专利名称：生长激素多肽及其制备和使用方法
生长激素多肽及其制备和使用方法
关于联邦资助研究的声明
本发明在由美国国立卫生研究院授予的SBIR基金2R44GM079873-02的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月8日提交的美国临时申请N0.61/185，112 ；2009年8月25日提交的美国临时申请N0.61/236,836 ;和2009年11月10日提交的美国临时申请N0.61/280，955，以及2010年2月3日提交的美国申请N0.12/699，761和PCT申请N0.PCT/US10/23106的优先权权益，这些申请都是待决的，其全部内容在此以引用的方式并入本文。
发明背景
人生长激素(hGH)是参与调节人生长和发育的激素。生长激素(下文称为“GH”)还称为促生长素，代表了一类由垂体前叶的促生长细胞产生和分泌的蛋白质激素。GH的分泌受下丘脑的生长激素释放激素(GHRH)刺激，并受促生长素抑制素的抑制。这种垂体激素表现出许多生物效应，包括体质发生、泌乳、巨噬细胞的活化、胰岛素样和致糖尿病效应等等(Chawla, R, K.(1983)Ann.Rev.Med.34,519 ；Edwards,C.K.等(1988)Science 239,769 ；Thorner，M.0.，等(1988) J.Clin.1nvest.81，745)。人生长激素是包括胎盘催乳激素、促乳素和GH的其它遗传和种类变体的同源激素家族的成员。除了统称为生长调节素的其它肽激素以外，GH还调节胰岛 素样生长因子(IGF-1，以前称为生长调节素C)的分泌，这负责其大部分的生物活性。
许多疾病和疾患与GH缺乏相关。缺乏可以是先天的、在儿童或成人生命中获得的，并且可以是部分的或完全的。在一些情况下，缺乏是短暂的，但更通常是持久的，并且可以伴随其它垂体激素的缺乏而发生。儿童的生长激素缺乏导致侏儒症、生长不足或身材矮小。在成人中缺乏是罕见的，但症状可以包括体重降低和骨密度不良以及许多心理症状。其它激素或腺体疾患常与生长激素缺乏一致。
刺激儿童身高增加是GH最普遍了解的效应，并且似乎通过至少两种机制而发挥功能:GH直接刺激软骨的软骨细胞的分裂和增殖，并且GH还刺激IGF-1的生成。IGF-1对许多组织具有生长刺激效应。另外的IGF-1在靶组织内产生，使其明显是内分泌和自分泌/旁分泌激素。IGF-1还对成骨细胞和软骨细胞活性具有刺激效应以促进骨生长。
通过其对蛋白质、糖类和脂类代谢的效应，人生长激素(hGH)在身体生长中起重要作用。除了其对身体生长的效应，已显示hGH在体外刺激血细胞(Derfalvi等，1998 ；Merchav等；1988)，增加红细胞和血红蛋白计数(Valerio等，1997 ；Vihervuori等，1996)，增强浆细胞系的增殖和Ig生成(Kimata和Yoshida，1994)并刺激⑶8+细胞计数和较低程度的 CD4+ 细胞计数(Geffner，1997)。
针对儿童和成人GH缺乏、特纳综合征(Turner Syndrome)、普瑞德威利综合征(Prader-Willi Syndrome)和小于胎龄儿的GH可注射形式已有销售。此外,它已经用于对抗衰老和用于体重管理以及动员能够在外周血中再生造血作用的细胞。
hGH的分子量22kDA远低于肾滤过的阈值约70kDa(Caliceti (2003)Adv DrugDeliv Rev 55:1261-1277)，这促使天然hGH在人中的血清半衰期低于20分钟。因此，hGH的商品化制剂必须每天给药以实现临床益处。GH的持续释放形式Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)在1999年被FDA批准,允许较少注射(每2或4周一次,而不是每天一次)；然而，该产品在2004年被中止。
对治疗蛋白的化学修饰可以改变其体内清除率和随后的血清半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通过PEG上与胺基(例如赖氨酸侧链或N端)反应的醛或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团而与蛋白质偶联。然而，偶联步骤可导致需要分离的不均一产物混合物的形成，导致明显的产物损失和生产复杂性，并且得不到化学上完全均一的产物。而且，如果其结合位点附近的氨基酸侧链被PEG化过程所修饰，GH的药理学功能可能受阻。其它方法包括Fe结构域与治疗性GH蛋白质的基因融合。Fe结构域的偶联增加了治疗蛋白的大小，因此降低了通过肾的清除率。此外，Fe结构域赋予结合溶酶体并通过FcRn受体从溶酶体再循环的能力，这导致增加的药代动力学半衰期。不幸的是，Fe结构域未能在重组表达期 间有效折叠，并易于形成被称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解并且功能性蛋白质必须从错误折叠的聚集物复性，这是耗时、低效且昂贵的过程。因此，依然需要能够增加半衰期并且能够以较低频率施用、但是更安全并且生产上较不复杂和成本较低的生长激素组合物。
发明概述
本公开内容涉及可用于或治疗通过施用生长激素而改善、缓解或抑制的任何疾病、疾患或病症的组合物和方法。具体说，本发明提供了融合蛋白组合物，所述融合蛋白组合物包含与生长激素(GH)连接的具有非重复序列和/或非结构化构象的一个或多个延伸的重组多肽(XTEN)。部分地，本公开内容涉及包含所述融合蛋白的药物组合物及其治疗生长激素相关疾病、疾患或病症的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其包含与选自表I的氨基酸序列具有至少约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%的同一性的生长激素，其中所述生长激素与至少约100、或至少约200、或至少约400、或至少约800、或至少约900、或至少约1000、或至少约2000、多至约3000个氨基酸残基的延伸的重组多肽(XTEN)连接，其中所述XTEN特征在于:(a)所述XTEN序列包含显示与类似长度的选自表3所示序列的氨基酸序列具有至少约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%同一性的至少约200个连续氨基酸；(b)当通过ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法分析时，所述XTEN序列缺少预测的T细胞表位，其中所述对所述XTEN序列中表位的ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法预测基于_5、或-6、或-7、或-8、或-9或更高的评分；(c)所述XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或甚至更小的序列评分；和(d)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成所述XTEN的总氨基酸残基的超过约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%。在一个实施方案中，分离的融合蛋白的生长激素是人生长激素。在另一实施方案中，所述分离的融合蛋白包含至少第二 XTEN，其中所述融合蛋白具有表5所示的多XTEN构型或其变体。
在另一实施方案中，GHXTEN融合蛋白的XTEN序列特征在于:通过GOR算法确定，它具有大于90 %的无规卷曲形成、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99 %的无规卷曲形成；并且通过Chou-Fasman算法确定,所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和2%的β折叠。
在另一实施方案中，本发明提供了 GHXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于 天冬酰胺和谷氨酰胺残基总和小于所述XTEN总氨基酸序列的10%，甲硫氨酸和色氨酸残基总和是所述XTEN总氨基酸序列的小于2 %，所述XTEN序列具有小于5%的带正电荷的氨基酸残基，通过GOR算法确定所述XTEN序列具有大于90%的无规卷曲形成、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%的无规卷曲形成；并且通过Chou-Fasman算法确定所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和2%的β折叠。
在另一实施方案中，本发明提供了 GHXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于:XTEN序列的至少约80 %、或至少约90 %、或至少约91%、或至少约92 %、或至少约93 %、或至少约94%、或至少约95 %、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %由非重叠序列基序组成，其中每个序列基序具有约9至约14个氨基酸残基，并且其中任何两个连续氨基酸残基的序列在每个序列基序中出现不超过两次，所述序列基序由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴、谷氨酸(E)和脯氨酸⑵的4至6个类型的氨基酸组成。
在一些实施方案中，没有一个类型的氨基酸构成GHXTEN的XTEN序列的超过30 %。在其它实施方案中，XTEN具有其中没有三个连续氨基酸是相同的序列，除非所述氨基酸是丝氨酸，在这种情况下，不超过三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约80%、或约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%、或100%由非重叠序列基序组成，其中每个序列基序具有12个氨基酸残基。在一个实施方案中，XTEN序列由非重叠序列基序组成，其中所述序列基序来自表2的一个或多个序列。
在一些实施方案中，GHXTEN融合蛋白与未连接XTEN的GH相比表现出增强的药代动力学性质，其中增强的性质包括但不限于更长的终末半衰期、更大的曲线下面积、血药浓度在治疗窗内维持时间的增力口、连续剂量之间时间的增加和随时间的摩尔剂量的降低。在一些实施方案中，施用给受试者的GHXTEN融合蛋白的终末半衰期增加至以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的GH的终末半衰期的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍、或甚至更高。在其它实施方案中，增强的药代动力学性质由以下事实反映=GHXTEN融合蛋白在给定时段在治疗窗内维持的血药浓度是以类似剂量施用给受试者的未连接 XTEN的GH的至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍。与未连接XTEN的相应GH相比，半衰期和治疗窗内维持时间的增加允许较低频率的给药和施用给受试者的融合蛋白量(以摩尔当量表示)的减少。在一个实施方案中，治疗有效剂量方案导致融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至使用类似剂量方案施用给受试者的未连接至融合蛋白的GH的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至少10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍、或至少约100倍。
在一些实施方案中，与连接了生物活性蛋白的XTEN相比，XTEN与生物活性蛋白连接时增强了生物活性蛋白的热稳定性，其中热稳定性通过在暴露于约37°C的温度下至少约7天之后测量生物活性的保留来确定。在前述一个实施方案中，与未连接XTEN的GH相比，包含XTEN的GH的生物活性保留时间增加至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、或约150%、至少约200%、至少约300%或约500%。
在一些实施方案中，具有至少第一 XTEN的分离的融合蛋白包含GH，其中GH是人生长激素。在一些实施方案中，分离的融合蛋白还包含第二 XTEN，其可以与第一 XTEN相同或不同，并且其中融合蛋白具有表5所不的多XTEN构型。在前述的一个实施方案中，第一和第二 XTEN可以各自是选自表3的序列，或者可以表现与选自表3的序列至少约80%、或至少约90%、或至少约91%、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %或100 %序列同一性。在另一实施方案中，包含第二 XTEN序列的分离的融合蛋白具有表5所示的多XTEN构型。
在一个实施方案中，分离的融合蛋白与未连接XTEN的GH相比具有较低的免疫原性，其中免疫原性通过例如在给受试者施用类似剂量之后测量选择性结合生物活性蛋白的IgG抗体的生成来确定。
在一些实施方案中，融合蛋白的生长激素肽和XTEN通过间隔区连接，其中所述间隔区序列包含约I至约50个氨基酸残基，任选地包含裂解序列。在一个实施方案中，裂解序列易受蛋白酶裂解。这种蛋白酶的非限制性实例包括FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa,FIXa、FXa、凝血酶、弹性蛋白酶-2、粒酶 B、MMP-12、MMP-13、MMP-17 或 MMP-20、TEV、肠激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分选酶A(sortase A)。
在一些实施方案中，构造分离的融合蛋白使之与未连接至融合蛋白的相应GH相比具有降低的对相应GH的靶受体的结合亲和力。在一个实施方案中，GHXTEN融合蛋白对GH的靶受体表现出如下范围的结合亲和力:缺少XTEN的相应GH的结合亲和力的约0.01% -30%、或约0.1%至约20%、或约1%至约15%、或约2%至约10%。在另一实施方案中，GHXTEN融合蛋白对GH的靶受体的结合亲和力降低至未连接XTEN的GH的最多约1/3、或最多约1/5、或最多约1/6、或最多约1/7、或最多约1/8、或最多约1/9、或最多约1/10、或最多约1/12、或最多约1/15、或最多约1/17、或最多约1/20、或最多约1/30、或最多约1/50、或最多约1/100。在相关的实施方案中，亲和力降低的融合蛋白可以具有降低的受体介导的清除和相应的半衰期增加，半衰期是未连接融合蛋白的相应GH的至少约3倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约12倍、或至少约 15倍、或至少约17倍、或至少约20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的GHXTEN融合蛋白，其包含与选自表35、表36和表37的序列具有至少约80%、或至少约90%、或至少约91 %、或至少约92%、或至少约93%、或至少约94%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%、或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了 GHXTEN融合蛋白，其中GHXTEN在生理条件下表现出溶解度增加至未连接融合蛋白的GH的溶解度的至少3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。
在一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱测定，GHXTEN融合蛋白表现出与实际分子量相比增加的表观分子量，其中表观分子量是至少约100kD、或至少约150kD、或至少约200kD、或至少约300kD、或至少约400kD、或至少约500kD、或至少约600kD、或至少约700kD，而融合蛋白的每个GH组分的实际分子量小于约25kD。因此，GHXTEN融合蛋白的表观分子量可以是融合蛋白的实际分子量的约4倍、或约5倍、或约6倍、或约7倍、或约8倍。在一些情况下，前述实施方案的分离的GHXTEN融合蛋白在生理条件下表现出大于约4、或约5、或约6、或约7、或约8的表观分子量因子。
本发明涵盖GHXTEN融合蛋白组合物，其包含但不限于选自表I的GH(或其片段或序列变体)、选自表3的XTEN (或其序列变体)，GH和XTEN具有选自表5的构型。一般而言，得到的GHXTEN将保留未连接XTEN的相应GH的至少一部分生物活性。在其它情况下，GH组分在其通过加入GHXTEN的间隔区序列内的任选裂解序列的裂解而从XTEN释放时具有生物活性或活性增加。
在GHXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供了式I的融合蛋白:
(XTEN)x-GH-(XTEN)y I
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；x是O或I且y是O或1，其中x+y彡I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在一些实施方案中，XTEN在生长激素的N端或C端与生长激素融合。在一些实施方案中，分离的融合蛋白包含人生长激素和选自AE912、AM923、AE144和AE288的第一 XTEN和第二 XTEN。
在GHXTEN组合物的另一个实施方案中，本发明提供了式II的融合蛋白:
(XTEN) x- (GH) - (S) y- (XTEN) y 11
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包含裂解序列3是0或1且7是0或1，其中x+y彡I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式III:
(GH) - (S) x- (XTEN) - (S) y- (GH) - (S) z_ (XTEN) z III
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包含裂解序列；x是O或l;y是O或l;z是O或I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中融合蛋白具有式IV:
(XTEN) x- (S) y- (GH) - (S) z_ (XTEN) - (GH) IV
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包含裂解序列；x是O或l;y是O或l;z是O或I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的融合生长激素，其中融合蛋白具有式V:
(GH) x-⑶ x- (GH)-⑶「(XTEN) V
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包含裂解序列；X是O或I ;y是O或I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VI:
(XTEN) - (S) x- (GH) - (S) y- (GH) VI
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包含裂解序列；X是O或I ;y是O或I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VII:
(XTEN) - (S) x- (GH) - (S) y- (GH) - (XTEN) VII
其中每次出现时独立地，GH是生长激素；S是具有I至约50个氨基酸残基的间隔区序列，其可任选地包含裂解序列；X是O或I ;y是O或I ;并且XTEN是延伸的重组多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VIII:
((S)m_(GH)xDn_(XTEN)y-(S)0)t VIII
其中t是大于O的整数(1、2、3等)；m、n、o、x和y各自独立为整数(0、1、2、3等)，GH是生长激素4是间隔区，任选地包含裂解位点；并且XTEN是延伸的重组多肽，条件是:(l)x+y > I,⑵当t = I时，X > O且7 > O, (3)当存在不止一个GH、S或XTEN时，每个GH、XTEN或S是相同的或独立不同的；并且(4)当t > I时，每个亚单位中的m、n、o、x或y是相同的或独立不同的。
在一些实施方案中，治疗有效剂量的式1-VIII的实施方案的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致在融合蛋白治疗窗内维持的时间增加至以类似剂量施用给受试者的未连接XTEN的相应GH的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍或更多。在其它情况下，治疗有效剂量的式1-VIII的实施方案的融合蛋白施用给有相应需要的受试者可以导致与以类似剂量施用的未连接XTEN的GH相比，维持治疗有效剂量方案所必需的连续剂量之间时间增加至少48h、或至少72h、或至少约96h、或至少约120h、或至少约7天、或至少约14天、或至少约 21天。
融合蛋白可以被设计为具有不同构型，GH的N端至C端、XTEN和任选的间隔区序列，包括但不限于 ΧΤΕΝ-GH、GH-XTEN、XTEN-S-GH、GH-S-XTEN、XTEN-GH-XTEN、GH-GH-XTEN、XTEN-GH-GH,GH-S-GH-XTEN,XTEN-GH-S-GH及其多聚体。如本文所公开的，构型的选择可以赋予特定的药代动力学性质、理化性质或药理性质。
在一些实施方案中，分离的融合蛋白特征在于:(i)与缺少XTEN的相应生长激素相比，它具有更长的半衰期；(ii)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少XTEN的相应生长激素相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积(AUC)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少XTEN的相应生长激素相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的治疗效应；(iv)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的缺少XTEN的相应生长激素相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积(AUC) ；(v)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的缺少XTEN的相应生长激素相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的治疗效应；(vi)与以另外等同的剂量期施用给受试者的缺少XTEN的相应生长激素相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积(AUC);或(vii)与以另外等同的剂量期施用给受试者的缺少XTEN的相应生长激素相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的治疗效应。
在一个实施方案中，上文描述的式1-VIII的GHXTEN融合蛋白表现出生物活性是未连接融合蛋白的GH的生物活性的至少约0.1 %、或至少约0.1 %、或至少约I %、或至少约2%、或至少约3%、或至少约4%、或至少约5%、或至少约10%、或至少约20%、或至少约30%、或至少40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或至少约95%。在另一实施方案中，式1-VIII的GHXTEN融合蛋白与未共价连接至融合蛋白的相应亲本生物活性蛋白结合相同的受体或配体。
本发明提供了制备融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与一个或多个延伸的重组多肽(XTEN)融合的生长激素，该方法包括:(a)提供包含编码所述融合蛋白的重组多核苷酸分子的宿主细胞；(b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；和(C)回收所述融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，融合蛋白的生长激素与人生长激素或选自表I的序列具有至少90%序列同一性。在该方法的另一个实施方案中，所表达的融合蛋白的一个或多个XTEN与选自表3的序列具有至少约90%、或约91%、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%至约100%序列同一性。在该方法的另一个实施方案中，为了所述融合蛋白在宿主细胞中增强的表达而对编码XTEN的多核苷酸进行密码子优化。在该方法的另一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在该方法的另一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在该方法的另一个实施方案中，分离的融合蛋白以基本上可溶的形式从宿主细胞的细胞质中回收。
本发明提供了包含选自以下的多核苷酸序列的分离的核酸:(a)编码前述实施方案任一个的融合蛋白的多核苷酸，或(b) (a)的多核苷酸的互补体。在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其包含与以下具有至少80%序列同一性、或约85%、或至少约90%、或约91 %、或约92%、或约93%、或约94%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%至约100%序列同一性的多核苷酸序列:(a)选自表35、表36和表37的类似长度的多核苷酸序列；或(b) (a)的多核苷酸的互补体。本发明提供了包含与本段落所述的上述实施方案任何一个的核酸的表达载体。在一个实施方案中，前述表达载体还包含与多核苷酸序列可操作连接的重组调控序列。在另一实施方案中，前述表达载体的多核苷酸序列与编码分泌信号序列的多核苷酸在框内融合，所述分泌信号序列可以是原核信号序列。在一个实施方案中，所述分泌信 号序列选自OmpA、DsbA和PhoA信号序列。
本发明提供了可包含之前段落中公开的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在另一实施方案中，宿主细胞是真核细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含前述实施方案的任何一个的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包括:包装材料和包含前述实施方案的药物组合物的至少第一容器以及标识所述药物组合物以及存储和处理条件的标签，以及关于所述药物组合的重建和/或施用给受试者的一张说明。
本发明提供了治疗受试者的生长激素相关病症的方法，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的前述实施方案任一个的融合蛋白。在该方法的一个实施方案中，生长激素相关病症选自生长激素缺乏、特纳综合征、普瑞德威利综合征、特发性身材矮小、AIDS消瘦、多发性硬化、克罗恩氏病(Crohn' s disease)、溃疡性结肠炎和肌营养不良症。
在一些实施方案中，组合物可以皮下、肌肉内或静脉内施用。在一个实施方案中，组合物以治疗有效量施用。在一个实施方案中，所述治疗有效量导致与以类似剂量施用给受试者的未连接融合蛋白的融合蛋白相应GH相比，在融合蛋白治疗窗内维持的时间增加。在治疗窗内维持的时间增加至未连接融合蛋白的GH的至少3倍，或者可选地是未连接融合蛋白的相应GH的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。在治疗方法的一些实施方案中，(i)与以另外相同的剂量方案施用的缺少XTEN的相应生长激素相比，施用较小摩尔量(例如，约1/2、或约1/3、或约1/4、或约1/5、或约1/6、或约1/8、或约1/100或更少)的所述融合蛋白，并且所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应；(ii)与使用另外相同的剂量的缺少XTEN的相应生长激素相比，所述融合蛋白以较低频率(例如，每2天一次、约每7天一次、约每14天一次、约每21天一次、或约每月一次)施用，并且所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应；或(iii)与以另外相同的剂量方案的缺少XTEN的相应生长激素相比，施用累积较低摩尔量的所述融合蛋白(例如，约5%、或约10%、或约20%、或约40%、或约50 %、或约60 %、或约70 %、或约80 %、或约90 % )，所述融合蛋白达到与缺少XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积和/或类似的治疗效应。所述累积更低的摩尔量是针对至少约一周、或约14天、或约21天、或约一个月的时段的测量。在该方法的一些实施方案中，治疗效应是选自以下的测量参数=IGF-1浓度、IGFBP3浓度、身高速度、瘦体重、全身脂肪、躯干脂肪、对胰岛素挑战的应答、软骨细胞分裂速率、软骨细胞数目、骨密度、骨生长和骺板宽度增加。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，包括利用使用治疗有效剂量方案施用的多次连续剂量的药物组合物给受试者施用上述药物组合物。在前述的一个实施方案中，所述治疗有效剂量方案可以导致所述融合蛋白的血药水平的至少两个连续Cmax峰和/或Cmin谷之间的时间增加至以类似剂量方案施用给受试者的未连接所述融合蛋白的相应融合蛋白的生长激素的至少3倍或可选地至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少约30倍、或至少约50倍、或至少约100倍。前述另一实施方案中，与使用治疗有效方案施用给受试者的未连接融合蛋白的相应生物活性蛋白组分相比，使用药物组合物的融合蛋白的较低频率给药或较低总剂量(以摩尔计)施用融合蛋白导致生长激素相关疾病的至少一个测量参数的改善。
本发明还提供了包含前述实施方案任何一个的融合蛋白的组合物在制备用于治疗有相应需要的受试者 的疾病、疾患或病症的药剂中的用途。在前述一个实施方案中，所述疾病、疾患或病症选自由特纳综合征、普瑞德威利综合征、特发性身材矮小、AIDS消瘦、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和肌营养不良症组成的组。所公开的实施方案的任何一个可以根据感兴趣的应用而单独实施或者组合实施。
通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用的方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请明确且单独地被指明而通过引用的方式并入。
附图简述
本发明的特征和优势可以参考以下详述和列出示例性实施方案的附图来进一步解释。
图1示出了全部以N端至C端方向描绘的示例性GHXTEN融合蛋白(图1A_H)的示意图。图1A示出GHXTEN融合蛋白(100)的两种不同构型，每种构型包含单个生长激素(GH)和XTEN，第一种构型具有与GH(103)的C端连接的XTEN分子(102)，并且第二种构型具有与GH(103)的N端连接的XTEN分子。图1B示出GHXTEN融合蛋白(100)的两种不同构型，每种构型包括单个GH、间隔区序列和XTEN，第一种构型具有与间隔区序列(104)的C端连接的XTEN分子(102)和与GH(103)的C端连接的间隔区序列，并且第二种构型具有与间隔区序列(104)的N端连接的XTEN分子和与GH(103)的N端连接的间隔区序列(104)。图1C示出GHXTEN融合蛋白(101)的两种不同构型，每种构型包含两个分子的单个GH和一个分子的XTEN，第一种构型具有与第一 GH的C端连接的XTEN并且第一 GH与第二 GH的C端连接，且第二种构型处于相反方向，其中XTEN连接至第一 GH的N端并且第一 GH连接至第二 GH的N端。图1D示出GHXTEN融合蛋白(101)的两种不同构型，每种构型包含两个分子的单个GH、间隔区序列和一个分子的XTEN，第一种构型具有与间隔区序列的C端连接的XTEN和与第一 GH的C端连接的间隔区序列并且第一 GH与第二 GH的C端连接，且第二种构型处于相反方向，其中XTEN与间隔区序列的N端连接并且间隔区序列与第一 GH的N端连接并且第一 GH与第二 GH的N端连接。图1E示出GHXTEN融合蛋白(101)的两种不同构型，每种构型包括两个分子的单个GH、间隔区序列和一个分子的XTEN，第一种构型具有与第一 GH的C端连接的XTEN和与间隔区序列的C端连接的第一 GH并且间隔区序列与第二GH分子的C端连接，且第二种构型处于相反构型，NTEN与第一 GH的N端连接，第一 GH与间隔区序列的N端连接，而间隔区序列与第二 GH分子的N端连接。图1F示出GHXTEN融合蛋白(105)的构型，每种构型包含一个分子的GH和与该GH的N端和C端连接的两个分子的XTEN0图1G示出与两个XTEN连接的单个GH的构型(106)，第二 XTEN通过间隔区序列与GH分开。图1H是与两个XTEN连接的两个GH的构型(106)，其中第二 XTEN与第一 GH的C端和第二 GH的N端连接，第二 GH在GHXTEN的C端。
图2是编码图1的相应GHXTEN多肽的GHXTEN基因的示例性多核苷酸构建体(图2A-H)的示意图；全部以5'至3'的方向描述。在这些说明性实例中，所述基因编码GHXTEN融合蛋白，该GHXTEN融合蛋白具有一个GH和XTEN(200);或一个GH、一个间隔区序列和一个XTEN(200);两个G H和一个XTEN(201);或两个GH、间隔区序列和一个XTEN(201);—个GH和两个XTEN(205);或两个GH和两个XTEN(206)。在这些描绘中，多核苷酸编码以下组分:XTEN(202)、GH(203)和可以包含裂解序列(204)的间隔区氨基酸，所有序列在框内连接。
图3是两个示例性单体GHXTEN和该单体融合蛋白结合细胞表面靶受体的能力以及随后细胞信号转导的示意图。图3A示出由GH(103)和XTEN(102)组成的GHXTEN融合蛋白(100)和由与两个XTEN(105)连接的GH组成的第二 GHXTEN融合蛋白(105)。图3B示出C末端具有GH的GHXTEN (100)和C末端具有XTEN的GHXTEN (105)与细胞表面(107)上GH的靶受体(108)的相互作用。在该情况下，当GH具有游离C端时表现出与受体的高亲和力结合，而具有C端XTEN的GHXTEN没有与受体紧密结合，并且解离，如图3C所示。图3D示出以高结合亲和力结合的GHXTEN(IOO)保持与受体(106)结合并且已经内化到细胞中的内体(110)，说明结合的GH的受体介导的清除并且引发细胞信号转导(109)，描绘为斑点状的细胞质。
图4是XTEN的组装、产生和评估中代表性步骤的示意流程图。
图5是编码融合蛋白的GHXTEN多核苷酸构建体组装中代表性步骤的示意流程图。单个寡核苷酸501被退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(“12-mer”)，其随后与含有BbsI和KpnI限制位点的寡聚体503连接。来自文库的其它序列基序与该12-mer退火，直到获得期望长度的XTEN基因504。将XTEN基因克隆到填充载体(stuffer vector) 0该载体编码Flag序列506,随后是两侧具有Bsa1、BbsI和KpnI位点的终止序列507和exendin_4基因508，得到编码XTEN-GH融合蛋白的基因500。
图6是在编码包含生长激素(GH)和XTEN的融合蛋白的基因的组装、其表达和作为融合蛋白回收、及其作为候选GHXTEN产物的评估中代表性步骤的示意流程图。
图7是使用不同的加工策略设计GHXTEN表达载体的示意图。图7A示出编码与GH编码序列3'端融合的XTEN的示例性表达载体。注意，该载体中不需要额外的前导序列。图7B描绘了编码与GH编码序列5'端融合的XTEN的表达载体，其具有CBD前导序列和TEV蛋白酶位点。图7C描绘了图7B中CBD和TEV加工位点被优化的N端前导序列(NTS)所替代的表达载体。图7D描绘了编码NTS序列、XTEN、GH编码序列和第二个XTEN编码序列的表达载体。
图8是包含与hGH连接的N端XTEN编码序列的GHXTEN基因的逐步构建，以及与XTEN的C端连接的144或288XTEN编码序列随后连接的示意图，如实施例22所描述。
图9示出包含GFP和XTEN序列的所示构建体的表达分析结果。使用荧光板读数器(激发395nm，发射510nm)分析表达培养物以测定GFP报告分子的存在量。结果以图表表示为框须图，指示虽然中值表达水平是“基准” CBD N端辅助结构域(helper domain)表达水平的大约一半，但来自文库的最佳克隆非常接近基准，表明围绕这些序列进一步优化是有保证的。结果还显示，从氨基酸MA起始的文库比从ME开始的那些具有更好的表达水平(参见实施例14)。
图10示出用于来自LCW546、LCW547和LCW552的克隆的N端序列中第三和第四密码子的三个随机文库。如所示的，将文库设计为第三和第四残基被修饰而使得允许的XTEN密码子的所有组合存在于这些位置。为了使每个文库包含所有这些允许的XTEN密码子，设计具有第三和第四残基密 码子多样性的编码12个氨基酸的9对寡核苷酸、使其退火并连接至IjNdel/Bsal限制酶消化的填充载体pCW0551 (填充片段_XTEN_AM875_GFP)，并转化入大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞以获得三个文库LCW0569、LCW0570和LCW0571的菌落。
图11示出如实施例15所述优化步骤之后针对前75个克隆的GFP荧光信号的再测试的直方图，相对于基准CBD_AM875构建体。结果指示几个克隆目前优于基准克隆。
图12是为联合N端48个氨基酸的两个区域的密码子优化偏好而进行的重组方法的示意图。该方法在XTEN蛋白的N端产生新的48mer，用于评估表达优化，所述表达优化得到可能是XTEN蛋白表达的解决方案的前导序列，其中XTEN在GH的N端。
图13示出证实获自XTEN N端密码子优化实验的优选密码子表达的SDS-PAGE凝胶，与在构建体序列的N端包含CBD前导序列的基准XTEN克隆相比较，如实施例17所述。
图14示出来自与GFP的N端融合的融合蛋白XTEN_AE864的稳定性研究的样本的SDS-PAGE凝胶(参见实施例39)。使GFP-XTEN在食蟹猴血浆和大鼠肾裂解物中于37°C下孵育达7天。此外，还评估了施用给食蟹猴的GFP-XTEN。在第0、1和7天提取样本并通过SDS PAGE分析，随后使用Western分析检测并使用抗GFP抗体检测。
图15示出针对hGH的受体结合分析的结果，其中将与K288多肽融合的hGH的结合活性与游离hGH相比较，如实施例25所述。
图16示出hGH-AM864(圆圈)和AM864_hGH(倒三角)与hGHR-Fc的体外结合亲和力分析的结果，如实施例25所述。示出未修饰的重组hGH(方块)用于比较。
图17示出热处理对hGH和AM864-hGH稳定性的影响，如实施例26所述。图17A是在25°C和80°C处理15分钟的两个样本的SDS-PAGE凝胶，而图17B示出80处理。C样本相对于25°C处理样本的受体结合活性的相应百分比，指示XTEN赋予hGH和GHXTEN融合蛋白热稳定性和活性保留。
图18示出基于ELISA的测定的结果，以确定加入C端XTEN降低GHXTEN结合GH受体的结合亲和力的能力，如实施例25所述。
图19示出与K288融合的hGH的SDS-PAGE分析，样本来自纯化过程的任何阶段，如实施例19所述。
图20示出进行了非还原和还原SDS-PAGE的与Y576融合的5μ g最终纯化蛋白hGH(构型为hGH-Y576和Y576_hGH)的SDS-PAGE分析，如实施例24所述，根据制造商说明 书使用来自 Invitrogen 的 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶。
图21示出重叠显示的两个GHXTEN构建体Y576-GH和hGH_Y576 (N端至C端)的尺寸排阻色谱曲线，如实施例24所述。
图22示出两个GHXTEN构建体Y576-GH和hGH_Y576 (N端至C端)在静脉内施用给食蟹猴之后的药代动力学曲线，如实施例30所述。结果显示，hGH相对于XTEN的方向(N端与C端)不影响融合蛋白的清除。
图23示出单次剂量的5mg/kg AM864_hGH皮下施用给食蟹猴之后的药代动力学曲线，其中显示了推导的等同hGH浓度(虚线)，如实施例30所述。使用单区室拟合(singlecompartment fit)通过WinNonLin计算终末半衰期为33小时。
图24示出食蟹猴中响应于施用所示剂量的hGH或GHXTENAM864_hGH的IGF-1分泌的结果，如实施例27所述。
图25示出在垂体切除的大鼠模型中以所示剂量施用hGH或AM864_hGH对体重的影响，如实施例28所述。结果显示，效价等同于hGH的而较低频率给药的GHXTEN构建体对生物活性的保留。
图26示出施用安慰剂、hGH和AM864_hGH对切除垂体的大鼠中胫骨骺板中软骨生长的对比性影响，以治疗9天之后胫骨的组织学横截面显示，如实施例29所述。
图27示出通过皮下途径施用给大鼠的四种hGH GHTXEN融合蛋白的药代动力学结果，与未修饰的重组hGH相比，如实施例31所述。
图28示出三种hGH XTEN构建体在皮下施用给食蟹猴之后的浓度曲线，如实施例32所述。
图29示出以0.3 (空心圆圈)、1.5 (方块)和7.5mg/kg(三角)三种剂量水平施用给雄性和雌性食蟹猴SC的GHXTEN AE912-hGH-AE144的药代动力学研究结果，如实施例33所述。
图30示出食蟹猴中响应于施用AE912-hGH-AE144的IGF-1水平的结果，如实施例33所述(根据图29的相同组)。
图31示出比较通过三种不同途径施用的GHXTENAE912-hGH-AE144的生物利用率的实验结果，如实施例34所述。AE912-hGH-AE144以1.5mg/kg通过静脉内(三角)、皮下(空心圆圈)和肌肉内(方块)途径施用给雄性和雌性食蟹猴SC，其中GHXTEN的血浆浓度以数字示出。
图32示出施用媒介物(空心圆圈)、剂量为5nmol/kg/天的重组hGH(实心圆圈)、不同剂量和剂量频率的GHXTENAE912-hGH-AE144(实心三角=0.5nmol/kg/天；空心三角=1.5nmol/天；方块=3nmol/kg/Q2D)对切除垂体的大鼠体重的影响,如实施例35所述。
图33示出hGH或GHXTEN在切除垂体的大鼠模型中在治疗窗内维持血药水平的能力的模型投射结果，基于从图32中描绘的数据得到的结果，使用相同的给药组。
图34示出根据已知分子量的蛋白质标准品测量的胰高血糖素-XTEN构建体样本的尺寸排阻色谱分析结果，其中图形输出为吸光度对保留体积，如实施例37所述。胰高血糖素-XTEN构建体是I)胰高血糖素-Y288 ；2)胰高血糖素Y-144 ；3)胰高血糖素-Y72 ;和4)胰高血糖素-Y36。结果指示表观分子量随着XTEN部分长度的增加而增加。
图35示出在皮下或静脉内施用单次剂量的与不同长度的非结构化多肽连接的GFP的不同组合物之后在食蟹猴中的药代动力学曲线(血浆浓度)，如实施例38所述。所述组合物是 GFP-L288、GFP-L576、GFP_XTEN_AF576、GFP-Y576 和 XTEN_AD836_GFP。在注射之后不同时间分析血液样本，并使用用于捕获的抗GFP的多克隆抗体和用于检测的相同多克隆抗体的生物素化制品通过ELISA测量血浆中的GFP浓度。结果呈现为血浆浓度对给药后时间(h)，并且具体显示了具有最长序列长度的XTEN的组合物XTEN_AD836-GFP的半衰期的明显增加。具有最短序列长度的构建体GFP-L288具有最短的半衰期。
图36示出预测人响应于Ex4-XTEN_AE864的异速增长尺度律(al1metricscaling)结果，基于四个动物物种(即，小鼠、大鼠、食蟹猴和狗)的测量结果。图36A示出测量的终末半衰期对体重，在人中预测的T1/2为139h。图36B示出测量的药物清除对体重，在人中预测的清除率值为30ml/h。图36C示出测量的分布体积对体重，在人中预测的值为 5970ml 。
图37示出Ex4-XTEN_AE864的近紫外圆二色谱，如实施例42所述进行。
发明详述
在描述本发明实施方案之前，要理解，这些实施方案仅作为例子而提供，并且可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案来实施本发明。本领技术人员现在将可以想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法和材料。冲突时，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是示例说明性的而不旨在限制。本领技术人员现在会想到不背离本发明的许多改变、变化和替代。
定义
除非另外规定，如本文使用的以下术语具有归属于它们的含义。
除非上下文另外清楚地指明，说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一种细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是线性或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其间可以插入非氨基酸。这些术语还包括例如通过二硫键形成、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(例如与标记组分偶联)而被修饰的氨基酸聚合物。
本文使用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单字母或三字母密码指定氨基酸。
术语“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光异构体形式:甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
应用于序列并在本文使用的术语“非天然存在的”指没有哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列的对应物、与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不互补、或与哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，适当比对时，非天然存在的多肽或片段可以与天然序列共享不超过90%,80%,70%,60%,50%或甚至更低的氨基酸序列同一性。
术语“亲水性”和“疏水性”指物质具有的与水的亲和力程度。亲水性物质对水具有强亲和力，易于溶解于水、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本缺乏对水的亲和力，易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或与水混合或被水润湿。氨基酸可以根据其疏水性来表征。已经发展了许多量表。一个实例是由Levitt，M，等，J Mol Biol (1976) 104:59 发展的量表，其列于 Ηορρ,ΤΡ，等，Proc Natl Acad Sci U SA (1981) 78:3824。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别关注的亲水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”是保留至少一部分治疗活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白的截短形式。“变体”是与天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白质，保留了生物活性蛋白的至少一部分治疗活性和/或生物活 性。例如，变体蛋白可以与参考生物活性蛋白共享至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“生物活性蛋白部分”包括例如通过定点诱变、插入而有意修饰或通过突变而意外修饰的蛋白质。
“宿主细胞”包括可以是或已经是主题载体的受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于天然、意外或有意的突变，后代不一定与原始亲代细胞完全相同(形态方面或者总DNA互补体的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体在体内转染的细胞。
当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是通常会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。对于本领域技术人员明显的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以使之与其天然存在的对应物相区分。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在对应物相区分，因为浓度或每体积的分子数目一般大于其天然存在的对应物。一般而言，通过重组方式制备并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
“分离的”多核苷酸或多肽编码核酸或其它多肽编码核酸是从所述多肽编码核酸的天然来源中正常伴随的至少一种污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子。分离的多肽编码核酸不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离的多肽编码核酸分子可与天然细胞中存在的特定多肽编码核酸分子相区分。然而，分离的多肽编码核酸分子包括正常表达所述多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分子，此时，例如，核酸分子处于不同于天然细胞核酸分子的染色体内或者染色体外位置。
“嵌合”蛋白含有至少一个融合多肽，包含与天然存在不同的序列位置的区域。所述区域可以正常存在于不同的蛋白质中并且在融合多肽中汇集在一起；或者它们可以正常存在于相同的蛋白质中但在融合多肽中处于新的排列。嵌合蛋白可以通过例如化学合成或者通过产生并翻译其中肽区域以期望关系编码的多核苷酸来产生。
“偶联的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文可互换使用。这些术语指通过包括化学偶联或重组方式在内的任何方式使两个或多个化学元素或组分结合在一起。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述序列是可操作连接的。一般而言，“可操作连接”表示被连接的DNA序列是连续的，并且在阅读相内或框内。“框内融合”指两个或多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF正确阅读框的方式结合形成连续更长的0RF。因此，得到的重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或多个片段的单个蛋白质(所述片段通常本质上不会如此结合)。
多肽上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中以氨基端至羧基端方向的氨基酸顺序，序列中彼此邻接的残基在多肽一级结构中是连续的。“部分序列”是已知在一个或两个方向包含额外残基的多肽的一部分的线性序列。
“异源的”指衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。例如，从其天然编码序列取出并可操作连接至不同于天然序列的编码序列的富含甘氨酸序列是异源的富含甘氨酸序列。术语“异源的”应用于多核苷酸、多肽时指所述多核苷酸或多肽衍生自与进行比较的实体其余部分基因型不同的实体。
术语“多核 苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以发挥已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析确定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分的偶联。
术语“多核苷酸的互补体”表示与参考序列相比具有互补碱基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互补体可以与具有完全保真性的参考序列杂交。
“重组的”应用至多核苷酸时指该多核苷酸是体外克隆、限制酶消化和/或连接步骤以及产生可能在宿主细胞中表达的构建体的其它程序的各种组合的产物。
术语“基因”或“基因片段”在本文可互换使用。它们指含有能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白质的至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组或cDNA，只要该多核苷酸含有至少一个开放阅读框，该开放阅读框可以涵盖整体编码区或其片段。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸构成的基因。
“同源性”或“同源的”指两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用例如BestFit等程序来测定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或者可以选择适当的评分矩阵例如blosum45或blosum80来优化同一'丨生、相似性或同源性评分。优选地，同源的多核苷酸是在本文定义的严格条件下杂交的那些序列并且与那些序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、更优选95%、更优选97%、更优选98%和甚至更优选99%序列同一性。
“连接”指在两个核酸片段或基因之间形成磷酸二酯键而使它们连接在一起的过程。为了使DNA片段或基因连接在一起，DNA末端必须彼此相容。在一些情况下，末端在核酸内切酶消化之后即是相容的。然而，可能必须首先将通常由核酸内切酶消化后产生的交错末端转化成平末端以使它们适合连接。
术语“严 格的条件”或“严格的杂交条件”包括提及多核苷酸将以比其它序列可检测地更大程度(例如，超过背景至少2倍)与其靶序列杂交的条件。一般而言，杂交的严格性部分地参考进行洗涤步骤的温度和盐浓度来表示。通常，严格条件是如下条件:其中pH 7.0至8.3下的盐浓度小于约1.5M Na离子、通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的多核苷酸(例如，10至50个核苷酸)是至少约30°C并且对于长的多核苷酸(例如，大于50个核苷酸)是至少约60°C—例如，“严格的条件”可以包括在37°C下50%甲酰胺、IM NaClU% SDS中杂交，以及在0.1XSSC/1% SDS中于60°C下至65°C下三次洗涤，每次15分钟。可选地，可以使用约65°C、60°C、55°C或42°C的温度。SSC浓度可以从约0.1至2XSSC变化，其中SDS以约0.1%存在。这种洗涤温度通常被选择为比确定离子强度和PH下特定序列的热力学熔点低约5°C至20°C。Tm是50%的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和PH下)。计算Tm的方程和核酸杂交条件是熟知的并且可以参见 Sambrook, J.等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2 版,第 1-3 卷,Cold Spring Harbor Press,Plainview N.Y.;特别参见第 2 卷第 9 章。通常，使用阻断试剂来阻断非特异性杂交。这种阻断试剂包括例如约100-200yg/ml的经剪切和变性的鲑鱼精子DNA。在特定情况下，例如对于RNA = DNA杂交，还可以使用有机溶剂，例如浓度约35-50% v/v的甲酰胺。对这些洗涤条件的有用改变对于本领域普通技术人员而目是明显的。
术语“百分比同一性”和“ ％同一性”应用于多核苷酸序列时指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这种算法可以标准化且可重复的方式在被比较的序列中插入空位以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。可以对整体确定的多核苷酸序列长度测量百分比同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多核苷酸序列的片段长度测量百分比同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附图或序列表中示出的序列所支持的任何片段长度可以被用来描述可被测量百分比同一性的长度。
有关本文鉴定的多肽序列的“百分比)氨基酸序列同一性”被定义为:比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，询问序列中与另一个参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比。旨在测定百分比氨基酸序列同一性的比对可以本领域技术中的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括对被比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。可以对整体确定的多肽序列长度测量百分比同一性，或者可以对较短长度例如对获自较大的确定的多肽序列的片段长度测量百分比同一性，所述片段例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附图或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度可以被用来描述可被测量百分比同一性的长度。
本文多肽上下文中使用的术语“非重复性”指在肽或多肽序列中缺乏或有限程度的内部同源性。例如，术语“基本上非重复的”可以指例如序列中很少或没有四个连续氨基酸是相同的氨基酸类型，或者多肽具有10或更小的子序列评分(下文定义)，或者没有构成多肽序列的序列基序从N端至C端顺序的模式。本文多肽上下文中使用的术语“重复性”指肽或多肽序列中内部同源性程度。相反，“重复的”序列可以含有短氨基酸序列的多个相同拷贝。例如，目标多肽序列可以被分成n-mer序列，并且相同序列的数目可以被计数。高度重复的序列含有大比例的相同序列，而非重复的序列含有很少的相同序列。在多肽上下文中，序列可以含有确定或可变长度的较短序列或基序的多个拷贝，其中基序本身具有非重复序列，使全长多肽是基本上非重复的。其中测量非重复性的多肽长度可以是3个氨基酸至约200个氨基酸、约6至约50个氨基酸、或约9至约14个氨基酸。多核苷酸序列的上下文中使用的“重复性”指序列内部同源性程度，例如，给定长度的相同核苷酸序列的频率。重复性可以例如通过分析相同序列的频率来测量。
“载体”是优选在适当宿主 中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转到宿主细胞中和/或在宿主细胞之间。该术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，以及功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是被引入适当宿主细胞时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含可以用于产生期望的表达产物的表达载体的适合的宿主细胞。
“血清降解抗性”应用于多肽时指多肽在血液或其组分中抵抗降解的能力，血清或血浆中通常包括蛋白酶。血清降解抗性可以通过使蛋白质与人(或视情况为小鼠、大鼠、猴)血清或血浆通常在约37°C混合通常一定天数(例如0.25、0.5、1、2、4、8、16天)来测量。可对这些时间点的样本进行蛋白质印迹分析，并使用抗体检测蛋白质。抗体可以针对蛋白中的标签。如果蛋白质在印迹(western)上显示单条带，其中蛋白质大小与注射蛋白质大小相同，则没有发生降解。在该示例性方法中，通过蛋白质印迹或等效技术判断50%蛋白被降解的时间点是蛋白质的血清降解半衰期或“血清半衰期”。
本文使用的术语“t1/2”指终末半衰期，计算为In⑵/Kel。Kel是通过log浓度对时间曲线的终末线性部分的线性回归而计算的终末消除速率常数。半衰期通常指活生物体中储存的施用物质的半数被正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文可互换使用。
“表观分子量因子”或“表观分子量”是相关术语，指特定氨基酸序列表现出的表观分子量的相对增加或降低的量度。表观分子量使用尺寸排阻色谱(SEC)和类似方法与球状蛋白标准品相比较来测定，并且以“表观kD”单位来度量。表观分子量因子是表观分子量和实际分子量之间的比率；后者通过基于氨基酸组成而加合组成中每种氨基酸的计算分子量来预测。
“流体动力学半径”或“Stokes半径”是分子在溶液中的有效半径(Rh，以nm计)，通过假设它是穿过溶液并受溶液粘性抵抗的主体来测量。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白的流体动力学半径测量与‘表观分子量因子’相关联，表观分子量因子是更直观的量度。蛋白质的“流体动力学半径”影响其在水溶液中的扩散速率以及其在大分子凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径由其分子量以及其结构(包括形状和致密度)决定。测定流体动力学半径的方法是本领域熟知的，例如通过使用尺寸排阻色谱(SEC)，如美国专利N0.6，406，632和N0.7，294，513所述。大多数蛋白质具有球形结构，这是蛋白质在最小流体动力学半径下可以具有的最致密的三维结构。一些蛋白质具有随机和开放的非结构化或‘线性’构象，因此与类似分子量的典型球形蛋白质相比具有大得多的流体动力学半径。
“生理条件”指活宿主中的一组条件以及模拟活受试者那些条件的体外条件，包括温度、盐浓度、pH。已经确立了用于体外分析的许多生理相关条件。一般而言，生理缓冲液包含生理浓度的盐并且被调节至中性pH，范围从约6.5至约7.8，并且优选约7.0至约7.5。许多生理缓冲液列于Sambrook等(1989)。生理相关温度范围从约25°C至约38°C并且优选约35°C至约37 °C。
“反应基”是可以与另一反应基偶联的化学结构。反应基的实例是氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应基可以被活化以促进与另一反应基的偶联。活化的非限制性实例是羧基与碳二亚胺反应，羧基转化为活化的酯，或者羧基转化为叠氮化物官能。
“控释剂”、“缓释剂”、“贮库制剂”或“持续释放剂”可互换使用，指与多肽在缺乏这些物质而施用时的释放持续时间相比能够延长本发明多肽释放持续时间的物质。本发明的不同实施方案可以具有 不同的释放速率，导致不同的治疗量。
术语“抗原”、“靶抗原”或“免疫原”在本文可互换使用，指抗体片段或基于抗体片段的治疗剂与之结合或对之具有特异性的结构或结合决定簇。
本文使用的术语“有效负载”指具有生物活性或治疗活性的蛋白质或肽序列；小分子药效团的对应物。有效负载的实例包括但不限于细胞因子、酶、激素和血液和生长因子。有效负载还可以包含基因融合或化学偶联的部分，例如化疗剂、抗病毒化合物、毒素或造影齐U。这些偶联部分可以通过连接子连接至多肽其余部分，所述连接子可以是可裂解的或不可裂解的。
本文使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽拮抗剂的方法可以包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。在本发明上下文中，拮抗剂可以包括蛋白质、核酸、糖类、抗体或降低生物活性蛋白效应的任何其它分子。
术语“激动剂”以最广泛的含义使用并且包括模拟本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。适合的激动剂分子具体包括激动剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小有机分子等。用于鉴定天然多肽的激动剂的方法可以包括使天然多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与天然多肽相关的一种或多种生物活性的可检测的变化。
“活性”出于本文目的指融合蛋白组分与相应的天然生物活性蛋白一致的作用或效应,其中“生物活性”指体外或体内生物功能或效应,包括但不限于受体结合、拮抗剂活性、激动剂活性或细胞或生理反应。
本文使用的“治疗(treatment)” 或“治疗(treating) ” 或“减轻(palliating)”或“缓解(ameliorating)”在本文可互换使用。这些术语指获得包括但不限于治疗益处和/或预防益处的有益或期望结果的方法。所谓治疗益处是指被治疗的潜在疾患的消除或缓解。而且，随着与潜在疾患相关的一种或多种生理症状的消除或缓解使得在受试者中观察到改善而实现治疗益处，尽管受试者可能依然受累于所述潜在疾患。为了预防益处，组合物可以被施用给处于发展特定疾病风险的受试者或者报告了疾病的一种或多种生理症状的受试者，尽管可能还未做出该疾病的诊断。
本文使用的“治疗效应”指生理效应，包括但不限于人或其它动物中疾病的治愈、缓和、缓解或预防，或者指除此以外增强人或动物的生理或精神状态，这是由本发明融合多肽而非诱导生成针对生物活性蛋白具有的抗原表位的抗体的能力引起的。治疗有效量的确定在本领域技术人员能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
本文使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的量，所述生物活性蛋白一次或重复剂量施用给受试者时能够对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征具有任何可检测的有益效应。这种效应不一定绝对是有益的。
本文使用的术语“治疗有效剂量方案”指单独或作为融合蛋白组合物的一部分的生物活性蛋白的连续施用剂的计划表，其中所述剂以治疗有效量给予以对疾病状态或病症的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续有益的效应。
I).一般技术
除非另外指出，本发明实践采用本领域技术范围内的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见Sambrook，J.等，“Molecular Clon ing:A Laboratory Manual,，，第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001 Current protocols in molecular biology”, F.M.Ausubel,等编辑，1987 ；系列 “Methods in Enzymology,，，Academic Press, San Diego, CA.;“PCR 2:a practicalapproach”，M.J.MacPherson, B.D.Hames 和 G.R.Taylor 编辑，Oxford University Press,1995 ;“Antibodies, a laboratory manual，，Harlow, E.和 Lane, D.编辑，Cold SpringHarbor Laboratory,1988 ;“Goodman&GiIman’ s The Pharmacological Basis ofTherapeutics, ” 第 11 版，McGraw-Hi11,2005 ；和 Freshney, R.1.,“Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,，，第 4 版，John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000,这些参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文。
II).生长激素
本发明部分涉及包含人生长激素(hGH)在内的生长激素(GH)的融合蛋白组合物。
(a)生长激素蛋白
“生长激素”或“GH”指生长激素蛋白及其种类和序列变体，并且包括但不限于人GH的191单链氨基酸序列。GH可以是天然的全长蛋白质或者可以是保留天然蛋白质至少一部分生物活性的序列变体的截短片段。有两个已知类型的源自脑垂体的人GH(下文“hGH”):一个具有约22，000道尔顿的分子量(22kD hGH)，另一个具有约20，000道尔顿的分子量(20kD hGH)。20kD HGH具有对应于由191个氨基酸组成的22kD hGH的氨基酸序列，除了22kD hGH的第32至第46的15个氨基酸残基缺失。一些报道已显示，已经发现20kD hGH表现出比22kD hGH更低的风险和更高的活性。本发明考虑使用22kD、20kD hGH以及其种类和序列变体和截短片段，因为其适合用作本文公开的GHXTEN组合物的XTEN的融合配偶体。hGH的克隆基因已经在大肠杆菌中以分泌形式表达(美国专利N0.4，898，830 ；Chang,C.N.,等，Gene 55:189 [1987])并且已经报道了其DNA和氨基酸序列(Goeddel,等Nature,281:544 [1979) ;Gray，等，Gene 39:247 [1985])。
本发明考虑在GHXTEN组合物中加入与GH序列具有同源性的序列、例如来自人、非人灵长类动物、哺乳动物(包括家畜)的天然的序列片段、以及保留了 GH的至少一部分生物活性或生物学功能和/或用于预防、治疗、调节或缓解GH相关疾病、缺陷、疾患或病症的非天然序列变体。非哺乳动物GH序列在文献中充分描述。例如，鱼GH的序列比对可以参见 Genetics and Molecular Biology 2003 26ρ.295-300。禽 GH 序列的进化分析提供于Journal of Evolutionary Biology 2006 19ρ.844-854。此外，与人 GH 同源的天然序列可以通过标准同源性检索技术例如NCBI BLAST来发现。
GH对身体组织的效应一般可被描述为合成代谢的。像大多数其它蛋白激素一样，天然GH通过与称为生长激素受体的特异性血浆膜受体相互作用而发挥作用。GH作用于肝和其它组织以刺激IGF-1生成，IGF-1负责GH的生长促进效应并且还反映生成的量。IGF-1转而对成骨细胞和软骨细胞活性具有刺激效应以促进骨生长。在一个实施方案中，本发明提供了表现出上文所述天然GH性质的至少一个的GHXTEN。
在一个实施方案中，加入主题组合物的GH是具有对应于天然存在蛋白质的序列的重组多肽。在另一实施方案中，GH是天然序列的序列变体、片段、同源物或模拟物，保留了相应天然GH的至少一部分生物活性。表I提供了本发明GHXTEN融合蛋白所涵盖的、来自许多哺乳动物物种的GH序列的非限制性列表。这些GH序列或通过该组物种或家族之间个体突变而构建的保留了天然GH的至少一部分生物活性的同源衍生物的任何一个可用于本发明的融合蛋白。可加入GHXTEN融合蛋白的GH可以包括与选自表I的序列具有至少约 80%序列同一性、或可选地81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ^ 100%序列同一性的蛋白质。
表1:来自动物物种的生长激素氨基酸序列
权利要求
1.一种分离的融合蛋白，其包含与选自表I的氨基酸序列具有至少90%同一性的生长激素(GH)，其中所述生长激素与至少约200个氨基酸残基的延伸的重组多肽(XTEN)连接，其中所述XTEN特征在于: (a)所述XTEN序列包含显示与类似长度的选自表3的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的至少约200个连续氨基酸； (b)当通过TEPITOPE算法分析时，所述XTEN序列缺少预测的T细胞表位，其中对所述XTEN序列中表位的所述TEPITOPE算法预测基于_9或更高的评分； (c)所述XTEN具有小于10的子序列评分；和 (d)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和构成所述XTEN的总氨基酸残基的超过约90%。
2.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述生长激素是人生长激素。
3.根据权利要求1或2所述的分离的融合蛋白，其还包含第二XTEN序列，并且其中所述融合蛋白具有表5所示的多XTEN构型。
4.根据权利要求1至3任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述生长激素肽和所述XTEN通过间隔区连接，其中所述间隔区序列包含I至约50个氨基酸残基，并且其中所述间隔区任选地包含裂解序列。
5.根据权利要求1至4任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白与缺少所述XTEN的相应天然生长激素结合相同的靶受体，并且其中所述融合蛋白保留缺少所述XTEN的相应生长激素的结合亲和力的至少约0.1% -30%。
6.根据权利要求1至5任一项所述的分离的融合蛋白，其包含与选自表35、表36和表37的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
7.—种药物组合物，其包含根据权利要求1至6任一项所述的分离的融合蛋白和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求1至6任一项所述的分离的融合蛋白，其根据式I构造:(XTEN)x-GH-(XTEN)y (I) 其中每次出现时独立地: (a)x是O或I;并且 (b)y是O或1，其中x+y彡I。
9.根据权利要求1至6任一项所述的分离的融合蛋白，其中所述XTEN在所述生长激素的N端或C端与所述生长激素融合。
10.根据权利要求1至6和8至9任一项所述的分离的融合蛋白，其包含人生长激素和选自 AE912、AM923、AE144 和 AE288 的第一和第二 XTEN。
11.根据权利要求1至6和8至10任一项所述的分离的融合蛋白，其特征在于: (i)与以类似摩尔剂量施用给受试者时的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，所述分离的融合蛋白在施用给受试者时具有更长的终末半衰期； ( )与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，当较小摩尔量的所述融合蛋 白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积(AUC)； (iii)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，当较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的治疗效应； (iv)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积(AUC)； (v)与使用另外等同的摩尔量施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，当所述融合蛋白以较低频率施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的治疗效应； (vi)与以另外等同的剂量期施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的曲线下面积(AUC);或 (vii)与以另外等同的剂量期施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，当累积较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者时，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的治疗效应。
12.—种制备融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与一个或多个延伸的重组多肽(XTEN)融合的生长激素(GH)，所述方法包括: (a)提供包含编码根据权利要求1或6所述的融合蛋白的重组多核苷酸分子的宿主细胞； (b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；和 (c)回收所述融合蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述融合蛋白的生长激素与以下具有至少90%序列同一性: (a)人生长激素；或 (b)选自表I的序列。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述表达的融合蛋白的一个或多个XTEN与选自表3的序列具有至少90%序列同一'丨生。
15.根据权利要求12至14任一项所述的方法，其中编码所述融合蛋白的多核苷酸分子包含与选自表35、表36和表37的核酸序列显不具有至少90%序列同一'丨生的核酸序列。
16.根据权利要求12至15任一项所述的方法，其中为了所述融合蛋白在所述宿主细胞中增强的表达而对所述多核苷酸进行密码子优化。
17.根据权利要求12至16任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
18.根据权利要求12至17任一项所述的方法，其中所述分离的融合蛋白以基本上可溶的形式从所述宿主细胞的细胞质中回收。
19.一种分离的核酸，其包含编码根据权利要求1至6和8至11任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列或其互补体。
20.一种表达载体，其包含根据权利要求19所述的核酸。
21.—种分离的宿主 细胞，其包含根据权利要求19所述的核酸，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
22.—种治疗受试者的生长激素相关病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至6和8至11任一项所述的融合蛋白。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述生长激素相关病症选自生长激素缺乏、特纳综合征、普瑞德威利综合征、特发性身材矮小、AIDS消瘦、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和肌营养不良症。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述治疗有效量导致维持所述融合蛋白的血药浓度在所述融合蛋白的治疗窗内的时间是以类似量施用给受试者的缺少所述XTEN的相应天然生长激素的至少三倍。
25.根据权利要求22至24任一项所述的方法，其中使用治疗有效剂量方案施用的所述融合蛋白的两次或多次连续剂量施用给受试者导致与使用针对GH确立的治疗剂量方案施用的未连接所述融合蛋白的相应生长激素相比，所述融合蛋白的血药水平的连续Cmax峰和/或Cmin谷之间时间增加。
26.根据权利要求22至25任一项所述的方法，其中 (i)与以另外等同的剂量方案施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，将较小摩尔量的所述融合蛋白施用给受试者，并且所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的治疗效应； ( )与使用另外等同的摩尔剂量施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相t匕，所述融合蛋白以较低频率施用给受试者，并且所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的治疗效应；或 (iii)与以另外等同的剂量期施用给受试者的缺少所述XTEN的相应生长激素相比，将累积较小摩尔量的所述融合 蛋白施用给受试者，所述融合蛋白达到与缺少所述XTEN的相应生长激素类似的治疗效应。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述治疗效应是选自以下的测量参数:IGF-1浓度、IGFBP3浓度、身高速度、瘦体重、全身脂肪、躯干脂肪、对胰岛素挑战的应答、软骨细胞分裂速率、软骨细胞数目、骨密度、骨生长和骺板宽度增加。
28.—种试剂盒，其包括权利要求7所述的药物组合物、标识所述药物组合物的标签和关于所述药物组合物的存储、重建和/或施用给受试者的说明。
全文摘要
本发明涉及包含与延伸的重组多肽(XTEN)连接的生长激素的组合物、编码所述组合物的分离的核酸和含有所述分离的核酸的载体和宿主细胞，以及制备所述组合物的方法和使用所述组合物治疗生长激素相关疾病、疾患和病症的方法。
文档编号A61P3/08GK103140236SQ201080035159
公开日2013年6月5日 申请日期2010年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者V·谢尔恩伯杰, J·西尔弗曼, W·P·施泰姆尔, 王家威, N·吉西格, J·L·克莱兰, B·斯平克 申请人:阿穆尼克斯运营公司