新颖的翻译后纤维蛋白原变体的制作方法

专利名称：新颖的翻译后纤维蛋白原变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及通过重组方法制备的人纤维蛋白原的新颖的翻译后变体的提供。本发明也涉及与这些新颖的变体有关的方法和应用。
背景技术：
纤维蛋白原(关键性的结构血浆蛋白之一)是一种340-kDa糖蛋白，如Doolittle 等人所描述(Doolittle RF, Spraggon G, Everse SJ. Three-dimensional structural studies on fragments of fibrinogen and fibrin (纤维蛋白原和纤维蛋白的片段的三维结构研究).Curr Opin Struct Biol.(结构生物学当前进展)(1998) 8 :792-798)。脊椎动物纤维蛋白原分子由3对不同的链(α2、β2和Υ2链)组成，其中一对中的2个成员是相同的。对于人纤维蛋白原，还原的Αα-、Ββ-和^链具有大约65，000、55，000和47，000 的分子量。
_4] mm&i^-^^mmm, (FReDs)纤维蛋白原参与凝血，被凝血酶活化，以装配成纤维蛋白凝块。2X3链的N-端结合，以形成称作二硫化物结(disulfide knot)的球形排列。纤维蛋白原链的C-端以球形结构域作为末端，它们不是完全相同的。Y链的C-端球形结构域(C-Y)会二聚体化，并结合α链的N-端结构域的GI^R基序，而β链的N-端结构域的GHR基序结合另一个β链的 C端球形结构域(C-β)，从而导致网络形成。在血管损伤以后，纤维蛋白原被凝血酶裂解， 以形成纤维蛋白，所述纤维蛋白是血块的最丰富的组分。另外，纤维蛋白原和纤维蛋白的不同裂解产物会调节细胞粘附和扩散，显示出血管收缩剂和趋化活性，且是几种细胞类型的促分裂原。以前描述的一个或多个纤维蛋白原基因中的突变会导致几种病症，包括纤维蛋白原缺乏血症(afibrinogenemia)、异常纤维蛋白原血症(dysfibrinogenemia)、低异常纤维蛋白原血症(hypodysfibrinogenemia)和血栓形成趋势。已知，在人类中，纤维蛋白原存在几个差异，这取决于遗传因素已经提出，多达 51%的血浆纤维蛋白原水平差异可以归因于遗传因素。已经提出，在由几个实验室生成的纤维蛋白原蛋白序列数据和早期编码区DNA序列数据内或二者之间的差异，是实验人为产物(罕见的或新的变体)的结果，或指示真实的、确定的多态性。Colafranceschi等人已经使用非线性方法、再现量化分析，在野生型中，和在许多天然存在的或人工突变体中，研究了人纤维蛋白原的A α _、B β -和γ -链中的疏水性模式分布，其目的是发现用于区分沉默的和病理学的突变体的结构基础(Colafranceschi M， Papi M,Giuliani A,Amiconi G,Colosimo Α. ,Pathophysiol. Haemost. Thromb.(病理生理止血和凝血)，2006，35 :417-27)。在突变是在Aa-链上的情况下，Colafranceschi等人是成功的，这是由于该链与其它2条链相比特有的特征。关于Aa -链的点突变体的有关发现如下(a)这类突变体的基于再现量化分析的分类与临床分类一致性良好，和(b)突变的残基在序列上的位置比它的疏水特征起更相关的作用。根据Colafranceschi等人，Aa -链的延长同种型的终末区(600-866残基)中的人工点突变体与前面的(1-207)残基的天然出血性突变体聚簇在一起。
Ajjan等人描述了纤维蛋白原Ββ链的C-端区域中的共有变异。根据Ajjan和他人，纤维蛋白原B β Arg448Lys是共有多态性的结果，所述共有多态性位于分子的B β -链的羧基端内(Ajjan R, Lim BCB, Standeven KF, Harrand R, Dolling S, Phoenix F, Greaves R, Abou-Saleh RH, Connell S, Smith Dam, Weisel Jff, Grant PJ, Ariens RAS. Blood ( . 液)，(2008) 111 :643-649 ；Baumann RE, Henschen AH，Blood(血液)(199 82 :2117-2124 ； Carter AM, Catto AJ, Bamford JM, Grant PJ. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (1997), 17 :589-594)。在理解先天性纤维蛋白原缺乏血症的分子基础方面，已经取得了最新的进展，所述先天性纤维蛋白原缺乏血症是一种常染色体隐性的凝固障碍，其特征在于完全缺失可检测的纤维蛋白原。在一个非血亲的瑞士家族中鉴别出了该障碍的第一个成因突变；存在纤维蛋白原α链(FGA α )编码基因的大约111Λ的纯合子缺失。单倍型数据提示，该缺失发生在独特的祖先染色体上，表明FGA基因的该区域可能易于通过共同机理发生缺失。所有缺失在碱基对上是相同的，可能源自非同源的(不正常的)重组。在随后的13位无亲戚关系的先天性纤维蛋白原缺乏血症患者的研究中，作者分析了 FGA基因，以便鉴别成因突变，并确定11-1Λ FGA缺失的普遍性。还表征了 3个移码突变、2个无义突变和1个其它的剪接位点突变。其它研究鉴别出了 1个另外的FGA α无义突变、2个FGBi3错义突变和1个TOy无义突变，都是在单个患者中的纯合基因(Neerman-Arbez M. ,Ann N Y Acad Sci. 2001 ；936 496-508)。总之，大多数患者具有FGA α基因中的截短突变，尽管凭直觉可以预测所有3个纤维蛋白原基因同等地涉入。现有的知识会促进该障碍的分子诊断，允许对有此需要的家族进行产前诊断，并为新的治疗方案(诸如基因治疗)铺设道路。以前的纤维蛋白原的基因型-表型关联研究，已经受到主要种族集合内和之间的 FGB β,FGA α和TOY的基因组序列变化的不完全知识的限制。该连锁不平衡被表征为，欧裔美籍人和非裔美籍人种群的人纤维蛋白原基因基因座之间的模式和单倍型结构。在年轻人中，纤维蛋白原多-基因座基因型表现得与血浆纤维蛋白原水平有关。这些关联的具体的单核苷酸多态性和单倍型模式表现得随种群和表型试验而异。血浆纤维蛋白原浓缩物的遗传组分的大部分似乎是由于在3个纤维蛋白原基因以外的遗传变化。已经提出混杂的原因和颠倒的因果关系，作为高纤维蛋白原水平和心血管疾病之间的关联的解释。遗传变体可以改变纤维蛋白原特征，且不会发生这些问题。为了测定纤维蛋白原-A α (FGAaThr312Ala)和纤维蛋白原_Β β (FGB β -455G/A)中的基因型变体的纤维蛋白原血浆水平，以及这些变体是否与动脉血栓形成有关，在基于种群的病例对照研究 (包括年龄为18-50岁的女性)中测定了纤维蛋白原基因型。reBi3-455G/A变体增加了血浆纤维蛋白原水平，而FGAaThr312Ala变体降低了血浆纤维蛋白原水平，尽管是在不大的程度上。当将纯合子次要等位基因与纯合子主要等位基因相对比时，改变了缺血性中风的风险。FGAaThr312Ala单核苷酸多态性(SNP)与风险的降低有关，而FGB β-455G/A SNP可能已经增加了风险。对于任一种SNP而言，没有改变心肌梗塞的风险。使用该遗传变化作为血浆纤维蛋白原水平改变的标志物，由此排除混杂和颠倒的因果关系，提示的结果是与对于心肌梗死而言，血浆纤维蛋白原水平可以作为缺血性中风的危险因素起更显著的作用 (Siegerink B, Rosendaal FR, Algra A. J Thromb Haemost. (2009)7:385—90)。
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因子XIII和纤维蛋白原在凝固因子中是不常见的，因为它们都不是丝氨酸蛋白酶。纤维蛋白是血块的主要蛋白组分，其通过连接邻近的纤维蛋白单体的酰胺或异肽键被因子XIIIa稳定化。通过蛋白和基因分析、定点诱变和χ-射线晶体学，已经阐明了因子XIII 和纤维蛋白(原)的许多结构和功能特征。但是，仍然未解释在不溶性纤维蛋白体内和体外形成的复杂过程中所涉及的一些分子方面。纤维蛋白原、因子XIII和心血管病症或其它血栓性病症之间的关系的发现，已经将许多注意集中在这两种蛋白上。特别令人感兴趣的是，因子XIII的基因中的共有变异与改变的血栓形成风险特性之间的关联。尽管关于这些观察存在许多争论，最重要的是，提示了对血块形成和治疗干预的理解。已经研究了在FXIII A亚基中的位置34处的共有多态性Val至Leu，作为血栓形成的危险决定因素。因为认为Val34Leu邻近凝血酶切割位点，假设它会改变FXIII的功能 使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱法分析凝血酶的FXIII亚基蛋白酶解，已经证实了与34Val相比，凝血酶会更快地且在更低的剂量裂解FXIII 34Leu。分离的活化肽的质谱法证实了预测的单个甲基差异，并证实了凝血酶切割位点未被Val34Leu 改变。活化肽释放的动力学分析证实，凝血酶的催化效率(k(cat)/K(m))是0. 5(对于FXIII 34Leu而言)和0.2(对于34Val而言)(微摩尔/L) (-l)x sec(-l)。纤维蛋白的存在使催化效率分别增加至4.8和2.2(微摩尔/1)(-1)1 sec (-1)0尽管34Leu肽以与纤维蛋白肽 A类似的速率释放，34Val肽比纤维蛋白肽A更缓慢地释放，但是比纤维蛋白肽B产生更快速。与用34Val温育相比，当用FXIII 34Leu温育纤维蛋白时，γ -和α-链的交联出现得更早。完全活化的34Leu和34Val FXIII会表现出类似的交联活性。通过浊度和渗透性测量来分析使用来自FXIII 34Leu受试者的血浆制备的纤维蛋白凝块，已经证实了与 34Val相比减小的纤维质量/长度比和孔隙率。通过电子显微术，已经证实了结构差异。这些结果证实，Val34Leu会加速凝血酶对FXIII的活化，结果表现成以此方式影响交联的纤维蛋白凝块的结构。在美国专利6，037，457中，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产了重组纤维蛋白原。 提供了可以用于培养转染的哺乳动物细胞以表达纤维蛋白原的示例条件在具有附着的微载体珠子的滚瓶中，在含有血清的培养基中，繁殖细胞4-5周的时段，随后在共200ml无血清的培养基(Dulbecco氏改良的fegle氏培养基/F12培养基，其含有IOIU青霉素/ml、 IOmg链霉素/ml、IOU抑酞酶/ml和各10 μ g/ml的胰岛素、亚硒酸钠和转铁蛋白)中在37°C 培养细胞3周，然后开始每4-7天收集条件培养基，以便开始纯化过程，其中，根据美国专利 6，037，457的作者，在许多情况下，这从硫酸铵沉淀法开始。

发明内容
US 6，037，457排它地涉及重组纤维蛋白原的提供，此外，没有解决如在WO 2007/103447中所述的关于提供完全纯的重组人翻译后系统的问题。因此，US 6，037，457 既没有涉及关于得到的纤维蛋白原之间的翻译后差异的任何发现，也没有涉及迄今未公开的翻译后纤维蛋白原物质的存在。本发明涉及用于制备重组人纤维蛋白原的新颖的概念和方法，其具体地涉及人纤维蛋白原的未还原的生物活性的Αα、Ββ、γ链中的迄今未知的可鉴别的变化的利用，所述变化由选择用于生产这些纤维蛋白原链的重组表达系统引起。令人惊讶地观察到，由HEK 细胞生产的纤维蛋白原可以分成至少2种不同的纤维蛋白原组成，其中所述纤维蛋白原在凝血酶-活化的聚合中表现出显著的差异。根据本发明，在下述情况下，存在由此提供的2种单独的纤维蛋白原将α、β和 Y纤维蛋白原链编码基因构建进启动子和载体系统中，转染进某些人细胞系中，然后收获和分离来自这些细胞的表达产物。直到现在，发明人目前已经成功地建立了转染的人细胞系统，其能够表达纤维蛋白原中的这些新颖的差异，所述纤维蛋白原通过某些纯化方法，能够生成至少2种(两种) 不同的可区分的重组人纤维蛋白原，在本文中称作F5和F6。因此，在第一个方面，本发明因此提供了用于制备纤维蛋白原的方法，所述方法包括提供用编码单个纤维蛋白原链的表达载体转染的细胞，随后在便于所述细胞生产纤维蛋白原的条件下，培养所述细胞，随后回收所述纤维蛋白原，并分离以至少2种翻译后修饰的物质形式存在的所述纤维蛋白原，所述至少2种翻译后修饰的物质通过在PAGE凝胶中的不同迁移模式进行区分，和/或通过凝血酶活化后的不同聚合进行区分。在一个优选的实施方案中，得到的纤维蛋白原是人纤维蛋白原或在每个纤维蛋白原链中包含最多10 个氨基酸突变的人纤维蛋白原。具体地，每个α、β和γ链可以独立地包含0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9或10个单独的氨基酸突变。使用人细胞进行制备，已经得到了优良的结果，所以优选地，在第一个方面的方法中使用的转染的细胞由人细胞组成，例如选自人细胞克隆或人细胞系。特别优选的细胞是 HEK细胞，诸如HEI^93t和HEK293ts细胞，它们可从下述地址得到HumanZyme，2201 West Campbell Park Drive Suite 24, Chicago, IL 60612, USA。从本发明的实施例显而易见，本发明的方法已经导致在一类细胞中从相同的链编码载体集合表达的2种重组人纤维蛋白原的分离。在本发明的第一个方面，由此优选地，所述方法能够将人纤维蛋白原分离成为至少2种翻译后修饰的形式，其中一种(冊)具有与血清纤维蛋白原类似的PAGE迁移模式和聚合特征，且其中另一种(F6)具有这样的PAGE迁移模式其具有与CHO细胞表达的纤维蛋白原类似的聚合特征，但是在泳带强度方面存在差异。F5和F6纤维蛋白原之间的其它区别特征是，还原的纤维蛋白原(即这样的纤维蛋白原，其中二硫键已经通过添加还原剂而去除)中的α链具有不同的性质在PAGE中，F6泳带是分离的且狭窄的，而F5泳带显得不太分离和更模糊(表明与F6相比，F5蛋白的带电荷基团具有更大的分子内变化)。还发现，由人细胞表达的重组纤维蛋白原F5与血浆-衍生的纤维蛋白原相比是真实类似的(authentic-like)，且比F6是更真实类似的，如在PAGE凝胶上所看到的(图4)， 且也比CHO细胞衍生出的纤维蛋白原是更真实类似的。但是，在PAGE凝胶上，重组纤维蛋白原F6也不同于CHO细胞衍生出的纤维蛋白原。与在纤维蛋白原F5上和在CHO衍生的纤维蛋白原上观察到的更宽的且更扩散的泳带相比，未还原形式的重组纤维蛋白原F6显示为更强的且更密集和分离的泳带。与纤维蛋白原F5和CHO细胞衍生出的纤维蛋白原相比，还原的纤维蛋白原F6中的α链也出现在相对更高的浓度。最后，在已经用凝血酶诱导(活化)以后的单个聚合模式表明，F5与F6和CHO细胞衍生出的纤维蛋白原相比是更真实类似的。所以，在人细胞中生产的重组人纤维蛋白原(且如在本发明中所述)似乎含有至少2种不同的纤维蛋白原翻译后(PT)物质。本文使用的“纤维蛋白原PT物质”表示蛋白的翻译后变体，其具有与另一种纤维蛋白原分子完全相同的氨基酸组成；所述2种物质仅在它们的分子方面存在差异，所述差异是由于翻译后修饰，诸如糖基化、脂质化、磷酸化等引起的。当收获时，鉴别出这至少2种不同的纤维蛋白原蛋白物质，且可以分离为单独的物质，例如通过采用本文所述的纯化方法。这可以实现纤维蛋白原的重组生产，分离不同的 PT物质，并随后提供含有平衡量的至少2种不同的PT物质的纤维蛋白原制品，从而实现具有特定的且可再现的聚合特征的人纤维蛋白原组合物的生产。因此，在本发明的第二个方面，提供了基本上纯的人纤维蛋白原制品，其不含有非-纤维蛋白原血清蛋白，且其中所述纤维蛋白原由下述物质组成a)F5纤维蛋白原，b)F6纤维蛋白原，或c) F5和F6纤维蛋白原的混合物。预见到，如在本文中示例的重组生产的纤维蛋白原的情况一样，这样的多-PT物质生产可以发生在其它转染的细胞中以及克隆的或转基因的动物中，使得从这样的转染的细胞得到的纤维蛋白原实际上是不同纤维蛋白原PT物质的组合物一这因此也是本发明的一个方面。或者，本发明提供了至少2种纤维蛋白原PT物质的混合物，其中不同的纤维蛋白原PT物质是从2个或更多个不同的细胞类型得到。F5和F6之间的差异不涉及上面讨论的与纤维蛋白原中的病理学遗传改变有关的异常病症，且看起来现有技术尚未预料到不同的纤维蛋白原翻译后形式分布在正常血浆中的可能性。但是，基于本发明的发现，可以想象到，这样的不同形式在本质上的确存在于血浆中，这意味着血浆携带着以前没有描述的纤维蛋白原异质性。在应用于血浆纤维蛋白原的纯化过程中，这些可能的血浆纤维蛋白原之一(诸如F6)可以或多或少地被灭活，或者所述PT纤维蛋白原物质之一可以对经常应用于血浆纤维蛋白原上的热灭活更敏感，以便灭活病原体。与本发明的第一个方面(其提供了人纤维蛋白原的生产，所述人纤维蛋白原在每个纤维蛋白原链中具有至多10个氨基酸变化)相一致，本发明的制品也包括这样的制品， 其中所述人纤维蛋白原在每个链中独立地具有至多10个氨基酸变化(即在每个α、β和 Y链中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单独的氨基酸变化)。所以，本发明的一部分也是这样的纤维蛋白原其包含至少一个含有氨基酸置换的纤维蛋白原链。例如，脯氨酸至丙氨酸置换，例如在β链的位置162处。在导致本发明的工作中制备的最初的重组纤维蛋白原含有在β链的位置162处的脯氨酸残基，而不是丙氨酸。当由独立的实验室进行测试时，发现形成的“最初”纤维蛋白原比用作对照的“内部黄金标准”(Calbiochem人血浆纤维蛋白原)明显更缓慢地聚合。 当该同一个实验室以后测试用β链(其中我们已经去除了在位置162处的脯氨酸，并放入丙氨酸，并在转染的HEK293t细胞中表达它)制备的第二种重组人纤维蛋白原时，发现该重组人纤维蛋白原(具有在β链中的位置162处替代脯氨酸的丙氨酸)表现出至少与“黄金标准” Calbiochem人血浆纤维蛋白原相同的聚合速度。但是，显然，Ββ链中的该变化可能不一定是导致产生F5和F6纤维蛋白原的唯一改变，在Ββ、Αα和Υ中的其它变化可能提供形成F5和F6纤维蛋白原、或重组的F5和F6纤维蛋白原的基础。但是，本发明的一个优选的纤维蛋白原包含在链的位置162中的非-脯氨酸， 诸如在该位置的L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、 L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、 L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。在从HEK细胞(如本文所证实的)至PER-C6细胞或其衍生物的人细胞中，可以制备重组的F5和F6人纤维蛋白原。而且，可以用Αα、Ββ和、纤维蛋白原基因转染任意合适的人干细胞或人前体细胞，所述基因单独地构建进启动子和载体系统中，或者所有3个基因在同一个启动子和载体系统中，其中3个单独基因中的任意其它变化构成纤维蛋白原基因。除了别的以夕卜，通过它们在PAGE凝胶中的行为，和通过它们的Aa、Ββ和γ链在还原条件下的特定模式，可以表征未还原的纤维蛋白原。特别值得注意的是，在F5和F6 重组人纤维蛋白原的Aa蛋白链中出现的差异。与CHO衍生的纤维蛋白原相比，Aa链在 PAGE凝胶上实际上也更强。测试了不同比例的α、β、Y，因为最初的研究揭示，β链可能是得到甚至一致地完整的纤维蛋白原的限制因素，而不是得到α-Υ “无活性的纤维蛋白原”(没有β链存在的证据)。因此，测试了比例1 1 1、1 2 1和1 5 1，从而提供可利用的β链的量相对于α和、链的变化。因此，在本发明中预见到，所述基因之一(即Aa基因)的分离，能够混合F5和F6 基因(或其表达产物)，并使用这样的相对混合物其中基因或表达产物的α、β、Y比例为2 1 1或其它比例，在Aa基因占优势的情况下，替代目前使用的比例1 1 1。在初步试验中，使用1 2 1或甚至更高的β基因优势，例如多达1 5 1(但是，最初的发现似乎表明这样的导向1 5 1对于HEK 细胞培养物而言是相对有毒性的)，β链似乎可以是限制因素，至少对于与重组纤维蛋白原的总产率有关的结果而言。 所以也在这里，α、β和Υ链之间的比例不同于1 1 1，其中β链的优势是优选的。 在两类情况下，当被诱导时，或甚至当与B β混合时和与、链蛋白混合时，得到的F5和F6 多肽可以强化或提供聚合。因而，当分部分或作为整个完整的纤维蛋白原分子提供F5和F6 纤维蛋白原时，是在本发明范围内的。本发明也涵盖了新的和改进的启动子和载体系统和新的HEK细胞系(来自伊利诺州芝加哥的HumanZyme Inc.的启动子和载体和HEK细胞系)用于生产F5和F6纤维蛋白原分子的应用。导致Ββ链的氨基酸序列中的氨基酸修正的Ββ基因可以参与优化纤维蛋白原组成，这在不同的条件下可能是最有用的，例如，当将非常可靠的纤维蛋白原用于系统地治疗具有不同的纤维蛋白原异常(诸如异常纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症)的患者时，以及作为严重出血性创伤患者(包括严重事故、灾难、战争和爆炸有关的情形)的必需治疗的可能的拯救生命的纤维蛋白原。购得用于制备重组纤维蛋白原的最初的人纤维蛋白原 α、β和γ基因，有关的登记号是ΝΜ_021871(对于Fb_Aa)、BC106760(对于Fb_B3)和BC021674(对于 ^_γ)。使用针对纤维蛋白原α、β、Y基因的PCR，测试了这些基因。当我们分析购得的BC106760fpr FB_B β基因时，它似乎具有在Ββ纤维蛋白原蛋白链的氨基酸位置162处的脯氨酸。我们然后将在该位置162处的脯氨酸改变成丙氨酸，以便制备人野生型纤维蛋白原。仍未完全确信，人纤维蛋白原β链是否在本质上具有在位置162处的脯氨酸或丙氨酸，但是从已经测试的最优的血浆纤维蛋白原标准(Calbiochem人血浆纤维蛋白原)的观点看，与目前的重组人纤维蛋白原相比，具有在位置162处的脯氨酸的重组人纤维蛋白原在该重组纤维蛋白原的对数更高的量表现出聚合，根据本发明，具有在β链的位置162处的丙氨酸的形式是非常优选的。但是，其它变体聚焦于β链的位置162处的氨基酸变化，预见到这会产生改良的聚合特性。因而，在β链的位置162处的任意非-脯氨酸L-氨基酸残基是与本发明有关的突变体或变体，具有这样的突变体/变体β链的纤维蛋白原也是如此。因而，在位置162 处的氨基酸选自例如L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。也预见到，且在本发明的范围内，F5重组纤维蛋白原、或更具体地F5哺乳动物重组纤维蛋白原、或甚至更具体地F5人重组纤维蛋白原，在很大程度上可以是通常收获的血浆纤维蛋白原之一，或者是占优势地收获的血浆纤维蛋白原之一，或者可能构成类似于F5 的主要血浆纤维蛋白原。因而，F6纤维蛋白原可以仍然存在于许多哺乳动物(包括人类) 中，但是血浆衍生的F5纤维蛋白原和血浆衍生的F6纤维蛋白原的相对浓度可能存在差异。 血浆纤维蛋白原的聚合曲线在很大程度上类似于在本发明中发现的F5重组人纤维蛋白原的聚合曲线。所以，如果预期F5和F6以混合物形式出现在血浆中，且所述血浆含有血浆F5 组分或分子的最高相对浓度，则聚合曲线会或可能倾向于接近纯化的和分离的F5重组人纤维蛋白原，参照本文报道的发现，即当以50 50的比例混合F5重组人纤维蛋白原和F6 重组纤维蛋白原时，聚合曲线倾向于相对更接近F5(与F6相比)。使用方法本发明的方法和本发明的制品提供了纤维蛋白原，其可以用于与血浆纤维蛋白原或其它现有技术水平的纤维蛋白原制品通常相关的相同场合。这些场合之一是，预防或治疗出血，特别是过量出血。根据本发明，将3个单独的纤维蛋白原编码基因例如转染进细胞(具体地且主要地，具有人起源的那些细胞)中，以便得到形成的特定纤维蛋白原(诸如F5和F6)的人糖基化模式，这些中的任何一个可能最适用于系统治疗，例如通过注射或输注到人或哺乳动物中。通过本发明的纤维蛋白原的施用和活化可以靶向的疾病或病症是通常使用纤维蛋白/纤维蛋白原进行治疗的那些不同情况导致的严重出血，所述情况包括特征在于改变的或降低的纤维蛋白原浓度或活性的医学病症，以及由外科手术或由事故/损伤引起的创伤。另外，纤维蛋白原的过度消耗也可能导致对外源施用的需求。而且，在移植应用中和对于表面(topical)应用而言，可以使用本发明的纤维蛋白原。例如，当制备用于治疗表面出血的重组纤维蛋白胶或重组组织密封剂时，例如在手术或其它干预过程中，本发明的纤维蛋白原是有用的。
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因此，在第三个方面，本发明提供了治疗或预防个体的出血的方法，所述方法包括施用有效量的本发明第二个方面的制品或通过构成本发明第一个方面的方法得到的纤维蛋白原。例如，其中施用纤维蛋白原可以有效地基本上维持或恢复断裂的/受损伤的脉管系统的凝血能力。在手术方法中、在急救场合或损害控制场合(诸如当给已经受到严重身体创伤的个体提供第一线治疗时，对于战斗士兵、事故或恐怖行为的受害者的情况也是如此)，或在纤维蛋白原的受体正在遭受或可能开始遭受过量出血的任意其它情形下，这可以具有实际用途。例如，当个体在所述治疗或预防之前遭受出血或易于出血时，所述出血由下述原因引起功能性纤维蛋白原的功能障碍或缺乏，损伤，过去的或将来的手术治疗(在预见到大量出血的情况下；一个实例是心脏手术，其中约5%，诸如心脏搭桥手术；或为了连接组织诸如血管、器官、脑组织，和连接桥连组织缺陷以修复所述缺陷)，产后出血，弥漫性血管内凝血(在患者的纤维蛋白原水平降低的情况下，所述降低是由于弥漫性凝固，导致纤维蛋白裂解产物的形成，它们生成在纤维蛋白内，且当血块溶解时会发生降解，和在需要用纤维蛋白原系统地治疗患者的情况下)，和器官移植(例如肝移植或其它器官移植，其中血浆纤维蛋白原会降低)。根据情况，可以系统地或局部地施用根据本发明的纤维蛋白原通常，当由上面指出的一般情况或病症导致个体具有自体纤维蛋白原的一般损失时，系统给药是优选的；而在更受控的场合，局部(local)或表面给药通常是优选的，在该情况下，纤维蛋白原经常与凝血酶或其类似物(后一个术语指示在将纤维蛋白原活化成纤维蛋白方面具有与凝血酶相同的生物活性的分子，凝血酶的类似物可以是例如人凝血酶突变体，诸如点突变形式或生物活性的凝血酶片段；也参照WO 2007/103447，其中提供了合适的凝血酶分子和它们的制备)一起施用。一个这样的“受控的场合”是这样的情况其中与纤维蛋白原一起施用凝血酶或其类似物，以便将器官或细胞粘合在一起，当对器官进行手术而普通手术连接不太有效时，就是这种情况(但是一般而言，在器官或各种脉管中，所述脉管诸如血管、泌尿道管、泌尿生殖管、肠和其它中空器官)。而且，与纤维蛋白原一起施用凝血酶或其类似物，以便在手术过程中，或在局部过量出血但是不需要或不可能系统施用纤维蛋白原的场合，实现止血。连接个体中的手术伤口的方法(其中施用纤维蛋白原，其任选地与凝血酶或其类似物相组合) 也是第三个方面的一部分。本发明也能够将细胞或组织移植给个体，所述方法包括给所述个体施用有效量的根据本发明第二个方面的制品或通过本发明第一个方面的方法得到的纤维蛋白原，其任选地与细胞和/或组织因子和/或凝血酶和/或凝血酶类似物的施用相组合。在这里，当必要时(例如当个体的身体不能在移植部位提供足够的凝血酶活性时)，基本上加入凝血酶。 当在特定类型的移植中是常规的时，提供组织因子和细胞当移植细胞以便再生组织时，已知局部组织生长因子的额外加入可能是适当的，结缔组织起源的细胞的加入也是如此，以便促进移植的结果。与此相关地，本发明也涉及将细胞(诸如干细胞或祖细胞或前体细胞)粘附到个体中的靶位置的方法，所述细胞会粘附在所述靶位置，以便适当地起功能，修复邻近的细胞和组织，所述方法包括施用根据本发明的纤维蛋白原，其任选地与凝血酶或凝血酶类似物的施用相组合，此外，在必要时，并根据本领域的常见应用，施用凝血酶/凝血酶类似物。本发明第三个方面的优选实施方案是这样的，其中所述个体是人类。从聚合观点看，F6重组纤维蛋白原优选地用于治疗患者，特别是严重受伤的那些患者，诸如在战斗中受伤的士兵，其中患者上的多个出血部位显示纤维蛋白原快速损失至凝血尝试几乎不可能的水平。由于我们发现F6会显示出非常良好的快速聚合，由于F6纤维蛋白原远远更稳定(不会像F5—样快地发生降解)的事实，这使得技术人员能够制备F6 纤维蛋白原(例如以干燥形式，诸如冷冻干燥形式)，其可以溶解于溶剂中直接带至创伤位置，例如，在战场上，且在F6已经溶解后，它可以容易地系统性输入，并由此升高纤维蛋白原水平，从而使否则会发生的过量出血最小化。除了上面讨论的创伤类型以外，已经证实，产后出血和心脏搭桥手术会造成过度的和危险的出血(例如，在心脏搭桥手术中，需要手术再次干预的由纤维蛋白原耗竭造成的术后出血是约5% )，所以也在这些场合中，本发明的第三个方面是适当的。在创伤中和在这些疾病有关的或手术后有关的出血中，最重要的是，获得纤维蛋白原诸如F6，与当前可获得的大部分纤维蛋白原产品相比，其表现出缓慢的蛋白降解。如果在大量出血时需要在15-30分钟内补偿2-3升，应当施用的传统纤维蛋白原的冷沉淀物单位的量在大多数情况下实际上是不可能的，因为必须最可能地输入15-25冷沉淀物单位。在这样的情况下，根据本发明的F6纤维蛋白原制品(其不含有无活性的成分或甚至反活性的药剂诸如纤连蛋白)会提供优良的替代品。最后，当进行细胞移植(自体移植、同种异体移植或异种移植)时，本发明的纤维蛋白原与人或哺乳动物凝血酶(诸如在WO 2007/103447中公开的野生型或M84A突变体的重组(人)哺乳动物凝血酶)的组合，是在本发明范围内，以促进这样的细胞的移植，例如， 当进行软骨修复、骨修复、心脏细胞修复或肌肉修复时。关于剂量，在系统给药的情况下，需要施用足以建立允许凝血的纤维蛋白原血清浓度的量，换而言之，要施用的量取决于治疗的病症的严重性；大量出血比小量出血需要更多的纤维蛋白原，等。优选地，施用的量足以重建被认为是在正常血清浓度内或以上的纤维蛋白原血清浓度。本发明的第四个方面涉及将细胞粘附到固体或半固体表面上的方法，其中使所述细胞和所述固体或半固体表面接触根据本发明第二个方面的制品，或接触通过本发明第一个方面的方法得到的纤维蛋白原。从上述内容可以理解，本发明涉及用作药物的本发明第二个方面的制品或通过本发明第一个方面的方法得到的纤维蛋白原。具体地，本发明涉及用于根据本发明第三个方面的方法中的本发明第二个方面的制品或通过本发明第一个方面的方法得到的纤维蛋白原。本发明的试剂盒本发明也能够提供试剂盒，其适用于实现本发明的第三个和第四个方面。例如，本发明涉及一种试剂盒，其在单独的容器或器皿中包含1)本发明第二个方面的制品或通过本发明第一个方面的方法得到的纤维蛋白原，和幻凝血酶或其类似物，以及任选的幻因子 XIII(参照下面)。特别优选地，试剂盒的每种(优选所有)蛋白组分中的至少一种以干燥形式提供在容器/器皿中，具体地以冷冻干燥形式，因为这会实现增加的稳定性、容易运输以及容易混合该组分和液体，以提供适用于注射或表面/局部给药的组合物。其它内容/用涂预见到，本发明的观察(即相同的纤维蛋白原编码基因导致多-PT物质纤维蛋白原的产生)也适用于其它动物纤维蛋白原。因此，克隆任意哺乳动物的纤维蛋白原编码基因到合适的表达载体中，随后转染合适的宿主细胞(优选与纤维蛋白原基因相同的物种起源)，并实现这些基因的表达，以得到至少2种纤维蛋白原PT物质，是在本发明范围内的。 同样地，克隆携带细胞克隆的动物(诸如哺乳动物)，所述细胞克隆也能够生产两种PT物质诸如F5和F6 (类似于人或几乎类似于人纤维蛋白原)，也是在本发明范围内。所以，无论是单独地还是成对地生产F5和F6纤维蛋白原，都视作本发明的一部分。基于本发明的发现预见到，也可以在诸如CHO细胞的细胞中生产至少两种纤维蛋白原PT物质(例如与重组纤维蛋白原F5和F6相对应)，尽管这样的多PT物质迄今为止尚未鉴别出来。实际上，根据本发明，通过仔细地检查PAGE凝胶，至少两种PT纤维蛋白原物质非常可能也存在于哺乳动物血浆(诸如人血浆)中。但是，直到现在，还不可能辨别和例如制备分离的F5和F6(或其它单独的PT物质)的制品。因而，利用本发明，首次可能制备这样的组合物其具有每种现有的PT纤维蛋白原物质的确定的相对浓度，适用于特定纤维蛋白原产品。在本发明中，我们主要聚焦于在HEK细胞(尤其是伊利诺州芝加哥的HumanZyme 许可的HEK293t和HEK293ts细胞)中生产F5和F6物质。但是，认为其它人细胞系可用于相同目的，诸如例如PER细胞，尤其是PER 6和PER C6细胞。根据本发明，已经证实，由HumanZyme许可的2个启动子和载体系统特别适用于转染人细胞和适用于表达纤维蛋白原(当使用人细胞系统时)；但是，本发明不限于使用这些启动子和载体系统，而是可以替换为本领域技术人员已知的其它可商业得到的或实验性的启动子和载体系统。血浆凝血酶或重组哺乳动物凝血酶，或更具体地，重组人凝血酶，例如具有凝血酶野生型序列或M84A突变体重组人凝血酶序列的重组人真实类似凝血酶(参照WO 2007/103447)，可以活化本发明的纤维蛋白原和纤维蛋白原混合物。FXIII也可以在纤维蛋白原当被凝血酶裂解时可能凝结的速率中起作用，但是，关于本发明的范围，当在重组人纤维蛋白原F5和/或F6上进行测试时，不考虑FXIII。另一方面，本发明人正在考虑，FXIII的可能的影响(包括与FXIII分子的可能的变化有关的影响)可能进一步帮助个体聚合和/或F5和F6纤维蛋白原的凝固作用。因此，根据本发明， 当将本发明付诸实践时，可以调节和考虑影响纤维蛋白原活化成纤维蛋白的其它因子和化学药剂的精确选择。但是，根据本发明，本发明的第三个和第四个方面的方法的所有实施方案可以与FXIII的施用相组合，以便提高施用的纤维蛋白原的效果。附图标记

图1显示了重组生产的纤维蛋白原的IMAC的洗脱曲线。2个蛋白峰各自含有从 HEK293t细胞制备的重组人纤维蛋白原。通过应用20mM L-精氨酸以及50mM精氨酸，洗脱 2个峰，分别产生F5和F6蛋白。图2显示了在肝素柱上的进一步分离，其中用TBS缓冲液洗脱来自图1中的蛋白峰的物质。
2A 在20mM L-精氨酸时在IMAC柱上得到的F5重组人纤维蛋白原级分，它的出现没有大拖尾。2B 在50mM L-精氨酸时在IMAC柱上得到的F6重组人纤维蛋白原级分，它出现一些蛋白拖尾。图3显示了在IMAC和肝素柱纯化以后，关于F5和F6蛋白进行的PAGE凝胶电泳的结果。显示了未还原的(标记为” _”)和还原的(标记为(”+”)蛋白的结果。观察到， 与F6相比，还原的F5的Aa泳带更宽，且稍微发散，且不太分离。在F5和F6中的还原的 Ββ和γ泳带实际上具有相同的强度。图4显示了纯化的纤维蛋白原的PAGE凝胶结果。在左侧的泳道编号1至4显示了在非还原条件中的纯化的纤维蛋白原，右侧PAGE 凝胶泳道编号1至4显示了还原的纤维蛋白原。泳道1未还原的凝胶显示了血浆纤维蛋白原(Sigma#F4883)，其具有更宽的泳带，类似于泳道4中的未还原的泳带(它是来自HEK细胞的F5重组人纤维蛋白原)，泳道2显示了来自CHO细胞的未还原的重组纤维蛋白原，即更宽的且更发散的泳带，其位置低于其它未还原的纤维蛋白原；泳道3显示了来自HEK细胞的未还原的F6重组人纤维蛋白原，其密集度高于该凝胶中的其它纤维蛋白原；泳道4显示了来自HEK细胞的未还原的F5重组人纤维蛋白原，如前述的，其类似于泳道1中的未还原的血浆纤维蛋白原。未还原的泳道5显示了 F6和F5的混合物，其中泳带更密集，这最可能是由于F6的影响。在还原的PAGE凝胶上，泳道1中的A α链在一定程度上类似于泳道4中的A α (F5 重组人纤维蛋白原)，比来自其它纤维蛋白原的其它A α链更发散和更弱。泳道1中的B β 和Y链类似于泳道4中的相同泳带。泳道2中来自CHO细胞的重组纤维蛋白原的Aa链比其它纤维蛋白原的Aa链更纤细和更弱；来自CHO细胞的重组纤维蛋白原的B β链的位置稍微低于其它纤维蛋白原的Ββ链。还原的泳道5显示了 F6和F5的混合物，其中Aa 泳带更密集，这最可能是由于F6的影响。图5显示了纤维蛋白原的聚合试验。以0. 2mg/ml的浓度，测试了纤维蛋白原，用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶 1 μ g/ml诱导聚合。显然，根据本发明在HEK细胞中制备的F5重组人纤维蛋白原显示出与血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)相同的聚合曲线，而根据本发明在HEK细胞中制备的F6重组人纤维蛋白原遵循在CHO细胞中制备的重组纤维蛋白原所显示出的聚合曲线。图6显示了纤维蛋白原的聚合试验。以0. 2mg/ml的浓度，测试了纤维蛋白原，用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶 1 μ g/ml诱导，并在这些条件下聚合。显然，F5重组人纤维蛋白原显示出与血浆纤维蛋白原 (Sigma F4883)基本上相同的聚合曲线，而F6重组人纤维蛋白原显示出与重组人纤维蛋白原F5相比和与血浆纤维蛋白原(F488;3)相比明显不同的聚合模式。当混合(50/50)F5和 F6时，与50/50混合物所预见到的相比，聚合曲线更接近F5。实施例前言以前已经描述了在下述实施例中用于制备纤维蛋白原基因的Aa、Ββ和、对的基因材料购得用于制备重组纤维蛋白原的起始人纤维蛋白原Αα、Ββ和、基因，GB
14登记号为:NM_021871 (Fb_A α ) ；BC106760 (Fb_B β )和 BC021674 (Fb_ Y )，例外是登录号 BC106760，具有在引物 5，-3，序列 SEQ ID NO 3 :GTGAATAGCAATATCC 处的 156 碱基对大小 (用于表达在位置号162处的脯氨酸)的Ββ链被改变为具有在引物5’-3’序列SEQ IDNO 4 :GTGAATAGGCAATATCG处的156碱基对大小(其编码在位置162处的丙氨酸)的B β编码链。如上所述，在目前可利用的基因材料中，尚未完全确立含有脯氨酸或含有丙氨酸的B β 是否是正确的野生型，但是，这2种不同的纤维蛋白原的最高活性形式最可能是真实的野生型——无论如何，最高活性形式是根据本发明的一种优选形式。形成的B β纤维蛋白原氨基酸序列显示为SEQ ID NO :2，而由BC106760最初编码的序列显示为SEQ ID NO :1ο实施例1 测试了构建进PHZsec载体-启动子系统(经HumanZyme许可)中的A α、B β禾口 Y纤维蛋白原基因对HEK 细胞(HumanZyme，并经HumanZyme许可)以及几种HEK细胞变体的转染。在大肠杆菌中扩增载体，得到多载体/基因库，随后转染进各个HEK细胞，并在含有血清的培养基中培养成单层细胞系。选择克隆，并单独地培养。选择生产纤维蛋白原 (具有在β链中的氨基酸位置162处的丙氨酸)的克隆。选择最佳生产细胞克隆，并用于适应无血清的培养基(HumanZyme，经HumanZyme许可)或无血清的、化学上确定的培养基 (HumanZyme,经HumanZyme许可)大约1周，以便适应细胞悬浮培养。在WO 2007/103447中使用和描述的以前使用的HEK293细胞系表现得不能转变成悬浮培养，而是继续结块或簇集在一起。选择另一个细胞系(来自HumanZyme的HEK293t 细胞系，经HumanZyme许可)细胞，且表现得能够适应悬浮培养，且经证实会生产重组人纤维蛋白原。该转化的细胞系因此继续进入悬浮培养，并分离出纤维蛋白原。令人惊奇地，在IMAC(固定化金属亲和色谱法)柱上纯化出2个不同的纤维蛋白原泳带，如图1所示。当在IMAC操作中加入20mM L-精氨酸时，出现一个含有重组人纤维蛋白原的显著蛋白峰；当在IMAC操作中将L-精氨酸浓度升高至50mM时，清楚地出现第二个显著的蛋白峰，其也含有重组人纤维蛋白原。已经发现，在它的聚合特征以及它在PAGE凝胶上的外观方面，在20mM L-精氨酸时出现的代表重组人纤维蛋白原的蛋白峰明显不同于在50mM L-精氨酸时出现的重组人纤维蛋白原；在20mM L-精氨酸时出现的纤维蛋白原被命名为“F5重组人纤维蛋白原”(或简称” F5”)。在50mM L-精氨酸时出现的也含有重组人纤维蛋白原的第二个蛋白峰，表现得在它的聚合和它的外观方面(在下述的研究中予以描述)明显不同于F5重组人纤维蛋白原。 出现在该第二个峰中的纤维蛋白原被命名为“F6重组人纤维蛋白原”或简称”F6”。实施例2合并含有显著的F5蛋白峰(如在实施例1和图1中所证实的)的级分，并上肝素柱，用TBS缓冲液洗脱。在肝素柱上进行的纯化如图2A所示。合并含有显著的F5蛋白峰(如在实施例1和图1中所证实的)的级分，并上肝素柱，用TBS缓冲液洗脱。在肝素柱上进行的纯化如图2B所示。实施例3
通过PAGE凝胶电泳，单个地测试纯化的F5和F6重组人纤维蛋白原，如图3所示。 结果表明，在凝胶上的未还原的F5重组人纤维蛋白原显示出比关于F6所观察到的泳带更宽的泳带，F6未还原的泳带显得更分离，且模糊性更低。当F5被还原时，"F5A α，，显得比“F6A α，，更发散，“F6A α，，显得更分离且相对浓度更高，而在“F5Bi3 “和”F6Bi3 ”之间，以及在“F5y “和”F6Y “泳带之间，存在更少的差
已实施例4使用PAGE凝胶电泳，进行了纤维蛋白原的下述对比。在图4左侧的泳道中，显示了未还原的纤维蛋白原蛋白，在右侧，显示了还原的纤维蛋白原蛋白。在左侧和右侧泳道1中，应用了未还原的和还原的血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)。在左侧和右侧泳道2中，显示了从CHO细胞制备的未还原的和还原的重组纤维蛋白原。在左侧和右侧泳道3中，显示了未还原的和还原的F6重组人纤维蛋白原，在左侧和右侧泳道4中，显示了未还原的和还原的F5重组人纤维蛋白原。结果表明，在未还原的泳道中，血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)类似于未还原的 F5重组人纤维蛋白原。将该令人感兴趣的观察结果与在实施例5中揭示的关于聚合的观察结果相对比。在泳道3中，来自HEK细胞的未还原的F6重组人纤维蛋白原不同于其它未还原的纤维蛋白原，因为泳带是狭窄的且分离的。泳道5是F6和F5重组人纤维蛋白原的 50/50混合物。未还原的泳道5显示了 F6和F5的混合物(50/50)，其中泳带更密集，这最可能是由于F6的影响(图4)。血浆纤维蛋白原的A α (在还原的泳道1中)和重组纤维蛋白原F5的还原的A α 链(在泳道4中)似乎没有表现出任何显著的差异，尽管仔细检查凝胶确实表明，还原的泳道1含有2个分开的A α泳带(一个是发散的，一个是在该发散泳带上面紧邻处更清楚的)，而还原的泳道4仅含有1个模糊的泳带；这可能暗示，血浆纤维蛋白原实际上含有2 种不同的Aa物质。血浆纤维蛋白原的还原的Ββ链类似于F5重组人纤维蛋白原的还原的Ββ链，而且血浆纤维蛋白原的还原的Y链也在一定程度上类似于F5重组人纤维蛋白原的还原的Y链。与其它未还原的纤维蛋白原中的任一种相比，来自CHO细胞的未还原的重组纤维蛋白原在泳道2中的位置明显更低，且相对更发散和更宽。这最可能是由于下述事实，即 CHO细胞是仓鼠衍生出的细胞，与在人细胞中制备的重组人纤维蛋白原相比，其提供不同的糖基化模式——糖基化模式由转染的细胞的性质决定，而不是由转染到细胞中的基因决定，或换而言之，不是由插入特定细胞中的基因决定，而是由翻译后修饰(PTM)决定。因此， 宿主细胞的选择可以在它们的物理和化学性质方面(例如，MW、P〗、折叠、稳定性和生物活性)改变所得到的加工过的和分泌的糖蛋白。也认识到，磷酸化由翻译后修饰决定。还原的泳道3显示了来自HEK细胞的F6重组人纤维蛋白原，与在任意其它纤维蛋白原中所观察到的结果相比，其显示出明显更强的和更密集的Aa泳带(图4)。当观察还原的泳道3(F6)时，令人感兴趣的是，与来自其它纤维蛋白原的还原的 Aa链相比，来自人细胞的重组人纤维蛋白原的还原的Aa链是非常纤细且密集的泳带。结果还表明，来自CHO细胞的重组纤维蛋白原的还原的Ββ和γ链的位置低于其它纤维蛋白原的还原的Ββ和γ链。所以，基于在非还原条件下和在还原条件下泳带的位置，所述重组纤维蛋白原是不同的。代表来自人细胞的未还原的F6重组人纤维蛋白原的泳道4不同于其它未还原的纤维蛋白原，因为如前所述的，与其它未还原的纤维蛋白原相比，Aa泳带是更密集的且更不发散。还原的泳道5显示了 F6和F5的混合物，其中A α泳带更密集，这最可能是由于F6的影响(图4)。实施例5将血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)的聚合与来自CHO细胞的重组纤维蛋白原、F5 重组人纤维蛋白原和F6重组人纤维蛋白原(后二者根据本发明在转染的HEK细胞中制备) 的聚合进行了对比。在该试验中，以0. 2mg/mL的浓度，加入纤维蛋白原，并用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶1 μ g/ml诱导。该研究证实，F5重组人纤维蛋白原显示出与血浆纤维蛋白原基本上相同的聚合曲线，而F6重组人纤维蛋白原显示出不同的聚合曲线。F6聚合曲线在某种程度上类似于来自 CHO的重组纤维蛋白原所显示的聚合曲线，参照图5。实施例6将血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)的聚合与重组人纤维蛋白原F5、重组人纤维蛋白原F6、以及F5重组人纤维蛋白原和F6重组人纤维蛋白原的50/50混合物的聚合进行了对比。在该试验中，以0. 2mg/mL的浓度，加入纤维蛋白原，并用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶1 μ g/ml诱导。结果再次表明，重组人纤维蛋白原F5显示出与血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)相同水平的聚合曲线。重组人纤维蛋白原F6再次显得明显不同于重组人纤维蛋白原F5和血浆纤维蛋白原(Sigma F4883)。当检查在这些条件下的聚合开始时，测试的所有纤维蛋白原似乎大致同时聚合， 具有微小的非显著的差异。当以50/50混合F5和F6时，预期聚合会表现出几乎在F5和F6 水平之间的曲线，但是相反，令人惊讶地证实，F5/F6混合物远远更接近F5和血浆纤维蛋白原。该发现表明这样的导向，即使在可能的血浆纤维蛋白原F5和可能的血浆纤维蛋白原F6的理论混合物中，聚合特征可能由纤维蛋白原F5(而不是F6)控制，这可以反驳F6 可能在血浆中退化(由于纤维蛋白原F6的稳定性更低)，还反驳在F6的血浆纤维蛋白原的热处理过程中可能被灭活，这是由于下述事实，即在整个测试之前和过程中，两种重组人纤维蛋白原F5和F6保持在相同条件下。实际上，在聚合试验之前，在-80°C保存重组纤维蛋白原F5和F6。
权利要求
1.一种用于制备纤维蛋白原的方法，所述方法包括提供用编码单个纤维蛋白原链的表达载体转染的细胞，随后在便于所述细胞生产纤维蛋白原的条件下，培养所述细胞，随后回收所述纤维蛋白原，并分离以至少2种翻译后修饰的物质存在的所述纤维蛋白原，所述至少2种翻译后修饰的物质通过在PAGE凝胶中的不同迁移模式进行区分，和/或通过凝血酶活化后的不同聚合进行区分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原或在每个纤维蛋白原链中包含至多10个氨基酸突变的人纤维蛋白原。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述转染的细胞由选自人细胞克隆或人细胞系的人细胞组成。
4.根据权利要求4所述的方法，其中所述转染的细胞是HEK细胞，诸如HEK293t和 HEK293ts 细胞。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述人纤维蛋白原分离成为至少2种翻译后修饰的形式，其中一种(冊)具有与血清纤维蛋白原类似的PAGE迁移模式和聚合特征，且其中另一种(F6)具有泳带强度不同的PAGE迁移模式但具有与CHO细胞表达的纤维蛋白原类似的聚合特征。
6.一种基本上纯的人纤维蛋白原制品，其不含有非-纤维蛋白原血清蛋白，且其中所述纤维蛋白原由下述物质组成a)F5纤维蛋白原，b)F6纤维蛋白原，或c)F5和F6纤维蛋白原的混合物。
7.根据权利要求6所述的基本上纯的制品，其中所述纤维蛋白原是天然的人纤维蛋白原或在每个纤维蛋白原链中包含至多10个氨基酸突变的人纤维蛋白原。
8.根据权利要求7所述的基本上纯的制品，其中所述人纤维蛋白原包含非脯氨酸作为 β -链中的氨基酸残基162，诸如丙氨酸残基。
9.一种治疗或预防个体中的出血的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原。
10.根据权利要求9所述的方法，其中施用所述根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原有效地基本上维持或恢复断裂的/受损伤的脉管系统的凝血能力。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中在所述治疗或预防之前，所述个体遭受出血或易于出血，所述出血由下述原因引起功能性纤维蛋白原的功能障碍或缺乏，损伤，过去的或将来的手术治疗，产后出血，弥漫性血管内凝血，和器官移植。
12.根据权利要求11所述的方法，其中系统地施用有效量的根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原。
13.根据权利要求11所述的方法，其中表面地或局部地施用有效量的根据权利要求 6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原，其任选地与凝血酶或其类似物相组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中施用所述制品或纤维蛋白原、凝血酶或其类似物，从而将器官或细胞粘合在一起。
15.根据权利要求13所述的方法，其中施用所述制品或纤维蛋白原、凝血酶或其类似物，从而实现止血。
16.一种将细胞或组织移植给个体的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原，其任选地与细胞和/或组织因子和/或凝血酶和/或凝血酶类似物的施用相组合O
17.一种将诸如干细胞或祖细胞或前体细胞的细胞粘附到个体中的靶位置的方法，所述细胞会粘附在所述靶位置，以便适当地行使功能，修复邻近的细胞和组织，所述方法包括给所述个体施用有效量的根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5 中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原，其任选地与凝血酶或凝血酶类似物的施用相组合O
18.一种连接个体中的手术伤口的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方 法得到的纤维蛋白原，其任选地与凝血酶或其类似物相组合。
19.根据权利要求9-18中任一项所述的方法，其中所述个体是人类。
20.一种将细胞粘附到固体或半固体表面上的方法，其中使所述细胞和所述固体或半固体表面接触根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原。
21.—种试剂盒，其在单独的容器或器皿中包含1)根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原，和2、凝血酶或其类似物，以及任选的3)因子XIII。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中1)根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原和/或2、凝血酶或其类似物和 /或幻因子XIII是干燥形式，诸如冷冻干燥形式。
23.根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原，其用作药物。
24.根据权利要求6-8中任一项所述的制品或通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的纤维蛋白原，其用在根据权利要求9-19中任一项所述的方法中。
全文摘要
本发明提供了纤维蛋白原(尤其是人纤维蛋白原)的新颖的翻译后修饰的变体，用于生产和分离所述变体的方法，以及使用所述变体的方法，尤其是用于系统地和局部地/表面地治疗和预防过量出血。
文档编号A61K31/405GK102481346SQ201080026316
公开日2012年5月30日 申请日期2010年4月13日 优先权日2009年4月14日
发明者库尔特·奥斯特 申请人:胡玛基因公司