专利名称：来源于胎盘的贴壁细胞及其在疾病治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明，在其一些实施例中，涉及来源于胎盘的贴壁细胞(粘附细胞，adherentcell)及其在疾病治疗中的应用。
背景技术：
近年来，大量的研究工作集中在间充质基质细胞(MSC)在各种医学应用包括损伤器官例如脑、心脏、骨骼和肝脏的组织修复以及支持骨髓移植(BMT)中的治疗潜力。间充质基质细胞，一种从例如骨髓、脂肪组织、胎盘和血液中获得的异种细胞群，基于各种生物活性因子的影响，能够分化成不同类型的细胞，例如网状内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、成骨前体细胞。因此，在再生医学中已对作为建造用于修复损伤或取代病理组织的新组织如骨骼、软骨和脂肪的基础以及遗传性疾病和获得性疾病的治疗方法的间充质基质细胞进行了广泛研究[Fibbe and Noort, Ann N Y AcadSci (2003)996:235-44;Horwitz et al.,Cytotherapy(2005)7(5) :393-5 ；Zimmet andHare, Basic Res Cardiol (2005) 100 (6) :471-81]。此外，间充质基质细胞的多向能力、其简单的分离和培养、及其高离体扩增潜能使其成为一种有吸引力的治疗工具[Fibbe andNoort, supra;MinguelI et al, Exp Biol Med(Maywood)(2001)226(6):507-20]。最新出现的资料表明间充质基质细胞逃脱了同种异体反应细胞的识别，并且被认为是免疫豁免的[Le Blanc et al，Exp Hematol (2003) 31 (10) : 890-6]。因为具有低免疫原性，所以间充质基质细胞不被患者的免疫系统排斥，因此认为不要求做人白细胞抗原配型。来源于胎盘的间充质基质细胞呈现许多对从其他组织中分离出的间充质基质细胞来说是常见的标记物，例如⑶105、⑶73、⑶90和⑶29，并且没有造血细胞、内皮细胞的和滋养细胞-特异性细胞标记物的表达。在适当条件下培养来源于胎盘的间充质基质细胞，已实现脂肪形成、骨形成、和神经元分化[Yen et al, Stem Cells (2005) 23 (I) : 3-9]。此外，已显示从胎盘中分离并在体外培养的间充质基质细胞与间充质基质细胞类似，是免疫豁免的[Li et al, Cell Res (2005) 15 (7) : 539—47]。因此，胎盘提供不会引起伦理学争议且易于获得的、用于实验应用和临床应用的间充质基质细胞的来源[Zhang et al, ExpHematol(2004)32(7):657-64]。
发明内容
根据本发明一些实施方式的一个方面提供来源于胎盘的纯化的贴壁细胞群、由本文中所述的可用于治疗可以收益于细胞或器官移植的疾病的任何贴壁细胞群所制备的条件培养基(conditioned media)。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞包含选自⑶73、⑶90、⑶29、⑶105和D7-fib的阳性标记物表达；亦即，在一些实施方式中，贴壁细胞表达⑶73、⑶90、⑶29、CD105或D7-fib中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞包含选自⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA-DR、⑶lib、⑶14、⑶19、⑶34、⑶31、⑶200、KDR、和⑶79的阴性标记物表达；亦即，在一些实施方式中，贴壁细胞不表达 CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD I Ib、CD 14、CD 19、CD34、CD31、CD200、KDR、或 CD79。根据本发明的一些实施方式,在三维(3D)培养中培养贴壁细胞。根据本发明的一些实施方式，三维(3D)培养包括三维生物反应器。根据本发明的一些实施方式，在灌注下实施贴壁细胞在三维培养中的培养。根据本发明的一些实施方式，实施贴壁细胞的培养达至少3天。根据本发明的一些实施方式，实施贴壁细胞的培养直到至少10%的贴壁细胞在增殖。根据本发明的一些实施方式,在二维(2D)培养中培养贴壁细胞。根据本发明的一些实施方式，至少10%的贴壁细胞处于增殖状态；亦即至少10%的贴壁细胞在增殖。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞与从生长骨髓中获得的贴壁细胞相比较少成为成骨谱系并且能够在相同条件下分化。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞与从生长的骨髓中获得的贴壁细胞相比较少成为脂肪形成谱系并且能够在相同条件下分化。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种来源于胎盘的贴壁细胞群，其中该细胞群包含至少70%的来自胎盘母体部分的贴壁细胞。根据本发明的一些实施方式，胎盘的母体部分包括基蜕膜、壁蜕膜，或者同时包括基蜕膜和壁蜕膜。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种来源于胎盘的贴壁细胞群，其中所述细胞群包含至少70%的来源于胎盘胚胎部分(fetal portion)的贴壁细胞。根据本发明的一些实施方式，胎盘的胚胎部分包括羊膜。根据本发明的一些实施方式，胎盘的胚胎部分是由羊膜构成。根据本发明的一些实施方式，胎盘的胚胎部分包括绒毛膜绒毛(chorionicvilli)。根据本发明的一些实施方式，胎盘的胚胎部分是由绒毛膜绒毛构成。根据本发明的一些实施方式，细胞群是如下的细胞群其中不多于3.5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的来自母体部分的贴壁细胞群表达CD200，正如由流式细胞仪并采用确定阴性表达的同种型对照所测量的。根据本发明的一些实施方式，所述贴壁细胞具有小于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞的细胞直径。根据本发明的一些实施方式，所述贴壁细胞具有高于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞的细胞增殖能力。、
根据本发明的一些实施方式，当在混合淋巴细胞培养中进行测试时，所述贴壁细胞能够抑制免疫反应的程度低于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种从包含任何上述细胞群的培养物中分离出的条件培养基。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种药物组合物，其包括作为活性成分的本文中所述任何细胞群或任何本文中所述条件培养基、以及药学上可接受载体。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种治疗受益于细胞或器官移植的医学疾病的方法，该方法包括向需要其的受试者给予治疗有效量的任何本文中所述的药物组合物，因此治疗受试者。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供本文中所述的任何细胞群或条件培养基的应用，其是用于治疗可以受益于细胞或器官移植的疾病的药物的制造。 根据本发明的一些实施方式，所述疾病是选自缺血、外周动脉疾病(PAD)、严重肢体缺血(CLI)、下肢缺血、中风、缺血性血管病、肾脏的血管病、缺血性心脏病、心肌缺血、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化性心血管疾病、左主冠状动脉疾病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管疾病、动脉硬化、视网膜病变、视网膜修复、重构紊乱(重塑紊乱，remodeling disorder)、林岛综合征、遗传性出血性毛细血管扩张、缺血性血管病、伯格氏病(Buerger’ s disease)、缺血性肾病、胎盘缺血、与生殖相关的疾病、移植物抗宿主病、实体器官移植、造血干细胞移植、糖尿病、结缔组织损伤、癌症、癌前期、骨癌、骨肉瘤、骨转移、骨折、烧伤、关节软骨缺陷、深部伤、伤口延迟愈合、溃疡延迟愈合、软骨下骨囊肿、骨质疏松、骨关节炎、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺陷、腱损伤、自身免疫性疾病、代谢紊乱、银屑病、神经病理性疼痛、周围神经损伤、神经退行性疾病、肾移植的支持(support of kidneytransplantation )、和炎症性疾病。根据本发明的一些实施方式，所述疾病是选自心力衰竭、心肌梗塞、神经病理性疼痛、骨骼肌缺陷、中风、和缺血性心脏病。根据本发明一些实施方式的一个方面，所述方法是治疗骨骼肌缺陷的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物，因此治疗骨骼肌缺陷。根据本发明一些实施方式的一个方面，所述方法是治疗神经病理性疼痛的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的包括来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物，因此治疗神经病理性疼痛。根据本发明的一些实施方式，神经病理性疼痛与炎性疼痛、糖尿病多发性神经病变、人类免疫缺陷病毒(HIV)感觉神经病变、中风后综合征、缺血、或多发性硬化有关。根据本发明一些实施方式的一个方面，所述方法是治疗心肌梗塞的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物，因此治疗心肌梗塞。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物的应用，其是用于治疗骨骼肌缺陷、神经病理性疼痛、心肌梗塞的药物的制造。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供一种药物组合物，其包括作为活性成分的用于治疗骨骼肌缺陷、神经病理性疼痛或心肌梗塞的来源于胎盘的贴壁基质细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物是一种用于治疗与炎性疼痛、糖尿病多发性神经病变、人类免疫缺陷病毒(HIV)感觉神经病变、中风后综合征、缺血、或多发性硬化有关的神经病理性疼痛的药物组合物。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞表达 ⑶73、⑶90、⑶29、⑶105或D7_fib中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞不表达⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA-DR、CDllb, CD14、CD19、CD34、CD31、CD200、CD271、KDR、或 CD79。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞表达￠-内啡肽、强啡肽A、亮氨酸-脑啡肽、或甲硫氨酸-脑啡肽中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞抑制T细胞活性。根据本发明的一些实施方式，贴壁细胞包含至少70%的来自胎盘母体部分的贴壁细胞。根据本发明的一些实施方式，不多于3. 5%、不多于3%、不多于2%、或不多于1%的来自母体部分的贴壁细胞表达CD200，正如利用流式细胞仪并使用确定阴性表达的同种型对照所测量的。根据本发明的一些实施方式，胎盘的母体部分包括基蜕膜、壁蜕膜、或者同时包括基蜕膜和壁蜕膜。根据本发明的一些实施方式，通过采用三维培养条件进行培养而获得贴壁细胞。根据本发明的一些实施方式，三维(3D)培养包括三维生物反应器。根据本发明一些实施方式的一个方面，在灌注下实施三维培养。根据本发明一些实施方式的一个方面，实施贴壁细胞的培养达至少3天。根据本发明一些实施方式的一个方面，实施贴壁细胞的培养直到至少10%的所述贴壁细胞在增殖。除非另有规定，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所一般理解含义相同的含义。尽管在本发明实施方式的实施中可以使用类似于或等同于本文中所述的方法和材料，但下面将对示例性方法和/或材料加以描述。在发生矛盾的情况下，包括定义在内的本专利说明书将起支配作用。另外，这些材料、方法和例子仅仅是说明性的，并非意图一定是限制性的。
本文中仅通过例子并参照附图来描述本发明的一些实施方式。现在详细参照附图，应强调的是通过例子来揭示详细内容，并且目的是说明性地描述本发明实施方式。在这方面，通过描述以及附图本领域技术人员将明了如何实施本发明的实施方式。在附图中图I是胎盘结构及各部分的示意图。图2A-图2C是显示从胎盘、基蜕膜(A)、绒毛间质⑶和羊膜(C)中所获得贴壁细胞的形态的显微照片。图3是显示细胞直径与从不同胎盘部分中所得细胞的传代数的关系图。图4是显示细胞群加倍与从不同胎盘部分中所得细胞的传代数的关系图。
图5A-图5B是显示各种胎盘部分的体外免疫调节特征的直方图。图5A示出了四个不同实验的结果，而图5B示出了图5A中所得结果的平均值，包括标准差。图6A-图6C是显示从各种胎盘部分中所得贴壁细胞的条件培养基对内皮细胞增殖的效果的棒图。图7示出了经PLX处理(“PLX”)和空白对照(“Sham”)大鼠中的收缩力值。“I”-创伤后的立即移植；“DEL”_创伤7天后移植；“FT”_快速抽动收缩力；“TET”_巨大收缩力。
图8A和图8B示出了爪压力测试中PLX细胞对炎性疼痛的效果。图8A绘出了在发炎的爪中作为时间函数的爪压阈值。图8B示出了对侧爪的相同信息。图9A和图9B示出了在给予PLX细胞后在发炎的爪(图9A)和对侧的爪(图9B)中作为时间函数的标出的爪体积(paw volume)。图IOA和图4B显示了 PLX细胞对神经病理性疼痛中的同侧爪(图10A)和对侧爪(图10B)的机械敏感性(von Frey测试)的影响。图IlA和图5B绘出了在神经病理性疼痛中PLX细胞对同侧爪(图11A)和对侧爪(图11B)热敏感性的影响(Hargreaves测试)。图12A-图12E绘出了 P -内啡肽(图12A)、强啡肽A (图12B)、亮氨酸-脑啡肽(图12C)、甲硫氨酸-脑啡肽(图12D)、以及9种不同的PLX批次的总水平(图12E)。
具体实施例方式本发明，在一些实施方式中涉及来源于胎盘的贴壁细胞及其在疾病治疗中的应用。在详细说明至少本发明的一个实施方式之前，应理解的是本发明不必将其应用限制在以下说明中所展示或由实施例所示例的详细内容。本发明可以采用其他实施方式或者用各种方式实施。胎盘代表了被赋予独特的免疫抑制特性及组织再生特性的细胞容易获得的来源。来源于胎盘的经纯化贴壁细胞群或者对这些细胞群进行调整所获得的细胞对于治疗可以受益于细胞或器官移植的疾病是有价值的。另外，本发明人已发明出从胎盘不同部分中分离出经高度纯化的细胞群的方法(见下面的实施例部分)。出人意料地发现从胎盘母体部分中分离的细胞群的特点是具有明显不同于从胚胎胎盘部分中分离的其他细胞群的独特形态特性和功能特性(参见下面的实施例部分)。这些细胞对于大量医学疾病的治疗是有价值的。因此，根据本发明的一方面，提供一种贴壁细胞群，其包含至少大约70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%或者甚至100%的从胎盘母体部分中获得的细胞。根据本发明的另一个方面，提供一种细胞群，其包含至少大约70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%或者甚至100%的从胎盘胚胎部分中获得的贴壁细胞。根据具体实施方式
，胎盘的胚胎部分包括羊膜。根据具体实施方式
，胎盘的胚胎部分是由羊膜构成。根据具体实施方式
，胎盘的胚胎部分包括绒毛膜绒毛。根据具体实施方式
，胎盘的胚胎部分是由绒毛膜绒毛构成。
本文中使用的术语“胎盘”是指将正在发育的胚胎与子宫壁相连的哺乳动物器官。出生后胎盘被排出(并且称为产后胎盘)。优选地对胎盘进行充分时间的灌注以除去残留的细胞(例如，血液)。
本文中使用的“胎盘的胚胎部分”是指胎盘中不是母体的任何部分(参见图I的结构说明)。本文中使用的“胎盘的母体部分”是指胎盘中不是胚胎的任何部分(参见图I的结构说明)，例如从基蜕膜或壁蜕膜中获得的胎盘的部分。胎盘的胚胎部分包括羊膜、绒毛、或者绒毛膜绒毛，参见图I。切开胎盘以获得细胞的方法，对于本领域技术人员是熟知的。在下面的实施例部分中将对一些方法加以描述。将组织标本在生理缓冲溶液例如磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)或者Hank氏缓冲液中清洗。通过用消化酶处理组织(见下文)或者/并且切碎再冲洗组织部分经过尼龙过滤器、或者通过轻缓的移液(Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)再清洗培养基,而制作单细胞悬浮液。通过用消化酶例如胶原酶、胰蛋白酶和/或分散酶、和/或有效浓度的透明质酸酶或DNA酶、和乙二胺四乙酸(EDTA)，于25_50°C的温度下对组织进行10分钟到3小时的处理，因此可获得从胎盘各种部分中分离的贴壁细胞。然后，可使细胞通过孔径为20微米到I毫米的尼龙或纱布过滤器。以IOOXg到3000Xg的转速于4-50°C的温度下对细胞进行I分钟到I小时的离心(参见美国专利第7，078，230号)。优选地在无菌条件下实施细胞恢复。一旦获得了分离细胞，则让它们附着在粘附材料上例(如，设置成一个表面)，因此分离贴壁细胞。本文中使用的短语“贴壁细胞”是指为了在体外生长而依赖于贴壁(即需要附着于表面)的细胞。本文中使用的“粘附材料”是指合成的、自然形成的、或者合成加自然形成的、具有可将细胞保持在表面上的化学结构(例如，带电荷的表面暴露基团)的非细胞毒性(即生物相容)的材料。可用于本发明此方面的粘附材料的例子包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚烯烃、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、细胞外基质成分(例如，纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、软骨粘连蛋白、层粘连蛋白)、胶原蛋白、聚乳酸、葡聚糖、和惰性金属纤维。可利用本领域中熟知的方法来实施纯化的其他步骤或者贴壁细胞的富集(例如，通过使用标记物表达的FACS，如本文下文中的进一步说明)。根据本发明的用于培养的基础培养基的非限制性例子包括Eagle最低必需培养基、ADC-I、LPM(无牛血清白蛋白)、FlO (HAM)、Fl2 (HAM)、DCCMl、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有和无Fitton-Jackson改良)、Eagle基础培养基(BME-添加Earle氏盐基)、Dulbecco 氏改良 Eagle 培养基(DMEM-无血清)、Yamane、I MEM-20 > Glasgow 改良的 Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15 培养基、McCoy 5A 培养基、培养基 M199 (M199E-具有 Earle氏盐基)、培养基M199(M199H-具有Hank氏盐基)、Eagle最低必需培养基(MEM-E-具有Earle氏盐基)、Eagle最低必需培养基(MEM-H-具有Hank氏盐基)和Eagle最低必需培养基(MEM-NAA，具有非必需氨基酸类)等等，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams’G、Neuman & Tytell、Higuchi、CDB 30UMCDB 202,MCDB 50UMCDB 40UMCDB 41UMDBC 153 的大量其他培养基。用于本发明的优选培养基是DMEM。这些培养基和其他有用培养基可从美国纽约的GIBCO，GrandIsland和以色列的Biological Industries, Bet HaEmek等公司获得。在《酶学中的方法(Methods In Enzymology)》中总结了这些培养基中的部分,第LV III卷“细胞培养(CellCulture) ”第 62-72 页，由 William B. Jakoby 和 Ira H. Pastan ed. ,Academic 出版有限公司出版。可用例如血清(例如牛或人或者其他种属的胚胎血清)以及可选择地或者，用生长因子、维生素(例如抗坏血酸)、细胞因子、盐类(例如B-甘油磷酸盐)、甾体药物(例如地塞米松)以及激素(例如生长激素)、地塞米松、血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、C-试剂盒配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、纤毛亲神经因子、血小板源性生长因子、和骨形态发生蛋白，以皮克/ml到毫克/ml水平的浓度补充到培养基。还公认的是可把其他成分加入到培养基中。这种成分可以是抗生素、抗霉菌剂、白蛋白、氨基酸类、以及细胞培养领域已知的其他成分。可以在纯化工艺的各步骤中实施细胞群，即母体或者胚胎胎盘细胞。例如，可以基于胚胎或母体细胞的核型分析来认定雄性胚胎的胎盘(即，XX细胞是母体而XY细胞是胚胎，见下面的实施例部分)。一旦获得，来源于胎盘的贴壁细胞可以用作在培养中增殖。细胞可传代到二维条件或三维条件。应理解的是，尽管在分离后可立即将细胞转移到三维构造的基质、或者可在二维条件后传代到三维装置。本文中使用的短语“二维培养”是指对细胞进行处理以适于细胞生长条件同时让细胞在一个平面中生长的培养。本发明的二维培养中的条件被设计成使贴壁细胞能够扩
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>曰o本文中使用的短语“三维培养”是指对细胞进行处理以适合于细胞生长的条件(包括支架)从而允许在三维空间实现细胞与细胞的接触的培养。可理解的是，在生命有机体(或者组织)中的细胞原位环境是在三维构造中。细胞被其他细胞包围。它们被支持在允许建立各种局部微环境的细胞外基质纳米尺度纤维的复杂网络中。它们的细胞外配体不仅介导对基底膜的附着，而且进入多种血管和淋巴管。将氧、激素和营养素运送给细胞，并带走废产物。将本发明三维培养的条件设计成模拟这种环境，正如以下进一步的例示。应理解的是，二维培养或三维培养的条件是使贴壁细胞能够扩增。本文中使用的术语“扩大”和“扩增”是指细胞的基本上较少分化的维持以及最终的细胞生长，即伴随增加无分化的细胞群的增加(例如，至少2倍)。本文中使用的术语“维持”和“维护”是指基本上较少分化的细胞更新，即基本上稳定的细胞群并且伴随这种稳定性无细胞分化。对于二维培养，通常在3±0.2 X IO3个细胞/cm2的培养密度下实施胎盘细胞的接种。在接种后，通常将细胞培养物在组织培养箱中在湿润条件下在5%C02中于37°C进行培、养。根据本发明的一 个实施方式，使所述细胞在无抗生素补充的培养基中生长至少2个传代、至少3个传代、或者至少4个传代。根据本发明的一个实施方式，使细胞进行至少4个传代、至少5个传代、至少6个传代、至少7个传代、或者至少个8传代。应理解的是，通常使细胞传代到达到大约70-90%的汇合，通常在3-5天后(例如，1-3次复制)。对于三维培养，可在分离后立即将贴壁细胞转移到三维构造的基质中，或者作为选择在二维(2D)条件后可传代到三维装置。有时，在二维培养与三维培养之间可能需要进行细胞的低温保存。因此，根据一些实施方式的粘附材料是构造成三维培养，因此提供基本上增加用于细胞附着的有效附接表面，从而模拟组织的基本结构即，胎盘的生长基质。对于大规模的生产，可以在三维生物反应器中实施培养。这种生物反应器的例子包括但不限于推流式生物反应器、连续搅拌釜式生物反应器、固定床生物反应器(填充床生物反应器)、和流化床生物反应器。Celligen生物反应器(New Brunswick Scientific公司)能够在受控的条件(例如PH值、温度和氧水平)且恒定地灌注细胞生长培养基下实现贴壁细胞的三维扩增。此外，可以监测细胞培养物中的葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐和铵的浓度水平。贴壁细胞的葡萄糖消耗率和乳酸盐形成率使得研究人员能够测量细胞生长率并确定收获时间。可以用于本发明的其他三维生物反应器包括但不限于连续搅拌釜式生物反应器，其中将培养基连续地加入生物反应器并且将所使用的培养基连续地抽出，以维持生物反应器中的时间恒定稳态。搅拌釜式生物反应器可用于流化床(悬浮载体)或者纤维床篮(可从例如纽约Edison的New Brunswick Scientific公司获得)、固定床生物反应器、气升式生物反应器(其中通常将空气加入到向上流动从而形成气泡的中央通风管的底部并且在柱的顶部除去排气)、带Polyactive泡沫的生物反应器[正如Wendt, D. et al,Biotechnol Bioeng 84:205-214(2003)的描述]、径向流灌注生物反应器中的多孔支架[如 Kitagawa et al, Biotechnology and Bioengineering 93 (5) :947-954 (2006)中所述]、带支架或载体的径向流生物反应器、空心纤维生物反应器、和微载体。可以用于本发明的其他生物反应器描述于美国专利第6，277，151、6，197，575、6，139，578,6, 132,463、5，902，741 和 5，629，186 号。在一个示例性实施方式中，总共接种200±100 X IO6个细胞，接种3-10 X IO6个细胞/克载体、或者接种0. 06-0. 2 X IO6个细胞/ml。根据一个示例性实施方式，在2000-9000细胞/cm2的FibraCel盘中实施细胞接种。当至少大约10%的细胞在增殖时则可以收获细胞，同时避免不受控制的分化和衰老。实施培养达至少约2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、20天、I个月或更
长时间。应理解的是，对于在生物反应器内的培养来说可延长该时间段。可以在培养基的连续流动下，实施三维培养中的贴壁细胞培养。也可以通过实施传代来增加细胞数。应理解的是，可通过改变培养基而延长并改善培养条件。根据本发明的一个实施方式，在培养基灌注下实施细胞培养。通常，灌注率取决于贴壁细胞培养基中的葡萄糖浓度。因此，根据本发明的教导，当葡萄糖浓度约为500mg/L、约为550mg/L、或者约为600mg/L时可以更换培养基。本发明的一些实施方式的贴壁细胞包含至少大约10%、28%、30%、50%、80%或者更多的增殖细胞(正如可以通过利用FACS监测S相和G2/M相来检测)。本发明的一些实施方式的贴壁细胞可包括至少一种“基质细胞表现型”。本文中使用的“基质细胞表现型”是指是从骨髓中获得的基质(即，间充质)细胞所特有的结构或功能表现型。因此，例如细胞可具有纺锤形。作为选择或另外，所述细胞可表达基质细胞所特有的标记物或一系列标记物(例如表面标记物)。基质细胞表面标记物(阳性和阴性)的例子包括但不限于 CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、D7-f ib+、CD3\ CD4\ CD34' CD45' CD80'CD5_、CD20—、CDl lb_、CD14—、CD19—、CD79—、HLA-DR—、CD31—、KDR—、和 FMC7—。其他基质细胞标记物包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和H-NF。根据本发明的一个具体实施方式
，贴壁细胞包括从胎盘母体部分或者胚胎部分获得的细胞，不表达干细胞标记物⑶271。本文中使用的短语“干细胞”是指不在最后分化的细胞。根据本发明的一个具体实施方式
，从胎盘胚胎部分(例如，由绒毛膜绒毛组成、或者包括绒毛膜绒毛)获得的贴壁细胞的特征为阳性CD200表达(见下面的实施例部分)。根据本发明的一个具体实施方式
，不多于3. 5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的来自母体部分的贴壁细胞表达CD200，正如利用流式细胞仪并使用确定阴性表达同种型对照所测量的。基质细胞所特有的功能表现型的例子包括但不限于T细胞抑制活性(它们不刺激T细胞却相反地抑制T细胞，例如当在混合淋巴细胞培养中进行测试时)、和造血干细胞支持活性。根据一个示例性实施方式，本发明的贴壁细胞与从生长骨髓中获得的贴细胞相比较少参与分化成成骨系或脂肪形成系，并且在相同条件下分化。例如，根据一个示例性实施方式，当在W02010026575的实施例4_7 (其全部内容以参考的方式并入本文中)中所述的条件下，本发明的贴壁细胞不分化成成骨系或脂肪形成系。根据本发明的一个实施方式,本发明的贴壁细胞能够抑制受试者中的免疫反应。本文中使用的短语“抑制受试者中的免疫反应”是指降低或抑制受试者中响应于抗原(例如，外源细胞或其一部分)所发生的免疫反应。可被贴壁细胞抑制的免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫反应，它们分别涉及到经由抗体和T-淋巴细胞(T细胞的增殖)特异性地识别病原体抗原。在实施例中给出了判定贴壁细胞是否抑制免疫反应的方法的一些例子。根据一个具体实施方式
，从母体胎盘获得的贴壁细胞能够抑制免疫反应的程度低于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞(例如，至少低大约2%、5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%)。在一些实施方式中，通过测量细胞抑制混合淋巴细胞培养的能力来判定对免疫反应 的抑制。在其他实施方式中，通过在体外试验中测量由植物血凝素(PHA)引起的对T细胞大量形成的抑制，而确定对免疫反应的抑制。根据一个具体实施方式
，母体胎盘的贴壁细胞的细胞直径小于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞(例如，大约2%、5%、10%、15%,20%或30%)。根据一个具体实施方式
，母体胎盘的贴壁细胞的细胞增殖能力高于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞(例如，大约2%、5%、10%、15%,20%或30%)。根据一个具体实施方式
，所述细胞可以是自体的、同基因的、异基因的或者异种的来源。根据另一个具体实施方 式，通过用遗传方法对细胞进行改良而表达外源蛋白。根据又一个具体实施方式
，用遗传学方法对细胞进行改良。应理解的是，可以从包含所述细胞/有所述细胞组成的培养物中分离出条件培养基。本文中使用的“条件培养基”是在特定培养期后富含在本文中所述培养物(即，包含/由任何上述细胞群组成)中所存在的分泌因子的培养基。通过在生长培养基中在适于制造条件培养基的条件下培养上述细胞，而制作出条
件培养基。生长培养基可以是适于让本发明胎盘粘壁细胞生长的任何生长培养基，如上文中所述。可利用营养因子例如氨基酸类(例如，L-谷氨酰胺)、抗氧化剂(例如，￠-巯基乙醇)和生长因子来补充生长培养基。在高达20%的有效浓度范围内添加血清和/或血清代替物。例如，将细胞在生长培养基中培养充分长的时间，从而允许分泌因子的充分蓄积以支持免疫抑制和/或血管新生。通常，通过于37°C下培养1-5天来调整培养基。然而，可以通过评估条件培养基对免疫抑制和/或血管新生的实施来调整培养期，例如在实施例中所述。在一些实施方式中，为了进行免疫抑制而对培养基进行3-5天的调整，为了进行血管新生而对培养基进行24-72小时的调整。对用于调整培养基的培养装置的选择，是基于条件培养基的生产规模和目的。大规模生产优选涉及到生物反应器的使用，如上文中所述。在培养基中积累了充分的因子后，从细胞中分离并收集生长培养基(即，条件培养基)。应理解的是，可以在额外的培养期内重复使用细胞来进一步调整各批次的培养基，假设这些细胞保持调整培养基的能力。本发明的条件培养基可直接使用(如以下进一步的说明)或者进行提取例如通过盐过滤以浓缩有效因子。为了将来的使用，优选于_80°C下冷冻条件培养基。胚胎部分的贴壁细胞可以用于各种研究装置。例如用于测试与母体部分有关的贴壁细胞的生物学特性(例如，形态、大小)(见例如实施例部分)。本文中所述的来源于胎盘的经纯化细胞群、或者本文中所述的任何条件培养基，可以用于治疗可受益于细胞或器官移植的疾病。本文中使用的术语“疾病”是指可受益于细胞(例如基质细胞)或器官移植的任何病状(疾病、状态、综合症状或失调)。其例子包括缺血性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、胃肠道疾病、整形外科病、造血病、肾病和肝病，例如但不限于外周动脉疾病(PAD)(如肢体缺血和严重肢体缺血(CLI))、下肢缺血、缺血性血管病、中风、缺血性心脏病、心肌缺血、急性心肌梗塞(MI)、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化性心血管疾病、左主冠状动脉疾病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管疾病、动脉硬化、视网膜病变、视网膜修复、整形疾病、林岛综合征(von Hippel-Lindau syndrome)、遗传性出血性毛细血管扩张缺血性血管病、伯格氏病、糖尿病、肾血管病、缺血性肾病、肝病、胎盘缺血、与繁殖相关的疾病、移植物抗宿主病(GVHD)、实体器官移植、造血干细胞移植(HSCT)、胃肠(GI)道的炎症疾病、溃疡性结肠炎、伤口延迟愈合、溃疡延迟愈合、癌症(例如乳腺癌)、癌前期、以结缔组织损伤为特征的疾病(如骨癌、骨肉瘤、骨转移、骨折、视乳头变性疾病、成骨不全(01)、烧伤、关节软骨缺陷、深部伤、伤口延迟愈合、溃疡延迟愈合、代谢紊乱、银屑病、神经病理性疼痛、周围神经损伤、肾移植的支持、软骨下-骨囊肿、骨质疏松、骨关节炎(OA)、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺陷、腱损伤(例如伸张过度引起的腱损伤)和韧带损伤。
缺血性疾病是由于因各种因素引起血管构造中血流降低而造成组织变成缺血状态的医学疾病，所述各种因素例如是血管腔的收缩、血凝块的形成、血管闭塞、血管炎、血管收缩、或者血粘度增加。缺血性疾病包括外周血管疾病、缺血性心脏病(例如,缺血性心肌病、心肌梗塞、缺血性心力衰竭)、缺血性脑血管疾病(包括中风)、缺血性肾病、缺血性肺病、以及与感染性疾病有关的缺血性疾病。在整个本申请中列出了缺血性疾病(本文中也称为缺血)的其他非限制性例子。外周血管疾病是由于因例如血管腔收缩、血凝块形成、血管闭塞、血管炎、血管收缩、或血液浓度增加所造成外周动脉血流降低而导致外周组织变成缺血状态的医学疾病。与外周血管病相关的疾病包括慢性动脉阻塞性疾病(如动脉硬化脉管炎和伯格氏病)、和进行性全身性硬化、系统性红斑狼疮、雷诺氏病、振动综合症、动脉瘤、和血管炎。在整个本申请中列出了外周缺血性疾病的其他非限制性例子。根据一个具体实施方式
，所述疾病是心力衰竭、心肌梗塞、神经病理性疼痛、骨骼肌缺陷和缺血性心脏病。根据一个具体实施方式
，本文中所述的条件培养基用于治疗中风。本文中使用的“中风”或者“急性脑血管发作”是指由于大脑血液供应失调所造成的快速形成的大脑功能损失。其原因可以是由血栓形成或栓塞所造成的缺血(缺乏葡萄糖和氧供应)、或者出血(蛛网膜下腔出血或者脑出血)。应理解的是，本发明的细胞能够在受试者中引起免疫抑制和/或免疫耐受并且/或者能够引起血管新生。因此，贴壁细胞或者从贴壁细胞中获得的条件培养基可用于治疗需要血管新生和/或免疫抑制和/或免疫耐受的任何疾病。这种疾病包括但不限于自身免疫性疾病和炎症性疾病(包括急性和慢性炎性疾病)，包括但不限于心血管疾病、类风湿病、腺体疾病、胃肠疾病、皮肤病、肝病、神经系统疾病、肌肉疾病、肾病、与繁殖相关的疾病、结缔组织病、及系统性疾病。自身免疫性心血管疾病的例子包括但不限于动脉粥样硬化(Matsuura E. et al,Lupus. 1998; 7Suppl 2:S135)、心肌梗塞(Vaarala 0. Lupus. 1998;7Suppl 2:S132)、血栓形成(Tincani A. et al, Lupus 1998; 7Suppl2: S107-9)、韦格纳肉芽肿、多发性大动脉炎、川崎病(Praprotnik S. et al,ffien Klin Wochenschr 2000 年 8 月 25 日；112 (15-16) :660)、抗第八因子自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S. et al, Semin Thromb Hemost。2000;26(2) :157)、坏死性小血管血管炎、显微镜下多血管炎、变应性肉芽肿血管炎、微量免疫病灶坏死性和新月体肾炎(Noel LH. Ann Med Interne (巴黎)。2000年5月;151 (3) : 178)、抗磷脂综合征(Flamholz R. et al, J Clin Apheresis 1999; 14(4) : 171)、抗体引起的心力衰竭(ffallukat G. et al, Am J Cardiol. 1999 年 6 月 17 ；83(12A) :75H)、血小板减少性紫癒(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999年 4 月-6 月;14(2) :114 ；Semple Jff. et al,Blood1996年 5 月 15; 87 (10) :4245)、自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG. et al, Leuk Lymphoma1998 年 I 月；28(3-4) :285 ；Sallah S. et al，Ann Hematol 1997Mar; 74 (3) : 139)、恰加斯氏病中的心脏自身免疫(Cunha-Neto E. et al, J Clin Invest 1996年 10 月 15;98 (8) : 1709)、和抗辅助 T 淋巴细胞自身免疫(Caporossi AP. et al, Viral TmmunoI 1998; 11 (I) :9)。自身免疫性类风湿病的例子包括但不限于类风湿关节炎(Krenn V. et al,HistolHistopathol 2000年7 月；15(3):791;Tisch R,McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units
SA 1994 年 I 月 18;91 (2) :437)和强直性脊柱炎(Jan Voswinkel et al, Arthritis Res2001;3 (3):189)。自身免疫性腺体疾病的例子包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾 病、甲状腺机能亢进、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、慢性淋巴性甲状腺炎、粘液性水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不孕症、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫多腺体综合征包括但不限于胰脏的自身免疫性疾病、I型糖尿病(Castano LandEisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647;Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996年 10月;34Suppl:S125)、自身免疫性甲状腺疾病、甲状腺机能允进(Orgiazzi J. Endocrinol etal，Ciin NorthAm 2000 年 6 月;29(2) :339 ；Sakata S. et al，Mol Cell Endocrinol 1993年3月；92 (I) :77)、自发性自身免疫性甲状腺炎 raley-Mullen H. and Yu S，J Immunol2000年 12月 15 日；165(12) :7262)、桥本氏甲状腺炎(ToyodaN. et al,Nippon Rinsho. 1999年 8 月;57 ⑶:1810)、粘液性水肿(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 年 8 月;57 ⑶:1759)、卵巢自身免疫(Garza KM. et al, J Reprod TmmunoI 1998 年 2 月；37 (2) : 87)、自身免疫性抗精子不孕症(Diekman AB. et al, Am J Reprod ImmunoL. 2000 年 3 月；43 (3) : 134)、自身免疫性前列腺炎(Alexander RB. et al, Urology 1997 年 12 月;50 (6) :893)、和 I 型自身免疫多腺体综合征(Hara T. et al, Blood. 1991 年 5 月 I 日；77 (5) : 1127)。自身免疫性胃肠疾病的例子包括但不限于慢性炎症肠道疾病(GarciaHerolaA. et al, Gastroenterol Hepatol. 2000 年 I 月；23(1):16)、乳糜湾(Landau YE.andShoenfeld Y. Harefuah 2000年I月16日；138 (2) : 122)、结肠炎、回肠炎、和克罗恩病。自身免疫性皮肤病的例子包括但不限于自身免疫性大疱性皮肤病，例如但不限于寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶性天疱疮。自身免疫性肝病的例子包括但不限于肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎(Franco A. et al, Clin Immunol Immunopathol 1990 年 4 月；54(3) :382)、原发性胆汁性肝硬化(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996Nov ；91 (5) :551 ；Strassburg CP. et al, EurJ Gastroenterol HepatoL. 1999 年 6 月；11 (6) : 595)、和自身免疫性肝炎(Manns MP. JHepatol 2000 年 8 月；33 (2):326)。自身免疫性神经系统疾病的例子包括但不限于多发性硬化(Cross AH. et al, JNeuroimmunol, 2001 年 I 月；2 (1-2) : I)、阿尔茨海默氏病(Oron L. et al, J Neural TransmSuppL. 1997; 49; 77)、重症肌无力(Infante AJ. and Kraig E, Int Rev Immunol 1999 ；18(1-2) :83; Oshima M. et al, Eur J Immunol 1990 年 11 月；20 (12) : 2563)、神经病变、自主神经病变(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000年5月；7 (3) : 191)、格林巴利综合症和自身免疫性神经病变(Kusunoki S.Am J Med Sci. 2000年4月;319 (4) : 234)、肌无力、Lambert-Eaton 肌无力综合征(Takamori M. Am J Med Sci. 2000 年 4 月；319 (4) : 204);苜丨」肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩、和僵人综合征(Hiemstra HS. et al,Proc Natl Acad Sci units S A 2001 年 3 月 27 日；98 (7) :3988);非副肿瘤性僵人综合征、进行性小脑萎缩、脑炎、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩侧索硬化、小舞蹈病、抽动-移1语综合征、和自身免疫性多内分泌腺病(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (巴黎)2000年I 月;156 (I) : 23);免疫异常性神经病变(Nobile-Orazio E. et al, ElectroencephalogrClin Neurophysiol Suppl 1999;50:4-19);获得性神经性肌强直、多关节挛缩症(Vincent
A.et al,Ann N Y Acad Sci. 1998 年 5 月 13 日；841:482)、神经炎、视神经炎(SoderstromM. et al, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 年 5 月；57 (5) : 544)、和神经退行性疾病。自身免疫性肌肉疾病的例子包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原发性干燥综合征(Feist E. et al, Int Arch Allergy Immunol 2000Sep ; 123 (I) :92)、及平滑肌自身免疫性疾病(Zauli D. et al, Biomed Pharmacother, 1999 年 6 月;53 (5-6) : 234)。自身免疫性肾病的例子包括但不限于肾炎和自 身免疫性间质性肾炎(KellyCJ.，J Am Soc Nephrol, 1990 年 8 月;I (2):140)。与繁殖相关的自身免疫性疾病的例子包括但不限于反复胚胎丢失(TincaniA. et al, Lupus 1998;7Suppl 2 S 107-9)。自身免疫性结缔组织病的例子包括但不限于耳病、自身免疫性耳病(YooTJ. etal, Cell Immunol, 1994 年 8 月；157(1) :249)和内耳的自身免疫性疾病(Gloddek B. etal, Ann N YAcad Sci 1997 年 12 月 29 日；830:266)。自身免疫系统性疾病的例子包括但不限于系统性红斑狼疮(Erikson J. etal, TmmunoI Res 1998; 17 (1-2) :49)和系统性硬化(Renaudineau Y. et al, Clin Diagn LabImmunol. 1999 年 3 月；6 (2):156) ；Chan OT. et al, Immunol Revl999 年 6 月；169:107)。此外，贴壁细胞或者条件培养基可用于治疗与移植物移植相关的疾病，包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥、和移植物抗宿主病。本文中使用的术语“治疗”是指抑制或者阻止病状的发展并且/或者导致病状的减轻、缓解、或复原。本领域技术人员将理解可利用各种方法和检测来评价病状的发展，并且类似地也可利用各种方法和检测来评价病状的减轻、缓解或复原。术语“治疗”也可指代减轻或降低与该病状相关的症状。利用贴壁细胞或条件培养基治疗的受试者可以是任何受试者(例如，哺乳动物)，例如人受试者或者饲养动物，包括但不限于诊断出或者患有可以受益于基质细胞移植的病状的马(即马)、牛、山羊、绵羊、猪、犬、猫、骆骑、羊骑、美洲骑和牦牛。因为所述的细胞可以是天然的细胞或者可以是经基因技术改良从而获得有用的细胞系(见美国专利申请第20030219423号)。所述细胞可以是新鲜的或者是冷冻(例如，冷冻保存)制品。根据医学疾病，可给受试者给予其他化学药物(例如，免疫调节剂、化疗剂等)或者细胞。所述细胞，虽然其特征为免疫抑制活性，但仍然会引起寄主或供者所产生的不良免疫应答。业者已开发出各种方法来降低对非自体细胞排斥的可能性。这些方法包括抑制受体免疫系统、或者在移植前将非自体细胞包囊在免疫隔离的半渗透膜中。包囊技术一般分类为微包囊，涉及小球形赋形剂和大包囊，涉及较大的平片和中空纤维膜(Uludag, H. et al,哺乳动物细胞包囊。Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42:29-64)。制备微胶囊的方法在本领域是熟知的并且包括例如由Lu MZ et al公开的方法，用海藻酸盐和a-苯氧基肉桂叉-乙酰化聚(烯丙基胺)进行细胞包囊。BiotechnolBioeng.2000，70:479-83，Chang TM 和 Prakash S. enzymes, cells and geneticallyengineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17:249-60,以及 Lu MZ et al,Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpoly(allylamine). J Microencapsul. 2000, 17:245-51。例如，通过用甲基丙烯酸2-羟基乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元共聚物壳与改良胶原蛋白复合而制备微胶囊，形成2-5i!m的胶囊厚度。可以用额外的2-5 三元聚合物壳对这种微胶囊进一步包囊，以赋予带负电荷的平滑表面并且使血楽■蛋白吸附最小化(Chia, S. M. et al, Multi-layered microcapsules for cellencapsulation Biomaterials. 200223:849-56)。其他微胶囊是基于海藻酸盐,海产多糖类(Sambanis, A. Encapsulated islets indiabetes treatment. Diabetes TechnoL. Ther. 2003, 5:665-8)或者其衍生物。例如，可以通过在氯化钙存在下使聚阴离子海藻酸钠和纤维素硫酸钠与聚阳离子聚(亚甲基-Co-胍)盐酸盐发生聚电解质复合反应而制备微胶囊。应理解的是，当使用较小的胶囊时可改善细胞包囊。因此，当把胶囊大小从Imm减小至400 ii m时，可改善品质控制、机械稳定性、扩散性能、和包囊的细胞的体外活性(Canaple L. et al, Improving cell encapsulation through size control.J Biomater Sci Polym ED. 2002; 13:783-96)。此外，发现具有良好控制孔径(小达7nm)的纳米多孔生物胶囊、定做的表面化学和精细的微体系结构可成功地使细胞的微环境免疫隔离(Williams D. Small is beautiful microparticle and nanoparticletechnology in medical devies. Med Device Technol. 1999, 10 6~9 ；Desai,T. A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert OpinBiol Ther. 2002，2:633-46)。免疫抑制剂的例子包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢素、环孢素A、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺批唳(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素(anakinra)、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNF-a抑制剂(一种以抗炎细胞因子为目标的生物制剂)、和非甾体抗炎药(NSAID)。非甾体抗炎药的例子括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬酯、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。此外，应理解的是，细胞或条件培养基可以本身的形式使用，或者优选地作为还包括药学上可接受载体的药物组合物的一部分的形式而使用。本文中使用的“药物组合物”是指细胞或由该细胞获得的条件培养基与其他化学成分(如药学上适合的载体或赋形剂)所组成的制剂。药物组合物的目的是便于将细胞给予给受试者。、
在下文中，术语“药学上可接受载体”是指不引起对受试者的显著刺激并且不取消给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的非限制性例子是丙二醇、生理盐水、DMSO、HAS、有机溶剂与水的乳液和混合物。本文中的术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步便于化合物给药的惰性物质。赋形剂的非限制性例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。可从“Remington,s Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co, Easton,PA，最新版(其内容以参考的方式 并入本文中)中找到药物的制剂和给药技术。因此，可使用一种或多种生理学可接受的载体(包括赋形剂和辅料)并按常规方式用于将本发明的药物组合物制成制剂，便于将活性成分处理成制剂，可以具有药学应用。合适的剂型取决于所选的给药途径。对于注射，可将该药物组合物的各活性成分配制在水溶液中，优选生理学相容的缓冲剂中，例如Hank氏液、林格氏液、生理盐水缓冲液，或者冷冻含冷冻保存剂的培养基。本领域技术人员能够实施治疗有效量的确定，特别是按照本文中的详细公开内容。可通过标准药学步骤在体外、细胞培养或者实验动物中测定本文中所描述活性成分的毒性和疗效。根据被治疗疾病的严重长度和应答性，给药可以是单次给药或者多次给药。然而，给予的组合物量当然将取决于被治疗的受试者、病痛的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。在移植后，优选地使一部分的本发明细胞在患病区存活一时间段(例如大约2-6周)，以便观察到治疗效果。也可以制备包括配制在相容的药学载体中的本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中并且附上所指疾病的治疗的标签。若需要，本发明的组合物可存在于包装或者分配装置中，例如FDA批准的试剂盒，可包含一个或多个包含活性成分的单位剂型。包装可以是例如包括金属薄膜或塑料薄膜，如罩板包装。包装或者分配装置可以附带使用说明书。包装或者分配装置也可提供以管理药品制造、使用或销售的政府机构颁发的与容器相关的通知，通知是由政府机构对组合物或者人或兽医使用许可的反应。这种通式，例如可以是由美国食品药物管理局许可的用于处方药物或许可产品的插件标签。本文中使用的术语“大约”是指±10%。术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们的同根变形词表示“包括但不限于”。此术语包括术语“由-构成”和“基本上由-构成”。短语“基本上由…组成”表示组合物或者方法可包括其他成分和/或步骤，但仅仅是在其它成分和/或步骤并不显著改变申请专利保护的组合物或方法的基本的和新型的特征的情况下。本文中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文中明确指出。例如，术语“一个化合物”或者“至少一个化合物”可包括多个化合物，包括其混合物。在本申请的全文中，可以用范围的形式来描述本发明的各种实施方式。应理解的是，采用范围现实的说明仅仅是为了方便和简洁并且不应理解成对本发明范围的不可改变的限制。因此，应认为对范围的描述已特异性地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的描述如从I至6应该被认为具有明确公开的子范围,例如I至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在此范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5、和6。无论范围的宽度如何均适用。每当本文中指出数值范围，它表示包括在所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字的范围内/在范围之间”与“在第一指示数字和第二指示数字的范围内”在本文中可互换地使用，表示包括第一个和第二个所指的数字以及两者之间的所有分数和整数。 本文中使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于化学、药理学、生物学、化学或医学领域的技术人员所了解的方式、手段、技术和步骤，或者可容易地从已知方式、手段、技术和步骤开发出的方式、手段、技术和步骤。本文中使用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病的进展，基本上改善疾病的临床或者外观症状、或者基本上防止疾病的临床症状或外观症状的出现。本文中使用的词语“示例性”表示用作例子、举例或者说明。任何描述成“示例性”的实施方式不必被理解成比其他实施方式优选或者有利并且/或者排除其他实施方式的特征的并入。本文中使用的词语“可选择地”表示“在一些实施方式中提供并且在其他实施方式中不提供”。本发明的任何具体实施方式
可包括多个“可选择的”特征，除非这种特征产生矛盾。应理解的是，在单独实施方式的上下文中所描述的本发明某些特征，为了清楚起见，也可以在单个实施方式中以组合的形式提供。相反，为了简洁，单个实施方式的上下文中描述的本发明各种特征也可以单独地或者以任何适当的亚组合的形式提供或者以本发明的任何其他描述的实施方式提供。各种实施方式的上下文中所描述的某些特征不应看作是这些实施方式的基本特征，除非没有这些因素实施方式无法实施。在上文中描述的以及在下面的权利要求部分中要求的各种实施方式以及本发明的各方面在下面的实施例中能够找到实验支持。实施例现在参照下面的实施例连同以上描述以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。一般来说，本文中使用的命名法和本发明中采用的实验室步骤包括分子技术、生物化学技术、微生物技术和重组DNA技术。这种技术完全地在文献中有说明。参见例如“分子克隆实验手册”Sambrook et al (1989)分子生物学中的实验室指南"Volumes I-IIIAusubel, M.，ed. (1994) ；Ausubel et al, “分子生物学中的实验室指南” John Wiley andSons, Baltimore, Maryland (1989) ；Perbal “分子克隆的实用指南” John Wiley &Sons,纽约(1988) ；ffatson et al, “重组 DNA”，Scientific American Books,纽约；Birrenet al ed. “基因组分析实验手册系列” Vol. 1-4, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,纽约(1998);如美国专利第 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和5，272,057号中所陈述的方法；“细胞生物学试验室手册”，第I-III卷细胞Coligan，J. E. , ed. (1994) ； " Basic and Clinical Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.,ed. (1994) ；Stites et al ed. , Basic and Clinical Immunology"(第 8 版)，Appleton
&Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishell and Shiigi ed. “细胞免疫中的选择方法”W.H-Freeman公司，纽约(1980);有用的免疫检测方法广泛地描述于各专利和科学文献，见例如美国专利第 3，791，932,3, 839，153,3, 850，752,850, 578 ;3，853，987,3, 867，517、3，879，262,3,901,654,3,935,074,3,984，533,3, 996，345,4, 034, 074,4, 098, 876、4,879, 219,5, 011, 771 和 5, 281, 521 ;“寡核苷酸合成” Gait，M. J.，ed. (1984) ；NucleicAcid Hybridization" Hames, B. D. , and Higgins S. J. , ed. (1985);“转录和翻译，，Hames，
B.D.，and Higgins S. J.，ed. (1984)； ”动物细胞培养"Freshney，R. I. ed. (1986);“固定化细胞和酶” IRL Press, 1986);“分子克隆的实用指南”Perbal，B.，1984)和“酶学中的方法” VoL. 1-317, Academic Press ;“PCR 试验方案方法和应用的导论” Academic Press,San Diego, CA(1990) ；Marshak et al, “蛋白纯化的策略和特征-ALaboratory CourseManual" CSHL Press (1996);所有以参考的方式并入本文，如全部在本文中列出一样。本专利文件的全文中提供其他一般性参考。认为其中的步骤对于本领域是众所周知的并且为了方便读者而提供。其中所包含的所有信息以参考的方式并入本文中。实施例I从胎盘分离的贴壁基质细胞(ASC)中回收和处理贴壁细胞-人胎盘是签署知情同意书后在健康供体母亲的剖腹产后获得。将来源于胎盘的切碎的组织于37°C用0. 1%胶原酶(Img胶原酶/ml组织)进行2-5小时培养。将包含补充有10%FBS、两性霉素B 0. 25ii g/ml和庆大霉素50ii g/ml的DMEM的二维(2D)细胞培养基(2D-培养基)添加到经消化的组织中，粗略地过滤经过灭菌金属粗滤器，收集在灭菌烧杯中，并且离心(10分钟，1200RPM，4°C )。采用轻缓的移液，然后用补充抗生素的二维培养基稀释悬浮细胞，接种于175cm2烧瓶中并且于37°C在组织培养培养箱中在补充5%C02的湿润条件下进行培养。2-3天后，让细胞附着在烧瓶表面，用PBS清洗细胞并加入二维培养基。二维(2D)细胞生长-通常在7-15天后实施第一次传代。开始于第2代并继续直到第6-8代，将细胞传代直到培养达到70-90%的汇合，通常在4-5天后(I. 5-2倍)。利用0. 25%胰蛋白酶-EDTA(4分钟，于37°C下)从烧瓶中分离出细胞并且以4±0. 5X103个细胞/cm2的培养密度进行接种。在整个的过程中，在组织培养培养箱中在湿润的条件下在5%C02中于37°C使培养物生长。在总共进行5-9次传代后，收集细胞并冷冻保存。二维细胞的低温保存步骤-保存产品-为了二维细胞存量低温保存，在无菌条件下利用0. 25%胰蛋白酶-EDTA收集二维培养的细胞。将细胞离心(1200RPM，10'，4°C )，计数，再次悬浮于二维培养基中。对于冷冻，用I: I 二维冷冻混合物(最终浓度为10%DMS0，40%FBS和50% 二维培养基)稀释细胞悬浮液。以10X 106/ml的最终浓度将细胞保存在5ml低温保存聚丙烯玻璃小瓶中。给玻璃小瓶做上标记并且转移到控制速率的冷冻器中实施逐渐降温过程(1°C /分钟)，然后就将它们转移并保存于液氮冷冻器的气相中。涉及在二维和三维条件下分离和培养胎盘ASC的进一步详细内容描述于以下参考文献中。W02007/108003，其全部内容以参考的方式并入本文中，描述了三维(3D)培养条件适于来源于胎盘的ASC的扩增。W02009/037690，其全部内容以参考的方式并入本文中，教导了通过给予受试者治疗有效量选自胎盘和脂肪组织的组织的贴壁细胞而治疗缺血和诱导结缔组织再生的方法。W02010/026574，其全部内容以参考的方式并入本文中，描述了适于来源于胎盘的ASC的扩增的二维(2D)培养条件。W02010/026575，其全部内容以参考的方式并入本文中，描述了涉及适于来源于胎盘的ASC的扩增的灌注的三维(3D)培养条件。实施例2胎盘部分的分离和特征。I.从不同的胎盘部分分离贴壁细胞。 材料和方法胎盘-在签署知情同意书后从健康供体母亲的剖腹产后从雄性胚胎中获得人胎盘。细胞分离(见图I的结构说明)从羊膜中分离细胞-将胎盘放置成胚胎侧朝上。通过钝的机械剥离从绒毛膜中分离出羊膜(无血管)。将羊膜转移到含有Hank氏平衡盐溶液(HBSS)的50ml管中。将该膜切成 0. 5-lcm2的小片并且置于一个新的50ml管中。从蜕膜部分分离细胞-在除去羊膜后实施此步骤，如以上的详细说明。将胎盘放置成母体侧朝上。仅从面向母体的表面的中心区切开蜕膜(见图I)。切出约Icm3的正方形，深度不大于0. 5cm。将各小片置于含HBSS的500ml瓶中并用HBSS清洗。从绒毛部分离细胞-在除去蜕膜部分后实施此步骤，如上面的详细说明。把胎盘再放置成胚胎侧面朝上。在大血管之间切出约4-5cm的正方形，深度约为0. 5-lcm。将各小块置于灭菌玻璃板上再用解剖刀进行擦洗。分离绒毛(小血管)并且仅收集周围组织而不收集女性(chorine)羊膜层。将切碎的组织置于含HBSS的500ml瓶中并用HBSS清洗。贴壁细胞的分离-以上述方式获得各种胎盘区的切碎组织，以上述PLX细胞的制备中所述的方式进行处理。细胞来源的判定-为了判定从各种胎盘源中获得的细胞在分离和扩增条件后是否为母体或胚胎来源，按照此方案对从男性新生儿中获得的5个胎盘中获得的细胞实施FISH分析。母体源性的细胞必定是XX(雌性核型)而胚胎源性的细胞必定是XY(雄性核型)。将结果总结于以下的表I。表I-核型
权利要求
1.一种来源于胎盘的贴壁细胞群，其中所述细胞群包含至少70%的来自所述胎盘母体部分的贴壁细胞。
2.根据权利要求I所述的贴壁细胞群，其中所述胎盘的所述母体部分包括基蜕膜、壁蜕膜，或者同时包括基蜕膜和壁蜕膜。
3.一种来源于胎盘的贴壁细胞群，其中所述细胞群包含至少70%的来源于胎盘的胚胎部分的贴壁细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞群，其中所述胎盘的胚胎部分包括羊膜。
5.根据权利要求3所述的细胞群，其中所述胎盘的胚胎部分是由羊膜构成。
6.根据权利要求3所述的细胞群，其中所述胎盘的胚胎部分包括绒毛膜绒毛。
7.根据权利要求3所述的细胞群，其中所述胎盘的胚胎部分是由绒毛膜绒毛构成。
8.根据权利要求I或2所述的细胞群，其中不多于3.5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的来自母体部分的贴壁细胞群表达CD200，如通过流式细胞术利用确定阴性表达的同种型对照所测量的。
9.一种条件培养基，是从包含权利要求1-8所述的任意细胞群的培养物中分离的。
10.一种药物组合物，包括作为活性成分的权利要求1、2或8所述的细胞群或权利要求9所述的条件培养基以及药学上可接受载体。
11.一种治疗可受益于细胞或器官移植的医学疾病的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的权利要求10所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
12.权利要求I所述的细胞群或者权利要求9所述的条件培养基在制备用于治疗可受益于细胞或器官移植的疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求11所述的方法或者根据权利要求12所述的应用，其中所述疾病选自由缺血、外周动脉疾病(PAD)、严重肢体缺血(CLI)、下肢缺血、中风、缺血性血管病、肾的血管病、缺血性心脏病、心肌缺血、冠状动脉疾病(CAD)、动脉粥样硬化性心血管疾病、左主冠状动脉疾病、动脉阻塞性疾病、外周缺血、外周血管疾病、动脉硬化、视网膜病变、视网膜修复、重构紊乱、林岛综合征、遗传性出血性毛细血管扩张缺血性血管病、伯格氏病、缺血性肾病、胎盘缺血、与生育相关的紊乱、移植物抗宿主病、实体器官移植、造血干细胞移植、糖尿病、结缔组织损伤、癌症、癌前期、骨癌、骨肉瘤、骨转移、骨折、烧伤、关节软骨缺陷、深部伤、伤口延迟愈合、溃疡延迟愈合、软骨下骨囊肿、骨质疏松、骨关节炎、骨退化、软骨损伤、关节软骨缺陷、腱损伤、自身免疫性疾病、代谢紊乱、银屑病、神经病理性疼痛、周围神经损伤、神经退行性疾病、对肾移植的支持和炎症性疾病所构成的组。
14.根据权利要求11所述的方法或者根据权利要求12所述的应用，其中所述疾病是心力衰竭、心肌梗塞、神经病理性疼痛、骨骼肌缺陷、中风、或缺血性心脏病。
15.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中所述贴壁细胞表达CD73、CD90、CD29、CD105或者D7_fib中的一种或多种。
16.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中所述贴壁细胞不表达CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CDllb, CD14、CD19、CD34、CD31、CD200、KDR、或 CD79。
17.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中当在混合的淋巴细胞培养中进行测试时，所述贴壁细胞抑制免疫反应的程度小于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞。
18.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中在三维(3D)培养中培养所述贴壁细胞。
19.根据权利要求18所述的细胞群、药物组合物、方法、或应用，其中所述三维(3D)培养包括3D生物反应器。
20.根据权利要求18所述的细胞群、药物组合物、方法、或应用，其中在灌注下实施所述贴壁细胞在所述3D培养中的培养。
21.根据权利要求18所述的细胞群、药物组合物、方法、或应用，其中实施所述贴壁细胞的培养至少3天。
22.根据权利要求18所述的细胞群、药物组合物、方法、或应用，其中实施所述贴壁细胞的培养直到至少10%的所述贴壁细胞在增殖。
23.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中在二维(2D)培养中培养所述贴壁细胞。
24.根据权利要求23所述的细胞群、药物组合物、方法、或者应用，其中至少10%的所述贴壁细胞在增殖。
25.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中与从生长骨髓中获得的贴壁细胞相比，所述贴壁细胞较少定向为成骨细胞系，并且允许在相同条件下分化。
26.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中与从生长骨髓中获得的贴壁细胞相比，所述贴壁细胞较少定向为脂肪形成细胞系，并且可以在相同条件下分化。
27.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中所述贴壁细胞包括小于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞的细胞直径。
28.根据权利要求1、2或8所述的细胞群、根据权利要求10所述的药物组合物、根据据权利要求11所述的方法、或者根据权利要求12所述的应用，其中所述贴壁细胞包括高于来源于胎盘胚胎部分的贴壁细胞的细胞增殖能力。
29.一种治疗骨骼肌缺陷的方法，包括给予需要其的受试者治疗有效量的包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物，从而治疗骨骼肌缺陷。
30.一种治疗神经病理性疼痛的方法，包括给予需要其的受试者治疗有效量的包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物，从而治疗神经病理性疼痛。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述神经病理性疼痛与炎性疼痛、糖尿病多发性神经病变、人类免疫缺陷病毒(HIV)感觉神经病变、中风后综合征、缺血、或多发性硬化有关。
32.—种治疗心肌梗塞的方法，包括向需要其的受试者给予治疗有效量的包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物，从而治疗心肌梗塞。
33.包含来源于胎盘的贴壁基质细胞的组合物在制备用于治疗骨骼肌缺陷、神经病理性疼痛、心肌梗塞的药物中的应用。
34.包含作为活性成分的来源于胎盘的贴壁基质细胞的药物组合物，用于治疗骨骼肌缺陷、神经病理性疼痛、或心肌梗塞。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述神经病理性疼痛与炎性疼痛、糖尿病多发性神经病变、人类免疫缺陷病毒(HIV)感觉神经病变、中风后综合征、缺血、或多发性硬化有关。
36.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，根据权利要求33所述的应用、或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞表达⑶73、⑶90、⑶29、⑶105或D7-fib中的一种或多种。
37.根据权利要求29-32中任一项所述的方法、根据权利要求33所述的应用、或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞不表达⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA-DR、CDllb, CD14、CD19、CD34、CD31、CD200、CD271、KDR、或 CD79。
38.根据权利要求29-32中任一项所述的方法、根据权利要求33所述的应用、根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞表达β -内啡肽、强啡肽A、亮氨酸-脑啡肽、或甲硫氨酸-脑啡肽中的一种或多种。
39.根据权利要求29-32中任一项所述的方法、根据权利要求33所述的应用、或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞抑制T细胞活性。
40.根据权利要求29-32中任一项所述的方法、根据权利要求33所述的应用、或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述贴壁细胞包括至少70%的来自胎盘母体部分的贴壁细胞。
41.根据权利要求40所述的方法、应用、或药物组合物，其中不多于3.5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的来自母体部分的所述贴壁细胞表达CD200，如通过流式细胞术利用确定阴性表达的同种型对照所测量的。
42.根据权利要求40所述的方法、应用、或药物组合物，其中胎盘的所述母体部分包括基蜕膜、壁蜕膜、或者同时包括基蜕膜和壁蜕膜。
43.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，根据权利要求33所述的应用、或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中通过采用3D培养条件的培养产生所述贴壁细胞。
44.根据权利要求43所述的方法、应用、或药物组合物，其中所述三维(3D)培养包括3D生物反应器。
45.根据权利要求43所述的方法、应用、或药物组合物，其中，在灌注下实施所述贴壁细胞在所述3D培养中的培养。
46.根据权利要求43所述的方法、应用、或药物组合物，其中实施所述贴壁细胞的培养至少3天。
47.根据权利要求43所述的方法、应用、或药物组合物，其中实施所述贴壁细胞的培养直到至少10%的所述贴壁细胞在增殖。
全文摘要
提供了通过给予需要其的受试者来源于胎盘的贴壁基质细胞来治疗疾病的方法。这些疾病包括骨骼肌缺陷、神经病理性疼痛、和心肌梗塞。还提供了其中将所给予的贴壁基质细胞在2维或3维生长条件下培养的方法。也提供了其中所给予的细胞中的至少70%贴壁细胞来自于胎盘的母体或胎儿部分的方法。
文档编号A61K35/50GK102639692SQ201080054298
公开日2012年8月15日 申请日期2010年11月29日 优先权日2009年11月30日
发明者扎米·阿贝尔曼 申请人:普拉里斯坦有限公司