专利名称：通过用岩藻黄质和石榴油酸的组合激活去乙酰化酶Sirtuin来延缓衰老过程的方法
技术领域：
本发明涉及ー种用于延缓哺乳动物受试者的衰老过程的组合物。本发明还涉及ー种用于激活Sirtuin酶(一种去こ酰化酶)的组合物。
背景技术：
Sirtl是ー种使有助于细胞调节的蛋白质脱こ酰基的酶。Sirtuin-l (Sirtl)參与使寿命与脂肪组织相关联的分子机制。Sirtl在动物脂肪沉积中具有关键性的调控作用，其參与脂肪生成，并促进白色脂肪细胞中的脂肪动员。Sirtuin-I调控若干支配脂肪代谢的转录因子，包括过氧化物酶体增埴物-激活物受体-Y (PPAR- Y )、叉头框(fork-head-box)转录因子和脂联素(adiponectin)。Sirtl的激活通过抑制脂肪储存过程中的转录因子之一 PPAR-Y来促进脂肪动员。Sirtl抑制脂肪细胞中的脂质积聚。Sirtuin基因显著地抑制DNA不稳定性，还使得DNA进行修复。衰老的部分原因是衰老细胞不能象我们较年轻时那样在每个新细胞中完整地复制DNA。这会产生DNA碎片，所述碎片通过加速个体细胞的死亡来引起衰老。有证据将Sirtl与衰老联系在一起。体内脂肪的主要类型是白色脂肪组织(WAT)，其作用是以甘油三酯(TG)细胞内微滴的形式储存能量并且分泌数种细胞因子(脂肪因子)，所述细胞因子通过影响其他组织和器官诸如脑、肌肉和肝的功能来调控总能量平衡。脂肪因子包括瘦素(Ieptin)、脂联素、内脂素(visfatin)、抵抗素(resistin)、白介素(IL)-6和肿瘤坏死因子-a (TNFa )，它们调控能量代谢、胰岛素敏感性和心血管健康。当需要能量时，储存的TG经脂肪分解途径的
激活而被水解。TG储存和利用的协调受到蛋白质化合物家族-围脂滴蛋白(periIipins)
的调控，围脂滴蛋白包覆TG微滴并允许或阻止接近脂肪分解酶。另ー种类型脂肪是褐色脂肪组织(BAT)，其主要功能是燃烧TG释放的(脂解)脂肪酸以生成热能(“无寒战”产热)，尤其在新生儿中在出生后进入寒冷环境中的最初几小时期间作为保护性措施。随着人的成熟，BAT储库的尺寸显著减小，其在遍布全身的小袋内存在于成人中，并分布在WAT沉积物内。褐色脂肪组织存在于人类中直至第八个十年。白色和褐色脂肪组织之间的功能差异在于仅褐色脂肪被装备用于快速氧化来自脂肪储库的脂解产物。WAT由填充有单个脂滴的单泡细胞构成，而BAT由脂肪快速氧化引起的多泡脂质储存构成。活性BAT也在很大程度上受神经支配。BAT的实验性去神经支配产生许多类似白色脂肪细胞的单泡细胞。BAT细胞比白色脂肪组织的细胞小，并且BAT见于特征性的部位。在人类中BAT可见于颈部血管和肌肉附近，锁骨和腋窝之下，肋间血管周围，气管和食管之间，在主动脉旁区中以及在肾周和肾上区中。在肩胛间区中的褐色脂肪逐渐減少直至30岁，之后急剧減少。在新生儿中BAT以体重的相对大的量(2-5% )存在，并且通常认为其随着衰老而萎縮，可能转化成白色脂肪组织。BAT的減少与无寒战产热的能力减弱以及WAT积累(例如，向心性肥胖)和总体重増加的易感性相平行。脂肪组织的研究表明，基于形态学表现，随着老化，BAT的活性越来越低，所述形态学表现不同于新生儿或适冷的啮齿类动物中BAT的形态学表现。还存在证据表明，在男性中，取决于不利大气条件，诸如暴露于寒冷，BAT会更为明显和更具活性。例如，已经发现在户外生活的芬兰人的体内较广泛地分布BAT。饮食和年龄对BAT有重大影响。热量限制(CR)已经显示防止在数种组织诸如肝、心脏和骨骼肌中与年龄相关的的线粒体功能和生物合成的丧失，并且防止BAT中与年龄相关的线粒体功能的下降，可能与线粒体生物合成的较少损害有关。从事先接受40% CR饮食持续12个月的24月龄雄性和雌性大鼠获得的BAT线粒体与来自自由采食的老年(24个月)和幼年出个月)大鼠的线粒体相比较。就脂肪含量和脂肪细胞数目而言，与老年的自由采食大鼠相比，老年的受限制大鼠显示BAT尺寸减小。在幼年个体中，褐色脂肪细胞含有大量线粒体，并且密集受到交感神经系统的神经支配。这些神经末梢将去甲肾上腺素释放到脂肪细胞的周围环境中，在此去甲肾上腺素激活G-蛋白-偶联的β-肾上腺素能受体，该受体触发激活解偶联蛋白I(UCPl)的代谢事件。Sirtl的激活诱导UCPl的表达。UCPl是BAT的标志分子。解偶联蛋白I是褐色脂肪细胞的独特特征，其允许环境因素(例如，寒冷)、食物以及内源性刺激经由代谢激素例如糖皮质激素通过激活副交感和交感神经系统来生成能量。UCPl存在于线粒体的内膜中，在此解偶联蛋白I将燃料的氧化与产生三磷酸腺苷(ATP)解偶联，引起无寒战产热。UCPl水平増加可以被认为与活性BAT同义。机体(包括BAT和WAT)的代谢功能很大程度上取决于细胞的“发电站”，线粒体。通过Sirtuin蛋白家族維持有活力的线粒体，该类蛋白在进化中高度保守，具有保护细胞存活的单一功能。简单生物体的Sirtuin,例如酵母中的Sir2,和哺乳动物的Sirtuin,即哺乳动物Sirtl-7蛋白在处于热量限制(CR)饮食、不利环境条件例如恶劣和寒冷的天气、以及冬眠时是上调的。令人感兴趣的是，CR饮食是唯一已经证明的延长生物体寿命的方式，所述生物体从细菌至人类。在模型生物体例如酵母、果蝇(Drosophila fly)、线虫或啮齿类动物中的研究提示两种进化途径可能増加寿命(a)修复编码生命的遗传物质，以及(b)节约代谢活动以使維持生命的代谢的附带伤害和消耗效应最小化。Sirtuin酶,例如Sirtl和Sirt3,通过从蛋白质移除こ酰基来发挥它们的功能。脱こ酰作用导致在细胞代谢中蛋白质的作用失活，并且防止基因过表达，从而使细胞进入冬眠状态(较少的消耗和更多的修复时间)，因此潜在地増加了其寿命。细胞以与磷酸化/去磷酸化类似的方式利用こ酰化/去こ酰化来激活或失活蛋白质。脱こ酰作用的机制受Sirtl-7蛋白之间的相互作用调控，这些蛋白的功能是烟酰胺(NAD)依赖性的。通常，Sirtuin的激活伴有NAD水平的升高。去こ酰作用的NAD依赖机制调控代谢并维持细胞的寿命。NAD及其还原形式NADH之间的比率与热量摄取相关。NADH水平増加意味着热量摄取较多，因为食物中的能量转换成NADH，然后NADH用于生成ATP形式的能量。另ー方面，在CR饮食中出现NAD/NADH比率的增加。已经广泛研究了通过给予热量限制饮食或白藜芦醇来激活Sertl，并且已经将、Sirtl与衰老相关联。研究者已经比较了用具有各种限制以及高剂量或低剂量白藜芦醇的饮食饲养的小鼠。较高剂量的白藜芦醇直接增加Sirtuin或Sirtl的水平。发现白藜芦醇预防小鼠的肥胖以及年龄相关的心血管衰退。它还对年龄相关的状况具有数种积极的作用，诸如改善的平衡和运动协调，较少的白内障，较好的骨厚度、密度和矿物含量。延缓衰老过程，减少年龄相关的疾病，并且实际上延长生命。已经发现较低剂量的白藜芦醇对Sirtuin基因显示相同的作用。Sirtuins的激活抑制过氧化物酶体增殖物-激活受体Y ,PPAR-Y ,并且減少脂肪形成，以及触发WAT的脂解和损耗。相反，抑制Sirtuins増加WAT的形成。減少WAT延长了小鼠 的寿命，此发现提示了在哺乳动物中将热量限制与生命延长联系起来的可能分子途径。Sirt3-5的线粒体定位特别重要，原因在于线粒体功能障碍与哺乳动物衰老和代谢病有夫，所述代谢病包括糖尿病，神经变性疾病和癌症。Sirt3在褐色脂肪组织中表达，并且据报道Sirt3的脱こ酰基酶活性是诱导BAT及其标志物解偶联蛋白I (UCP-I)所必需的。Sirt3调控线粒体功能，其过表达加快呼吸，同时减少活性氧类别的产生。在人群研究中，Sirt3基因内的多态性(保护有价值基因的机制)已经与寿命相关联。BAT解偶联蛋白I在小鼠骨骼肌中的异位表达和UCPl在小鼠或人白色脂肪细胞中的诱导促进脂肪酸氧化和对肥胖的抵抗。褐色脂肪组织在调控人类的能量平衡中的重要性不可低估。一方面，已经发现BAT预防肥胖症；另一方面，其抗肥胖机制通过Sirtl-7蛋白的増加独特地发挥作用并与其相关，所述Sirtl-7蛋白延长寿命。已经发现少至40-50克的活性BAT可使代谢率增加20-25%。此BAT量相当于低于O. I %的平均人体重量。每天能量消耗相差20%可导致在保持体重和以每年20千克的速率増加体重之间的差异。此发现与人体的衰老尤其相关，因为普通成人在25岁以后每年増加O. 45kg (I lb)，并且在25岁以后每年丢失O. 2kg (O. 5 lb)肌肉和骨质量。植物酚类物质，包括植物抗毒素(phytoalexin)，即葡萄皮中存在的白藜芦醇，可以刺激Sirtuin酶，其接下来可以延缓衰老过程并且还可以调控代谢过程。在采用脂肪细胞的体外实验中，白藜芦醇可以影响数种脂肪形成转录因子和酶的表达，例如下调过氧化物酶体增殖物-激活受体PPART Y、C/EBP a、SREBP-Ic, FAS、HSL, LPL基因，并上调负责线粒体活性的基因，即Sirt3、UCPl和Mfn2 (线粒体融合蛋白(Mitofusin) 2)的表达。这些体外发现表明白藜芦醇可以通过在成熟过程中的前脂肪细胞中直接影响细胞活力和脂肪形成和在脂肪细胞中诱导凋亡来改变脂肪量，因此可以应用于治疗肥胖症。然而，天然化合物如白藜芦醇和其他植物酚类物质在调控代谢方面和作为抗肥胖化合物的潜在作用由于其主要在体外和动物研究中所表现出的不良胃肠吸收、组织生物利用度而被削弱。另外，白藜芦醇可提高心血管疾病风险因子(高半胱氨酸)的血液水平，而量大的一些酚类化合物，例如，茶多酚可能与肝脏毒性有夫。
发明内容
在美国肥胖个体的患病率在1960年和2000年之间几乎增加了两倍，并且可用的药理学和营养干预没有减慢这种趋势。岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案提供了一种增强肥胖症复原及其代谢后果的安全和有效的方法，所述实施方案由标准化的植物提取物构成，所述方法通过下述步骤来实现防止与年龄相关的BAT损耗，
在減少白色脂肪组织的情况下，増加褐色脂肪组织的体积，以及延 缓衰老过程。各种示例性实施方法涉及增效混合物在制备用于通过激活Sirtuin家族蛋白的至少ー个成员来延缓哺乳动物受试者的衰老过程的药剂中的用途。所述增效混合物包含(a)有效量的岩藻黄质，岩藻黄质的药学上可接受的盐，或它们的混合物；和(b)有效量的石榴油酸。各种示例性实施方案涉及岩藻黄质和石榴油酸的增效混合物在制备用于激活Sirtuin家族蛋白的至少ー个成员的药剂中的用途。各种实施方案涉及岩藻黄质和石槽油酸的增效混合物在制备用于使细胞进入冬眠状态的药剂中的用途，所述药剂通过激活选自由Sirtl和Sirt3蛋白组成的组的至少ー种蛋白质而使蛋白质脱こ酰基,从而使细胞进入冬眠状态。各种实施方案涉及岩藻黄质和石榴油酸的增效混合物在制备用于激活选自由Sirt3、Sirt4和Sirt5组成的组的至少ー种线粒体蛋白的药剂中的用途。各种实施方案涉及岩藻黄质和石榴油酸的增效混合物在制备用于激活线粒体UCP-I蛋白的药剂中的用途。各种示例性实施方案涉及岩藻黄质和石榴油酸的增效混合物在制备用于延缓衰老过程，和进ー步治疗非酒精性脂肪性肝病，増加能量消耗率，或増加褐色脂肪组织的体积和/或減少白色脂肪组织的体积的药剂中的用途。各种示例性实施方案涉及增效混合物在制备用于通过使蛋白脱こ酰基而使细胞进入冬眠状态来延缓哺乳动物受试者的衰老过程的药剂中的用途，其中所述增效组合包含岩藻黄质和石榴油酸。各种实施方案涉及ー种通过激活Sirtuin家族蛋白的至少ー个成员，来改善哺乳动物受试者的身体成分的方法，其中所述激活包括向所述受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合。岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案涉及基于其组分的相加和增效作用的组合物。第一个组分是岩藻黄质。岩藻黄质可以提取自，例如，褐色海藻(裙带菜(Undaria pinnatifida),褐藻纲(Phaeophyceae))。在各种示例性实施方案中，这样的提取物包含O. I重量％至10重量％的岩藻黄质,优选O. 5至5重量更优选O. 6至I. O重量％，最优选O. 8重量％。在各种示例性实施方案中，褐色海藻提取物另外包含ω3_脂肪酸。褐色海藻中的主要脂肪酸是η-3脂肪酸诸如ω-3 18:3_α-亚麻酸和ω-3 20:5 二十碳五烯酸。基于相加作用的组合物的第二个组分是石榴油酸。石榴油酸可以作为纯化合物被包含，或石榴油酸可以作为石榴油的组分被包含。如果石榴油酸作为石榴油的组分被包含，则石榴油一般含有50-90%石榴油酸，优选60-80%的石榴油，更优选70%的石榴油。石榴油提取自，例如，石槽籽(石槽(Punica granatum),石槽科(Punicaceae))。石槽油酸是9-顺式，11-反式共轭亚麻酸(9c，lit，13c-CLNA)并且构成石榴籽油的主要组分。岩藻黄质/石槽籽油的各种示例性实施方案涉及ー种通过激活Sirtuin家族蛋白的至少ー个成员来延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法。激活Sirtuin家族蛋白的至少一个成员包括向受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合的步骤。所述受试者可以是人或动物。Sirtuin家族蛋白被激活的成员可以是选自由Sirt3、Sirt4和Sirt5组成的组的至少一种线粒体蛋白。岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案涉及一种通过激活选自由Sirtl和Sirt3蛋白组成的组的至少一种蛋白来延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法。Sirtl或Sirt3蛋白的激活引起蛋白的脱乙酰化，使细胞进入冬眠状态。岩藻黄质/石槽籽油的各种不例性实施方案涉及一种通过向受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合，从而通过激活线粒体UCP-I蛋白来延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法。岩藻黄质/石槽籽油的各种不例性实施方案涉及一种通过向受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合，来增加受试者褐色脂肪组织的体积并减少白色脂肪组织的体积的方法。岩藻黄质/石槽籽油的各种不例性实施方案涉及一种通过向受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合，联合至少一种ω -3脂肪酸，从而通过激活Sirtuin家族蛋白的至少一个成员来延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法。所述ω-3脂肪酸可以来源于褐藻。在某些实施方案中，岩藻黄质和ω-3脂肪酸两者都可来源于褐藻提取物。在一些实施方案中，岩藻黄质可以是合成产生的，ω-3脂肪酸可以来源于褐藻提取物。在其他实施方案中，合成产生的岩藻黄质可以与褐色海藻的提取物组合，其中褐色海藻的提取物含有与ω-3脂肪酸组合的天然产生的岩藻黄质。在岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案中，石榴油酸是作为纯化的化合物使用的。在某些实施方案中，石榴油酸是作为石榴油的组分加入的。石榴油含有50-90 %石榴油酸，优选60-80 %石榴油，更优选70 %石榴油。在岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案中，所述岩藻黄质和石榴油酸的增效组合包含a)下列的至少一种天然产生的岩藻黄质；合成产生的岩藻黄质；包含岩藻黄质的褐色海藻提取物；和包含岩藻黄质和至少一种源于褐藻的ω-3脂肪酸的褐色海藻提取物；b)下列的至少一种天然产生的石榴油酸；合成产生的石榴油酸；以及包含石榴油酸的石榴籽油；以及c)任选地，至少一种ω -3脂肪酸。在此公开的各种实施方案涉及一种通过激活Sirtuin家族蛋白的至少一个成员来改善哺乳动物受试者的身体成分的方法，其中所述激活步骤包括向所述受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合。在各种实施方案中，改善身体成分包括通过用所述增效组合治疗，在哺乳动物受试者中增加褐色脂肪组织的体积并减少白色脂肪组织的体积。在此公开的各种实施方案涉及一种激活脂肪组织中的Sirtl的方法，其中所述激活可以通过使脂肪组织与有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合接触而在体外或体内进行。在各种实施方案中，增效组合物包含50wt. %的褐色海洋植物的提取物，所述提取物 包含30重量％的海洋植物油和O. I重量％至10重量％，优选O. 5至5重量％，更优选O. 6至I. O重量％，最优选O. 8重量％的岩藻黄质；和50wt. %的石榴籽油，所述石榴籽油包含60-80重量％，优选70重量％的石榴油酸。
在岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案中，所述岩藻黄质和石榴油酸的增效组合可以通过向所述受试者局部应用或经胃肠外施用所述增效组合来施用。在各种不例性实施方案中，包含O. I重量％至10重量％岩藻黄质,优选O. 5至5重量％，更优选O. 6至I. O重量％，最优选O. 8重量％岩藻黄质的褐色海洋植物的提取物可以以所述组合物的约25至75重量％的量存在；并且石榴籽油可以以所述组合物的约25至75重量百分比的量存在。当经口服时，褐色海洋植物油的提取物以足够提供Img至50mg岩藻黄质/天，优选2. O至15. Omg岩藻黄质/天,更优选2. O至5. Omg岩藻黄质/天的量存在。石榴籽油以足够提供I至IOOOmg石榴油酸/天的量存在。在岩藻黄质/石榴籽油的各种示例性实施方案中，岩藻黄质和石榴油酸的增效组 合可以通过向受试者经口服施用所述增效组合来施用。尽管优选口服，岩藻黄质/石榴籽油可以经口服、局部或经胃肠外施用。岩藻黄质/石榴籽油适用于人类、宠物动物和工业动物。
为了更充分地理解本发明的岩藻黄质/石榴籽油的性质和期望目的，结合附图参考以下详细说明，在附图中图I显示了蛋白质印迹(Western Blot)研究的结果,该结果证明Xanthigen 、岩藻黄质和石榴籽油对细胞Sirtl水平的影响；图2A是褐色海洋植物提取物的HPLC色谱图；图2B是岩藻黄质参比标准品的HPLC色谱图；图3显示Xanthigen (艾克西珍TM)对患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的肥胖受试者的肝脏脂肪含量和正常肝脏脂肪含量(NLF)作用的图表。
具体实施例方式在一个16周、双盲、随机化、安慰剂对照的临床研究中，评价了包含岩藻黄质、ω-3脂肪酸和石榴油的组合物。将岩藻黄质/石榴油组合物与单独的岩藻黄质、单独的石榴籽油或橄榄油安慰剂进行比较。在不改变生活方式的前提下，每天的饮食摄取量为1800千卡(中度限制的饮食)。在进入研究时和每周一次持续16周对110名非糖尿病绝经前肥胖女性评价摄食量数据、身体成分、能量消耗率(EER)和血样分析结果，这110名女性包括肝脏脂肪含量超过11 % -非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的72名女性(η = 72)和肝脏脂肪含量低于6.5% -正常肝脏脂肪(NLF)的38名女性(η = 38)。岩藻黄质/石槽籽油以200mg —天三次(TID)(总的日剂量包括2. 4mg岩藻黄质和210mg石榴籽油)的量施用16周，与接受安慰剂的志愿者相比，引起体重、腰围(仅NAFLD组)、身体和肝脏脂肪含量、肝脏酶(仅NAFLD组)、血清甘油三酯和C-反应蛋白在统计学上的显著降低。在研究中，体重减轻以及身体和肝脏脂肪含量减少在具有NLF的患者中比在具有NAFLD的患者中出现得早。与接受安慰剂的志愿者相比，在肥胖受试者中岩藻黄质/石榴籽油显著地增加了 EER。与单独服用岩藻黄质相比，石榴籽油通过激活岩藻黄质诱导的EER增加以及改善患者的临床和总体健康状态，产生了意想不到的效果。公开的组合物在肥胖非糖尿病女性中增加EER，促进体重减轻，减少身体的特别是肝脏的脂肪含量，并且改善肝脏功能。补充给药在具有NAFLD的肥胖女性中是特别有益的，而且还改善具有NLF的女性的健康状况。与石榴籽油联合给药的岩藻黄质可以被认为是在肥胖受试者中提高身体代谢、肥胖控制和正常化代谢和生化参数的一种有前途的食物补充剂。公开的组合物含有作为褐色海洋植物提取物的组分存在的岩藻黄质，和作为石榴籽油的组分存在的石槽油酸。该组合物极大地提高细胞中Sirtuin酶的表达(即Sirtl表达)。该组合物具有比单独的岩藻黄质实质上更大的作用。由岩藻黄质/石榴油酸组合物引起的Sirtl表达的极大提高是出人意料的，因为石榴油酸单独不会增强Sirtl表达；事实上，石榴油酸抑制Sirtl表达。由岩藻黄质/石榴油酸组合物引起的Sirtl激活以多种方式影响机体。首先，sirtl的激活诱导UCPl的表达。尽管岩藻黄质基于对UCPl的诱导而具有公认的减轻体重的性质，但岩藻黄质与石榴籽油的组合极大地增强了 Sirtl激活，因此比单独岩藻黄质更强烈地增强UCPl表达。岩藻黄质/石榴油酸组合物对UCPl的增强还通过解偶联细胞代谢中的步骤导致能量消耗率(EER)增加。岩藻黄质/石榴油酸还增强褐色脂肪组织(BAT)中的Sirt3表达，并且Sirt3的脱乙酰酶活性诱导BAT及其标志物解偶联蛋白-I的水平升高。岩藻黄质，单独或联合石榴油酸，上调WAT中UCPl基因的表达，从而促进KK-Ay小鼠中白色脂肪组织的减少和体重的显著减轻。岩藻黄质，单独或联合石榴油酸，还抑制脂肪细胞分化和脂质积聚，由此抑制甘油-3-磷酸脱氢酶活性。此外，岩藻黄质/石榴油酸还增强褐色脂肪组织(BAT)中的Sirt3表达，并且Sirt3的脱乙酰酶活性诱导BAT及其标志物解偶联蛋白-I的水平升高。已知甘油-3-磷酸脱氢酶与身体质量指数、WAT和血液葡萄糖有关。与相匹配的对照相比，发现甘油-3-磷酸脱氢酶敲除小鼠具有较低的身体质量指数，WAT重量减少40%，并具有较低的空腹血糖。岩藻黄质另外的降血脂性质源于下调过氧化物酶体增殖物-激活受体-Y (PPART- Y )，其负责成脂基因的表达。膳食石榴籽油显著地减少血清TG(—种促进肥胖和WAT的主要体脂)水平。石榴的石榴油酸已经显示抑制Λ-9脱饱和酶(脂肪代谢的一种酶)，这是石榴籽油减少肝TG积累作用背后的可能机制。褐藻ω-3脂肪酸可能提供另外的机制以减少血清和肝脏TG浓度，其原因是据报道ω-3促进肝脏脂肪酸β_氧化。这种降血脂机制可通过岩藻黄质与ω-3脂肪酸的共同给药进一步加强，这可以增加肝脏中膳食ω-3脂肪酸的量。所公开组合物的主要机制是由于与单独使用的岩藻黄质或石榴油相比，其对能量消耗率(EER)和相关的代谢和临床效应的出人意料的效果。通过间接测热法在患者中测量能量消耗率(EER)。用电化学氧传感器测量氧，并且用红外线二氧化碳传感器(阿美特克(Ametec) 二氧化碳分析仪)测量二氧化碳。在每次测量前，用O2和CO2气体混合物校准仪器。计算氧消耗(O2)和二氧化碳产生(CO2)的速率，并且以Imin的间隔打印出来。由O2和CO2值得到能量消耗。与用单独的岩藻黄质或石榴籽油/石榴油酸补充相比，补充所公开的岩藻黄质/石榴籽油组合物增加了 EER，尤其是在具有非酒精性脂肪肝疾病或NAFLD的肥胖受试者中，而且在具有正常肝脏脂肪含量或NFL的受试者中也是如此。单独岩藻黄质的最小有效剂量为2. 4mg。较低的岩藻黄质剂量I. 6mg尽管本身无效,但当补充以石槽籽油(200mg/天)、时，显示EER出人意料的显著增加(P < O. 05)和其他临床益处。因此，施用两个200mg胶囊，每个包含O. Smg岩藻黄质和IOOmg石榴籽油，是有效的。使用较高剂量的石榴籽油进一步增加了 EER。这些结果提示石榴籽油对岩藻黄质诱导的EER增加具有触发和增效的剂量依赖性作用。单独施用石榴籽油/石榴油酸对EER没有作用。
岩藻黄质/石榴籽油组合物的临床研究证明石榴油与岩藻黄质联合增效性发挥作用，产生岩藻黄质的EER-刺激作用。如在表4(以下进一步详细讨论)中所见，单独岩藻黄质显著地增加能量消耗率，而单独石榴油对能量消耗率的作用很小或没有作用。然而，岩藻黄质和石榴油的组合比单独岩藻黄质实质上更多地增加能量消耗率。增效的岩藻黄质/石榴油组合还引起提高的代谢率、WAT损失和体重减轻。增效的岩藻黄质/石榴油组合还产生较小的腰臀比(WHR)并使身体的自稳功能正常化，如正常化的血压和炎症指标例如C-反应蛋白或CRP所证明的那样。临床研究提供了 Sirtl-7蛋白激活的证据，其通过增加BAT维持身体成分和代谢功能获益，并且还延缓WAT随衰老过程的WAT积聚。岩藻黄质/石榴籽油组合物可以加强或削弱UCP-I蛋白表达，这将反映在该组合物对BAT生物发生和Sirtuin蛋白激活的影响上。如前述，具有NAFLD的肥胖患者以及具有NFL的那些患者受益于岩藻黄质/石榴籽油组合物，他们的肝脏和内脏脂肪减少，血浆氧化型LDL减少，以及体内炎性过程减少，例如，血清CRP水平降低，血清CRP水平与胰岛素抵抗、代谢综合征和2型糖尿病的发生正相关。岩藻黄质/石榴籽油组合物针对复杂的代谢紊乱提供了营养基因组方法，其作用于机体的基因组、表观基因组和蛋白质组。这种多重的营养基因组机制防止过多体脂的常见复发(振动效应(yo-yo effect))，确保肥胖症的恢复。岩藻黄质/石榴籽油组合物调控BAT和WAT以及脂肪因子包括瘦素、脂联素、内脂素、抵抗素、白介素(IL)-6和TNF，这些脂肪因子再影响能量代谢、胰岛素敏感性、心血管健康和全身健康。在其广泛的作用机制下，岩藻黄质/石榴籽油组合物具有减少肝脏甘油三酯含量的器官特异性效应。岩藻黄质/石榴籽油组合物所观察到的正常血压效应，这可能表明在肥胖个体中所述组合物广泛的自稳机制，其归因于体重、身体和肝脏脂肪含量的显著减轻，血清TG、炎症标志物和肝脏酶的减少。脂联素是一种WAT脂肪细胞来源的细胞因子，在CNS中作用以控制自主功能、能量和心血管内稳态，引起接受岩藻黄质/石榴籽油组合物的研究群体中的正常血压效应。岩藻黄质/石榴籽油组合物刺激脂联素，其发挥在临床研究中见到的自稳效应。岩藻黄质/石榴籽油组合物的机制导致由脂肪细胞产生的另一种脂肪因子瘦素的水平下降。岩藻黄质/石榴籽油组合物导致的脂联素与瘦素比率的增加与体重减轻、BAT与WAT比率的增加以及改善和节省的代谢能量过程相关。已经显示在空腹血浆中特定脂肪酸的存在可对炎性标志物的水平具有显著的影响。例如，较低的α-亚麻酸含量与较高的CRP相关，而高血浆η-3脂肪酸含量与较低的促炎标志物水平和较高的抗炎标志物水平相关。尽管石榴油酸(PA)在结构上与亚麻酸和亚油酸相关，但其具有截然不同的作用机制。例如，被给予除PA之外的共轭亚油酸或共轭亚麻酸异构体混合物饮食的动物发生胰岛素抵抗和脂肪肝，尽管体重显著减轻。服用岩藻黄质/石榴籽油组合物的个体减少WAT，这种作用可能涉及参与甘油三酯代谢的蛋白，即脂肪细胞中的围脂滴蛋白，其活性与UCPl改变的活性和增加的BAT有关。
围脂滴蛋白基因编码围脂滴蛋白，该蛋白包覆细胞内脂滴并且调控脂肪细胞中的脂解作用。脂滴蛋白的围脂滴蛋白(PAT)家族在哺乳动物中包括5个成员围脂滴蛋白、月旨肪分化相关蛋白(ADRP)、47kDa的尾连蛋白(TIP47)、S3-12和0ΧΡΑΤ。围脂滴蛋白存在于进化上远缘的生物体中，包括昆虫、粘菌类和真菌。这些蛋白在结构和结合细胞内脂滴的能力方面是类似的，所述结合是组成型的或响应于代谢刺激，例如，进出脂滴的增加的脂质流量。位于脂滴表面，围脂滴蛋白控制对其他蛋白(脂肪酶)以及对脂滴核内的脂质酯类的接近。围脂滴蛋白可以与对于脂滴生物合成重要的细胞器相互作用。已发表的研究强调了围脂滴蛋白作为脂解作用的调节剂的重要性，所述研究证明围脂滴蛋白在脂肪细胞中的过表达导致脂解减少，以及围脂滴蛋白敲除小鼠显示基础脂解水平增加和抗肥胖的证据。围脂滴蛋白的脱磷酸化形式限制接近脂滴，阻止脂质动员。当激素发出信号需要代谢能量时，脂质必须被带出储库，并被转运至可氧化脂肪酸以产生能量的组织。为此，酶腺苷酸环化酶被激活并且依次导致围脂滴蛋白的cAMP-依赖性 蛋白激酶(PKA)磷酸化。围脂滴蛋白的磷酸化形式允许胞液中的脂肪酶移动至脂滴，并且水解TG，释放脂肪酸和甘油。本发明的岩藻黄质/石榴籽油组合物由于Sirtl-7级联的营养基因组激活而具有广泛的代谢活性，减少WAT以利于BAT，改善能量消耗率，改善葡萄糖耐量，减少炎症标志物，降低血压，减轻体重并改善个体的总体健康状态。如以上所讨论，Sirtuin酶,例如Sirtl和Sirt3，通过从蛋白移除乙酰基而发挥它们的功能。脱乙酰作用导致在细胞代谢中的所述蛋白作用的失活并且防止基因过表达，从而使细胞进入冬眠状态并延长其寿命。岩藻黄质/石榴籽油组合物通过延缓原发的衰老(增加寿命)，并通过降低慢性退行性疾病的发病率发挥针对继发衰老的保护效应来增加肥胖的复原。综上所述，岩藻黄质/石榴籽油组合物类似热量限制(CR)饮食的效应。然而，大多数人不太可能愿意在他们整个生存期的大部分时间内保持减少30%的饮食，即使它意味着更多健康的岁月。为此原因，岩藻黄质/石榴籽油组合物作为CR模拟物特别有利，提供与CR相同的有益效果，无须过多节食。不需要大幅度减少食物摄取，岩藻黄质/石榴籽油组合物有利地影响免疫功能和激素概况，尤其是减少葡萄糖/能量流的那些。不受任何理论的约束，本发明人确信岩藻黄质/石榴籽油组合物通过发挥广泛的调节性自稳机制来增加对衰老过程的抵抗。胰岛素抵抗是随着衰老碳水化合物代谢障碍增加的重要原因之一。这些变化的机制已经部分地被阐明。体力活动的减少和全身尤其是腹部和肝脏脂肪的增加是尤其重要的发病机制。骨骼肌中葡萄糖载体4(GLUT-4)水平和胰岛素样生长因子I (IGF-I)血清水平的变化可以是与脂肪组织无关的机制。可与衰老过程中胰岛素抵抗相关的其他机制涉及瘦素和脂联素血清水平或线粒体能量代谢变化和饮食中高级葡萄糖终产物水平。许多研究提示在高于60岁的人中β细胞功能下降。可以在负荷试验中尤其是利用延长的静脉内葡萄糖输液检测年龄相关的β细胞功能缺陷。缺陷的机制是胰岛素加工、胰岛素分泌、胰岛素释放动力学中的异常，同时伴有较低的胰岛素分泌能力，不能适当地增加胰岛素释放，以及随年龄增加的胰岛素抵抗。这些致病变化与内脏脂肪沉积的增加和其他机制相关，诸如β细胞结构缺陷，葡萄糖和肠降血糖素感知减弱和复制/再生过程的缺陷性进程。另外，开发脂肪器官的可塑性的可能性，将白色脂肪组织中的白色脂肪细胞转变成非典型的褐色脂肪细胞并增加它们中的产热被认为是增加人能量消耗的另一潜在靶标。
实施例I.岩藻黄质/石榴油酸混合物对Sirtl表达的作用细胞培养研究岩藻黄质/石榴油酸混合物对小鼠细胞中Sirtl表达的作用。购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(罗克维尔，马里兰州)的小鼠3T3-L1前脂肪细胞在补充有2mM谷氨酰胺(GIBCO BRL公司，格兰岛，纽约)，I %青霉素/链霉素(10000单位青霉素/mL和IOmg链霉素/mL)和10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dubecco' s modified Eagle' s medium) (DMEM) (GIBCO BRL 公司)中在 37°C在增湿的5% CO2气氛中培养。为了使3T3-L1前脂肪细胞分化，将细胞接种至6孔培养板(2X 104/mL)并如上所述进行培养。汇合(定义为第O天)后两天，细胞在含有I. 7 μ M胰岛素、O. 5mM 3-异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和12. 7 μ M地塞米松(DEX)的分化培养基中在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中孵育48h。然后用含有10% FBS和胰岛素(1.7μΜ)且含有或不含有(10、50和100 μ g/mL)岩藻黄质提取物、Xanthigen 或石槽籽油的DMEM更换培养基,并且每两天更换 为新鲜培养基。12天后，收获细胞，然后提取总蛋白用于蛋白质印迹分析。在小鼠细胞中Sirtl表达的此研究中使用的岩藻黄质提取物是裙带菜(Undariapinnatifica)完整植物的提取物。该提取物含有O. 8重量％的岩藻黄质和30重量％的海洋植物油。岩藻黄质提取物的脂肪酸组成示于表2。使用的岩藻黄质提取物可进一步含有(10. Owt. %的棕榈油。在此研究中使用的石榴籽油含有70wt. %石榴油酸，并且是石榴(Punica granatum)植物的种子的提取物。在此研究中使用的Xanthigen ,即岩藻黄质/石榴油酸混合物，含有50wt. %的岩藻黄质提取物和50wt. %的石榴籽油。通过向在冰上30min的细胞团添加100 μ L金裂解缓冲液(50mM Tris-HCl, pH7. 4 ；ImM NaF ；150mM NaCl ；ImM EGTA ;lmM 苯甲基磺酰氟；I % NP-40 和 10 μ g/mL 亮抑酶肽)，然后以10，OOOXg在4°C离心30min,提取总蛋白进行蛋白质印迹分析。通过Bio-Rad蛋白测定法(Bio-Rad Laboratories,慕尼黑，德国)测量总蛋白。样品(50yg蛋白)与含有 0.3M Tris-HCKpH 6. 8)，25% 2-巯基乙醇，12%十二烷基硫酸钠(SDS), 25mM EDTA,20%甘油和0. 1%溴酚蓝的5X样品缓冲液混合。混合物在100°C煮沸5min，并在20mA的恒定电流下加样至10% SDS-聚丙烯酰胺小型凝胶。电泳后，使用转移缓冲液将凝胶上的蛋白电转移至固定膜上(PVDF ；Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞州)，转移缓冲液由25mMTris-HCl (pH8. 9)，192mM甘氨酸和20%甲醇构成。用含有20mM Tris-HCl的封闭溶液封闭膜，然后用一抗进行免疫印迹，所述一抗包括Sirtl和β_肌动蛋白的抗体(TransductionLaboratories,列克星敦，肯塔基州)。印迹用PBST缓冲液漂洗3次，每次lOmin。然后印迹与辣根过氧化物(HRP)-偶联二抗(Zymed Laboratories,旧金山，加利福尼亚州)的
I 5000稀释液孵育，然后再次用PBST缓冲液洗涤3次。转移的蛋白用增强化学发光检测试剂盒(ECL ；Amersham Pharmacia Biotech,白金汉郡,英国)显影。如图I中所示，与3T3-L1前脂肪细胞相比，在分化的3T3-L1脂肪细胞中Sirtl蛋白的表达显著降低。另一方面，用岩藻黄质提取物和Xanthigen 处理显著增加分化的3T3-L1脂肪细胞中的Sirtl蛋白水平，而如表I中所见，用石榴籽油处理没有作用。对于3T3-L1前脂肪细胞和分化的脂肪细胞的蛋白质印迹结果的比较表明在不添加xanthigen、岩藻黄质或石槽籽油的条件下,3T3-L1前脂肪细胞中的Sirtl水平为分化的脂肪细胞中的Sirtl水平的约280% (2. 8vs. I. O)，如表I中所示。在不添加Xanthigen 、岩藻黄质或石榴籽油时的分化的3T3-L1脂肪细胞在这些实验中用作对照。对于已经用岩藻黄质处理的分化的3T3-L1脂肪细胞的蛋白质印迹结果表明岩藻黄质将分化的脂肪细胞中的Sirtl水平提高至几乎前脂肪细胞中的Sirtl水平(2. 4-2. 7vs. 2. 8)。提高的量不依赖剂量(10微克/ml，50微克/ml和100微克/ml得到类似的结果)。对于已经用石榴籽油处理的分化的3T3-L1脂肪细胞的蛋白质印迹结果与使用岩藻黄质所示结果非常不同。用石榴籽油处理实际上抑制分化的3T3-L1脂肪细胞中的Sirtl水平，相对于对照组中的Sirtl水平而言(O. 0-0. 4vs. I. 8)。提高的量似乎是剂量依赖性的(在用10微克/ml石榴籽油处理的细胞中观察到一些Sirtl活性，而在用50-100微克/ml石榴籽油处理的细胞中观察不到Sirtl活性)。因此，岩藻黄质和石榴籽油对于分化细胞中的Sirtl激活具有相反的效应。用包含50wt. %裙带菜提取物(含有0.8wt. %岩藻黄质)和50wt. %石槽籽油的混合物(Xanthigen)处理极大地提高了分化3T3-L1脂肪细胞中的Sirtl水平。用Xanthigen处理的分化脂肪细胞中的Sirtl水平已经增加至前脂肪细胞中的Sirtl水平的220-243%之间(6. 2-6. 8vs. 2. 8)，并且在对照组中的Sirtl水平的6倍之上。提高的量不依赖于剂量(10微克/ml，50微克/ml和100微克/ml得到类似的结果)。
因此，即使岩藻黄质和石榴籽油对分化细胞中的Sirtl激活具有相反的效应，它们的组合比单独岩藻黄质产生更大的Sirtl激活。此结果是出人意料的，因为单独的石榴籽油不增强Sirtl水平，反而是抑制Sirtl激活。表I.岩藻黄质/石榴油酸混合物对Sirtl表达的作用
权利要求
1.一种延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法，所述方法包括 激活Sirtuin家族蛋白的至少一个成员，其中所述激活包括 向所述受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述施用包括施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合，其中所述岩藻黄质作为褐色海洋植物提取物的组分被施用。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述施用包括施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合，其中所述石榴油酸作为石榴籽油的组分被施用。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述激活包括激活选自由Sirtl和Sirt3蛋白组成的组的至少一种蛋白质；其中所述激活通过将蛋白质脱乙酰基使细胞进入冬眠状态。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述激活包括激活选自由Sirt3、Sirt4和Sirt5组成的组的至少一种线粒体蛋白。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述激活进一步包括激活线粒体UCP-I蛋白。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述方法进一步包括使用所述增效组合治疗非酒精性脂肪性肝病。
8.根据权利要求I所述的方法，其中所述方法进一步包括使用所述增效组合治疗脂肪肝病症。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述方法进一步包括使用所述增效组合提高能量消耗率。
10.根据权利要求I所述的方法，其中所述方法进一步包括通过使用所述增效组合治疗来增加褐色脂肪组织的体积并减小白色脂肪组织的体积。
11.一种延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法，该方法包括 通过将蛋白质脱乙酰基使细胞进入冬眠状态，其中所述将蛋白质脱乙酰基通过向所述受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合而实现。
12.根据权利要求I所述的方法，其中所述增效组合进一步包含至少一种ω-3脂肪酸。
13.根据权利要求I所述的方法，其中所述增效组合进一步包含来源于褐藻的至少一种ω-3脂肪酸。
14.根据权利要求I所述的方法，其中所述增效组合包含来源于褐藻的岩藻黄质和来源于褐藻的至少一种ω-3脂肪酸。
15.根据权利要求I所述的方法，其中所述增效组合包含合成生成的岩藻黄质和来源于褐藻的至少一种ω-3脂肪酸。
16.根据权利要求I所述的方法，其中所述增效组合包含 岩藻黄质，单独或联合海洋褐藻提取物；和 石榴油酸，单独或联合石榴籽油。
17.根据权利要求I所述的方法，其中所述增效组合包括 岩藻黄质和石榴油酸的所述增效组合； 其中所述岩藻黄质作为海洋褐藻的至少一种提取物的组分被包含；并且 其中所述石榴油酸作为石榴籽油的组分被包含。
18.根据权利要求I所述的方法，其中所述施用包括向所述受试者局部应用或经胃肠外施用所述增效组合。
19.根据权利要求I所述的方法，其中所述施用包括向所述受试者经口服施用所述增效组合。
20.根据权利要求I所述的方法，其中所述受试者是人。
21.—种改善哺乳动物受试者的身体成分的方法，所述方法包括 激活Sirtuin家族蛋白的至少一个成员，其中所述激活包括 向所述受试者施用有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合。
22.—种激活脂肪组织中的Sirtl的方法，所述方法包括 使所述组织与有效量的岩藻黄质和石榴油酸的增效组合接触； 其中该增效组合物包含 · 50wt. %的褐色海洋植物提取物，所述提取物包含30wt. %的海洋植物油和0. 5至·5wt. %的岩藻黄质；以及 50wt. %的石榴籽油，所述石榴籽油包含60-80wt. %的石榴油酸。
23.根据权利要求I所述的方法，其中所述提取物包含30wt.%的海洋植物油和·0.8wt. %的岩藻黄质。
全文摘要
岩藻黄质/石榴籽油组合物描述出一种通过激活Sirtuin家族蛋白的至少一个成员从而延缓哺乳动物受试者的衰老过程的方法，其中所述激活步骤包括向所述受试者施用岩藻黄质和石榴油酸的增效组合。Sirtuin酶通过从蛋白质移除乙酰基来发挥其功能。脱乙酰作用导致在细胞代谢中蛋白质作用的失活并且防止基因过表达，从而使细胞进入冬眠状态并延长其寿命。
文档编号A61K31/202GK102630161SQ201080052452
公开日2012年8月8日 申请日期2010年9月17日 优先权日2009年9月18日
发明者V·帕德玛, 保罗·M·弗劳尔曼, 米格尔·希门尼斯·德尔·里奥 申请人:珀利弗诺斯自然有限公司