治疗和预防整合素αvβ5相关疾病的方法及组合物的制作方法

专利名称：治疗和预防整合素αvβ5相关疾病的方法及组合物的制作方法
治疗和预防整合素α νβ 5相关疾病的方法及组合物相关申请的交叉引用本申请要求于2009年7月M日提交的，美国临时申请号61/2 ，416的优先权， 其通过全文引用并入于此。由联邦政府资助的研究和研发作出的发明的权利声明该项工作由NIH Ro 1 HL083950 “整合素α ν β 5对血管通透性的调节”项目部分支持。政府对本发明享有某些权利。
背景技术：
败血综合征是由传染性微生物和宿主免疫、炎症和凝血应答之间复杂的相互作用引起的放大的炎症级联所导致的结果(Hotchkiss和Karl (2003) N Engl J Med 348:138)。 败血症期间升高的炎症激动剂，包括TNF-α和凝血酶，增加了内皮单层通透性。全身血管通透性增加导致体液和溶质向血管外区再分配，形成低血容量、血液浓缩和止血。每年被诊断为败血症的病例超过650，000例，其中死亡率为20% _50%，使败血症成为非冠心病重症监护病房中住院患者最常见的死因。尽管人们普遍接受宿主应答(包括多种细胞类型、炎症介质和凝血因子)决定了败血症相关的死亡率，但临床试验基本上未能确认有效的治疗靶点。人们对败血症的发展和维持的分子机制仍然知之甚少，针对这些严重疾病综合征的有效药物靶标尚未确定。如上所述，败血症的特点是，作为对放大的炎症级联的应答，血管通透性增力口。溶质通过细胞旁路途径或通过受体介导的转胞吞作用穿过内皮屏障(Michel (1992) Am Rev Respir Dis 146 :S32 ；Renkin(1985)J Appl Physiol 58:315)。目前普遍的共识是，细胞旁路途径是在引起急性炎症疾病状态观察到的血管通透性增加的主要原因 (Groeneveld (2002) Vascul Pharmacol 39 247 ；Bernard^ (1994)Am J Respir Crit Care Med 149:818)。一个经常引用的模型表明，细胞骨架、粘附细胞-细胞和细胞-基质的力之间的不平衡竞争导致细胞旁间隙形成。在该模型中，细胞骨架丝状(F)-肌动蛋白聚合成形态不同的应力纤维，其传递细胞连接和粘着斑之间肌动球蛋白产生的张力。粘着斑(Focal adhesions, FA)为大量大分子的集合，它将肌动蛋白细胞骨架连接到细胞外基质(ECM)，并将信号蛋白定位到整合素结合和聚集的位点。本发明公开了整合素ανβ5和α νβ 3作为重要的应答炎症激动剂的内皮屏障功能的调节剂。令人惊讶的是，这些密切相关的整合素支持相反的细胞机制，形成了通透性诱导的(α νβ 5和肌动蛋白应力纤维)和屏障加强的(α νβ 3和皮层肌动蛋白)细胞骨架结构的不同机构。我们在这里报告了整合素ανβ5和α νβ 3在败血症的血管通透性调节中发挥着出乎预料的不同作用。发明概述本发明提供用于治疗或预防整合素α νβ 5相关疾病如败血症的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供治疗、逆转或预防哺乳动物个体(例如，灵长类如人类、猴子或黑猩猩，犬科、猫科或家畜动物，如马、牛或羊)中败血症的方法。向所述个体给药治疗量或预防量的整合素α νβ 5的拮抗剂。在一些实施方案中，拮抗剂为抑制整合素α νβ 5活性或表达的制剂。在一些实施方案中，所述制剂选自α νβ 5特异性抗体、整合素α νβ 5的小分子抑制剂或整合素α νβ 5 的多核苷酸抑制剂，如反义分子。在一些实施方案中，所述制剂不抑制ανβ3、β3、ανβ6、 β6、ανβ8或β8中至少一种的活性或表达。在一些实施方案中，所述拮抗剂为抗体或抗体片段，例如，嵌合抗体或人源化抗体、scFv、Fab或(Fab' )2。在一些实施方案中，所述抗体不显著结合整合素α νβ 3或阻断配体结合整合素ανβ3。在一些实施方案中，所述抗体不显著结合ανβ3、β3、ανβ6、 β6、α νβ8或β 8中的至少一种。在一些实施方案中，所述抗体不显著结合α νβ3、β3、 ανβ6、β6、ανβ8 或 β8。在一些实施方案中，所述抗体与ALULA (所述抗体由ATCC保藏号ΡΤΑ-5817的杂交瘤细胞产生)特异性竞争以特异性结合整合素ανβ5。在一些实施方案中，所述抗体与整合素α ν β 5的相同表位结合作为ALULA。在一些实施方案中，所述抗体来自ALULA的⑶R 区、且具有基本上相似的⑶R氨基酸序列(例如，与ALULA的⑶R区一致性为90、95、97、98、 99或100 % )。在一些实施方案中，所述抗体包括与ALULA的V区氨基酸序列基本上相似的V 区(例如，与ALULA V区的一致性为90、95、96、97、98、99或100% )。所述抗体可以为ALULA 本身，人源化ALULA，嵌合ALULA，ALULA片段，包括例如ALULA的scFv、Fab和(Fab ‘ ) 2，或其它与ALULA竞争结合整合素α ν β 5的抗体。在一些实施方案中，所述方法包括给药含有整合素α νβ 5特异性抗体的药物组合物，且不给药结合整合素α νβ 3的抗体或拮抗剂。本发明的方法对于治疗罹患败血症或具有败血症发病风险的个体是有用的。给药可以为静脉或腹膜内注射，但不限于此。给药可以为单药治疗或典型的做法是结合其它疗法，旨在预防或治疗败血症相关的并发症，如静脉输液、加压剂、手术介入、抗生素、活化的蛋白C、胰岛素、GM-CSF、TGF-i3信号通路抑制剂、β _2激动剂、利尿剂、整合素α νβ 5的拮抗剂、特异性结合整合素α νβ 5的二抗、整合素α νβ 6的拮抗剂、血管收缩剂和肌肉收缩药物(如苯肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、多巴酚丁胺)。本发明的进一步实施方案提供确定治疗败血症的制剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使多种制剂与整合素α νβ 5接触，选择与配体竞争结合整合素α νβ 5的制剂，并确定所选制剂对败血症的效果。在一些实施方案中，所述方法包括使多种制剂与整合素α ν β 5接触，选择与ALULA竞争结合α ν β 5的制剂，并确定所选制剂对败血症剂的效果。在一些实施方案中，所述方法进一步包括排除与α νβ 3结合的制剂的步骤。在一些实施方案中，所述抗体不显著结合ανβ3、β 3、ανβ6、β 6、ανβ8或β8。对败血症有疗效的制剂被确定为治疗败血症的制剂。所述多种制剂可以为多种抗体。所述配体可以为抗体，包括ALULA，或可以为玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、腱生蛋白c和腺病毒五邻体基底 (adenovirus penton base)0通过以下详细的描述进一步说明本发明的这些和其它实施方案。


图IA 人肺动脉内皮细胞(HPAEC)中激动剂诱导的通透性可通过α νβ 5的抗体抑制进行削弱，并通过α νβ 3的抗体抑制进行增强。在Tmnswells 中将血清饥饿的 HPAEC单层融合细胞用ανβ3禾口 ανβ5抗体(抗α ν β 3禾口 α ν β 5 Ab) (10 μ g/ml)或对照(10 μ g/ml)抗体(Ab)孵育 lh，然后用 VEGF (30ng/ml)、TGF-β (10ng/ml)或凝血酶(IOU/ ml)刺激。跨内皮细胞渗漏(transendothelial leak)是通过将C14-白蛋白示踪剂施加于上室(apical well)，Ih后收集和闪烁计数(每分钟计数)(CPM)下室(basolateral well) 含量。数据显示为平均值+/_标准误差，η = 3。图1Β:ανβ3和ανβ5共定位于粘着斑。HPAEC的单层融合细胞被固定、渗透，并用ανβ3和ανβ5特异性抗体染色(然后进行Alex 488标记的和罗丹明标记的二抗)。 将整合素ανβ3和ανβ5分别伪彩色处理(pseudocolor)成绿色和红色，用Image Pro 软件合并。图IC和D :ανβ5优选支持凝血酶诱导的应力纤维的形成，ανβ3优选支持SlP诱导的皮层肌动蛋白的形成。HPAEC的单层融合细胞用同种对照(对照抗体 (Control Ab))、α ν β 3 或 α ν β 5 抗体(10 μ g/ml)预处理 lh，然后用凝血酶(10U/ml， 10分钟)或SlP(0.5yM，10分钟)刺激。然后固定、渗透细胞，并用罗丹明鬼笔环肽 (rhodamine-phalloidin)染色。图IE : α Vβ 3阻断克服了对凝血酶诱导的通透性的SlP保护。在Transwells 中将血清饥饿的HPAEC单层融合细胞用α νβ 3或同种对照抗体(10 μ g/ml)和/或 SlP (0.5 μ M)孵育lh，然后用凝血酶刺激。通过将C14-白蛋白示踪剂施加于上室(apical well)，Ih后收集和闪烁计数(每分钟计数)(CPM)下室(basolateral well)含量来测定跨内皮细胞渗漏(transendothelial leak)。数据显示为平均值+/_标准误差，η = 3。图2 β 3基因敲除(k. ο.)小鼠在LPS诱导的ALI模型中肺水肿的形成增加。将含 50 μ g LPS的50 μ 1水vs. 50 μ 1水载体对照，或10mg/kgvs.等体积水对照经气管内(A)， 或10mg/kg腹膜内注射(i. p.) (B)，对体重和性别匹配的β 3基因敲除小鼠和野生型小鼠给药。给药LPS或水5天后，在进行肺灌注和摘取整块肺之前池，球后静脉(retroorbitally) 注射伊文思蓝(Evans blue)染料。用甲酰胺提取血管外的伊文思蓝，并通过分光光度法 (560nm)测定。测得的外渗伊文思蓝为分光光度单位/总肺干重(g—1)。数据显示为平均值 +/_标准误差，η = 10。图3Α 与野生型对照相比，β 3基因敲除小鼠在腹膜内注射LPS-诱导的败血症模型中死亡率增加。通过腹膜内注射对体重和性别匹配的β3基因敲除小鼠和野生型对照小鼠给药LPS 10mg/kgo对数据进行Kaplan-Meier生存分析，Iogrank检验组间差异，ρ = 0.0044。图:3B 腹膜内注射LPS (10mg/kg)后，β 3基因敲除小鼠肠系膜血管周围有 FITC-BSA示踪剂局部外渗。在小鼠被处以安乐死之前lh，球后静脉注射FITC-标记的 BSA(90 μ m, Sigma) (30mg/kg，溶于生理盐水中)，在显微镜下确定内皮渗漏的位点。取整块肠系膜及小肠，小心不要破坏血管。制备肠系膜全标本并固定(Baluk等(1999)Br J Pharmacol 126 522) 用Leica DM5000B显微镜确定渗漏位点作为局部FITC外渗区。图3C 腹膜内注射LPS(10mg/kg)后，β 3基因敲除小鼠的小肠和肠系膜以及结肠中125I-BSA示踪剂外渗增加。通过腹膜内注射对体重和性别匹配的β 3基因敲除小鼠和野生型对照小鼠给药LPS10mg/kg。30h时，通过球后静脉注射给药0. 5 μ Ci 125I-BSA示踪剂。池后，对小鼠处以安乐死，摘取小肠和肠系膜以及结肠，分析每分钟总计数(CPM)。数据显示为平均值+/_标准误差，每组η = 6。β 3基因敲除vs.野生型对照小肠/肠系膜ρ = 0. 034，结肠 p = 0. 042。图3D 通过α νβ 3的抗体抑制提高了激动剂诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 的通透性。在Transwells 中将血清饥饿的HUVEC单层融合细胞用抗α ν β 3抗体和对照抗体(Ab) (10μ g/ml)孵育 lh，然后用 VEGF(30ng/ml)、TGF-β (10ng/ml)或凝血酶(10U/ml) 刺激。数据显示为平均值+/_标准误差，每组η = 3。对照vs.抗α νβ 3抗体对于生理盐水，ρ = 0. 972，对于 VEGF，p = 0. 033，对于凝血酶，ρ = 0. 041，对于 TGF-β，ρ = 0. 029。图3Ε 腹膜内注射LPS(10mg/kg)后，β 3基因敲除小鼠出现血液浓缩。通过腹膜内注射对β 3基因敲除小鼠和野生型对照小鼠给药LPS 3 后，经由下腔静脉穿刺采血，测定血细胞比容水平。数据显示为平均值+/_标准误差，每组η = 6。图4Α 在腹膜内注射LPS(13mg/kg)的败血症模型中，β 5基因敲除小鼠的死亡率下降。通过腹膜内注射对体重和性别匹配的β 5基因敲除小鼠和野生型对照小鼠给药LPS 13mg/kg。对数据进行Kaplan-Meier生存分析，Iogrank检验组间差异，ρ = 0. 0007。图4Β 与野生型对照相比，腹膜内注射LPS(13mg/kg)后，β 5基因敲除小鼠肠系膜血管周围的FITC-BSA示踪剂外渗减少。在小鼠被处以安乐死之前lh，球后静脉注射 FITC-标记的BSA (90 μ m, Sigma) (30mg/kg,溶于生理盐水)，在显微镜下确定内皮渗漏的位点。摘取整块肠系膜及小肠，小心不要破坏血管。制备肠系膜全标本并固定(Baluk等 (1999) Br J Pharmacol 126 522) 用 Leica DM5000B 显微镜确定渗漏位点作为局部 FITC 外渗区。图4C 与野生型对照相比，对LPS诱导的败血症(13mg/kg)给药α νβ 5封闭抗体延缓了死亡时间。通过腹膜内注射对体重和性别匹配的野生型小鼠给药LPS i;3mg/kg。注射LPS 24h后，对小鼠进行随机球后静脉注射α νβ 5抗体或同种对照抗体。对数据进行 Kaplan-Meier生存分析，Iogrank检验组间差异，ρ = 0. 01Μ。图5 与对照相比，对盲肠结扎穿孔法(CLP)诱导的败血症给药α νβ 5封闭抗体延缓了死亡时间。对体重和性别匹配的野生型小鼠进行CLP手术。术后且腹部切口闭合后， 小鼠被随机球后静脉注射α νβ 5抗体或同种对照抗体。对数据进行Kaplan-Meier生存分析，Iogrank检验组间差异，ρ = 0. 0427。发明详述I.介绍本发明部分基于以下惊人的发现，用能够结合整合素α νβ 5的制剂治疗动物，可降低败血症的症状。本发明人已经证明，结合到整合素α νβ 5的抗体阻断了配体与整合素 α νβ 5的结合。更特别的是，阻断整合素α νβ 5的结合可降低败血症的严重程度。本发明的结果是惊人的，因为给药α νβ 5封闭抗体实际上逆转了败血症。败血症的标准疗法一般遵循于预防败血症，例如，使用抗生素或消炎药。通常，败血性反应(s印tic reaction)的急性性质需要及时和积极的医疗干预；标准疗法是不能够起效的。因此，本发明提供通过向个体给药有效量的α νβ 5的拮抗剂以治疗、预防或逆转个体败血症的方法。本发明还提供通过鉴定与整合素α νβ 5发生相互作用的制剂并检验它们治疗败血症的能力，从而确定用于治疗败血症的新制剂的方法。
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II.定义“ α ν β 5拮抗剂”是可与α ν β 5配体竞争整合素α ν β 5上的可用配体结合位点的任何制剂。α ν β 5拮抗剂包括可特异性结合到α ν β 5或β 5上，或能够抑制整合素α ν β 5 活性或表达的制剂。实例包括抗体、小分子抑制剂和多核苷酸抑制剂(例如，反义RNA和 siRNA)。“整合素α ν β 5”是粘附分子家族成员，其包括能够介导尤其是细胞_细胞间相互作用、细胞-胞外基质(ECM)间相互作用以及细胞-病原体间相互作用的非共价结合的α/β异二聚体。α νβ5是唯一包含β5亚基的整合素。ανβ5识别R⑶肽序列并结合玻连蛋白(例如，见Hynes，细胞(Cell) 69 11-25 (1992))，且与多种疾病包括中风、心肌梗死、癌症(即血管形成)和眼部新生血管疾病有关(例如，见Friedlander 等，科学(Science) 270 (5241) :1500-2(1995) ；Friedlander 等，PNAS 美国 93(18) 9764-9(1996) ；Elicieri 等，J. Cell Biol. 157(10 :149-159(2002) ；Heba 等，J. Vase. Res. 38(3) :288-300(2001) ；Soeki 等，Cardiology 93(3) :168-74(2000)；以及 Li 等， Am. J. Physiol. 270(5 Pt 2) :H1803_1 1(1996))。αν 和 β 5 已被测序并进行特性分析(例如，分别见Hynes, 1992见上，以及美国专利No. 5，527，679)。因此，整合素α ν β 5的活性包括但不限于结合RGD和玻连蛋白，以及介导细胞-细胞、细胞-ECM和细胞-病原体间的相互作用。败血症的特点表现为急性炎症蔓延至全身的迹象，例如，发热和白细胞数异常。有时是由细菌感染引起败血症，因此，细菌感染的症状本身也可能具有指示性。因此，具有败血症发病风险的个体可包括遭受感染的个体，特别是遭受严重感染的个体，或过去经历过败血症的个体。在败血性反应中，免疫系统对感染做出反应，并可能导致组织损伤和引起代谢变化。这种反应的体外症状经常包括心率快(每分钟90次以上)，呼吸频率高(每分钟超过 20次呼吸)，白细胞(WBC)计数增加(12，000以上)以及体温升高或下降(低于36°C或高于38°C)。免疫反应会导致急性期蛋白(acute phase protein)的普遍激活，而后对血管和器官造成损害。极端情况下可导致死亡。对于任何疾病或病症，医学领域的技术人员能够最好地识别和诊断败血症。技术人员也应该知晓“败血症”不是绝对的术语，而是可用来指全身炎症反应综合征、严重败血症和败血性休克。整合素α νβ 5拮抗剂的“治疗剂量”、“治疗量”、“治疗有效量”或“有效量”是指预防、减轻、消退或减少整合素α νβ 5相关疾病，包括如败血症患者症状严重程度的拮抗剂的量。本文中使用的术语“治疗”和“预防”并不是绝对的术语。治疗可以指任何发病延迟、症状减轻、患者存活率改善、组织损伤减少等。事实上，在一些实施方案中，本发明的治疗可以导致疾病的逆转。相似地，预防可以指任何发病延迟，或取决于具体情况，指症状严重程度降低。可对未接受治疗的个体或一群个体进行疗效比较，或者对同一患者，如治疗前进行疗效比较。本文中广泛使用的术语“个体(subject)”是指被考虑接受治疗的任何个体 (individual) 0通常，个体(subject)是人类或某些其它哺乳动物。术语“抗体”是指能够特异性结合和识别抗原的，由免疫球蛋白基因或其功能片段编码的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ (kappa)、λ、α、Υ、δ、ε和μ (mu)恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或 ε，分别依次定义免疫球蛋白类为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N-端可变区定义了约100-110个或更多个氨基酸，主要负责抗原识别。术语“重链可变区”、“Vh”或“VH”是指免疫球蛋白重链可变区，包括FV、SCFV、dSFV或Fab ；而术语“轻链可变区”、“VJ或“VL”是指免疫球蛋白轻链可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。抗体功能片段的实例包括，但不仅限于，完整的抗体分子，抗体片段，如Fv、单链 Fv(scFv)、互补决定区(CDRs)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2，及它们的任意组合，或能够结合靶抗原的免疫球蛋白肽任何其它功能部位(例如见，基础免疫学 (Fundamental Immunology)，Paul等，第四版2001)。本领域技术人员知晓，通过多种方法可获得不同的抗体片段，例如，用酶如胃蛋白酶消化完整的抗体，或重新合成。往往采用化学法或通过重组DNA方法重新合成抗体片段。因此，本文中使用的术语抗体，包括对完整抗体进行改造后的抗体片段，或采用重组DNA方法重新合成的抗体片段(例如单链Fv)或利用噬菌体展示文库确定的抗体片段(例如见，McCafferty等，(1990)自然(Nature) 348 552)。术语“抗体”还包括二价或双特异分子、双链抗体、三链抗体和四链抗体。二价和双特异分子描述于，例如 Kostelny 等(1992) J. Immunol. 148 1547，Pack 和 Pluckthun (1992) 生物化学(Biochemistry) 31 :1579, Hollinger 等(1993)，PNAS.美国 90 :6444, Gruber 等(1994)J Immunol. 152 :5368, Zhu 等(1997)Protein Sci. 6 :781，Hu 等(1996)Cancer Res. 56 :3055, Adams 等(1993)Cancer Res. 53 :4026 以及 McCartney 等(1995)Protein Eng. 8 :301。“单链Fv (scFv) ”或“单链抗体”是指一种蛋白，其中scFv抗体的Vh和\区包括一条单链，其折叠以产生类似于在双链抗体中发现的抗原结合位点。制备scFv抗体的方法描述于例如，Ward 等，Exp Hematol. (5) :660-4(1993)；及 Vaughan 等，Nat Biotechnol. 14(3) :309-14 (1996)。单链Fv(scFv)抗体任选包括长度不超过50个氨基酸的肽连接，一般不超过40个氨基酸，优选不超过30个氨基酸，更优选不超过20个氨基酸。 在一些实施方案中，所述肽连接是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的串联体，例如2、3、4、5或 6个这样的序列。然而，应知晓，所述肽连接中可发生某些氨基酸替换。例如，缬氨酸可被取代为甘氨酸。其它肽连接及其应用为本领域熟知的。例如见，Huston等，Proc. Nat' 1 Acad. Sci.美国 8 :5879 (1988) ；Bird等，科学(Science) 242 :4236 (1988) ；Glockshuber 等， 生物化学(Biochemistry) 29 :1362(1990)；美国专利号 4，946，778，美国专利号 5，132，405 和 Stemmer 等，生物技术(Biotechniques) 14 :256-265 (1993)。本文中使用的“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使抗原结合位点(可变区)连接到不同的或改变的类、效应子功能和/或种的恒定区，或赋予该嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、 药物等；或(b)可变区或其部分被改变、被具有不同的或改变抗原特异性的可变区或其部分替换或交换，或被来自另一物种或来自另一类抗体或其亚类的相应序列替换或交换。本文中使用的“人源化抗体”是指来自供体抗体的CDR区被移植到人类框架序列上的免疫球蛋白分子。人源化抗体也可在框架序列中包括源自供体的残基。人源化抗体还可包括人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体还可包括既不存在于受体抗体上，又不存在于外源(imported) CDR或框架序列中的残基。可使用本领域已知的方法进行人源化(例如，Jones 等，自然(Nature) 321 :522-525 ； 1986 ;Riechmann 等，自然(Nature) 332 :323-327，1988 ;Verhoeyen 等，科学(Science)239 1534-1536，1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596,1992 ；美国专利号 4，816，567)，包括例如“超人源化(superhumanizing) ”抗体技术(Tan 等，J. Immunol. 169 :1119,2002)和“表面重塑 (resurfacing) ” 技术(例如，Staelens 等，Mol Immunol. 43 :1243,2006 ；禾口 Roguska 等， Proc. Natl Acad. Sci 美国 91 :969，1994)。本文中使用的“V区”是指包括框架I(Fl)、互补决定区1(⑶Rl)、F2、⑶R2和F3， 包括⑶R3和F4区段的抗体可变区，这些区段被添加到V区段(V-segment)，结果是B细胞分化期间，重链和轻链的V区基因发生重排。本文中使用的“V区段”是指由V基因编码的 V区(重链或轻链)的区域。重链可变区的V区段编码FRl-⑶R1-FR2-⑶R2和FR3。从本发明的目的出发，轻链可变区的V区段被定义为从FR3延伸至CDR3。本文中使用的术语“J区段(J-segment) ”是指可变区编码的、包括⑶R3和FR4的 C-末端部分的子序列。内源J区段是由免疫球蛋白J-基因编码的。本文中使用的“互补决定区(CDR) ”是指每条链的三个高变区中的一个，其破坏了由轻链和重链可变区构建的四个“框架”区。CDR主要负责结合到抗原表位上。每条链的 ⑶R通常称为⑶R1、⑶R2和⑶R3，从N-端开始按顺序编号，通常也可由特定⑶R所在的链来确定。因此，举例来说，发现Vh⑶R3位于抗体的重链可变域，而发现Vl⑶Rl是来自于抗体轻链可变域的⑶R1。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区，即构成轻链和重链的结合框架区，作为位置并将⑶R排列成三维空间。因此，⑶R在V区内的位置在抗体之间相对保守。CDR区和框架区的氨基酸序列和位置可采用本领域各种熟知的定义来确定，例如 Kabat，Chothia,国际免疫遗传学数据库(international ImMunoGeneTics database, IMGT)，以及 AbM(例如见，Johnson 等，见上；Chothia & Lesk，1987，免疫球蛋白区白勺典型结构(Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins)J. Mol. Biol. 196,901-917 ；Chothia C.等.，1989，免疫球蛋白高变区的构象(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions)自然(Nature) 342，877-883 ；Chothia C.等.，1992，人 VH 区段的结构谱(structural repertoire of the human VH segments)J. Mol. Biol. 227,799-817 ；Al-Lazikani 等， J. Mol. Biol 1997,2730))。抗原结合位点的定义还描述于Ruiz等，IMGT，国际免疫遗传学数据库(international ImMunoGeneTics database). Nucleic Acids Res., 28，219-221 (2000)；及 Lefranc，Μ. -P. IMGT,国际免疫遗传学数据库.Nucleic Acids Res. Jan 1 ；29(1) =207-9(2001) ；MacCallum等，抗原抗体相互作用接触分析及结合位 ^jf (Antibody-antigen interactions Contact analysis and binding site topography) J. Mol Biol，262 (5)，732-745 (1996)；及 Martin 等，Proc. Natl Acad. Sci ^ 国，86，9268-9272 (1989) ；Martin 等，酶学方法(Methods Enzymol) 203，121-153，(1991)；Pedersen 等，免疫学(Immunomethods) 1，126，(1992)；以及 Rees 等，In Sternberg Μ. J. Ε.(主编)，蛋白结构预测(Protein Structure Prediction)牛津大学出版社，牛津大学，141-172 1996)。短语“特异性(或显著性或选择性)结合”当指给定的蛋白或多肽时，是指在异源蛋白群和其它生物体存在的条件下，决定该蛋白存在的结合反应。因此，在指定的免疫检测条件下，特异性抗体结合特定的蛋白(例如，整合素α νβ 5、β 5或其部分)，且不以显著的量结合样品中存在的其它蛋白。在这种条件下，特异性结合抗体可能需要选定一种对特定蛋白具有特异性的抗体。例如，作用于整合素α ν β 5或β 5多肽的抗体可做进一步选择，获得与该蛋白发生特异性免疫反应，且不与其它蛋白发生反应的抗体。在一些实施方案中，所述特异性抗体还能够结合蛋白的多态变体，例如，与目的蛋白序列至少有80^^85^^90%, 95%或99% —致性的蛋白。在一些实施方案中，本发明选择特异性结合到α νβ 5或β 5上的表位，而不显著结合到ανβ3或β3的抗体。在一些实施方案中，α νβ 5特异性抗体不显著结合"3 6、3 6、38或"旦80本领域技术人员应知晓“特异的”或“显著的”结合并不是绝对的术语。例如，如果抗体不显著结合到特定表位上，则与作用于该表位的抗体相比，它的亲和力下降了至少5 倍、8倍、10倍、20倍、50倍、80倍或100倍。例如，如果与结合α ν β 5相比，ανβ5特异性抗体结合 ανβ3、ανβ6 或 ανβ8 的亲和力低于 20 %、10 %、5 %、1 %、0· 5 %、0· 1%, 0. 05%、0. 01%或更低，则α νβ 5特异性抗体不显著结合0￥日3、0^^6或0^^8。可采用本领域已知的技术测定结合亲和力，例如ELISA法。亲和力可表示为解离常数(Kd或Kd)。 相对较高的Kd值表示较低的亲和力。因此，举例来说，作用于ανβ5的ανβ5特异性抗体的Kd值通常会降低至少5、8、10、15、20、50、100、500、1000因子，或高于α ν β 5特异性抗体与另一种蛋白结合的Kd值。本领域技术人员应知晓如何设计对照以指示非特异性结合并比较相对的结合水平。可采用多种免疫检测法筛选与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，常使用固相ELISA免疫检测法、蛋白质印迹法(Western blots)或免疫组织化学法来筛选与蛋白发生特异性免疫反应的单克隆抗体。见Harlow和Lane抗体，实验室手册，冷泉港出版社，纽约(1988) (Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications, NY(1988))，描述了可用于确定特异性免疫反应性的免疫检测法和条件。通常，特异性或选择性反应至少为背景信号或噪声的两倍，更典型为高于背景的10倍至100倍。“特异性竞争”结合的制剂减少了抗体与多肽的特异性结合。在一抗存在的条件下，采用本领域已知的任何竞争性结合检测(例如见，Harlow和Lane，见上)，如果二抗与抗原的结合减少了至少30 %，通常至少约40 %、50 %、60 %、75 %或至少约90 %，则一抗被认为是竞争性抑制二抗的结合。术语“平衡解离常数”或“亲和力”的缩写(Kd或Kd)，是指解离速率常数(kd，时间―1)除以结合速率常数(ka，时间—Μ—1)。可采用本领域已知的任何方法测定平衡解离常数。 在37°C下通过表面等离子共振分析(surface ρlasmon resonance analysis)，测得高亲和力抗体的单价亲和力低于约ΙΟηΜ，通常低于约500pM或约50pM。在一些实施方案中，本发明抗体的亲和力(利用表面等离子共振测定)低于500pM，通常低于约ΙΟΟρΜ，或甚至低于 25pM0
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本文中术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换用于指氨基酸残基的聚合物。该术语用于表示氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸残基为相应的自然发生的氨基酸的人工化学模拟物，以及用于表示自然发生的氨基酸聚合物和非自然发生的氨基酸聚合物。本文中使用的术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即，抗原)，其中所述的氨基酸残基通过共价肽键连接。术语“氨基酸”是指自然发生的及合成的氨基酸，以及与自然发生的氨基酸以类似方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。自然发生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来经过修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。 氨基酸类似物是指与自然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即α碳结合氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这些类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架 (baclAones)，但仍保留了与自然发生的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指与氨基酸的一般化学结构不同的化合物，但仍以与自然发生的氨基酸类似的方式发挥功能。本文中所指的氨基酸可由它们公知的三个字母或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的一个字母来表示。同样，核苷酸可由普遍接受的单字母代码表示。术语“模拟肽(ρ印tidomimetic) ”和“模拟物(mimetic) ”是指与本发明的α ν β 5 拮抗剂具有基本相同的结构和功能特点的合成的化合物。肽类似物作为非肽类药物，具有与模板肽类似的性质，被普遍用于制药行业。这些类型的非肽类化合物被称为“肽-模拟物(peptide mimetics)，，或“月太模拟物(ρ印tidomimetics)，，(例如见，Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 :29(1986) ；Veber 和 Freidinger TINS 392 页(1985)；以及 Evans 等 J. Med. Chem. 30 :1229(1987)) 0与具有疗效的肽结构相似的肽模拟物可被用于产生相当的或增强的治疗或预防效果。一般来说，肽模拟物与范式(paradigm)多肽(即具有生物或药理活性的多肽)结构相似，如自然发生的α νβ 5配体，但有一种或多种任选被选自下组的连接(linkage)取代的肽连接例如，-CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH-(顺式和反式)、 COCH2、-CH (OH) CH2-和CH2SO-。所述模拟物可以完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成， 或者为部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物的嵌合分子。所述模拟物还可掺入任何数量的天然氨基酸的保守替换，只要这些替换基本上不会改变所述模拟物的结构和 /或活性。本文中使用的术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。使用的术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(即，短链多核苷酸)。该术语也指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及自然发生的变体，也可指合成的和/或非自然发生的核酸(即包括核酸类似物或修饰的骨架残基或连接)，例如且不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNAs)等。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含包括其保守修饰的变体 (例如，简并密码子替换)和互补序列以及明确表示的序列。具体来说，简并密码子替换可通过生成一种或多种所选(或全部)密码子的第三位碱基被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(例如见，Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka 等， J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985)；以及 Cassol 等，(1992) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 :91-98(1994))。
“siRNA”或“RNAi”是指能够形成双链RNA的核酸，当siRNA作为基因或靶基因在同一细胞中表达时，该双链RNA能够减少或抑制基因或靶基因的表达(例如见，Bass, 自然(Nature)，411，似8-似9 0001) ；Elbashir 等，自然(Nature)，411，494-498 Q001) ；WO 00/44895 ；WO 01/36646 ；WO 99/32619 ；WO 00/01846 ；WO 01/29058 ；WO 99/07409 ；和 WO 00/44914)。因此，“siRNA”是指由互补链形成的双链RNA。通常，杂交形成双链分子的siRNA 的互补部分基本上或完全相同。在一个实施方案中，siRNA是指与靶基因具有基本上或完全相同的核酸，并形成了双链siRNA。siRNA的序列可对应于靶基因的全长，或其子序列。通常，siRNA的长度至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每条互补序列长度为15-50 个核苷酸，且双链siRNA长度为约15-50个碱基对，优选长度为约20-30个核苷酸，优选约 20-25 个核苷酸，例如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个核苷酸。“沉默”或“下调”是指靶序列的转录和/或翻译可检出地下降，BP, RNAi靶向该序列，或与不存在RNA干扰或其它核酸序列的条件下检测到的正常水平相比，靶序列或蛋白的量或活性下降。可检出的下降可小到5 %或10 %，或大到80 %、90 %或100 %。更典型地， 可检测出的下降的范围是20%、30%、40%、50%、60%或70%。III. α νβ 5活性的抑制本发明提供通过抑制配体与整合素α νβ 5的结合以治疗和预防整合素α νβ 5相关疾病例如败血症的方法。根据本发明的方法，能够抑制整合素α νβ 5表达或配体与整合素α νβ 5结合的任何方法都可用于治疗整合素α νβ 5相关疾病。例如，特异性结合整合素α νβ 5的抗体、特异性结合β 5亚基的抗体、整合素α νβ 5的配体、肽类、非肽类和这些配体的肽模拟类似物均可用于抑制结合整合素α νβ 5，从而治疗或预防整合素ανβ5相关疾病。此外，抑制β5表达的多核苷酸(例如，siRNA分子，反义序列等)可用于治疗或预防整合素α νβ 5相关疾病，如败血症。整合素亚基是杂泛性的(promiscuous)，可结合到不同的二聚体伴侣和不同的配体上。不同的二聚体对可结合到不同的，但往往相互重叠的一组配体和组织上。例如，αν 亚基可以与几种整合素β亚基配对，例如，β 1、β 3、β 5、β6和β 8。整合素ανβ5以不同的亲和力与例如@Ig-h3、玻连蛋白、骨桥蛋白、CXCL4等结合，且整合素ανβ 、ανβ3禾口 α νβ 5可以有重叠的组织结合模式，例如在脑内动静脉畸形和脑海绵状血管瘤中(Seker 等Q006)神经外科(Neurosurgery) 58 :159-68)。骨桥蛋白是一个配体可以以不同的亲和力与α5β1、ανβ3、ανβ5、α9β1禾口 α νβ 6结合的实例。Sdc—Ι (多配体蛋白聚糖_1)、 玻连蛋白，纤连蛋白也可以结合到多种整合素对上。因此，特定整合素对之间可能有类似的局部分布或明显的结合冗余，然而也有明显的差异，如本文中的例举。整合素不能功能性互换，因此，预期特定整合素的调节剂不具备可互换的功能。此外，由于配体之间的杂泛性(promiscuity)和不同的亲和力，靶向特定配体是不可预见的且不能完全确定其与整合素的相互作用。在这方面，由于抗体非凡的特异性，其对于靶向特定的整合素是特别有用的。抗体可作用于特定靶标，并识别(特异性结合)靶标上独特的、三维表位。Α. α ν β 5抗体拮抗剂可特异性结合整合素α ν β 5或整合素α ν β 5的β 5亚基的抗体可用于治疗或预防败血症。所述抗体还可与其它配体竞争结合整合素α νβ 5或整合素ανβ5的β5亚基。合适的抗体包括但不限于单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗体片段(即Fv、Fab、 (Fab' )2或8冲力。在一些实施方案中，本发明的抗体不结合其它整合素，例如，ανβ3、 ανβ6或ανβ8。在一些实施方案中，本发明的抗体包括ALULA和与ALULA竞争结合 ανβδ的抗体，以及它们的嵌合和片段形式。如本文所证实，整合素ανβ3和α ν β 5在败血症反应中具有相反的作用。ανβ5 的特异性抗体在两个不同的小鼠败血症模型中有效地延长了生存期，而作用于α νβ3的抗体实际上降低了生存期。相似地，β 5缺陷小鼠存活更好，具有更轻的败血症反应(例如， 血管通透性和外渗下降)，而β 3缺陷小鼠表现出更严重的败血症反应(例如，血管通透性和外渗增加)。为了治疗败血症，本发明提供特异性结合α νβ 5而不显著结合α νβ 3的抗体。在某些情况下，该抗体不结合整合素β3、β6或β8。结合通常是在种内进行比较，例如，如果抗体是对人α νβ 5特异的，则它不显著结合人整合素0 3、06或08。在一些实施方案中，所述抗体对。^^3具有非常低的亲和力，例如1(1)大于0.11111。所述抗体可特异作用于 β 5—只有与β 5配对时才存在的α ν表位，或包括α ν和β 5的部分的表位。在一些实施方案中，α νβ 5特异性抗体抑制α νβ 5与配体的相互作用，增加了血管通透性。采用本文中描述的标准技术可检测出能特异性地检测整合素ανβ5而非β 3、 β 6或β 8的抗体。示例性氨基酸序列的GenBank登录号包括小鼠和人￠ 3(054890和 P05106. 2)、小鼠和人 β 5 (Pl 1688 和 Ρ18084)、小鼠和人 β 6 (Q9Z0T9 和 Ρ18564. 2)，以及小鼠和人i3 8(P26012 *Q0VBD0)。其它种类的整合素序列，例如，非人类灵长类动物，大鼠、 狗、猫、马、牛等，也可公开获得。特异性地检测整合素α ν β 5而非β 3、β 6或β 8的抗体，是指能够结合来自特定物种的整合素蛋白。例如，根据本发明，如果抗体对人ανβ5而不对β 3、β6或β8整合素亚基特异，则它不显著结合人β3、β6或β8。在一些实施方案中，能够结合整合素α νβ 5的单克隆抗体ALULA(由ATCC保藏号 PTA-5817的杂交瘤细胞产生，于2004年2月13日保藏于ATCC，10801大学大道。马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209)被用于治疗或预防整合素α νβ 5相关疾病，包括败血症。在一些实施方案中，人源化或嵌合ALULA、ALULA抗体片段或与ALULA竞争结合整合素α ν β 5 或整合素α νβ 5的β 5亚基的单克隆抗体被用来治疗败血症。可利用⑶R序列或ALULA 的V区序列衍生得到可竞争结合整合素α νβ 5的抗体。在一些实施方案中，可通过筛选与 ALULA竞争的抗体来确定竞争性抗体。ALULA可与整合素α ν β 5结合，对哺乳动物个体给药ALULA可降低个体中败血症的严重性。在一些实施方案中，ALULA是特异作用于α νβ 5的鼠IgG2b同种单克隆抗体。 在一些实施方案中，使用ALULA的α ν β 5结合片段，例如Fab ‘区或保留了 ALULA的⑶R的人源化Fab'区，或能够结合ανβ5的类似序列。ALULA不显著结合包括整合素β 3、β6 或β 8的表位(Su等Q007)Am J Respir Cell Mol Biol 36 :377)。采用本领域公知技术可实现ALULA嵌合化或人源化。采用本领域技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。简单地说，用所需抗原免疫的动物中取出脾细胞进行无限增殖(immortalized)，通常与骨髓瘤细胞融合(例如见， Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6 :511-519 (1976))。无限增殖化(immortalization)的替代方法包括用EB病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因或逆转录病毒转化，或采用本领域众所周知的其它方法。从无限增殖的单一种类细胞形成的细胞集落中筛选产生对抗原具有所需特异性和亲和力的抗体，可通过各种技术来提高由这些细胞产生的单克隆抗体的产量，包括向脊椎动物宿主的腹膜腔内注射。此外，根据Huse等，科学(Science)246: 1275-1281 (1989)中概述的一般方法，我们可以通过筛选人类B细胞的DNA文库，从而分离得到编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。收集单克隆抗体并进行免疫检测，滴定免疫原，例如，用固定在固相支持物上的免疫原进行固相免疫检测。通常单克隆抗体以至少约0. ImM Kd值，更通常以至少约IyM Kd 值结合，且常设计为以InM或更小的Kd值结合。在一个示例性实施方案中，用多肽α νβ 5或编码该多肽的核酸构建体免疫动物， 如兔或小鼠。可使用标准方法分离免疫产生的抗体。通过各种重组DNA技术容易生产本发明的免疫球蛋白，包括结合片段及其衍生物，包括在转染细胞(例如，无限增殖的真核细胞，如骨髓瘤或杂交瘤细胞)中表达或采用众所周知的方法在小鼠、大鼠、兔或其它能够产生抗体的脊椎动物中表达。提供DNA序列的合适细胞源以及表达和分泌免疫球蛋白的宿主细胞可以从多种来源获得，如美国典型培养物保藏中心(细胞系和杂交瘤细胞目录，第五版(1985年)罗克维尔市，马里兰州)。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体，即保留了非人类抗体的反应性、 且减少了在人体中免疫原性的抗体。例如，可通过保留对整合素ανβ5特异的非人类 CDR区，并用来自人类抗体的相应部分替换该抗体的其余部分而实现。例如见，Morrison 等，PNAS 美国，81 :6851-6855(1984) ；Morrison 和 0i, Adv. Immunol,44 :65-92(1988)； Verhoeyen 等，科学 Science)，239 1534-1536 (1988) ;Padlan，Molec. Immun.，28 489-498(1991) ；Padlan, Molec. Immun. ,31(3) 169-217 (1994)。人源化抗体技术是本领域众所周知的，例如描述于美国专利号4,816, 567 ；5, 530，101 ；5, 859, 205 ；5, 585, 089 ； 5，693，761 ；5，693，762 ；5，777，085 ；6，180，370 ；6，210，671 ；和 6，329，511 ；WO 87/02671 ； 欧洲专利申请 0173494 Jones 等(1986)自然(Nature) 321 :522 ；以及 Verhoyen 等(1988) 科学(Science) 239 :1534。人源化抗体进一步描述于Winter和Milstein(1991)自然 (Nature) 349 :293。例如，可通过人工合成或通过组合适当的cDNA和基因组DNA片段制备包括编码人源化免疫球蛋白框架区的第一序列和编码所需免疫球蛋白互补决定区的第二序列的多核苷酸。可根据本领域众所周知的方法从各种人体细胞中分离人恒定区DNA序列。用于产生本发明免疫球蛋白的CDR同样来自于能够特异结合整合素α νβ 5的单克隆抗体(例如，ALULA或与ALULA竞争以特异性结合整合素α ν β 5的抗体)。在某些情况下，CDR转移到人框架中导致人源化抗体的特异性缺失。在这类情况下，可将回复突变引入到该抗体的人源部分的框架区中。回复突变的方法是本领域众所周知，并描述于，例如Co等，PNAS美国88 ;2洸9-2273(1991)和WO 90/07861中。ανβδ特异性抗体也可以是嵌合的，以保留全部或大部分可变区，但恒定区被替换。以ALULA为例，将具有整合素α νβ 5结合活性的鼠类可变区与人类恒定区或来自其它哺乳动物的恒定区结合用于兽医治疗中。在一些实施方案中，所述抗体为抗体片段，如Fab、F(ab' )2、Fv或scFv。可采用本领域已知的任何方法生成抗体片段，包括化学消化(例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)和重组方法，分离和制备重组核酸的方法是本领域技术人员已知的(见Sambrook等，分子克隆·实验室手册(Molecular Cloning. A Laboratory Manual)(第二版，1989) ；Ausubel 等， 现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology) (1995))。抗体可在多种宿主细胞，包括大肠杆菌、其它宿主菌、酵母和各种高等真核细胞如C0S、CH0和HeLa 细胞系和骨髓瘤细胞系中表达。本发明的一个实施方案提供用于确定与ALULA竞争特异性结合整合素α νβ5的抗体。竞争性结合试验可用于确定与ALULA竞争特异性结合整合素α ν β 5的抗体。可使用本领域已知的众多竞争性结合试验中的任何一种来测定两种抗体对相同抗原之间的竞争。简单地说，测定不同的抗体抑制另一种抗体结合的能力。例如，可使用夹心ELISA法检测它们结合的表位从而区分抗体。这可以通过用捕获抗体包被孔(well)的表面而进行。 然后向捕获的表面添加半饱和(subsaturating)浓度的标记抗原。该蛋白通过特异性抗体表位的相互作用与抗体结合。清洗二抗后，将共价连接到可检出的部分(例如，HRP，带有标记的抗体，被定义为检测抗体)的二抗添加到ELISA中。如果该抗体能识别与捕获抗体相同的表位，则它将无法结合靶蛋白，因为特定表位不可以再用于结合。然而，如果该二抗能识别靶蛋白上的不同表位，则它可以结合，这种结合可使用相关底物通过活性水平的量化(抗体由此结合)来测定。将背景定义为使用一种抗体作为捕获和检测抗体，而最大信号是通过捕获抗原特异性抗体并检测结合到抗原标签上的抗体来确定的。通过以所述背景和最大信号为参考，以成对的方式评估抗体，从而确定表位特异性。如果在一抗存在的条件下，采用上述任何的检测方法，测得二抗与抗原的结合减少了至少30 %，通常至少约40 %、50 %、60 %或75 %，通常至少约90 %，则认为一抗竞争性抑制二抗的结合。B.抑制整合素α ν β 5的表达如上所述，本发明是基于令人惊奇的发现，即阻断配体与整合素α νβ 5的结合， 降低了败血症的严重程度。例如，在以下实施例中描述的，本发明人已证实在败血症模型中，β 5+小鼠和用α νβ 5拮抗剂抗体处理的小鼠，提高了存活率。α νβ 3的抗体拮抗剂实际上是有害的，并加重了败血症的反应。因此，在转录或翻译水平上特异性干扰整合素β 5基因表达的核苷酸序列可用于治疗或预防败血症。例如，该方法可利用siRNA和/或反义寡核苷酸，通过用siRNA诱导 mRNA降解或通过用反义核酸屏蔽mRNA以阻断特定突变的mRNA的转录或翻译。在一些实施方案中，siRNA或反义构建体不显著阻断β 3亚基的表达。1. siRNA通过诱导β 5mRNA转录物的降解，对应于β 5基因的双链siRNA可用于沉默整合素α νβ 5的转录和/或翻译，从而通过阻止整合素α νβ 5的表达来治疗或预防败血症。 siRNA典型地为约5-约100个核苷酸长度，更典型地为约10-约50个核苷酸长度，最典型地约15-约30个核苷酸长度。siRNA分子及其制备方法描述于，例如Bass，2001，自然 (Nature)，411，428-429 ；Elbashir 等，2001，自然(Nature)，411，494-498 ；WO 00/44895 ；WO 01/36646 ；WO 99/32619 ；WO 00/01846 ；WO 01/29058 ；WO 99/07409 和 WO 00/44914 中。转录dsRNA或siRNA (例如，作为发夹双螺旋)的DNA分子还提供RNAi。转录dsRNA的DNA分子公开于美国专利No. 6，573，099，美国专利申请公开Nos. 2002/0160393和2003/0027783， 以及 Tuschl 和 Borkhardt，分子干预(Molecular Interventions), 2 :158(2002 年)。例如，与 GenBank 登录号AK0M968、BF588784、BE208820、BE207859 或 BE206567 中公布的核酸序列特异性杂交的dsRNA寡核苷酸可用于本发明方法中。与不存在RNA干扰的情况下检测到的症状相比，败血症症状严重程度的下降可用于监测siRNA的疗效。可使用本领域已知的任何方式将siRNA施用于个体，包括注射、吸入或口服 siRNA。另一种合适的siRNA给药系统为胶体分散体系，例如，高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠，以及脂质递送系统包括水包油型乳液、胶束，混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体体系是脂质体。脂质体为人工膜囊泡，它可用于作为体外和体内的递送载体。脂质体内的核酸包括RNA和DNA，以生物活性形式递送至细胞内(Fraley等，Trends Biochem. Sci,6 77,1981)。使用本领域已知的任何方法均可将脂质体靶向递送到特定的细胞类型或组织。2.反义寡核苷酸与编码β 5多肽的核酸序列特异性杂交的反义寡核苷酸也可用于整合素α νβ 5 的沉默转录和/或翻译，从而治疗或预防败血症。例如，与GenBank登录号BF588784 (人)、 BE208820(人)、BE207859 (人)、BE206567 (人)、NM_002213(人)、BC006M1 (人)、 NM_74679 (牛)；AF468059 (牛)、NM_010580(鼠)、BC058246 (鼠)、XM_47237 (鼠)、 AF02211K 鼠)、AF022110(鼠)、AF043257(鼠)、AF043256(鼠)和 S58644(大鼠)中公布的核酸序列特异性杂交的反义寡核苷酸可用于本发明方法中。与不存在反义核酸的情况下检测到的症状相比，败血症症状严重程度的下降可用于监测反义核酸的疗效。反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(例如见， Weintraub，美国科学(Scientific American), 262 :40(1990)) 通常，合成的反义寡核苷酸长度一般为15-25个碱基。反义核酸可包括自然发生的核苷酸或修饰的核苷酸，例如，硫代磷酸酯、甲基磷酸酯和异头糖磷酸酯(anomeric sugar-phosphate)、骨架修饰的核苷酸。在细胞内，反义核酸与相应的mRNA杂交形成双链分子。由于细胞不翻译双链的 mRNA,因此所述反义核酸干扰了 mRNA翻译。优选约15个核苷酸的反义寡聚体，因为它们易于合成，且当被引入到生产突变的靶核苷酸的细胞中时，不易出现像较大分子那样的问题。利用反义方法在体外抑制基因的翻译是本领域众所周知的(Marcus-Mkura，Anal. Biochem. , 172 :289, (1988))。使用直接结合DNA的反义分子并不常见。可使用本领域已知的任何方法来递送特异作用于整合素β 5基因的反义多核苷酸，包括例如直接注射、吸入或摄入多核苷酸。此外，可使用重组表达载体递送反义多核苷酸(例如，基于腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或逆转录病毒的病毒载体)或本文所述的胶体分散体系(例如，脂质体)。IV.确定其它的α ν β 5拮抗剂其它的整合素α νβ 5的拮抗剂可见于美国申请No. 20050226865或可容易地根据本领域技术人员已知的方法来确定。一种方便的筛选拮抗剂的方法包括测定潜在的拮抗剂与整合素已知的配体竞争结合的能力。例如，玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、腱生蛋白c 和腺病毒五邻体基底(adenovirus penton base)是整合素α ν β 5的已知配体，它们可用于竞争试验中以确定整合素α νβ 5的潜在拮抗剂。包括氨基酸序列RGD的其它多肽也可用于竞争试验中。此外，可与整合素α νβ 5结合的单克隆抗体及其片段可用于筛选整合素
16α νβ5的其它拮抗剂。在一些实施方案中，ALULA和与ALULA竞争结合α ν β 5的抗体可用于筛选整合素α νβ 5的其它拮抗剂。竞争试验(competition assays)是本领域众所周知的。通常，对整合素ανβ5 的配体或与配体竞争结合整合素α νβ5的抗体(例如，ALULA)进行标记，从而可以检测到结合整合素α νβ5(例如，在不断增量的整合素α νβ 5的潜在竞争性配体存在的条件下) 的差异。该配体可以是自然发生的配体以及合成的配体。竞争试验表明了潜在竞争性拮抗剂的亲和力。可利用多种不同的筛选方案来确定可调节细胞中，例如哺乳动物细胞中，尤其是人类细胞中特定拓扑结构的整合素α νβ 5的活性水平或功能的制剂。一般地，筛选方法包括筛选多种制剂以确定与α νβ 5发生相互作用的制剂，例如，通过结合整合素α νβ 5或阻止整合素α νβ 5特异性抗体(例如，ALULA)或配体(例如，玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、 腱生蛋白c和腺病毒五邻体基底)与整合素α νβ 5的结合。初步筛选可通过筛选能够结合整合素α νβ 5的制剂进行，以便确定至少一些制剂有可能成为整合素拮抗剂。结合试验(binding assays)通常包括将整合素 ανβδ与一种或多种待测制剂接触足够的时间，使整合素α νβ 5与待测制剂形成结合复合物。可使用众多已建立的分析技术中的任一种测定形成的任何结合复合物。蛋白结合检测包括，但不仅限于，免疫组织化学结合检测、流式细胞术或其它检测方法。这些检测中使用的整合素α νβ 5可以是自然表达的、克隆的或合成的。本发明的筛选方法可在体外或基于细胞进行检测。基于细胞的检测可以在任何表达整合素α νβ 5的细胞中进行。基于细胞的检测可包括整个细胞或含有整合素ανβ5 的细胞组分以筛选能够结合整合素α νβ 5的制剂或能够调节整合素α νβ 5活性的制剂。 本领域技术人员应知晓整合素α νβ 5可在不含内源性整合素α νβ 5的细胞中表达。合适的基于细胞的检测描述于例如DePaola等，生物医学工程手鉴(Annals of Biomedical Engineering)29 1-9(2001)。初步确定为与整合素α νβ 5发生相互作用的制剂可进一步测试，以验证明显的活性。优选此类研究用以下实施例中描述的合适的基于细胞或动物的败血症模型来进行。 这类方法的基本模式包括对动物模型给药初步筛选出的先导化合物，然后确定败血症是否有所减轻。验证研究中采用的动物模型一般可以为任何一种哺乳动物。合适动物的具体实例包括，但不仅限于，灵长类动物(例如，黑猩猩、猴子等)和啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等)。检测出的作为整合素α νβ 5潜在拮抗剂的制剂可以是任何小的化合物或生物体，如多肽、糖、核酸或脂质。或者，调节剂可以为整合素α νβ 5或整合素α νβ 5配体的基因改造形式。基本上可使用任何化合物作为潜在的调节剂或配体应用于本发明的检测中， 尽管最常用的是可溶解在水或有机(尤其是基于DMS0)溶液中的化合物。通过设定自动检测步骤并提供任何方便来源的化合物，设计试验以筛选大型化合物文库，所述试验典型地可平行进行(例如，在微孔板法中对微孔板进行机器检测)。在一个实施方案中，高通量筛选法包括提供含大量潜在治疗化合物的组合化合物或肽文库(潜在的调节剂或配体化合物)。然后在一种或多种本文所述的检测中筛选这种 “组合化合物文库”或“配体文库”，以确定那些显示所需特征活性的文库成员(特别是化学
17种态(chemical species)或亚类)。由此确定的化合物可作为常规的“先导化合物”，或它们本身可用于潜在的或实际治疗。组合化合物文库是由化学合成或生物合成通过组合大量化合物“构建单元 (building blocks) 试剂而产生的各种化合物的集合。例如，线性组合化合物文库，如多肽文库，其是通过将一组化合物构建单元(氨基酸)用尽可能的方法生成给定的化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数量)组合而形成。数以百万计的化合物可通过这样的化合物构建单元的组合混合而合成。组合化合物文库的制备和筛选为本领域众所周知的。这种组合化合物文库包括但不限于，肽文库(例如见，美国专利5010175，Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37 487-493(1991)和 Houghton 等，自然(Nature) 354 :84-88 (1991)) 也可以采用其它化学物质生成多样性化合物文库。这些化学物质包括但不限于类肽(例如，PCT公开号 W091/19735)、编码的多肽(例如，PCT公开号93/20242)，随机生物低聚物(例如，PCT公开号92/00091)，苯二氮卓类(例如，美国专利号5288514)，diversomers如乙内酰脲、苯二氮卓类和二肽(Hobbs 等，Proc. Nat. Acad. ScI 美国 90 :6909-6913 (1993))，插烯多肽 (vinylogous polypeptides) (Hagihara J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568 (1992))，含葡萄糖骨架的非肽类肽模拟物(Hirschmann 等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :9217-9218 (1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen等，J. Amer. Chem. Soc. 116 J661 (1994))，寡氨基甲酸酯类(oligocarbamates) (Cho 等，科学(Science) 261 :1303(1993))和 / 或肽酰磷酸酯类 (Campbell 等，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))，核酸文库(见 Ausubel，Berger 和 Sambrook， 见上)，肽核酸文库(例如见，美国专利5539083)，抗体文库(例如见，Vaughn等，自然生物技术(Nature Biotechnology), 14(3) :309-314(1996)和 PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(例如见，Liang 等，科学(Science)，274 :1520-1522 (1996)和美国专利 5593853)，有机小分子文库(例如见，苯二氮卓类，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；异戊二烯类，美国专利5569588 ；噻唑啉酮类(thiazolidinones)和间噻嗪酮类(metathiazanones)，美国专利5549974 ；吡咯烷类，美国专利5525735和5519134 ；吗啉基化合物，美国专利5506337 ； 苯二氮卓类，5观8514等)。制备组合文库的设备可市售获得(例如见，ECIS TM, Applied BioPhysics Inc.， Troy, NY, MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, ffoburn, MA,433A Applied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。 此外，许多组合文库本身可市售获得(例如见，ComGenex, Princeton, NJ.，Tripos, Inc.， St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD 等)。V.治疗如上所述，本发明还提供包括整合素α νβ 5的拮抗剂的组合物。本发明的组合物可用于治疗或预防整合素α νβ 5相关疾病，包括败血症。在一个实施方案中，本发明的组合物(例如，组合物包括ALULA、人源化ALULA、 ALULA片段或与ALULA竞争结合α νβ 5的抗体)可用于治疗或预防罹患败血症的个体或具有败血症发病风险的个体。例如，暴露于感染因素(infective agent)的个体很可能在这种暴露后得以治疗，而具有败血症发病风险的患者可预防性地和/或治疗性地治疗。具有败血症发病风险的患者的实例包括急性吸入患者，表现出细菌性败血症症状的患者，患者的血培养物对革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌呈阳性，胰腺炎患者或失血性休克患者。本发明的组合物可以以单剂量、多剂量或在一段时间(例如，2、3、4、5、6天或1-3 周或以上)内定期(例如，每天)给药。可采用本领域已知的任何途径将本发明的组合物直接施用于哺乳动物个体以阻断α νβ5结合，包括例如，通过注射(例如，静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内或皮内)、吸入、透皮给药、直肠给药或口服给药。本发明的药物组合物可包括药用载体。药用载体是部分基于待施用给药的特定组合物以及该组合物的特定给药方法而确定的。因此，有多种适合本发明药物组合物的制剂 (例如见，雷明顿制药科学出版物(Remington' s Pharmaceutical kiences)，第17版.， 1989)。本发明的组合物单独或与其它合适的成分组合，可制成气雾剂(即，它们可被“雾化”)通过吸入给药。气雾剂可置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。适于给药的制剂包括水溶液和非水溶液，可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂 (bacteriostats)和使制剂呈现等渗的溶质的等渗无菌溶液，可包括悬剂、增溶剂、增稠剂、 稳定剂和防腐剂的水溶液和非水溶液无菌悬液。在本发明的实践中，组合物可通过例如口月艮、鼻腔、局部、静脉注射、腹膜内注射或鞘内注射给药。化合物制剂可以以单位剂量或多剂量密封于容器内，如安瓿和小瓶。溶液和悬液可由之前描述的无菌粉末、颗粒和片剂制得。 所述调节剂也可作为制成的食物或药物的一部分给药。适合口服给药的制剂可包括(a)液态溶液，如悬浮在稀释剂如水、盐水或PEG 400中的有效量的包装的核酸；(b)分别含有预定量活性成分的液体、固体、颗粒或明胶的胶囊、袋装或片剂；(c)悬浮于适当液体中的悬剂；以及(d)合适的乳剂。片剂形式可包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、 胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸以及其它辅料，着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、 缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药用载体。含片形式可包括存在于调味剂如蔗糖中的活性成分，以及包括存在于惰性基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂 (acacia emulsions)、凝胶等中的活性成分的锭剂(pastilles)，除了活性成分以外，还含有本领域已知的载体。在本发明的上下文中，给患者施用的剂量应足使个体随着时间的推移产生有益的应答，例如，肺毛细血管静液压下降，肺部体液减少，肺部积液速率下降或它们的组合。任何患者的优选剂量水平将取决于多种因素，包括使用的具体调节剂的疗效、患者的年龄、体重、健康状况和饮食，与其它药物可能的组合和基于败血症的严重性。剂量的大小也将取决于对特定个体给药特定化合物或载体所伴随产生的任何不良副作用的存在、性质和程度。在确定所给药的整合素α νβ 5的拮抗剂的有效量时，医师可评价拮抗剂毒性和拮抗剂的循环血浆水平。在一般情况下，对于一般的个体，拮抗剂的剂量当量为约Ing/
kg-10mg/kgo用于给药时，可由拮抗剂的LD5tl和施用于主体(the mass)的不同浓度拮抗剂的副作用以及个体的整体健康状况所确定的速率来给药整合素α νβ 5的拮抗剂。可实现单次或分次剂量的给药。VI.组合治疗
在一些实施方案中，整合素α νβ 5的拮抗剂与治疗或预防败血症的第二治疗剂一起给药。例如，整合素α ν β 5的拮抗剂(例如，ALULA、人源化ALULA、ALULA片段或与 ALULA竞争结合α ν β 5的抗体)可与用于败血症的标准治疗的任何一种物质一起给药，如抗生素、他汀类药物、类固醇、活性蛋白C、利尿剂、血管收缩剂或正性肌力药物(inotropic drugs)。此外，整合素α νβ 5的拮抗剂可与作用于败血症代谢途径的制剂一起给药。例如， 整合素α νβ 5的拮抗剂可与以下物质一起给药TGFi3途径抑制剂、活化的蛋白C、GM_CSF、 特异性结合整合素α νβ 5或β 5的抗体、整合素α νβ 5的第二拮抗剂、特异性结合整合素 ανβ6的抗体、整合素α ν β 6的拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、抗凝血酶制剂、rho激酶抑制剂和抑制整合素α νβ 5表达的核酸，包括例如本文所述的反义寡核苷酸和siRNA。他汀类药物(HMG-CoA还原酶抑制剂)包括，例如辛伐他汀(simvastatin)或阿托伐他汀(atorvastatin)。抗生素治疗是常见的，最好由医疗专业人员专门针对特定的感染来选定。典型抗生素包括，例如青霉素、红霉素、环脂肽(达托霉素)、甘胺酰环素类(替加环素)和恶唑烷酮类(利奈唑胺)。TGF-β通路合适的抑制剂包括，例如TGF-β抗体(包括那些特异性阻断 TGF- β UTGF- β 2,TGF- β 3 或其任何组合)，描述于例如 Ling 等，J. Amer. Soc. Nephrol. 14 377-388 U003) ,McCormick 等，J. Immunol. 163 :5693-5699(1999)和 Cordeiro，Curr. Opin. Mol. Ther. 5(2) =199-203(2003) ；TGF-β受体II型抑制剂或TGF-β受体I型激酶抑制齐U，描述于例如 DaCosta Bayfield, Mol. Pharmacol. 65(3) :744-52(2004), Laping, Curr. Opin. Pharmacol. 3(2) :204-8(2003), Laping, Mol. Pharmacol. 62(1) :58-64(2002)；可溶性 II 型 TGF-β 受体，描述于例如 Pittet，J. Clin. Invest. 107 :1537-1544(2001) ；Wang 等，Exp Lung Res. 28(6) :405-17(2002)和 Wang，Thorax 54(9) :805-12(1999)；可溶性的潜在相关多肽，描述于例如Zhang，J Invest. Dermatol. 121(4) =713-9(2003)；血小板反应蛋白I型抑制剂，描述于例如Crawford等，细胞(Cell) 93 1159-1170 (1998)，Riberiro 等，J. Biol. Chem. 274 :13586-13593(1999)和 khultz-Cherry 等，J. Biol. Chem. 269 沈775力6782 (1994)。合适的β _2激动剂包括，例如沙丁胺醇、比托特罗、福莫特罗、异丙肾上腺素、左旋沙丁胺醇、异丙喘宁、吡布特罗、沙美特罗和特布他林。此外，整合素α νβ 5的拮抗剂可与美国专利公开No. 20020004042中描述的 β 2 肾上腺素受体以及美国专利公开 Nos. 2000/40019206,2004/0019037,2004/0019035, 2004/0018192,2004/0010023,2003/0181440,2003/0171271,2003/0139398, 2002/0037889,2002/0077321和2002/0072500中描述的整合素α νβ 5的小分子抑制剂一
起给药。整合素α νβ 5的拮抗剂(例如，ALULA、人源化或嵌合ALULA、ALULA片段或与 ALULA结合竞争α νβ 5的抗体)可与第二治疗剂同时或依次给药。例如，可首先给药整合素α νβ 5的拮抗剂，然后给药第二治疗剂。或者，可首先给药第二治疗剂，然后给药整合素 α νβ 5的拮抗剂。在某些情况下，整合素α νβ 5的拮抗剂和第二治疗剂可在同一制剂中给药。在其它情况下，整合素α νβ 5的拮抗剂和第二治疗剂可在不同制剂中给药。当整合素 α νβ 5的拮抗剂和第二治疗剂在不同制剂中给药时，它们的给药可同时或依次进行。用于给药时，可由拮抗剂和第二治疗剂组合的LD5tl和施用于主体(the mass)的不同浓度的拮抗剂和第二治疗剂的副作用以及个体的整体健康状况所确定的速率来给药整合素α νβ 5的拮抗剂和第二治疗剂。在某些情况下，整合素α νβ 5的拮抗剂和第二治疗剂分别施用的剂量为亚治疗剂量或治疗剂量。
实施例实施例1 材料和方法试剂和抗体LPS(List Pharmaceuticals)，VEGF 和 TGF-β (R&D Systems)，凝血酶(Amersham Biosciences)。鼠抗人 α νβ 3 抗体(LM609 克隆)(Chemicon)和鼠 IgGl 同种对照(Upstate)。鼠抗鼠 / 人 α ν β 5 抗体(ALULA)，由 Amha Atakilit 惠赠(Su 等 2007 Am J Respir Cell Mol Biol 36 :377)和 C7 (抗牛 LDL 受体 IgG2b 同种型对照(ATCC)。125I 标记的牛血清白蛋白(BSA)(Jeanatope ISO-TEX Diagnostics), 14C-BSA(Perkin-Elmer) 鞘氨醇1-磷酸(SIP) (Sigma)。细胞培养根据EGM-2 培养基(Clonetics，Lonza)中制造商的方法培养和维持人肺动脉内皮细胞(HPAEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。跨内皮白蛋白通量检测以每孔75，000个细胞的接种量将细胞接种到胶原蛋白包被的 6. 5mm PFTE 膜 Costar Transwells (Fisher Scientific)中，培养至细胞融合。将细胞与本文描述的抗体和试剂进行孵育。然后，向各上室(upper compartment)中加入 14C-BSA (0. 005 μ Ci) (Perkin-Elmer), 37°C 1 小时，然后从下室(lowercompartment 收集内容物并用 LS 6500 多用途闪烁计数器(LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter) (Beckman)计数。只研究基线处保持> 97%示踪剂的单层细胞。肌动蛋白细胞骨架染色细胞生长于胶原蛋白包被的盖玻片上，融合4天以上。所述细胞为血清饥饿的细胞(1池)，用本文描述的抗体和制剂进行预处理。然后用3.7%多聚甲醛固定细胞lOmin，用0.5% triton X-100渗透，然后用罗丹明鬼笔环肽(Molecular Probes)染色，包埋并用配备落射荧光(印ifluorescence)的Leica DM5000B显微镜成像。β 3亚基基因敲除小鼠、β 5亚基基因敲除小鼠和WT小鼠在本实验室中饲喂并保存129/sv背景的β 3和β 5亚基基因敲除小鼠以及WT小鼠。所有实验采用年龄和体重匹配的体重为20g(+/-2g)的雌性小鼠。腹膜内(i.p. ) LPS 败血症模型将用水稀释的 LPS (List Pharmaceuticals) lmg/ ml以lOmg/kg或i:3mg/kg的剂量进行腹膜内注射。器官血管外渗透检测分别应用败血性损伤(s印tic insult)后，在预定的时间点(LPS腹膜内注射约36小时)，球后静脉(retroorbitally)注射0. 5 μ Ci 125I-BSA并循环2小时。两个小时后，对小鼠处以安乐死，摘取器官分别进行每分钟125I计数(CPM) (Wizard Y counter, PerkinElmer)的个体评估。摘取的器官包括小肠/肠系膜、结肠。同时进行肺血管通透性评估，如使用我们之前描述的方法来测定血管外血浆当量 (extravascular plasma equivalents)(EVPE) (Su 等 2007 Am J Respir Cell Mol Biol 36 377)。FITC-BSA定位肠系膜血浆渗漏对小鼠处以安乐死之前2小时，球后静脉注射 (100mg/kg) FITC-标记的 BSA (90S Sigma FD70S，25mg/ml 储备液(stock))，在显微镜下确定内皮渗漏的位点。取整块肠系膜及小肠，小心不要破坏血管。制备肠系膜整标本并用4% 多聚甲醛和PBS 0. 3% Triton 固定(Baluk等(1999)Br J Pharmacol 126 :522)。用 LeicaDM5000B显微镜确定渗漏位点作为局部FITC外渗区。骨髓重建用过量异氟醚和颈椎脱位对6-8周龄的供体鼠(β 3基因敲除或野生型系)处以安乐死。从远端长骨的末端(distal ends of extremity long bones)采集骨髓细胞并悬浮于IMDM 20%胎牛血清培养液中。向经照射(1，lOORADs，约8分钟)的小鼠尾静脉注射1-3 X IO6个细胞/感受态细胞(recipient)。用新霉素/多黏菌素的水溶液后处理(postprocedure)经照射的小鼠6周。用流式细胞仪测定血小板上表达β 3的骨髓植入。表达β 3的鼠血小板的分离和评估从小鼠下腔静脉穿刺采血，并加入到含Walsh 缓冲液(NaCl 137nM, KCl 2. 7nM, MgCl2. 6H20 1. OmM, NaH2PO4. H2O 3. 3mM, HEPES 3. 8mM，葡萄糖0. 1%,BSA 0. 1%,ρΗ 7.4)和ACD(Sigma)的管中。加入10个单位腺苷三磷酸双磷酶 (apyrase)和0. 75 μ 1 PGEl，悬浮，然后离心(200g 5分钟)。除去富含等离子的血浆，加入 2. 0 μ 1腺苷三磷酸双磷酶和0. 75 μ 1 PGE1，然后离心(700g 5分钟)。然后将沉淀的血小板与β 3抗体孵育(eBioscience，抗鼠CD61克隆2C9. G3 16-0611-81)并用抗仓鼠PE 二抗 (杰克逊实验室(Jackson Labs))进行标记，用流式细胞仪(FACSort，Beckton Dickinson) 处理。血细胞比容测定通过穿刺下腔静脉采血并吸入到微量毛细管中，在微量毛细管 (Unico C MH30)中旋转(spin)。实施例2 激动剂诱导的人肺动脉内皮细胞(HPAEC)通诱件被α ν β 5的抗体抑制削弱，目.被α ν β 3的抗体抑制增强。用整合素α ν β 5和α ν β 3特异性的功能封闭抗体处理HPAEC，观察对发生水肿的(edemagenic)激动剂诱导的通透性的影响。通过测定Transwells中生长的单层融合细胞的C14-BSA通量检测内皮细胞通透性。抑制αvβ5的抗体削弱了应答VEGF、TGF-β和凝血酶所增加的通透性。相比之下，抑制α νβ 3的抗体提高了应答这些激动剂的通透性(图 1Α)。实施例3 α ν g 3禾口 a v g 5共定位于粘着斑。考虑到α νβ 5和α νβ 3阻断对激动剂诱导的通透性的影响相反，我们进行免疫细胞化学定位HPAEC中的α νβ 5和α ν β 3，来评价这些功能上的差异是否与不同的细胞分布有关。令人惊讶的是，两种整合素大量地共同定位于粘着斑位点(图1Β)。实施例4 a Vf3 5优选地支持凝血酶诱导的应力纤维的形成以及α νβ 3优选地支持SlP诱导的皮层肌动蛋白的形成。尽管它们占据着共同的粘着斑，我们检测ανβ5和α νβ 3是否能够以与观察到功能效应一致的方式支持肌动蛋白组织的不同模式。凝血酶为促凝的丝氨酸蛋白酶，其诱导内皮通透性的特性已被广泛研究。凝血酶信号通过PAIi1 G蛋白耦合受体(GPCR)启动能激活IihoA和组织F-肌动蛋白形成应力纤维的复杂信号通路。鞘氨醇-1-磷酸(SlP)是鞘磷脂膜破裂产生的脂质。与PAIi1相反，SlP1受体的激活引发了内皮屏障的保护性反应。 SlP1S化导致pllOa磷酸肌醇3-激酶(PI3K)依赖的Tiam-I募集到富含凹陷蛋白的微区 (microdomains)及Racl的激活，从而诱导了肌动蛋白重组为皮层分布的维管束，即“皮层” 肌动蛋白。我们研究了 α ν β 5和α ν β 3的抗体阻断对凝血酶功能和形态的不同效果的影响的HPAEC中应力纤维的形成。 整合素α νβ3封闭抗体没有影响(图1C)。相比之下，SlP诱导的皮层肌动蛋白的形成不受α ν β 5抗体的影响，而是被α ν β 3抗体削弱(图1D)。实施例5 α ν β 3阻断克服了对凝血酶诱导的通诱件的SlP保护。接下来我们研究了 α νβ 3阻断对SlP诱导的屏障保护应答的影响。用ανβ3或同种对照抗体预处理HPAEC，然后用SlP处理，用增加剂量的凝血酶刺激。与用同种对照预处理的细胞相比，用α νβ 3抗体进行的预处理克服了 SlP的屏障保护应答，并引发了对凝血酶的高渗透性应答。(图1Ε)。t施例6:在LPSi秀导的急t牛肺损伤(ALI) It型中，β 3某因敲除小鼠 曾力D了肺水肿形成。功能阻断性α νβ 5抗体减少了急性肺损伤(ALI)的缺血再灌注模型中肺水肿的形成，在ALI的呼吸机诱导模型(ventilator-induced model)中，阻止了经α ν β 5抗体处理的和β 5亚基基因敲除小鼠的肺水肿形成(Su等.(2007)Am J Respir Cell Mol Biol 36:377)。为了确定观察到的由α νβ 3阻断引发的高渗透性内皮应答是否与ALI模型有关，我们测定了气管(图2Α)和腹膜内(i.p.)(图2B)给药LPS后，β 3基因敲除小鼠对野生型对照小鼠的肺血管通透性。在各模型中，我们发现β3基因敲除组中肺部伊文思蓝外渗显著增加。为了确定β 5缺陷的保护效果是否适用于LPS诱导的ALI模型，我们测定了在进行气管和腹膜内LPS给药后，β 5基因敲除小鼠对野生型对照小鼠的肺部伊文思蓝外渗。初步结果表明，β 5基因敲除小鼠在LPS诱导的ALI模型中减少了肺水肿的形成。对体重和性别匹配的β 5基因敲除和野生型小鼠腹膜内给药含50 μ g LPS的水50 μ lvs. 50 μ 1水载体对照或10mg/kg。实施例7 在腹膜内LPS诱导的败血症中，与野生型对照相比，β 3基因敲除小鼠的死亡率增加。我们试图确定在全身败血症模型中，ανβ3功能的缺失是否会增强高渗透性内皮应答。在腹膜内LPS诱导的腹膜败血症模型中，我们发现与野生型对照相比，β3基因敲除小鼠的死亡率增加(图3Α)。实施例8 进行LPS腹膜内注射后，β 3基因敲除小鼠的肠系膜血管周围出现 FITC-BSA示踪剂局部外渗。为了确定β 3缺陷中LPS诱导的死亡率增加是否与全身血管的通透性增加有关， 我们在摘取完整的小肠和肠系膜进行整标本成像之前2小时，注射FITC-BSA血管示踪剂。 我们通过显微镜观察到完整的血管被FITC荧光加强。我们发现在进行腹膜内LPS给药 (10mg/kg)后，与野生型对照相比，β 3基因敲除小鼠局部肠系膜血管示踪剂外渗增加(图 3Β)。
_3]=flgflg^l^MLPS(10mR/kR)后，β 3基因高祁余小薩,夕卜渗至小肠/莫禾口
结肠中的1mI-BSA增加。 为了量化这种高渗透性应答，我们在整块摘取小肠/肠系膜和结肠之前2小时注射125I-BSA血管内示踪剂。我们对整器官进行每分钟计数(CPM)分析并标准化血清计数 (normalized to serum counts) 0我们发现与野生型小鼠相比，β 3基因敲除小鼠的肠系
23膜/小肠和结肠中125I-BSA示踪剂显着增加(图3C)。实施例10 α ν β 3的抗体抑制增强了激动剂诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的通诱件。为了确定α νβ 3阻断引起的内皮高渗透性应答是否与来自全身血管的内皮细胞有关，我们用α ν β 3封闭抗体对HUVEC进行预处理并研究它们对发生水肿的(edemagenic) 激动剂诱导的通透性的影响。通过检测Transwells中生长的单层融合细胞的C14-BSA通量来测定内皮通透性。我们发现，在HPAEC中，αvβ3抑制抗体增强了HPAEC中应答BEGF、 TGF-β和凝血酶引起的通透性的增加(图3D)。
_7] t施例11 目复腊内LPS 15 β 3某因高祁佘小鼠H示Ml血浓缩。整合素β 3亚基(⑶61)可与α ν (⑶51)亚基结合，也可与α IIb (⑶41)亚基结合。α ΙΛβ 3是血小板上主要的整合素并调节血小板活化、聚集和发挥功能。为了解决 (address)血小板功能障碍和可能出血的难题(confounder)，我们测定了腹膜内LPS给药 (10mg/kg)对血细胞比容的影响。我们发现β 3基因敲除小鼠的血细胞比容显著增加，针对显著出血提供了证据，更确切地说，血管通透性和血浆外渗增加(图3Ε)。^MM 12 在目复腊内LPS败血症It型中β 5某因敲除小鼠存活率 曾力口。α νβ 5阻断和缺陷为激动剂诱导的通透性提供了保护。我们目前的研究表明， ανβ5和α νβ 3对血管通透性具有相反的调节作用，在LPS诱导的败血症中，β 3基因敲除小鼠血管通透性及死亡率增加。在腹膜内LPS诱导的腹膜败血症模型中，我们发现与野生型对照相比，β 5基因敲除小鼠存活率增加(图4Α)。该结果表明，ανβδ缺陷降低了血管通透性和与败血症相关的不利影响。实施例13 进行LPS腹膜内注射后，β 5基因敲除小鼠的肠系膜血管周围 FITC-BSA示踪剂的局部外渗减少。为了确定用腹膜内LPS给药的β 5缺陷是否出现屏障保护性应答，我们在摘取完整的小肠和肠系膜进行整标本成像之前2小时，注射FITC-BSA血管示踪剂。通过显微镜观察到完整的血管被FITC荧光加强。我们发现在进行腹膜内LPS给药(13mg/kg)后，与野生型对照相比，β 5基因敲除小鼠局部肠系膜血管示踪剂外渗减少(图4Β)。实施例14 在腹膜内LPS诱导的败血症中，与野生型对照相比，给药α Vf3 5封闭抗体延缓了死亡时间。腹膜内LPS给药(i:3mg/kg)M小时后，野生型小鼠呈现出病态，类似于诊断为败血症综合征的危重个体。此时，用ανβ5封闭抗体对比同种对照抗体对小鼠进行治疗。我们发现，与用同种对照治疗的小鼠(图4C)相比，用α νβ 5封闭抗体治疗的小鼠显著延缓了死亡时间。这些结果是惊人的，因为给药α νβ 5封闭抗体实际上逆转了败血症。通常，败血症反应的急性性质需要立即有效的医疗干预，例如，通风、透析、静脉输液和抗生素。实施例15 在盲肠结扎和穿刺(CLP)败血症模型中，与野生型对照相比，给药 qyg5封闭抗体延缓了死亡时间。为了进一步探讨α νβ 5封闭抗体逆转败血症的能力，我们进行了盲肠结扎和穿刺手术，然后给药α νβ 5抗体ALULA和对照(C7)抗体。CLP是标准的用于研究多种微生物腹膜败血症的啮齿动物模型(例如见，Rittirsch等(2009)Nat. Protocols 4:31-36)。简
24单地说，手术包括在盲肠端部和回盲瓣之间50%距离处结扎盲肠，然后用23号针头贯穿穿刺远端盲肠。大便的小珠(a small bead of stool)(多种内源性细菌源)通过穿刺位点表达。盲肠穿孔导致细菌性腹膜炎，然后是全身性激活的炎症应答和败血症，并最终导致死亡。我们对20只小鼠进行了 CLP手术，随机各选10只用对照抗体或α νβ 5抗体进行治疗。进行CLP手术且腹部手术切口闭合后，以单剂量由球后静脉丛(retroorbital plexus)静脉注射(iv)给药α νβ 5抗体或对照抗体。死亡率记录如图5所示(时间单位为小时)。研究结果证实了它们来自于LPS的实例。同样，给药ανβ5封闭抗体显着提高了存活率，有80%小鼠存活超过10天。相比之下，用对照抗体治疗的小鼠只有40%存活。因此，暴露于细菌感染后给药α νβ 5封闭抗体足以降低败血症和死亡的可能性。以上实施例用于说明本发明，但不限制其范围。本发明的其它变化形式对于本领域普通技术人员而言是显而易见的，并涵盖于所附权利要求的范围内。本文中引用的所有出版物、数据库、专利、专利申请和登录号为所有目的通过全文引用并入于此。
权利要求
1.治疗或预防个体败血症的方法，该方法包括向个体给药治疗量的整合素ανβ5 特异性抗体，其中所述抗体特异性抑制配体与整合素α νβ 5结合，且所述抗体不显著结合 ανβ3, ανβ6, ανβ8^β8 中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体不显著结合ανβ3、β3、ανβ6、β6、 α νβ8或β 8中的任何一个。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述配体选自下组玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、腱生蛋白c和腺病毒五邻体基底。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体与由ATCC保藏号ΡΤΑ-5817的杂交瘤细胞产生的ALULA抗体特异性竞争结合整合素ανβ5。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体包括ALULA的互补决定区。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体为人源化或嵌合ALULA。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体为ALULA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述给药为腹膜内或静脉注射。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体为人类。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体罹患败血症。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体具有败血症的发病风险。
13.根据权利要求1所述的方法，进一步包括向个体给药第二治疗剂以治疗或预防败血症。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂选自下组抗生素、他汀类药物、类固醇、活化的蛋白C、TGF_i3信号通路抑制剂、GM-CSF、利尿剂、整合素α ν β 5的拮抗齐U、特异性结合整合素α νβ 5的二抗、整合素α νβ 6的拮抗剂、血管收缩剂和肌肉收缩药物。
15.治疗或预防个体败血症的方法，该方法包括通过给药治疗量的能够特异性抑制整合素α νβ 5的活性或表达，但不显著抑制ανβ3、β3、ανβ6、β6、ανβ8或β 8中至少一个的活性或表达的制剂，从而抑制个体中整合素α νβ 5的活性或表达。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述制剂选自下组整合素ανβ 5的拮抗剂、 整合素α νβ 5的小分子抑制剂和抑制β 5亚基表达的多核苷酸。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述制剂选自整合素ανβ 5特异性抗体和整合素α νβ 5的小分子抑制剂。
全文摘要
本发明提供通过阻断与整合素αvβ5结合以治疗和预防整合素αvβ5相关疾病的组合物及方法。具体地，整合素αvβ5特异性抗体可用于预防、治疗和逆转败血症。
文档编号A61K39/00GK102481347SQ201080033367
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月26日 优先权日2009年7月24日
发明者乔治·苏, 迪恩·谢泼德, 阿姆那·阿塔卡利特 申请人:加州大学董事会