专利名称：显示出缩短的生物学活性的神经毒素的制作方法
显示出缩短的生物学活性的神经毒素本发明涉及制药领域。具体地，预期编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示出生物学效应减少的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，由此编码的多肽，和特异性地与所述多肽结合的抗体。此外，本发明涉及包含所述多核苷酸和多肽的药物以及该药物特定的治疗应用。 此外，本发明预期用于所述多肽和药物生产的方法。肉毒杆菌和破伤风梭菌产生高效的神经毒素，即分别为肉毒毒素(BoNTs)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNTs)与神经元细胞特异性地结合并且干扰神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限蛋白酶解(切割)。活性的神经毒素由两条链组成，它们是通过二硫键连接的约50kDa的N端轻链和约IOOkDa的重链。CNTs由三个结构域组成，即催化轻链，包括易位结构域(N端的一半)的重链和受体结合结构域(C端的一半)，见Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188,39 ；Krieglsteinl991, Eur J Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒杆菌神经毒素以分子复合体形式合成，其包含150kDa 的神经毒素蛋白和相关的无毒性的复合蛋白。基于梭菌菌株和不同的神经毒素血清型，复合体的大小在300kDa至900kDa的范围内变化。在这些复合体中的复合蛋白稳定神经毒素并且保护其免于降解，见 Chen 1998，Infect Immun 66(6) :2420_2425。肉毒杆菌分泌七种抗原性不同的血清型，其被称作肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的 A至G型。全部血清型和破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)是Si2+内切蛋白酶，所述Si2+内切蛋白酶通过裂解SNARE蛋白封闭突触的胞吐作用，见Couesnon，2006， Microbiology, 152，759。CNTs在肉毒中毒中引起可见的弛缓性肌肉麻痹，见Fischer 2007，PNAS 104,10447。尽管它具有毒性作用，肉毒杆菌毒素已经用于很多疾病或病症的治疗剂。在1989 年肉毒杆菌毒素血清型A在美国被批准用于人的斜视、睑痉挛和其他的病症的治疗。它可作为肉毒杆菌毒素A蛋白复合体通过商业途径得到，例如以商品名BOTOX (Al lergan Inc) 或者商品名DYSP0RT(Ipsen Ltd)获得。为了治疗应用，直接将复合体注射入待治疗的肌肉中。在生理PH下，毒素从蛋白复合体中释放出来，并且产生了所期望的药理学效应。一种改进的非复合体的神经毒素A多肽制剂以商品名XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得。肉毒杆菌毒素的效应只是暂时的，这是需要肉毒杆菌毒素的重复施用以维持治疗效果的原因。梭菌神经毒素减弱随意肌强度并且是斜视、包括颈肌张力障碍的灶性张力障碍， 以及良性自发性睑痉挛的有效的治疗剂。已经进一步地显示梭菌神经毒素减轻单侧面部痉挛和局限性痉挛，并且，此外，其对多种其他的适应症如胃肠病症、多汗以及美容除皱是有效的，见 Jost 2007, Drugs 67，669。然而，对于医学状况或疾病如伤口愈合、骨的固定和腱断裂治疗、外科手术后固定，特别用于痔切除术、牙植入物的引入或者髋关节置换术(内假体)、膝关节形成术、眼科手术、痤疮或者易激肠疾病，减弱肌肉强度和收缩也是所希望的。神经毒素通常在一段时间内显示它们的生物学效应，所述一段时间比所述疾病或状况的有效治疗实际需要的时间长。然而，在所述医学状况或疾病的治疗中延长的肌肉麻痹是有害的或者至少不是优选的。 然而，只在所希望的时间段内显示它们的生物学效应的神经毒素还不能得到。因此，本发明的技术问题可以看作是提供满足前述需要的手段和方法。通过权利要求和下文表征的实施方案解决了该技术问题。因此，本发明涉及编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示生物学效应减少的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号。本文使用的术语“多核苷酸”指的是单链或双链DNA分子以及RNA分子。所述术语包括基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及这些分子种类所有的天然出现的或者人工修饰的衍生物。一方面，该多核苷酸可以是线性或者环形分子。此外，除了编码前述神经毒素多肽的核酸序列，本发明的多核苷酸可以包含正确的转录和/或翻译需要的其他的序列， 如5'或3' UTR序列。本发明的多核苷酸编码经修饰的神经毒素多肽，所述神经毒素多肽来源于肉毒杆菌神经毒素的抗原性不同的血清型之一，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/CU BoNT/ D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或者破伤风神经毒素(TeNT)。在本发明的一方面，所述多核苷酸包含在 SEQ ID NO 1 (BoNT/A)、SEQ ID NO 3 (BoNT/B)、SEQ ID NO :5(BoNT/Cl)、SEQ ID NO :7(BoNT/D)、SEQ ID NO :9 (BoNT/E)、SEQ ID NO : 11 (BoNT/F)、SEQ ID NO 13 (BoNT/G)或者SEQ ID NO 15 (TeNT)中所示的核酸序列。此外，在一方面包括多核苷酸序列，其包含核酸序列，所述核酸序列编码显示为SEQ ID NO 2 (BoNT/A)、SEQ ID NO 4 (BoNT/B)、SEQ ID NO 6 (BoNT/Cl)、SEQ ID NO 8 (BoNT/D)、SEQ ID NO 10 (BoNT/E)、SEQ ID NO :12 (BoNT/F)、 SEQ ID NO 14(BoNT/G)或SEQ ID NO 16 (TeNT)中的任一个的氨基酸序列。另一方面，所述多核苷酸是前述多核苷酸的变体，其包含一个或者多个核苷酸取代、缺失和/或添加，在另一方面该变体仍可导致其编码的氨基酸具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添力口。此外，在另一方面，本发明的变体多核苷酸包含核酸序列变体，其与SEQ ID NOs :1,3, 5、7、9、11、13或者15的任一个中所示的核酸序列有至少40%，至少50%，至少60%，至少 70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或者至少99%的同一性，或者这样的核酸序列变体，该核酸序列变体编码的氨基酸序列与SEQ ID NOs :2,4,6, 8，10，12，14，或者16中的任一个显示的氨基酸序列有至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或者至少99% 的同一性。此处使用的术语“同一性”指的是序列同一性，其如下表征确定两种核酸序列或者氨基酸序列之间相同的氨基酸数目，其中所述序列被比对以取得最高阶匹配。使用计算机程序中编码的公开的技术或方法例如BLASTP，BLASTN或FASTA(Altschul 1990，J Mol Biol215，40;3)可以计算序列同一性。一方面，在完整氨基酸序列上计算百分比同一性值。技术人员可得到用于比较不同序列的基于多种算法的一系列程序。在本上下文中， Needleman和^msch或者Smith和Waterman的算法提供特别可信的结果。可以使用程序 PileUp (Higgins 1989，CABI0S5，151)或者程序 Gap 和 BestFit (Needleman 1970，J Mol Biol 48 ；443 ；Smith 1981, Adv Appl Math 2,482)进行序列比对，所述程序是GCG软件包 (Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 的一部分。在本发明的另一方面，在完整序列区使用程序GAP确定上文所述的序列同一性值(以百分比(％ )表示)，使用以下设定空位权重50，长度权重3，平均匹配10. 000和平均错配0. 000，除非另外特别指出，该设定将一直用作序列比对的标准设定。一方面，每个前述变体多核苷酸编码保留各自神经毒素多肽的一种或者多种或者全部生物学性质的多肽，所述各自神经毒素多肽即BoNT/A，BoNT/B，BoNT/Cl，BoNT/D，BoNT/ Ε, BoNT/F, BoNT/G或者破伤风神经毒素(TeNT)。尽管可以想到未加工的前体可以行使一些生物功能或者有部分活性，本领域技术人员将理解其只有在蛋白水解激活后才能保持全部生物学活性。此处使用的“生物学活性”指的是(a)受体结合，(b)内化，(c)穿过内体膜进入胞质的易位，和/或(d)涉及突触囊泡膜融合的蛋白质的内切蛋白酶解切割。用于评估生物学活性的体内测定包括Pearce等人(Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128 :69-77)和 Dressier 等人(Dressier 2005,Mov Disord 20 1617-1619,Keller 2006， Neuroscience 139:629-637)描述的小鼠LD50测定和离体小鼠半隔膜测定。生物学活性通常用小鼠单位(MU)表示。此处使用的IMU是经腹膜内注射后杀死50%的特定小鼠群体的神经毒素组分的量，即小鼠i. P. LD50。另一方面，变体多核苷酸可以编码具有改进的或者改变的生物学性质的神经毒素，如它们可以包含切割位点，其改进酶的识别或者可以改进受体的结合或者上文提到的任何其他性质。此外，一方面包括融合多肽，其进一步地包含可检测的标记肽或者标记。一方面， 适合的标记是FLAG-标记，Myc-标记或者His-标记，所述标记也允许带标记的多肽的更有效的纯化。一方面，可检测的标记肽包括荧光蛋白如GFP，BFP等等。另一方面，变体多核苷酸应该编码融合神经毒素多肽，其包含不同血清型的至少两种神经毒素多肽的一部分，例如包含BoNT/A的重链和BoNT/E的轻链的融合神经毒素。本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽在它的轻链上进一步地包含至少一个降解信号。在本发明的一个方面，本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽的所述轻链通过轻链的修饰得到，被修饰的轻链由包含前述特定的核酸序列或者上文描述的它们的变体中的任一个的多核苷酸编码。前体多肽(单链多肽)的蛋白水解切割产生神经毒素多肽的轻链。 该轻链是前体多肽的N端部分，所述N端部分由蛋白水解切割得到。一方面，可以从下表指出的切割位点推导上文涉及的神经毒素多肽轻链的氨基酸序列。
权利要求
1.编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示出生物学效应缩短的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述生物学效应在受试者中引起肌肉麻痹。
3.权利要求1和2的多核苷酸，其中所述缩短的持续时间持续少于4、3或者2周。
4.权利要求1至3任一项的多核苷酸，其中所述降解信号选自a)至少一个内部或末端引入的PEST基序；b)至少一个内部或末端引入的E3连接酶识别基序；c)N-端寡赖氨酸残基；d)N-端连接的泛素；e)N-端脯氨酸用碱性氨基酸取代；f)表面展示的氨基酸残基用赖氨酸取代；并且g)N-端脯氨酸用碱性氨基酸取代与表面展示的氨基酸残基用赖氨酸取代相组合。
5.权利要求1至4任一项的多核苷酸，其中所述多肽的所述轻链通过修饰包含核酸序列的多核苷酸编码的轻链得到，所述核酸序列选自a)具有SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13或者15中显示的核苷酸序列的核酸序列；b)编码具有SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14或者16中显示的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和c)与a)或b)的核酸序列有至少40%同一性的核酸序列。
6.载体，其包含权利要求1至5任一项的多核苷酸。
7.宿主细胞，其包含权利要求1至5任一项的多核苷酸或者权利要求6的载体。
8.权利要求7的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞或者梭菌属或者芽孢杆菌属细胞。
9.权利要求1至5任一项的多核苷酸编码的多肽。
10.抗体，其与权利要求9的多肽特异性结合。
11.根据权利要求1至5任一项的多核苷酸，其用作药物。
12.根据权利要求9的多肽，其用作药物。
13.权利要求1至5任一项的多核苷酸或者权利要求9的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗伤口愈合、骨的固定和腱断裂治疗、外科手术后固定，特别用于痔切除术、 牙移植物的引入或者髋关节置换术(内假体)、膝关节置换术、眼科手术、痤疮或者易激肠疾病。
14.制备权利要求1至5任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽的方法，其包括以下步骤a)在允许权利要求1至5任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽表达的条件下培养权利要求7的宿主细胞，并且b)从a)的细菌培养物中得到权利要求1至5任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽。
15.制备药物的方法，其包括权利要求14的方法的步骤和将权利要求1至5任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽配制为药物的进一步步骤。
全文摘要
本发明涉及制药领域。具体地，预期编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示出生物学效应减少的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，由此编码的多肽，和特异性地与所述多肽结合的抗体。此外，本发明涉及包含所述多核苷酸和多肽的药物以及该药物特定的治疗应用。此外，本发明预期用于所述多肽和药物生产的方法。
文档编号A61K38/48GK102471765SQ201080027593
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月2日
发明者F·霍夫曼, J·弗雷韦特 申请人:莫茨制药有限及两合公司