使用副粘病毒载体的经鼻喷雾型结核疫苗的制作方法

专利名称：使用副粘病毒载体的经鼻喷雾型结核疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用副粘病毒载体的经鼻喷雾型结核疫苗，特别涉及使用人的副流感病毒2型病毒载体(hPIV2)的经鼻喷雾型结核疫苗。
背景技术：
结核是由属于分枝杆菌属的人型结核菌(结核分枝杆菌，Mycobacterium tuberculosis)引起的感染症。即使在现在，结核也是导致大量感染者的疾病之一。在全世界，每年有800万人患结核病，约200万人死亡。这是由于现有的结核疫苗BCG (Bacil 1 e de Calmette et Guerin 卡介菌)疫苗对成人不具有效果，因此，在婴幼儿期的疫苗接种只在年轻时得到预防结核效果，即使追加接种，也不能诱导对成人的预防结核效果。另外，在日本，每年产生2万人以上的结核病患者(约20名患者/10万人)，成为中等流行国家。在结核预防中使用的BCG疫苗以牛型结核菌(牛分枝杆菌，Mycobacterium bovis)为原型。通过将牛型结核菌经过长时间传代培养，失去对人的毒性，将仅残留抗原性的细菌作为BCG疫苗使用。由对人体接种该活菌而获得免疫，进行对人型结核菌的感染防御。BCG疫苗是现在被实用化的唯一的结核预防疫苗，婴幼儿结核的预防效果得到广泛认可。BCG疫苗的效果在十余年左右丧失，在成人后，通过自然免疫力的增加防止结核的发生。但是，依靠自然免疫力不能充分抑制成人结核的发病。对于该事态，可以考虑在成人后再接种BCG疫苗的方法，但是，已知BCG疫苗对成人结核的效果低(或几乎无效)。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开公报2002/066055专利文献2 日本特开2008-074749号公报非专利文献非专利文献1 第52届日本病毒学会学术集会，M蛋白欠損^ 7 7 ；^ > ι' 2 型々4卟7 (PIV2)及t/ 7々7 IL-4 f揷入L· tz PIV2乃性状解析，2004年11月21日

发明内容
发明所要解决的课题对于上述事态，进行了若干种成人结核疫苗的开发。例如，进行了 MVA85A疫苗(在安卡拉痘苗病毒中表达抗酸杆菌85A抗原的疫苗),Aeras402疫苗(在35型腺病毒中表达 85A 抗原和 TB10. 4 的疫苗)和 M72F (别名 GSK TBlOl 是由 GSK (Glaxo Smith Kline)公司开发的疫苗，是将结核分枝杆菌的蛋白质和GSK公司的AS02佐剂共同使用的疫苗)等的开发。但是，至今仍没有得到具有充分效果的成人结核疫苗。本发明是鉴于上述事实而作出的，其目的在于提供在结核预防中具有效果的经鼻喷雾型疫苗。
用于解决课题的方法hPIV2是属于副粘病毒科的病毒，其基因组是约15000碱基的单链负链RNA。在该核酸结合核衣壳蛋白(NP)，形成螺旋对称的核苷蛋白质复合体(核衣壳，RNP)。编码病毒基因组的蛋白质中，M蛋白与病毒糖蛋白的细胞质内区域、被膜脂质双层膜和RNP相互作用， 在病毒颗粒的出芽中是重要的。通过基因重组使M蛋白缺失的病毒基因组虽然感染细胞， 表达特定的病毒蛋白质，但不能出芽。本发明的发明人发现，使M蛋白缺失的PIV2能够作为用于在标的细胞表达外来蛋白质的载体使用(非专利文献1)。另一方面，本发明的发明人发现抗酸杆菌来源的α抗原在过敏性疾病的预防、治疗中是有效的(专利文献1)。构建在CMV启动子和TPA信号肽的下游中重组入有α抗原的表达载体PcDNA-α-K，在哮喘小鼠模型中进行验证。另外，发现为了有效地使用α抗原，作为表达量多的载体，使用PIV2，对过敏性疾病是有效的(专利文献2)。本发明的发明人在研究上述技术在结核疫苗中是否能够应用时，吃惊地发现， 在现有的方法中，几乎得不到效果的结核菌感染预防，在使M蛋白质或F蛋白质缺损的 hPIV2(rhPIV2)中重组入有α抗原的表达载体显示结核预防效果，从而基本完成了本发明。这样，第1发明涉及的经鼻喷雾型结核疫苗，特征在于在使M基因、F基因或HN 基因缺损的副粘病毒基因中重组入有抗酸杆菌来源的α抗原(Ag85B)、其类似物、编码具有与它们同样的功能的它们的突变体(以下称为“α抗原等”)的基因。另外，第2发明涉及的结核预防或治疗方法，特征在于在使M基因、F基因或HN 基因缺损的副粘病毒基因中重组入有抗酸杆菌来源的α抗原、其类似物、编码具有与它们同样的功能的它们的突变体的基因，对包括人的哺乳动物进行喷雾且经鼻给药。副粘病毒是指属于副粘病毒科的病毒。副粘病毒在基因组中具有负链单链RNA，病毒粒是指显示150nm 350nm多形性的病毒分类。副粘病毒颗粒被包于被膜中，在被膜表面排列有2种糖蛋白(F和HN)。副粘病毒中，例如，包括副流感病毒(PIV)、牛副流感病毒 3型、仙台病毒、流行性腮腺炎病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、麻疹病毒、小反刍动物瘟病毒、 新城鸡瘟病毒、禽副粘病毒2 9型、亨德拉病毒、尼帕病毒、牛呼吸合胞体病毒(牛RS病毒)、人呼吸合胞体病毒(人RS病毒)、人偏肺病毒等。α抗原优选是来自堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)或牛分枝杆菌 BCG(Mycobacterium bovis BCG)的α抗原。另外，α抗原的类似物优选为抗原85复合体结构蛋白85Α或抗原85复合体结构蛋白85C。发明的效果根据本发明，对成人结核也能够提供预防、治疗效果高的疫苗。本发明涉及的疫苗是充分利用作为骨架的副粘病毒(特别是hPIV2)具有的呼吸器感染中的高蛋白表达特性、并且给药便利性高的经鼻喷雾型的活疫苗。目前开发中的 MVA85A和Aeras 402的重组活疫苗均为注射剂，相对于此，本发明涉及的经鼻疫苗为喷雾剂，目的蛋白的表达量也高于注射剂给药。在结核预防中，在疾病表现部位的肺的局部免疫诱导被视为比全身免疫更重要。通过使用插入了具有细胞免疫(Thl)移动性功能的蛋白基因的副粘病毒载体，可以得到在肺中的高细胞性免疫诱导，因此，与其它载体相比，可以认为对结核菌的疫苗效果更高。另外，即使在作为骨架的病毒的病原性中，对成人的安全性也特别高。另外，在制造方面，通过培养细胞的使用和喷雾化，能够实现高成品率和成本降低。


图1是通过导入终止密码子从而不表达M蛋白质的反义rhPIV2基因组的简要说明图。图2是从含有通过在T7启动子的下游导入重组入的终止密码子而得到的M基因缺损型反义rhPIV2基因组cDNA的质粒载体回收病毒颗粒的方法的说明图。图3是表示使M蛋白基因或F蛋白基因缺失、将Ag85B等基因作为表达型重组入的 AM/rhPIV2 和 AF/rhPIV2 的结构图。图4是确认在rhPIV2_GFP经鼻给药的仓鼠的气管中GFP的表达的显微镜照片图。图5是通过rhPIV2_Ag85B确认有无基因产物的表达时蛋白免疫印迹的照片图。图6是表示在F表达细胞中含有GFP基因的Δ F/rhPIV2增殖从而出现GFP荧光的细胞增加的情况的图。图7是表示通过在Δ F/rhPIV2中导入BCG_Ag85B的载体表达BCG_Ag85B的情况的蛋白免疫印迹图。图8是以rhPIV2_Ag85B(M终止，M-stop)疫苗经鼻给药后的小鼠中确认感染结核菌后的肺中结核菌的结节的照片图。分别是(A)投与对照物(rhPIV2-GFP)4次后，(B)投与表达型 Ag85B-DNA 2 次、rhPIV2_Ag85B (Μ 终止)2 次后、(C)投与 rhPIV2_Ag85B (Μ 终止)4 次后，感染结核菌的小鼠的肺。图9是表示图8中所示的肺病变情况的显微镜照片图。分别是㈧投与 rhPIV2-Ag85B (Μ终止)4次后、(B)投与对照物(rhPIV2_GFP) 4次后，感染结核菌的小鼠的月市。图10是表示比较在rhPIV2_Ag85B(M终止)疫苗的结核感染预防试验中的结核菌数的图表。
具体实施例方式接着，边参照图表边说明本发明的实施方式。本发明的技术范围不受这些实施方式限定，能够不改变发明要点地以各种方式实施。本发明的技术范围覆盖均等的范围。在本发明中使用的人副粘病毒(特别是hPIV2)，病原性极低且蛋白质表达量多。 因此，能够制备直接重组入编码外来蛋白质的α抗原的基因的副粘病毒基因并使用。但是，除去病毒的结构蛋白质基因，将该基因由细胞、质粒等供给，供给更安全的非增殖型病毒载体的腺病毒载体等，在作为副粘病毒基因的一种的hPIV2载体中，使用使 hPIV2的M基因、F基因或HN基因缺损的rhPIV2，由此，虽然感染和蛋白质的表达同等进行， 但不产生感染性hPIV2，形成更安全的hPIV2载体。因此，在本发明中，在使M基因、F基因或HN基因缺损的hPIV2(rhPIV2)中重组入编码α抗原等的基因。作为重组入α抗原等的部位，可以是rhPIV2基因组的任意位置，但是，通过在反义病毒基因组的5 ‘末端侧重组入，外来蛋白质的表达量变多，故而优选。反义PIV2基因组是单链RNA，从5'末端向3'末端具有称为前导序列(Leader 启动子序列)、NP、V/P、M、F、HN、L、拖尾序列(Trailer)的结构。因此，编码α抗原等的基因优选位于紧随前导序列(启动子序列)之后或者NP和 V/P之间等的靠近5'末端侧的位置。为了使作为基质蛋白的M基因和作为构成膜蛋白质基因的F基因或HN基因缺损， 可以例示将编码M蛋白质、F蛋白质或HN蛋白质的基因部分的全部或一部分敲除的方法， 或在编码M蛋白质、F蛋白质或HN蛋白质的基因某处重组入终止密码子的方法等。通过在细胞中向使M基因、F基因或HN基因缺损的PIV2基因组基因中短暂性地导入分别表达M蛋白质、F蛋白质或HN蛋白质的质粒而使该基因表达的方法，或形成分别表达M基因、F基因或HN基因的细胞，在该细胞上使M基因、F基因或HN基因缺损的PIV2 增殖，由此，能够在不表达这些基因的细胞、组织中制作不进行多阶段增殖的非增殖型的 PIV2。将完全缺损M基因、F基因或HN基因、不能自律增殖的病毒分别称为AM/rhPIV2或 rhPIV2 ( Δ Μ)、Δ F/rhPIV2 或 rhPIV2 ( Δ F)、或 Δ HN/rhPIV2 或 rhPIV2 ( Δ ΗΝ)。在本发明中，α抗原(Ag85B)是在抗酸杆菌中普遍存在的蛋白之一，鉴定为作为抗原85复合体之一的抗原85复合体结构蛋白85B。该抗原85复合体由分子量为30 32kD 左右的抗原 85 复合体结构蛋白 85A(Ag85A Jnfect. Immun. 57 :3123-3130,1989)、抗原 85 复合体结构蛋白 85B (Infect. Immun. 58 (2), 550-556, (1990). Accession No. X53897) 和抗原85复合体结构蛋白85C(Ag85C Jnfect. Immun. 59 :5205-3212,1991)构成。这些蛋白质是抗酸杆菌的主要分泌蛋白。已知在结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等的同属细菌之间，这些分泌蛋白的基因、氨基酸序列超越种属，显示高同源性，显示对单克隆抗体的交叉反应性(Microbiol. Rev. 56 :648-661，1992)。作为α抗原(抗原85复合体结构蛋白85Β :Ag85B)的类似物，可以列举抗原85复合体结构蛋白85A(Ag85A)、抗原85复合体结构蛋白85C(Ag85C)等。在本发明中，编码抗酸杆菌来源的α抗原或其类似物的基因是指能够表达α 抗原蛋白或抗原85复合体结构蛋白85Α、抗原85复合体结构蛋白85C等α抗原蛋白的类似物的基因。具体而言，可以列举含有处于编码α抗原或其类似物的基因表达载体的形态的基因。作为编码α抗原的基因，可以列举编码堪萨斯分枝杆菌(Infect. Immun. 58 :550-556. 1990)、牛分枝杆菌 BCG(J. Bacteriol. 170 :3847-3854. 1988)、鸟分枝杆菌(Infect. Immun. 61 :1173—1179，1993)、胞内分枝杆菌(Biochem, Biophys. Res. Commun. 196 1466-1473，1993)、麻风分枝杆菌(Mol. Microbiol. 6 153-163，1992)等抗酸杆菌来源的α抗原的基因。这些基因均能够在本发明中使用。其中，作为编码堪萨斯分枝杆菌的α抗原的基因，可以列举具有序列序号1所示的第390 第1244的碱基序列的 DNA，作为编码牛分枝杆菌BCG的α抗原的基因，可以列举具有序列序号3所示的第121 第975的碱基序列的DNA。除了这些DNA以外，也能够使用具有与该DNA互补的序列的DNA 和在严格条件下杂交的突变体DNA，编码含有相对于由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列使1个或多个(优选数个)氨基酸残基被取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的蛋白质的 DNA;上述DNA是编码具有与堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG来源的α抗原同样的功能的蛋白质的突变体DNA。与堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG来源的α抗原同样的功能是指显示对结核菌(结核分枝杆菌)的感染发挥同样的预防效果。牛分枝杆菌BCG的α抗原包括285个氨基酸残基的成熟蛋白质，该氨基酸序列具有比堪萨斯分枝杆菌的α抗原更高的与结核分枝杆菌的氨基酸同源性(100%)，可以认为通过导入该α抗原，发挥更高的结核发病预防效果。作为用于得到突变体DNA的具体方法，例如，可以列举以下的方法。S卩，在50%甲酰胺、4XDenhardt、5XSSPE(SSPE 溶液EDTA 磷酸钠盐(SSPE)UXDenhardt 0. 02%水溶性聚蔗糖、0. 02%聚乙烯吡咯烷酮、0. 02%牛血清蛋白),0. 2% SDS、100y g/mL、ssDNA和 12. 5ng 的探针(使用 BcaBest DNA Labeling Kit (TakaRa)，通过[α-32P] dCTP (Amersham) 标记12. 5ng具有序列序号1所示的第390号 第1244号的碱基序列或序列序号3所示的第121号 第975号的碱基序列得到的cDNA断片)存在下，以45°C进行14 16小时菌落杂交后，在1XSSPE、0. 5% SDS溶液中以45°C洗净过滤器30分钟，此后，在0. IXSSPE, 0. 5% SDS溶液中，以55°C洗净过滤器1小时，最后，在0. 1XSSPE、0. 5% SDS溶液中，以65°C 洗净过滤器1小时，消除背景后，在X射线胶片(Fuji)中以-80°c暴露72小时，确定对应的菌落位置，将其单独分离，由此能够得到突变体DNA。它们的突变体所编码的氨基酸序列相对于α抗原的氨基酸序列通常具有60%以上的同源性，优选具有75%以上的同源性。在编码堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG以外的抗酸杆菌由来的α抗原的基因时，也可以同样是它们的突变体。作为编码α抗原类似物的抗原85复合体结构蛋白85Α的基因，可以列举与关于上述α抗原基因的各种抗酸杆菌同样的抗酸杆菌来源的基因。更具体而言，可以列举编码结核分枝杆菌来源的抗原85复合体结构蛋白85Α的DNA(Infect. Immun. 57 =3212-3130, 1989)。关于编码抗原85复合体结构蛋白85C的基因也同样可以列举各种抗酸杆菌来源的基因。更具体而言，可以列举编码结核分枝杆菌来源的抗原85复合体结构蛋白85C的 DNAdnfect. Immun. 59 =3205-3212,1991)。关于这些DNA，也与上述同样地，能够使用具有与这些DNA互补的序列的DNA和在严格的条件下杂交的DNA，编码含有相对于由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列使1个或多个(优选数个)氨基酸残基被取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；上述DNA是编码具有与抗原85复合体结构蛋白质85Α或抗原 85复合体结构蛋白85C同样功能的蛋白质的突变体。上述DNA能够基于上述文献中所记载的序列信息、Genbank等的序列信息等，使用适当的DNA部分作为PCR引物，通过对抗酸杆菌来源的mRNA进行RT-PCR反应等进行克隆。 另外，也能够基于氨基酸序列信息进行化学合成。上述DNA的突变体，例如，能够通过定点突变法、PCR法或通常的杂交法等容易地得到。在本发明中，在结核预防中也能够使用抗酸杆菌来源的α抗原蛋白、作为其类似物的抗原85复合体结构蛋白85Α或抗原85复合体结构蛋白85C其本身或它们的突变体蛋白。作为这样的α抗原，可以列举由编码上述α抗原的基因编码的蛋白质。具体而言，例如，可以列举由具有序列序号1所示的堪萨斯分枝杆菌的碱基序列的DNA编码的、具有序列序号2所示的氨基酸序列的α抗原，或由具有序列序号3所示的牛分枝杆菌BCG的碱基序列的DNA编码的、具有序列序号4所示的氨基酸序列的α抗原等。后者的碱基序列和氨基 Ml^^i^SU^tiM URL(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/X62397 ？ ordinalpos = l&amp ；itool = EntrezSystem2. PEntrez. Sequence. Sequence_ResultsPanel.Sequence_ RVDocSum)得到。除了具有这些氨基酸序列的α抗原以外，也可以是含有相对于序列序号2或序列序号4的氨基酸序列使1或多个(优选数个)氨基酸残基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的、与该α抗原具有同样功能的突变体蛋白质。除了堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG 来源以外的抗酸杆菌的α抗原时，也同样地是含有相对这些氨基酸序列使1或多个(优选数个)氨基酸残基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的、与该α抗原具有同样功能的突变体蛋白质。另外，关于抗原85复合体结构蛋白85Α或抗原85复合体结构蛋白85C，也可以列举结核分枝杆菌来源的抗原85复合体结构蛋白85Α (Infect. Immun. 57 =3213-3130, 1989)、结核分枝杆菌来源的抗原85复合体结构蛋白85C(Infect. Immun. 59 :3205-3212, 1991)等。关于这些α抗原蛋白的类似物，可以是与α抗原蛋白突变体同样的突变体。这样的蛋白质能够通过使用编码该蛋白质的基因得到重组DNA法制造，另外也能够通过化学合成制造。或者也能够以适当的培养基培养堪萨斯分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG等的抗酸杆菌，从其培养液通过公知的精制法精制而得到(kand. J. Immunol. 43 202-209，1996 J.Bacteriol. 170 :3847-3854,1988 ；Hiroshima J.Med. Sci. 32 :1-8,1983 ； J. Bacteriol. 170 :3847-3854,1988)。在本发明中，作为结核疫苗，在使用编码抗酸杆菌来源的α抗原、其类似物或它们的突变体的基因时，具体而言，以含有编码抗酸杆菌来源的α抗原、其类似物或它们的突变体的基因的hPIV2的形态使用。作为rhPIV2，能够使用使M基因、F基因或HN基因缺失的hPIV2基因组。通过在编码M基因、F基因或HN基因缺失的hPIV2(rhPIV2)基因组中重组入编码α抗原等的基因，构建表达α抗原等的rhPIV2载体。该表达载体通常能够作为喷雾剂对包括人的哺乳动物给药。喷雾剂能够通过通常方法制备。例如，可以通过在适当的溶剂(PBS等的缓冲液、生理盐水、稳定剂等)中溶解后， 根据需要以过滤器等过滤灭菌，接着在无菌容器中填充而制备。在喷雾剂中，可以根据需要加入常用的载体等。为了将这样得到的表达载体作为结核疫苗使用，能够通过喷雾剂的通常使用方法给药。作为结核疫苗的给药量，能够根据对象患者的体重等变化，通常，作为表达载体，1 次使用约IXlO3 IXIOki个病毒，优选使用约IXlO4 IXlO9个病毒，优选经过数日 数周的间隔，合计给药2 5次。以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限定。实施例1 通过导入终止密码子构建M蛋白缺失的反义rhPIV2 (Μ终止)基因组图1中，表示在编码M蛋白质的基因的确定位置中重组入终止密码子的反义 rhPIV2 (Μ终止)基因组的概要。表示在Τ7启动子的下游作为cDNA重组入Δ 119 (使M蛋白基因259位的AAG为TAG)和Δ观9 (使M蛋白基因89位的ATG为TAG，并且使259位的 AAG 为 TAG)的 2 种 M 蛋白缺损 hPIV2(分别为 rhPIV2(A119) ^P rhPIV2 ( Δ 289))反义 rhPIV2基因组的质粒载体的情况(将它们总称为rhPIV2(M终止))。在构建使M蛋白缺损的hPIV2(M终止)中，能够使用本领域技术人员所公知的基因手法(例如PCR法)。实施例2 :rhPIV2 (Μ终止)的制备方法接着，说明从含有在Τ7启动子的下游插入有反义rhPIV2基因组cDNA的质粒回收病毒颗粒的方法。在图2中表示该方法的概要。将如图1所示操作而构建得到的反义 rhPIV2 基因组(rhPIV2、rhPIV2(A^9)、rhPIV2(A119))转染到表达 T7 RNA聚合酶的细胞 (例如，BSR-T7/5)中。此时，一同转染作为表达hPIV2聚合酶单元(即，NP蛋白、P蛋白、L蛋白)载体的hPIV2-NP、hPIV2-P、hPIV2-L的3种表达载体。另外，在DNA的转移中，能够使用使用本领域技术人员所公知的方法(在本实施方式中使用Lipofectamine)。每48小时进行与Vero细胞的共培养5 7次，以90%以上的效率确认细胞病变效应(Cyto pathic effect :CPE)。此时，hPIV2中，在上清中可以确认大量的重组病毒颗粒，但在rhPIV2(A^9)和rhPIV2 ( Δ 119)中几乎不能确认重组病毒颗粒。这表示如果缺损M蛋白质，则不能进行hPIV2的出芽。因此，取代Vero细胞，使用表达hPIV2_M的Cos细胞(转染了作为表达M蛋白的载体的hPIV2-M的Cos细胞)共培养。其结果，对rhPIV2(A^9)和rhPIV2 ( Δ 119)也在上清中可以确认大量的重组病毒颗粒。上述说明了使用Τ7启动子的rhPIV2的制备方法，但根据本发明，也能够使用利用任意的载体制备的rhPIV2。实施例3 完全缺损M基因或F基因的反义基因组(AM/rhPIV2、AF/rhPIV2)的构建如图3所示，在pUC118载体的ka I-Kpn I限制酶酶切位点导入含有hPIV2的基因组基因的质粒中编码M基因、F基因和一部分HN基因的ka I-Kpn I限制酶酶切位点之间的大致5. 5kb的基因。关于M基因缺损基因组的构建，通过PCR制作包括M基因的Rl区域和R2区域的M 基因编码区域完全缺失的AM/rhPIV〗。合成结合有缺失M基因的M基因上游区域序列和下游区域的引物，实施多重PCR，构建M基因编码区域完全缺失的AM/rhPIV2。引物序列中，作为含有限制酶酶切位点的序列，为5' -tgaaggagat cattgagctc ttaaagggac ttg-3'(序歹丨J序号5)，作为M基因上游区域序歹丨J，为5 ‘ -tggaacgttt agttttttta ttaaatttat catgtccagc ct_3 ‘(序列序号6)，作为M基因下游区域序列，为5 ‘ -ttaataaaaa aactaaacgt tccacaataa atcaacgttc ag-3 ‘ (序列序号 7)和 5 ‘ -ggattcttaa agcttggatg gaga-3'(序列序号8)。另外，调整碱基数，使得全部碱基数为6的倍数。关于F基因缺损基因组的构建，制作完全缺失了含有F基因的Rl区域和R2区域的 F基因编码区域1884bp的AF/rhPIV2。关于F基因缺损基因组，在F结构基因的直上区域中存在Bcll限制酶酶切序列和在HN基因中存在Kpnl限制酶酶切序列，使用该限制酶酶切序列，进行基因的完全缺损。使用的引物，使用5' -actgatcaat ctaacaaaaa aactaaacgt tctaagcacg aacccttaag gtgtcgtaac gtctcgt-3 ‘ (序列序号 9)和 5 ‘ -acttgatagg acggtaccca ttgagcctca atg-3'(序列序号 10)进行构建。实施例4 短暂性病毒的回收对短暂性表达、回收导入结核疫苗的α抗原用基因并使M基因或F基因完全缺损的AM/rhPIV2或Δ F/rhPIV2病毒的系统，通过与rhPIV2 (M终止)病毒回收方法同样的方法或其它的方法实现病毒回收。实施例5 :M蛋白质表达细胞或F蛋白质表达细胞的构建由于使hPIV2的M蛋白质和F蛋白质单独且持续地在细胞中表达时，认为该蛋白质具有细胞毒性，因此，在(1)持续表达该蛋白质的系统以外，构建( 诱导性表达该蛋白质的系统。(1)蛋白质持续系统的构建
使用在保持新霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因病保持鸡β -actin启动子序列和兔β-globin polyA序列(CAG romoter)的载体中导入了 M或F基因序列的载体进行实施。(2)蛋白质诱导表达系统的构建由诱导表达系统得到的M蛋白质表达细胞或F蛋白质表达细胞的构建通过利用诱导表达系统用Cre重组酶除去在2个IoxP序列中存在的填充序列，使用诱导的系统(pCALN载体)实施表达。该载体能够在Swa I限制酶酶切位点插入外来基因。Swa I限制酶酶切位点是末端平滑，在该平滑末端部位为M基因时，在M基因的上下区域中通过PCR导入产生平滑末端酶切的Riie I限制酶酶切位点，构建该M基因的诱导表达载体。关于F基因诱导表达系统，在F基因的上下领域中通过PCR导入产生Swa I平滑末端酶切的限制酶酶切位点，构建该F基因的诱导表达载体。在该F基因回收用中使用的 PCR用弓丨物序列，使用 5' -aaatttaaat atattcagcc atgcatcacc tg_3'(序列序号 11)禾口 5' -aaatttaaat cttgtgatag atttcttaag atatcc-3 ‘ (序列序号 12)。实施例6 表达细胞的构建使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)等，向Vero细胞转染上述载体，添加新霉素培养(lmg/ml)。利用新霉素的抗药性进行筛选。回收能够诱导表达M基因的Vero细胞。 使该细胞感染表达Cre蛋白质的腺病毒，使M蛋白质表达。使该细胞感染由上述实施例回收的M基因缺失病毒，实现非增殖型病毒的回收。其结果，能够实现缺失M基因的非增殖型病毒的回收。以和M蛋白质表达细胞同样的方法或其它的方法进行F蛋白质诱导表达细胞和F 蛋白质持续表达细胞的构建。其结果，能够获得F蛋白质诱导表达细胞和F蛋白质持续表达细胞。使用这些细胞，能够实现缺损F基因的非增殖型病毒的回收(图6)。实施例7 含有编码α抗原的基因的rhPIV2的构建在含有序列序号1所示的第390 第1244的碱基序列的堪萨斯分枝杆菌的α 抗原基因(αΚ)的5'添加TPA的信号序列，再在3'中添加hPIV2的R1、插入序列和 R2，在rhPIV2的Not I部位插入，由此构建重组入有α抗原基因的rhPIV2 (以下称为 “rhPIV2-Ag85B”或“rhPIV2/Ag85B”)(参照图；3)。Not I部位是紧随rhPIV2基因组的前导序列重组入的部位，被设置在反义rhPIV2基因组的5'末端附近。另外，作为对照，在Not I部位中，构建重组入有GFP (水母由来的荧光蛋白质)基因的rhPIV2(以下称为“rhPIV2-GFP” 或“rhPIV2/GFP”)。通过实施例2的方法，大量制备rhPIV2-Ag85B和rhPIV2_GFP。接着，对于含有序列序号3所示的第121 第975的碱基序列的牛分枝杆菌BCG的 α抗原基因(aK)BCG_Ag85B的基因，在具有序列序号3所示的第121 第975的碱基序列的DNA中添加起始密码子(ATG)，在rhPIV2的Not I部位插入，构建重组入有BCG_Ag85B 的 rhPIV2 (以下称为 “ Δ M/rhPIV2_Ag85B (BCG) ” 或“或 Δ F/rhPIV2_Ag85B (BCG) ”)(参照图3)。Not I部位是紧随rhPIV2基因组的前导序列重组入的部位，被设置在反义rhPIV2 基因组的5'末端附近。即，对于BCG的Ag85B，在序列序号4的氨基酸序列中切除信号序列部分(1 40)，在第41 第325的氨基酸(FSR……)中重组入第121 第975的碱基(ttctccc……)。实施例8 仓鼠中的GFP的表达确认对仓鼠经鼻投与(例5\105个病毒)1~迚1￥2-6 ，如图5所示，在气管(trachea) 和肺(lung)的上皮细胞中确认到GFP的荧光。由此可知，rhPIV2通过经鼻给药，在气管和肺中极高地促进外来基因的表达(图4)。实施例9 关于使用小鼠的结核预防的效果确认将30只BALB/C小鼠分为A C 3组(10只/组)，队各组分别施加下述处理。A组(对照组)将rhPIV2-GFP以2周间隔经鼻给药4次。作为rhPIV2_GFP的经鼻给药量，1次分量为ι χ IO7个病毒/20 μ L。B组(试验组1)将表达型Ag85B_DNA经过2周腹腔内给药2次，将 rhPIV2-Ag85B (Μ终止)以2周间隔经鼻给药2次。作为表达型Ag85B_DNA的给药量，为每 1只50yg。另外，作为rhPIV2-Ag85B(M终止)的经鼻给药量，1次分量为1 X IO7个病毒 /20 μ L。C组(试验组2)将rhPIV2_Ag85B (Μ终止)以2周间隔经鼻给药4次。作为 rhPIV2-Ag85B (Μ终止)的经鼻给药量，1次分量为1 X IO7个病毒/20 μ L。对各组在最终免疫1周后，使之经鼻感染强毒性的结核菌(Mycobacterium tuberculosis Kurono菌株)。在实验开始后的第49日，摘出肺和脾脏，确认了结核结节、 病变切片的显微镜像和结核菌数。在图8 图10中表示结果。经鼻喷雾型疫苗的最大特征在于，与通过注射等进行疫苗接种相比，接种容易且安全性高。使用了 rhPIV2的结核疫苗能够以现有的喷喉类容器进行接种，能够进行迅速且安全的接种。特别是，考虑到医生不足和由注射产生感染等，也可以认为对发展中国家等的疫苗接种带来巨大的效果，世界性影响强。结核菌是在巨噬细胞等噬菌细胞中增殖的细胞内寄生性细菌。在结核菌的感染预防中，诱导活化的巨噬细胞和细胞毒性T细胞(CTL)的细胞性免疫(Thl)而不是抗体为主体的液体性免疫成为中心。Ag85B是不受基因背景影响地显示诱导Thl类免疫反应的抗酸杆菌生物活性的单一蛋白，促进诱导在结核预防中重要的活化巨噬细胞的Y干扰素 (INF- y )的产生和T细胞向CTL的分化。因此，为了作为结核疫苗利用，制备将外来基因Ag85B作为分泌型导入的载体 (rhPIV2-Ag85B)，确认了 Ag85B的表达。其结果，如图5所示，确认了 Ag85B作为蛋白质表达。使F表达细胞感染GFP-PIV2 ( Δ F)，如图6所示，确认到GFP荧光，由此可知，可以进行病毒的表达和回收。另外，关于导入了 BCG-Ag85B的AF/rhPIV2-Ag85B(BCG)载体，可知BCG-Ag85B也作为蛋白质表达(图7)。另外，可知在利用！·证1￥2(] 终止)、1~迚1￥2(八？)、1~迚1￥2(八]\0经鼻投与了 Ag85B 或 BCG_Ag85B 的小鼠中，月市中的强毒结核菌(Mycobacterium tuberculosis Kurono M 株)引起的肺结核特有的病变(结核结节)显著地减少。其中，在图8 图10中表示 rhPIV2-Ag85B的结果。在图8(A)中，确认了大量结核结节，另一方面，在图8 (B)和图8(C) 中，以该顺序结核结节数比对照组显著地减少。在图9中表示结核结节的显微镜照片图。在对照组(B)中，可知肺泡损坏情况，另一方面，在试验组2(A)中，确认与通常状态几乎同等的情况。另外，关于rhPIV2 ( Δ F)、rhPIV2 ( Δ Μ)，也可以确认关于Ag85B和BCG_Ag85B与上述同等的效果。在图10中表示在肺和脾脏中的结核菌数。在对照组中，分别计数得到在肺中105_°5 的菌数、在脾脏中104_°8的菌数。另一方面，在试验组1中，分别地计数得到在肺中104 2°的菌数、在脾脏中IO3 45的菌数，在试验组2中，分别地计数得到在肺中IO31tl的菌数、在脾脏中103_”的菌数。一般而言，在肺结核的计数试验中，在以往的疫苗试验中，除了 BCGjfW 确认显著差别，在试验组和对照组之间菌数相差10倍也是少有的。但是，在本试验中，使用 rhPIV2-Ag85B的试验组的结核菌数少至对照组结核菌数的1/10 1/100左右，因此，可知本实施方式的疫苗是预防效果非常高的疫苗。<关于本实施方式的结核疫苗的考察>hPIV2原型载体特异地感染气管粘膜，具有(_)极性的非节段型单链RNA作为基因组，该RNA基因组中，6个碱基卷绕1个核衣壳蛋白，构成螺旋状的核苷蛋白(RNP)。通过具有非节段型RNA作为基因组，不引起如具有节段型RNA基因组的流感病毒一样的节段之间的突变(不连续突变)。另外，如果基因组不是6的倍数，转录、复制的效果显著减少， 因此，也难以认为是由于同源性重组等产生的基因突变。在之前所示的临床试验阶段的 MVA85A (安卡拉痘苗病毒)与AeraS402(35型腺病毒)中，母体是DNA病毒，不能避免偶然的同源重组等的危险性，但本实施方式的hPIV2载体的母体是RNA病毒，由于在细胞质内进行所有的生活循环，因此，与上述2种DNA载体不同，基因组不重组入核内染色体中。通过终止密码子或基因的缺损而除去M基因、F基因或HN基因表达的载体，也没有2次感染性颗粒产生的危险性，是能够经鼻地向气管粘膜特异地导入基因的RNP机器。 该载体原来的病原性低于上述DNA载体，也没有人(成人)中的病原性报告，极其安全。另外，该载体涉及成为最大限度地利用来自hPIV2基因组的转录特征、使得基因组的外来基因表达量为最大，可以认为M基因、F基因或HN基因抑制了来自基因组的转录，因此，使M基因、F基因或HN基因的产物缺失的该载体的蛋白表达量极高。在仓鼠中经鼻投与了插入有 GFP (绿色荧光蛋白)的rhPIV2 (Μ终止)-GFP时，确认了 GFP的强表达(图4)。在预防结核中，比全身免疫更重要的是在作为病态出现部位的肺的局部免疫(细胞免疫)的诱导。在本实施方式中，使用插入了细胞免疫诱导蛋白(Ag85B或BCG-Ag85B)的非增殖型rhPIV2-Ag85B载体或rhPIV2_BCG_Ag85B作为疫苗。该载体由于安全且能够实现向肺的细胞免疫诱导蛋白的强表达，因此，可以认为作为成人结核疫苗载体是非常有效的。该疫苗载体通过接种只进行一次感染，作为不产生2次感染性颗粒的安全的弱毒性半活经鼻喷雾疫苗用被开发。作为外来抗原表达的非定型抗酸杆菌(堪萨斯分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG)来源的α抗原(Ag85B)具有细胞免疫诱导能力。通过在病态出现部位肺中使Ag85B高表达，可以认为诱导对结核菌的高细胞性免疫(Thl)。在实际中，如果使仓鼠鼻腔感染rhPIV2-GFP载体，则在气管上皮细胞以及指导肺末端支气管中可见作为标靶基因的GFP的强表达(图4)。在使用小鼠的感染防御试验(结核预防试验)中，可以确认rhPIV2_Ag85B强大的结核预防效果(图8 图10)。在该试验方案中，除了 rhPIV2-Ag85B的单独给药(试验组2) 以外，研究了表达型Ag85B-DNA和rhPIV2-Ag85B的并用给药(试验组1)的效果。在试验组2中，可以确认非常高预防效果，另一方面，在试验组1中只能确认有限的效果。根据现有的报告显示，对表达型Ag85B-DNA也可以确认预防效果，但在本次试验结果中，可以认为表达型Ag85B-DNA的预防效果是有限的，可以认为试验组1的预防效果多依赖于rhPIV2_Ag85B。另外，对导入BCG-Ag85B取代Ag85B的hgPIV2_BCG_Ag85B也可以得到与 rhPIV2-Ag85B同样的预防效果。另外，如果对Ag85A、Ag85C也进行上述同样的试验，发挥与Ag85B同样的结核预防效果的可能性非常高。这样，根据本实施方式，可知通过投与在副粘病毒(特别是rhPIM)中重组入有编码α抗原等的基因的表达载体，能够发挥显著的结核预防效果。
权利要求
1.一种经鼻喷雾型结核疫苗，其特征在于在使M基因、F基因或HN基因缺损的副粘病毒基因中重组入有抗酸杆菌来源的α抗原、其类似物、编码具有与它们同样的功能的它们的突变体的基因。
2.如权利要求1所述的经鼻喷雾型结核疫苗，其特征在于所述《抗原是来自堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG的α抗原。
3.如权利要求1或2所述的经鼻喷雾型结核疫苗，其特征在于所述α抗原的类似物是抗原85复合体结构蛋白85Α或抗原85复合体结构蛋白85C。
4.一种结核的预防方法，其特征在于在使M基因、F基因或HN基因缺损的副粘病毒基因中重组入有抗酸杆菌来源的α抗原、其类似物、编码具有与它们同样的功能的它们的突变体的基因，对人进行喷雾且经鼻给药。
5.如权利要求4所述的结核的预防方法，其特征在于所述《抗原是来自堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG的α抗原。
6.如权利要求4或5所述的结核的预防方法，其特征在于所述α抗原的类似物是抗原85复合体结构蛋白85Α或抗原85复合体结构蛋白85C。
全文摘要
本发明提供对人结核、特别是对成人结核具有高预防效果的经鼻喷雾型疫苗。通过在副粘病毒基因(特别是rh-PIV2)中重组入有抗酸杆菌来源的α抗原(例如来自堪萨斯分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG的α抗原)、其类似物、编码具有与它们同样的功能的它们的突变体的基因的经鼻喷雾型疫苗实现。
文档编号A61P31/06GK102573897SQ201080037188
公开日2012年7月11日 申请日期2010年11月1日 优先权日2009年11月2日
发明者保富康宏, 河野光雄, 福村正之, 野阪哲哉 申请人:国立大学法人三重大学, 独立行政法人医药基盘研究所, 生物科摩株式会社