果示于图15的(c)。图15(c)表示限于HLA_A*0206的CD8 阳性T细胞克隆识别该肽。如图15(c)所示，当使用表达HLA-A*0206的EBV-B细胞(KLU187 的自体EBV-B细胞和0S-P07EBV-B细胞)作为抗原呈递细胞来刺激从KLU187的抗原特异性⑶8阳性T细胞克隆而成的⑶8阳性T细胞克隆(8C187-1)时，检测到XAGE-Ib特异性地产生IFN- γ的细胞。从该结果可知，HLA-A*0206限制性的⑶8阳性T细胞克隆(8C187-1) 识别肽49-64。
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另外，对于肽45-60和49-64，为了确定被HLA_A*0206限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞识别的最小表位区域，合成图16表示的各种肽(48-61、49-61，50-61、 51-61、52-61、53-61、49-64、48-61、48-60、48-59、48-58、48-57 和 48-56)并进行 IFN-γ ELISA。将结果示于图16。图16是表示被HLA_A*0206限制性的⑶8阳性T细胞识别的 XAGE-Ib区域的图。如图16的(a)和(b)所示，从IFN-γ ELISA的结果可预料到被⑶8阳性T细胞识别的最小表位由11个氨基酸组成。因为在血清中包含蛋白质分解酶等，所以认为肽由于血清所含的各种成分、酶而受到修饰。因此，在不存在血清的条件下也进行同样的研究。IFN-γ ELISA的条件如下所示KLU187CD8 (8C187-1) IX IO4 个肽XAGE_lb肽各 1 μ M。将IFN-γ ELISA的结果示于图32。如图32的(b)所示，在不含蛋白质分解酶等的不存在血清的条件下(AIM-V)P50-60发生反应最多，所以可知表位区域仍然是XAGE-Ib 的氨基酸序列的50位-60位。另外，在图32的(a)表示的结果中，在血清存在下(5% PS/ AIM-V)认为就像表位是P50-61—样，但在不存在血清的条件下P50-61的反应下降。另一方面，即使在不存在血清的条件下P50-60的反应也有意义。从该结果可推测，XAGE-Ib的氨基酸序列的50位-60位(序列号17)是表位。进而，为了确定HLA_A*0206所呈递的表位区域，使用仅共有HLA_A*0206和 HLA-Cw*0102的非自体的抗原呈递细胞(Mi-EBV-B)而进行IFN-γ ELISA。可认为在血清不存在下T细胞的反应下降。因此，为了维持T细胞的活性，在AIM-V培养基中添加IL-2。 IFN-y ELISA的条件如下所示KLU187CD8 (8C187-1) IX IO4 个肽XAGE_lb肽各 1 μ M。将IFN- y ELISA的结果示于图33。如图33所示，因为使用Ρ50-60进行刺激时产生了 IFN- γ，所以可判断该⑶8阳性T细胞克隆识别HLA-A*0206上所呈递的P50-60。如图 15(c)所示，可知该⑶8阳性T细胞克隆不识别由(Okazaki EBV-B) HLA_Cw*0102呈递的肽。 因此，能证明在仅共有HLA-A*0206和HLA-Cw*0102的抗原呈递细胞(Mi-EBV-B)中，CD8阳性T细胞克隆识别的是由HLA-A*0206呈递的肽。如后述的图18所示，通常，CD8阳性T细胞所识别的肽很多是由9个氨基酸构成。 因此，制备包含XAGE-Ib的氨基酸序列的50-60位氨基酸的由9 12个氨基酸构成的肽 (P50-61、P50-60、P51-61及P51-60)，确认XAGE-Ib的氨基酸序列的50-60位的11个氨基酸序列是否真的是最小表位。将IFN-YELISA的结果示于图16(c)。如图16(c)所示，可知当在血清不存在下使用包含XAGE-Ib的氨基酸序列的50_60 位(序列号17)的肽刺激⑶8阳性T细胞时，IFN-γ产生量呈肽浓度依赖性地增加。另外， 使用具有XAGE-Ib的氨基酸序列的50-60位氨基酸序列的肽来刺激CD8阳性T细胞时与使用具有XAGE-Ib的氨基酸序列的50-60位氨基酸序列的肽来刺激CD8阳性T细胞时相比， 给予IFN-Y产生的效果显著。因为即使肽是低浓度也可维持⑶8阳性T细胞的反应，所以可知由HLA-A*0206呈递的肽是XAGE-Ib的氨基酸序列的50-60位的11个的氨基酸序列。
另夕卜，确认由KLU187的抗原特异性T细胞克隆而成的另外的T细胞克隆 (8C187-2)的⑶8限制性、classl限制性，然后用同样的方法判定最小表位。图17是表示肽45-60和肽49_64为被HLA_Cw*0102限制性的CD8阳性T细胞克隆(8C187-2)识别的肽的图。图17的(a)表示IFN-γ ELISA的结果，表示用8C187-2识别肽的结果。图17的(b)表示添加抗⑶4抗体、抗⑶8抗体、抗classl抗体或抗classll抗体而进行IFN- y ELISA的结果。图17 (c)表示限于HLA_Cw*0102的⑶8阳性T细胞克隆识别该肽。如图17所示，当使用表达HLA_Cw*0102的EBV-B细胞作为抗原呈递细胞来刺激由KLU187克隆而成的⑶8阳性T细胞克隆(8C187-2)时，检测到XAGE-Ib特异性地产生 IFN- γ 0从该结果可知，HLA-Cw^O 102限制性的CD8阳性T细胞克隆(8C187-2)识别肽
49-64。进而，为了确定被HLA_Cw*0102限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞克隆 (8C187-2)识别的最小表位区域，合成图18表示的多种肽(50-61、51-61、52-61、50-60、
50-59和 50-58)，进行 IFN- y ELISA。将结果示于图18。图18是表示被HLA_Cw*0102限制性的⑶8阳性T细胞识别的 XAGE-Ib区域的图。图18的(c)是表示由⑶8阳性T细胞产生的IFN-γ量呈肽浓度依赖性地增加的图。可预料到HLA_Cw*0102限制性的T细胞识别的XAGE-Ib肽区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的51-59位(序列号18)。但是因为⑶8阳性T细胞对P51-61的反应非常强，所以使用仅共有HLA-A*0206和HLA_Cw*0102的抗原呈递细胞(Mi-EBV-B)，调查根据图18的 (c)表示的4种肽(51-61、51-60、51-59和50-59)的浓度的CD8阳性T细胞克隆的反应。 将IFN- y ELISA的结果示于图18的(c)。如图18的(c)所示，可知使用包含HLA_Cw*0102限制性的肽的最小单位即P51-59 且追加C末端氨基酸而得的P51-60或P51-61来进行刺激的情况与用P51-59进行刺激的情况同样，IFN- γ产生量呈肽浓度依赖性地增加。由此，可证明由HLA-Cw*0102呈递的最小表位是XAGE-Ib的氨基酸序列的51-59位(序列号18)。由HLA_Cw*0102呈递的肽区域存在多个，但可认为成为核心部分的是不包含XAGE-Ib的氨基酸序列的50位氨基酸的51-59 位的氨基酸序列(序列号18)。图19是表示肽21-36为被T细胞克隆(8C187-4)识别的肽的图。图19的(a)表示IFN- y ELISA的结果，表示用8C187-4识别肽的结果。图19的(b)表示添加抗⑶4抗体、 抗⑶8抗体、抗classl抗体或抗classll抗体而进行IFN- y ELISA的结果。图19 (c)表示限于HLA-B*3501的⑶8阳性T细胞克隆识别该肽。图19的(b)是在确认由KLU187的抗原特异性T细胞克隆而成的另外的T细胞克隆(8C187-4)的CD8、classl限制性后，用同样的方法判定最小表位。如图19(c)所示， 当使用表达HLA-B*3501的EBV-B细胞作为抗原呈递细胞来刺激由KLU187克隆而成的⑶8 阳性T细胞克隆(8C187-4)时，检测到XAGE-Ib特异性的IFN-Y的产生。从该结果可知， HLA-B*3501限制性的CD8阳性T细胞克隆(8C187-4)识别肽21-36。另外，为了判定被HLA_B*3501限制性的XAGE-Ib特异性CD8阳性T细胞克隆 (8C187-4)识别的最小表位区域，合成图20表示的多个肽(17-32、21-36、17-31、18-31、、21-31、21-30、21-29 和 22-32)，进行 IFN-yELISA。将结果示于图20。可确定被HLA_B*3501限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞克隆(8C187-4)识别的最小表位区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的21位- 位。图21是表示肽21-36为被T细胞克隆(8C237-22)识别的肽的图。图21的(a) 表示IFN-YELISA的结果，表示用8C237-22识别肽的结果。图21的(b)表示添加抗⑶4 抗体、抗CD8抗体、抗classl抗体或抗classll抗体而进行IFN- y ELISA的结果。图21 (c) 表示限于HLA-B*4002的⑶8阳性T细胞克隆识别该肽。图21的(b)是在确认由KLU237的抗原特异性T细胞克隆而成的另外的T细胞克隆(8C237-22)的⑶8限制性、classl限制性后，用同样的方法判定最小表位。如图21 (c) 所示，当使用表达HLA-B*4002的EBV-B细胞作为抗原呈递细胞来刺激由KLU187克隆而成的⑶8阳性T细胞克隆(8C237-22)时，检测到XAGE-Ib特异性的IFN- γ的产生。从该结果可知，HLA-B*4002限制性的CD8阳性T细胞克隆(8C237-22)识别肽21-36。另外，为了判定被HLA_B*4002限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞克隆 (8C237-22)识别的最小表位区域，合成图22表示的多种肽(17_32、21_36、17-31、18-31、 19-31、20-31、21-31、21-30、21-29 和 22-32)，进行 IFN-yELISA。将结果示于图22。可鉴定被HLA_B*4002限制性的XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞克隆(8C237-22)识别的最小表位区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的21位- 位(序列号 15)。图23示出对建立的XAGE-Ib特异性CD4阳性T细胞(4C187-1)使用将XAGE-Ib 蛋白质、被转染XAGE-Ib质粒DNA的细胞的裂解液及自体肺癌组织的裂解液分别吞噬的自体树状细胞来进行刺激，结果显示抗原特异性的IFN-Y产生反应。图24示出对HLA-B*35限制性的CD8阳性T细胞克隆(8C187-4)用将XAGE-Ib 蛋白质、5种25mer的XAGE-Ib重叠多肽(具体的氨基酸序列参考图26)吞噬的自体树状细胞进行刺激，结果显示抗原特异性的IFN-Y产生反应。另外，通过使用25mer的长链肽而证明建立的T细胞能够反应的事实可证明之后说明的长链肽的有用性。另外，图对的(b) 示出8C187-4特异性识别被转染XAGE-Ib的质粒DNA的B*3501阳性肿瘤细胞。如图M所示，可知从抗XAGE-Ib抗体阳性患者上得到的T细胞识别天然表位肽， 对抗原阳性的肿瘤细胞具有特异性的细胞伤害活性。该事实启示XAGE-Ib具有强的免疫原性，在非小细胞肺癌患者中将XAGE-Ib作为靶的癌疫苗疗法是有用的。对XAGE-Ib特异性CD8阳性T细胞克隆的诱导，在世界上谁都没有成功，是本发明人等首次成功。另外，尚不知道XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞识别的肽区域，而通过本发明首次明确。进而，研究了为了诱导对XAGE-Ib的特异性免疫反应所认为必需的抗原与CD8阳性T细胞的反应时间。图25是表示根据抗原与细胞的反应时间的对XAGE-Ib诱导特异性免疫反应的图。图25的(a)表示IL-2和IL-7存在下的结果，(b)和(c)表示IL-7和IL-15 存在下的结果。另外，(b)是表示在与用XAGE-Ib重叠多肽进行刺激的EBV-B细胞共同培养8小时后，诱导XAGE-Ib特异性地产生IFN- γ的⑶8阳性T细胞的图。(c)表示在抗原特异性T细胞克隆中也同样地通过8小时的共同培养而得到反应。图25的(a) (c)各自的IFN- y ELISA的条件如下所示
图W的(a)
效应:KLU187 CD8 1 X IO4 个
靶KLU187 EBV-B (自体)2 X IO3 个
肽XAGE-lb重叠多肽 1 μ g/ml
3次刺激培养后(IVS X 3)
图W的(b)
效应:KLU187 CD8 1 X IO4 个
靶KLU187 EBV-B (自体)1 X IO4 个
肽XAGE-lb重叠多肽 1 μ g/ml
图 25(c)
效应KLU187 CD8 克隆 8C187-1 IX IO4 个
靶KLU187 EBV-B (自体)2 X IO3 个
肽XAGE-lb重叠多肽 1 μ g/ml
3次刺激培养后(IVS X 3)。
如图25所示，可知即使通过添加IL-15从而进一步活化⑶8阳性T细胞或增强抗原呈递能力，要在未实施疫苗的癌患者中诱导XAGE-Ib特异性的细胞免疫，也需要将抗原
和CD8阳性T细胞的反应时间设定在8小时左右。对于作为公知CT抗原的NY-ES0-1，也可确认在37°C使刺激培养后的⑶8阳性T 细胞与相同数目的用NY-ES0-1重叠多肽脉冲或非脉冲的自体EBV-B细胞在(X)2恒温器内反应4小时，进行IFN- γ捕获测定，可检测NY-ES0-1特异性⑶4阳性T细胞或⑶8阳性T 细胞(未图示)。这种抗原和CD8阳性T细胞的反应时间的不同，虽然可推测是肽的结构或XAGE-Ib 的抗原性等各种因素，但也认为是T细胞对各种癌抗原的反应机制的不同。〈总结〉[结论][1 体液免疫反应]对200例非小细胞肺癌患者，详细研究了对作为癌睾丸抗原之一的XAGE-Ib的免疫反应。其结果，(1)全部非小细胞肺癌中20/200(10. 0% )被认定为是抗体阳性例。(2)当限定在Stage;3B/4期的进展期肺腺癌时以13/69(18. 8% )的高频率认定抗体阳性例。(3)为了比较研究而研究了对NY-ES0-1的抗体反应，结果是全部肺癌中为6. 7% 为抗体阳性，stage3/4期的非小细胞肺癌中9. 7%是抗体阳性。(4)通过以上可判断，对XAGE-Ib的抗体反应阳性率能够与对在CT抗原中也具有高免疫原性且已经作为疫苗的靶抗原而进行了临床试验的对NY-ES0-1的抗体阳性率相比较，可成为对肺癌患者的疫苗的靶抗原的候选。(5)可知抗体识别的部位是XAGE-Ib的氨基酸序列的21_48位(序列号2) ,57-72 位(序列号7) ,65-81位(序列号8)这3个区域。(6)通过进一步提高抗体检测灵敏度，从而可以用于肺癌诊断。
[2 细胞性免疫反应]进一步研究XAGE-Ib特异性的⑶4阳性T细胞和⑶8阳性T细胞的免疫反应，结果是(1)在16名血清抗体效价阳性患者的研究中，14名(87. 5 % )成功检测到 XAGE-Ib特异性⑶4阳性T细胞。(2)可知对发现特异性的反应的CD4阳性T细胞识别的部位，CD4识别的区域是 XAGE-Ib的氨基酸序列的13-36位(序列号9)、29-48位(序列号12)、53-68位(序列号 13)，进而主要部位是13-28位(序列号10)和33-48位(序列号6)。(3)还进一步成功诱导XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞，确立其检测法。(4)在6例血清抗体效价阳性患者的研究中，在4例(66.7%)成功检测到 XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞。(5)可知特异性⑶8阳性T细胞识别的HLA_A*0206限制性的表位区域是XAGE-Ib 的氨基酸序列的50-60位(序列号17)，HLA-Cw*0102限制性的表位区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的51-59位(序列号18)。另外，可知特异性⑶8阳性T细胞识别的HLA-B*3501限制性的表位区域以及特异性CD8阳性T细胞识别的HLA-B*4002限制性的表位区域是XAGE-Ib 的氨基酸序列的21- 位(序列号15)。(6)通过鉴定特异性⑶8阳性T细胞识别的表位区域，包含这些区域的肽成为癌·肽疫苗的候选，能更有效率地诱导细胞杀伤性T细胞。[考察]在本发明中，(1)确认了肺癌患者中的对XAGE-Ib特异性的体液、细胞性免疫应答。(2) =XAGE-Ib抗体阳性例在全部非小细胞肺癌中以20/200例(10. 0% )诱导体液免疫，如果限于进展期6tage3B/4)肺腺癌则以13/69例(18.8% )诱导体液免疫。(3)抗XAGE-Ib抗体的识别部位是XAGE-Ib的氨基酸序列的21_48位(序列号 2)、57-72位(序列号7)、65-81位(序列号8)这3个区域。(4)以14/16例(87. 5% )诱导对XAGE-Ib的特异性CD4阳性T细胞，CD4阳性T 细胞识别的部位是XAGE-Ib的氨基酸序列的13-36位(序列号9) ,29-48位(序列号12)、 53-68位(序列号13)，进而主要部位是13-28位(序列号10)和33-48位(序列号6)。(5)以4/6例(66. 7% )诱导对XAGE-Ib的特异性CD8阳性T细胞，CD8识别的区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的9-M位(序列号14)、21-36位(序列号3)、29-44位(序列号5)、49-64位(序列号16)。(6)特异性⑶8阳性T细胞的反应与NY-ES0-1等相比，需要反应时间，用以往的检测法会很困难。(7)对XAGE-Ib的HLA_A*0206限制性的特异性⑶8阳性T细胞识别的肽区域是 XAGE-Ib的氨基酸序列的50-60位(序列号17)。(8)对XAGE-Ib的HLA_Cw*0102限制性的特异性⑶8阳性T细胞识别的肽区域是 XAGE-Ib的氨基酸序列的51-59位(序列号18)。(9)对XAGE-Ib的HLA_B*3501限制性的特异性CD8阳性T细胞以及对XAGE-Ib 的HLA-B*4002限制性的特异性⑶8阳性T细胞识别的肽区域是XAGE-Ib的氨基酸序列的21- 位(序列号15)。(10)明确XAGE-Ib特异性抗体识别的部位，这可以应用于肺癌诊断。(11)明确XAGE-Ib特异性CD4阳性和⑶8阳性T细胞识别的区域，这包含相同区域的肽成为癌疫苗疗法的候选肽(抗原)。(12)通过明确XAGE-Ib特异性⑶8阳性T细胞识别的区域，相同部位是能诱导细胞杀伤性T细胞的免疫原性强的肽，可应用于包含癌疫苗疗法的癌治疗。[实施例2]实施例2中，制造XAGE-Ib的长链肽。图沈是表示XAGE-Ib的长链肽的氨基酸序列的图。如图26所示，实施例2中制备的XAGE-Ib的长链肽是以覆盖由81个氨基酸构成的XAGE-Ib的全长的方式设计而成的、由25个氨基酸构成的以下5种肽。肽1-25 (由序列号19表示的氨基酸序列构成的肽)肽15-39 (由序列号20表示的氨基酸序列构成的肽)肽四-53 (由序列号21表示的氨基酸序列构成的肽)肽43-67 (由序列号22表示的氨基酸序列构成的肽)肽57-81 (由序列号23表示的氨基酸序列构成的肽)。在此，表示了将与XAGE-Ib相同的作为癌睾丸抗原的NY-ES0-1作为靶的肽疫苗的解析结果。关于NY-ES0-1疫苗，已经实施蛋白质(NY-ES0-1全长肽)疫苗。但是，可预料到 NY-ES0-1的蛋白质疫苗⑴成本非常高，(ii)蛋白质是非常大的物质，所以如果不使用适当的佐剂(免疫活化剂)则难以被抗原呈递细胞吞噬，以及(iii)因为是外来物质，所以难以充分地被抗原呈递给⑶8阳性T细胞(难以介由 MHC classl被抗原呈递)。因此，现在预测NY-ES0-1蛋白质的免疫原性高的部位(特异性抗体、特异性CD4阳性T细胞、或特异性CD8阳性T细胞识别的高频率部位)，实施包含其部位的长链肽的疫苗(ΝΥ-SO-lf肽疫苗)。但是，当使用f肽(由20个氨基酸构成的长链肽)作为疫苗时，不明确的是(A) f肽能否被抗原呈递，以及(B)f肽疫苗能否起到与蛋白质疫苗相同的效果。因此，首先，对所述(A)进行研究。具体而言，使用作为人单核细胞白血病株的 U937，将用20ng/ml PMA引发的U937使用结合有FAM 的NY-ESO-If肽进行培养。在U937 中的NY-ESO-If肽的定位通过观察荧光色素FAM 的荧光而得到确认。将结果示于图27。图27是表示NY_ES0_lf肽被摄入抗原呈递细胞(U937)的图。 图27的WGA (Wheat Germ Agglutini)表示细胞膜被染色。如图27所示，培养3小时后，确认NY-ESO-If肽被摄入到细胞中。从该结果可知， 比NY-ES0-1蛋白质(NY-ES0-1全长肽)短的NY-ESO-If肽(20个氨基酸)能够被摄入到抗原呈递细胞中。另外，已确认NY-ESO-If肽被MHC classll抗原呈递(图观)。具体而言，对于 NY-ES0-1特异性⑶4阳性T细胞克隆(E-8A1)，使用自体EBV-B细胞作为抗原呈递细胞，在肽NY-ESO-If肽存在下，在4°C或37°C的温度条件下进行IFN- y ELISA。图观是表示NY-ESO-If肽被MHC classll抗原呈递的图。图观的横轴的“已/丁比”表示效应器(T细胞)和靶(EBY-B细胞)的共培养比例。如图28所示，还可知用MHC classll的NY-ESO-If肽呈递受到温度影响。该结果显示，虽然NY-ESO-If肽被MHC classll 抗原呈递，但NY-ESO-If肽的摄入受到低温阻碍而对⑶4阳性T细胞的反应下降。另外，已确认NY-ESO-If肽也被MHC classl抗原呈递，即被交叉呈递(图四)。具体而言，在含有1 μ M的NY-ESO-I92,短链肽、1 μ M的NY-ES0_l91_11(1f肽或10 μ g/ml的重组蛋白质的无血清AIM-V培养基中，在10 μ M的细胞松弛素B的存在下或非存在下，培养树状细胞(5Χ IO5个/ml)，脉冲抗原。清洗细胞后，将⑶8阳性T细胞克隆(TK_f012H10) (5 X IO3 个)与用各个抗原脉冲的树状细胞(5X103个)在37°C共培养M小时。将抗原刺激导致的IFN-Y的产生量用ELISA进行测定。图四是表示NY-ESO-If肽被MHC classl抗原呈递的图。如图四所示，可知用 MHC classl的NY-ESO-If肽呈递受到细胞松弛素B的影响。该结果显示，虽然NY-ESO-If 肽被MHC classl抗原呈递，但NY-ESO-If肽的摄入被细胞松弛素B阻碍而对⑶8阳性T细胞的反应下降。外源性抗原(蛋白质及肽)被摄入抗原呈递细胞时，基本上是介由MHC class II 途径(与⑶4阳性T细胞的诱导有关的途径)被抗原呈递。与此相对，MHC class I途径 (与CD8阳性T细胞的诱导有关的途径)是用于将内源性抗原进行抗原呈递的途径。但是， 有时外源性抗原介由MHC class I途径被抗原呈递。这作为交叉呈递而被知晓。已确认NY-ES0-1的f肽(长链肽)被摄入抗原呈递细胞，介由作为用于抗原呈递外源性抗原的本来途径的MHC classll途径而能活化⑶4阳性T细胞，介由MHC classl途径被交叉呈递而能活化CD8阳性T细胞。另外，图四的结果启示了如果不使用适当的佐剂则蛋白质不能利用交叉呈递而充分地诱导⑶8阳性T细胞。这些结果证明，长链肽作为疫苗具有与蛋白质同样的功能。应予说明，短链肽疫苗(在MHC classl途径的情况下，最小表位约由9个 11个氨基酸构成。例如东京大学、中村佑辅教授指导的疫苗等)由受试体的HLA种类所限制。与此相对，蛋白质疫苗因覆盖抗原全长而无需问受试体的HLA种类。具体而言，短链肽疫苗因为使用限于特定HLA的肽，所以基本不能识别除其以外的HLA限制性的T细胞。例如，在XAGE-Ib的情况下，HLA_Cw*0102限制性的表位肽是具有与XAGE-Ib的氨基酸序列的51-59位对应的氨基酸序列的肽(用序列号18表示的由9个氨基酸构成的肽)。但是，该短链肽疫苗尽管能诱导HLA-Cw*0102限制性的免疫，但不能诱导HLA-A*0206限制性的免疫。这是因为HLA_A*0206限制性的最小表位是具有与XAGE-Ib 的氨基酸序列的50-60位对应的氨基酸序列的肽(用序列号17表示的由11个氨基酸构成的肽)，用序列号18表示的由9个氨基酸构成的肽过短。因此，用序列号18表示的由9个氨基酸构成的短链肽的疫苗仅能用于具有Cw0102这样的HLA的受试体。另一方面，例如，用序列号17表示的由11个氨基酸构成的短链肽疫苗能诱导 HLA-A*0206限制性的免疫。进而，该短链肽疫苗被摄入抗原呈递细胞，被适当地处理，也能诱导HLA-Cw*0102限制性的免疫。即，通过鉴定特异性⑶4阳性T细胞或特异性⑶8阳性 T细胞各自识别的部位(如果可能的话是表位肽)，然后调查识别的频率，从而能够制备与蛋白质疫苗同样而与受试体的HLA种类无关的、低成本的、且可成为有效的疫苗的长链肽。如图13所示，在XAGE-Ib的解析中，虽然认定被特异性抗体、特异性CD4阳性T细胞或特异性CD8阳性T细胞识别的XAGE-Ib的部位具有特异性的倾向，但特异性抗体、特异性⑶4阳性T细胞或特异性⑶8阳性T细胞识别的部位遍及XAGE-Ib全长地存在。因此， 可认为通过以覆盖XAGE-Ib全长的方式将多个长链肽进行组合而给药，能无需问受试体的 HLA的种类地实施XAGE-Ib疫苗。[产业上的可利用性]本发明可用于癌的检查或诊断、癌预防或癌治疗等，不仅能有助于将癌作为对象的医学、医疗的发展，而且也能在临床检验药剂产业、试剂产业等方面进行利用。
权利要求
1.一种肽，由以下(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列；International Journal of Oncology 30 :835-840, 2007 R Microbiol. Immunol. ,51 (8), 755-762，2007 中所记载的肽。
2.一种用于诊断肺癌的组合物，其特征在于，包含由以下(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌或肺腺癌。
4.一种肺癌诊断方法，其特征在于，包括抗体测定工序，该抗体测定工序是测定在来自受试体的试样中，与由以下(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗体的水平(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列。
5.一种肺癌诊断方法，其特征在于，包括肽测定工序，该肽测定工序是测定由以下 (a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽在来自受试体的试样中存在的水平(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列。
6.一种用于诱导对肺癌的体液免疫的组合物，其特征在于，包含由以下(a) (e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽(a)序列号1的1-25位的氨基酸序列；(b)序列号1的15-53位的氨基酸序列；(c)氨基酸序列，是序列号1的15-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的15-39位、29-53位、21-48位、21-36位、25-40位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(d)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(e)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、57-72位或65-81位的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌或肺腺癌。
8.一种肽，由以下(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成(f)序列号1的1-39位的氨基酸序列；(g)氨基酸序列，是序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号 1 的 1-25 位、15-39 位、13-36 位、13- 位、17-32 位、21-36 位、9- 位或 21- 位的氨基酸序列；(h)序列号1的四-53位的氨基酸序列；(i)氨基酸序列，是序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-48位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(j)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(k)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、53-68位、49-64位、50-60位或51-59位的氨基酸序列；International Journal of Oncology 30 :835-840, 2007 R Microbiol. Immunol. ,51 (8), 755-762，2007 中所记载的肽。
9.一种用于诱导对肺癌的细胞免疫的组合物，其特征在于，包含由以下(f) (k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽(f)序列号1的1-39位的氨基酸序列；(g)氨基酸序列，是序列号1的1-39位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号 1 的 1-25 位、15-39 位、13-36 位、13- 位、17-32 位、21-36 位、9- 位或 21- 位的氨基酸序列；(h)序列号1的四-53位的氨基酸序列；(i)氨基酸序列，是序列号1的四-53位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的四-48位、29-44位或33-48位的氨基酸序列；(j)序列号1的43-81位的氨基酸序列；及(k)氨基酸序列，是序列号1的43-81位的氨基酸序列的部分序列，该部分序列包含序列号1的43-67位、57-81位、53-68位、49-64位、50-60位或51-59位的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌或肺腺癌。
全文摘要
本发明明确了XAGE-1b的功能，并且开发了基于XAGE-1b的癌疫苗疗法。使用由(a)～(e)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽或由(f)～(k)中任一项所示的氨基酸序列构成的肽，诱导对肺癌中的XAGE-1b的体液免疫或细胞免疫。
文档编号A61P35/00GK102428102SQ20108002190
公开日2012年4月25日 申请日期2010年5月21日 优先权日2009年5月22日
发明者中山睿一, 大植祥弘 申请人:国立大学法人冈山大学