骨折的治疗的制作方法

专利名称：骨折的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过在存在HS-2的情况下的细胞培养所获得的间充质干细胞在治疗骨折中的使用。
背景技术：
开发防止延缓的和不愈合的骨折的骨再生疗法的动力是重要的治疗问题，特别是考虑到每年会发生数百万计骨折，其中至少10%不能自愈。在Brickman 等人，(1998), J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359 中鉴别并描述了硫酸乙酰肝素2 (，或称硫酸类肝素，HS-2)，并且它是从胚胎期10天(ElO)的鼠神经上皮中纯化的。随后，发现HS-2在离体培养中促进干细胞生长，并同时保留了它们的多能性(W02006/085209A1 和 US2009/0148420A1)。·间充质干细胞(MSC)是多能干细胞，其能够分化成结缔组织和/或骨细胞，如软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。

发明内容
本发明人已发现与通过在对照条件下的培育所获得的MSC相比，通过在存在HS-2的情况下的细胞培养所获得的间充质干细胞(HS-2MSC)在骨生长和再生方面是更优良的。因此，提供了 HS-2MSC在骨折修复中的使用。具体地，与通过在对照条件下的培育所获得的MSC的使用相比，当使用HS-2MSC时骨折修复得到加强。这种加强包括相对于通过使用在对照条件下的培育所获得的MSC进行治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改善(或提高)。使用HS-2MSC的骨折治疗导致了更快速的骨折修复，这可以包括更快速的骨生长，即新骨生长速度的提高，更快速的骨基质沉积，例如，矿化速率的提高，和/或在骨折修复中所实现的新骨体积的速率的提高。这些作用为减少治愈骨折所需的时间的减少作了准备。照此，在本发明的一些方面，提供了 HS-2MSC以用于与不使用MSC和/或使用在对照条件下培养的MSC的治疗相比改善的骨折修复速度的方法中使用。本发明的实施方式具体地涉及通过MSC的使用来治疗骨折的骨折修复领域。本发明的优势包括由改善的骨折修复速度所证明的并且由通过特定类型的MSC (即HS-2MSC)的使用所提供的骨折修复的出乎预料的加强(enhancement)。在本发明的一个方面，提供了通过在存在HS-2的情况下的细胞培养所获得的间充质干细胞在制备用于治疗骨折的药物中的使用。在一些实施方式中，所述药物用于在加强的间充质干细胞介导的骨折修复方法中使用。加强的间充质干细胞介导的骨折修复可以包括相对于通过使用通过在不存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改
盡
口 o在本发明的另一个方面，提供了通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞在治疗骨折的方法中的使用。在本发明的其它方面，提供了包含通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的药物组合物，其中所述药物组合物用于在治疗骨折的方法中使用。在一些实施方式中，间充质干细胞或药物组合物用于在包括加强的间充质干细胞介导的骨折修复的治疗方法中使用。加强的间充质干细胞介导的骨折修复可以包括相对于通过使用由在不存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改善。在本发明的另一个方面，提供了包含生物材料和由在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的生物相容性植入物或假体。在一些实施方式中，所述植入物或假体涂覆了通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。在一些实施方式中，所述植入物或假体浸溃了通过在存在HS-2的 情况下的培养所获得的间充质干细胞。在本发明的其它方面，提供了形成生物相容性植入物或假体的方法，所述方法包括用通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞涂覆或浸溃生物材料的步骤。在本发明的另一个方面，提供了治疗受试者中骨折的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。在一些实施方式中，所述方法是加强的间充质干细胞介导的骨折修复方法，所述方法包括相对于通过使用通过在不存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改善。在一些实施方式中，在施用间充质干细胞之前，所述方法包括与HS-2接触培养干细胞以产生所述治疗有效量的间充质干细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括将所述治疗有效量的间充质干细胞配制为药物组合物的步骤，所述药物组合物包含通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞和可药用载体、佐剂或稀释剂，其中将所述药物组合物施用给所述受试者。在一些实施方式中，所述方法包括将所述间充质干细胞或药物组合物施用至骨折周围的组织。在一些实施方式中，所述间充质干细胞或药物组合物的施用包括将所述间充质干细胞或药物组合物注射至骨折周围的组织。在本发明的其它方面，提供了治疗受试者中骨折的方法，所述方法包括通过手术将生物相容性植入物或假体植入到受试者骨折位点处或骨折位点周围的组织，所述植入物或假体包含生物材料和通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。在一些实施方式中，所述植入物或假体涂覆了通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。在一些实施方式中，所述植入物或假体浸溃了通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
具体实施例方式HS-2MSC本发明涉及使用HS-2MSC的骨折的治疗性治疗。在本说明书中，“HS-2MSC”是通过在存在HS-2的情况下的培养所获得并且可获得的间充质干细胞。在W02006/085209A1 和 US 2009/0148420A1 中描述了用于获得 HS-2MSC 的方法。这些文档中每一个的全部内容作为参考并入本文。如其中所述，与通过在不存在HS-2的情况下的细胞培养所获得(例如，如通过在对照条件下的培养所获得)的间充质干细胞相比，通过在存在HS-2的情况下的细胞培养所获得的间充质干细胞已表现出具有优良的(较好的，superior)干细胞性能。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下培养细胞获得HS-2MSC的步骤构成了本发明的部分。在一些优选的实施方式中，HS-2MSC是人骨髓细胞系hMSC_HS2，它是根据布达佩斯条约的条款由 Agency for Science, Technology and ResearchA*Star c/o VNSC Laboratory, Institute of Medical Biology, 8ABiomedicalDrive, #0606Immunos, Singapore, SG 138648 于 2009 年 12 月 28 日以保藏编号(登录号) PTA-10552保存在美国典型培养物保藏中心(或美国模式培养物保藏所，ATCC)的。在本发明的一些实施方式中，用于治疗骨折的HS-2MSC可以不包含HS-2，或仅包含微量的HS-2。HS-2MSC是一类独特的MSC，其特征在于由在存在HS-2的情况下培养细胞所引起的结构和功能特性的独特组合。具体地，与在不存在HS-2的情况下培养的干细胞相比，来自HS-2培养的MSC在相同的时间段或对于相同数目的群体倍增(PD)显示出显著的干细胞性能的保持。这些干细胞性能可以包括更长的端粒长度、如⑶49a、⑶73、⑶105、⑶90和STR0-1的分子标志物的连续高水平表达和干细胞多能特性的维持，例如，分化和形成新组织的能力，和最大程度减少或避免宿主免疫应答的连续能力。得自HS-2中的培养的MSC具有不同于对照培养(物)的独特遗传特征(遗传信号，genetic signature)并且可以通过基因表达和奇异值分解分析客观地进行测试。与在对照培养(无HS-2)中培养相同时间长度的干细胞相比，HS-2中培养的MSC表现出“年轻”得多的遗传特征，即，在HS-2中培养的MSC的基因表达谱反映了在对照培养中生长较短(更短的)时间段的细胞的基因表达谱。这与当在HS-2中培养时干细胞多能性的维持以及在不存在HS-2的情况下培养的MSC中的多能性以及其它干细胞特性的损失一致。因此，在HS-2中培养的MSC代表了在结构上不同于在不存在HS-2的情况下培养的MSC的一组独特的MSC。如上所述，HS-2已显示显著提高了多能MSC亚群的增殖，该多能MSC具有显著更长的端粒和以MSC为特征的细胞表面抗原的更大程度表达。在结构上，与在对照条件中培养的MSC相比，HS-2MSC具有显著更长的端粒和独特的基因表达特征(如通过干细胞阵列数据的奇异值分解(SVD)所测量的一参见W02006/085209A1和 US 2009/0148420A1)。在存在HS-2的情况下扩增15次群体倍增(PD)的MSC的平均端粒长度比在对照培养基中扩增15次ro的MSC的显著更长。在长期培养扩增后(45天)，HS-2MSC具有与来自较早代的对照细胞类似的基因表达特征，这表明HS-2维持了培养扩增的MSC的“干性”。MSC在HS-2中扩增38和45天后，表面标志物抗原STR0-1、CD49a和CD105的表达提闻，而⑶73的表达不受影响。基因表达特征分析(SVD分析)还表明HS-2对MSC的结构影响不是供体特异性的并且通过SVD所产生的基因表达特征可以用于可靠地比较来自不同供体的细胞。在功能上，HS-2MSC比在对照培养中扩增的MSC更具多能性，并且具有更长的体内寿命期，并且无可检测的末端酶活性。还已发现HS-2MSC维持了它们的CFU-F (集落形成单位-成纤维细胞)比例，尽管与对照培养相比在相同的培养期内经历了额外的群体倍增并借此获得了多至8倍的可用CFU-F增加。据发现在存在HS-2的情况下培养13或21次H)的MSC具有7%的CFU-F频率，其 中对MSC的后期培养(carry-on culture)的克隆测定与先前所报道的通过STR0-1分选后MSC富集所获得的频率相当，其中这种分选导致CFU-F频率低于1%，而STRO-Is群体获得了
9%的频率。HS-2MSC可以表达CD49a、CD73、CD105、CD90、STR0_l中的一种或多种，并且可以任选地不表达CD45。优选地，HS-2MSC是STRO-Γ气已发现HS-2MSC表现出稳定的染色体组型。根据上述内容，很显然通过由在存在HS-2的情况下的细胞培养获得MSC，所获得的细胞(HS-2MSC)具有独特的结构和功能特征并且代表了确定的一类MSC。本发明涉及HS-2MSC的具体使用，即在骨折治疗中的使用。可以通过参考在存在HS-2的情况下的细胞培养持续时间或在存在HS-2的情况下的培养期间MSC的扩增程度或速率来进一步限定HS-2MSC。细胞培养的持续时间可以由细胞培养时间(例如，最少天数)或者由细胞在培养期间所经历的群体倍增(PD)次数来表示。因此，在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下将细胞培养至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少12天、至少14天、至少16天、至少18天、至少20天、至少22天、至少24天、至少26天、至少28天、至少30天、至少32天、至少34天、至少36天、至少38天、至少40天、至少42天、至少44天、至少46天、至少48天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天或至少100天中的一种来获得HS-2MSC。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下培养小于100天、90天、80天、70天、60天或50天中的一种来获得HS-2MSC。在存在HS-2的情况下的培养可以最多为7、9、11、13、15、
20、25、30、35、40、45、50或更多天中的任一种。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下将细胞培养通过至少5次PD、至少6次H)、至少7次H)、至少8次H)、至少9次H)、至少10次H)、至少12次H)、至少14次H)、至少16次PD、至少18次PD、至少20次PD、至少22次PD、至少24次PD、至少26次H)、至少28次PD、至少30次PD、至少32次PD、至少34次PD、至少36次PD、至少38次PD、至少40次PD、至少42次PD、至少44次PD、至少46次PD、至少48次PD、至少50次PD、至少60次PD、至少70次PD、至少80次H)、至少90次H)或至少100次H)来获得HS-2MSC。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下培养小于100次Η)、90次Η)、80次PD、70次H)、60次ro、50次ro、4o次ro、30次ro或20次ro中的一种来获得hs-2msc。在一些实施方式中，培养或组合物中至少3%的细胞是集落形成单位(CFU)，更优选地，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%中的一种。这可以在培养结束时或者在选自以上列表的天数或群体倍增次数之后进行测定。CFU百分比提供了细胞培养中干细胞比例的量度。MSC的扩增是指通过细胞分裂所实现的培养中MSC群体的增加。可以通过培养中干细胞群体的加倍来量化(测量)扩增，并且可以将群体倍增速率用作干细胞扩增速率的量度。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下的细胞培养从而使得群体倍增速率在约0. 5次PD/天至约I. 2次PD/天、约0. 6至约0. 9次PD/天或约0. 6至0. 8次PD/天中的一种的范围内来获得HS-2MSC。在将HS-2加入至培养基后的I至10天之间，群体倍增速率可以在约0. 6至约0. 8次PD/天之间。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下将细胞培养足够的时间以将单个MSC扩增至多于1\103个干细胞的群体来获得肥-21^(。培养开始可以含有多于一个MSC。在该情况下，总扩增的MSC群体等于多个MSC以多于I X IO3倍的扩增。更优选地，扩增程度可以是以下之一 5X IO3UX 10\5X IO4UX IO5,5X IO5UX IO6,5X IO6UX IO7,5X IO7,IX 108、5X 108、1X IO9或5X 109。扩增MSC的培养时间可以在5至50天之间，更优选地在 10至45天之间，并且更优选地小于45天、40天、35天、30天、25天、20天或15天中的一种。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下将细胞培养足够的时间以将MSC培养从至少约2000个细胞/cm2培养空间(例如，培养皿或塑料制品的培养空间)的初始培养尺寸扩增至含有增加至少I X IO3倍的MSC (即至少约2 X IO6个MSC)的扩增培养尺寸来获得HS-2MSC。初始培养尺寸可以是以下之一至少约3000个细胞/cm2、约3500个细胞/cm2、至少约4000个细胞/cm2、约4500个细胞/cm2、5000个细胞/cm2，并且扩增培养尺寸可以是以下之一至少约3 X IO6个细胞/cm2、约3. 5 X IO6个细胞/cm2、至少约4X IO6个细胞/cm2、约4. 5X106个细胞/cm2、5X106个细胞/cm2。初始培养可以具有小于以下之一 6000、5000、4000,3000或2000个细胞/cm2。扩增培养可以具有大于以下之一 5X 103、I X 104、5X 104、lX105、5X105、lX106、5X106、lX107、5X107、lX108、5X108、lX109*5X109fMSC。在初始培养尺寸和扩增培养尺寸之间扩增的培养时间优选地在约10至50天之间，更优选地在约15至30天之间。它可以小于以下之一 50、45、40、35、30、25、20或15天。可以应用如上所述的方法以将MSC培养扩增至I X IO4、I X 105、I X IO6、I X 107、I X 108、IXlO9个细胞或更大的扩增培养尺寸。在一些实施方式中，通过在存在HS-2的情况下将细胞培养足够的时间以将MSC的培养从MSC的初始个数扩增至MSC的扩增个数来获得HS-2MSC，其中所述扩增个数为初始个数的至少100倍，优选地至少1000倍，并且其中将培养在初始个数和扩增个数之间扩增的时间为小于30天，更优选地为小于以下之一 :28、26、24、22、20、18、16、15、14、13、12、11、
10、9、8、7、6 或 5 天。在存在HS-2的情况下的细胞培养方法可以包括仅处于线性(对数)生长期的细胞的培养，仅处于汇合后生长的细胞的培养，或者可以包括在线性期和汇合后期延续的生长。在存在HS-2的情况下的细胞培养方法还可以包括细胞传代。在存在HS-2的情况下的细胞培养优选地在生理学温度下进行。在一些实施方式中，用于细胞培养的细胞可以包括能够导致产生MSC的细胞，例如，多潜能(pluripotent)或多能(multipotent)干细胞,如胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞。在其它实施方式中，用于细胞培养的细胞可以包括间充质干细胞。培养还可以包含其它细胞，例如，所收集的干细胞来源的组织中与干细胞有关的非干细胞和/或支持细胞，例如，饲养细胞。用于起始干细胞培养的细胞将优选地含有高比例的各自的干细胞，例如，至少60%的干细胞，更优选地，至少70%的干细胞、80%的干细胞、90%的干细胞、95%的干细胞、96%的干细胞、97%的干细胞、98%的干细胞、99%的干细胞或者100%的干细胞中的一种。可以在开始细胞培养之前富集(例如，通过富集如STRO-I或STR0-1亮的标志物)细胞，例如，从先前的细胞培养或从活的动物或人中收集的细胞。可以通过细胞分选(例如，FACS)来实施标志物富集。本文所述的HS-2MSC和为了获得HS-2MSC在存在HS-2的情况下培养的细胞可以是来自任何动物类型的细胞。优选地，它们是哺乳动物。在一些实施方式中，它们是人。在其它实施方式中，它们来自于非人哺乳动物。所述非人哺乳动物可以是家养宠物，或者是以商业目的饲养的动物，例如，比赛用马或家畜，如猪、羊或牛。非人哺乳动物包括兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括啮齿目(Ro d e n t i a )中的任何动物)、猫、狗、猪、羊、山羊、牛(包括母牛，例如，乳牛或牛目(Bos)中的任何动物)、马(包括马目(Equidae)中的任何动物)、驴和非人灵长类。为了获得HS-2MSC在存在HS-2的情况下培养的细胞开始不必须是MSC。它们可以是在培养期间诱导分化为MSC的多能或多潜能干细胞。如上所述的培养方法优选地在体外进行。术语“体外”旨在涵盖使用培养中的细胞的实验，而术语“体内”旨在涵盖使用完整多细胞生物的实验。在一些实施方式中，提供了包含通过任何所述方法产生的HS-2MSC的药物组合物。所述药物组合物在医疗方法中是有用的。适合的药物组合物还可以包含可药用载体、佐剂或稀释剂。所述药物组合物可以包括支架或基质材料，其具有植入或吸附至所述材料的细胞。这种组合物可以提供可植入装置或假体的基础，所述可植入装置或假体可以通过手术植入到需要治疗的患者中。在本说明书中，在存在HS-2的情况下的细胞培养是指在其中所培养的细胞能够接触到HS-2的条件下的细胞培养。在优选的实施方式中，这包括在含有HS-2的培养基中培养细胞。所述培养基可以是流体，例如液体或凝胶，并且除正常营养物、生长因子和基质 材料外还可以含有HS-2。HS-2优选地将以非微量存在。例如，培养基中HS-2的浓度可以在约I. Ong/ml培养基至约1000ng/ml培养基之间的范围内。更优选地，培养基中HS-2的浓度可以在约5ng/ml培养基至200ng/ml培养基之间，或者在约20ng/ml培养基至170ng/ml培养基之间。从在存在HS-2的情况下的培养中所获得的细胞的性能可以与从在对照条件下的培养中所获得的相同类型的细胞相比。“对照条件”或者“对照培养”是指在其中所培养的细胞不接触HS-2 (优选地，非微量的HS-2)的条件下的细胞培养。照此，对照条件可以包括在含有正常营养物、生长因子和基质材料但不含HS-2的培养基中的培养。用于MSC培养的对照培养基的实例包括无血清培养基，如MeseilCult -ACF培养基(STEMCELLTechnologies, Vancouver, Canada)或基础培养基,如用于人间充质干细胞的MesenCult MSC基础培养基(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)。用于细胞培养的示例性维持培养基可以包含DMEM、1000mg/l葡萄糖，其中补充了10%胎牛血清(FBS)并具有O. 1%的青霉素/链霉素和2mML-谷氨酰胺，其在加湿的5%C02培育箱中在37°C下培育。可以以三天的间隔更换培养基并且细胞每4-5天(约80%汇合)进行继代培养(subculture )。量近本发明涉及HS-2MSC治疗骨折的治疗性使用(人和兽医)。据本发明所报道，HS-2MSC增强了骨中伤口的愈合。HS-2MSC刺激创伤后的骨再生并且有助于骨中伤口愈合的改善。HS-2MSC提供了骨折修复速度的提高(改善)，从而使得能够缩短创伤恢复的时间。骨折是一种医学病况。在本发明申请中，“骨折”包括其中骨开裂、断裂或碎裂的骨损伤或创伤。断裂是指骨中的不连续。骨折可以由物理冲击或机械应力或者由如骨质疏松症或骨关节炎的医学病况所造成。骨折的整形外科分类包括闭合或开放以及单纯或多段骨折。在闭合性骨折中，皮肤保持完整，而在开放性骨折中，骨可以通过伤口位点暴露，这使得感染的风险更高。单纯骨折沿一条线发生，往往将骨分为两段。多段骨折将骨分成多块。 其它骨折类型包括压缩骨折、嵌插骨折、扭转骨折、完全和不完全骨折、横骨折、线形骨折和斜形骨折以及粉碎性骨折。在大部分受试者中，自然发生骨愈合(骨折愈合)并且是在创伤后开始的。出血通常导致凝块并吸引白血球和成纤维细胞，然而产生胶原纤维。随后，骨基质(羟基磷灰石钙)沉积(矿化作用)，从而将胶原基质转化为骨。未成熟的再生骨通常比成熟骨脆弱，并且未成熟骨随时间经历重建过程以产生成熟的“多层”骨。骨完全愈合的过程通过需要相当长的时间，通常为数月。其中发生骨折并且可能受益于使用HS-2MSC的治疗的骨包括所有骨类型，具体地，所有哺乳动物的骨，其包括(但不限于)长骨(例如，股骨、肱骨、指骨)、短骨(例如，腕骨、跗骨)、扁骨(例如，头盖骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆带)、不规则骨(例如，椎骨)、籽骨(例如，膝盖骨)。骨折还包括病理性疏松，如骨质疏松症受试者所表现出的。提供了 HS-2MSC以及包含HS-2MSC的药物组合物和药物在哺乳动物受试者的骨折治疗方法中的使用。治疗可以包括骨中的伤口愈合。治疗可以包括骨的修复、再生和生长。HS-2MSC通过促进新骨生长促进了骨折修复。HS-2MSC起作用以改善骨折修复的速度，从而使得能够发生更快速的骨愈合，导致创伤恢复的时间得到改善。治疗可以导致骨强度得到改善。治疗还可以包括骨质疏松症或骨关节炎的治疗。优选地，将HS-2MSC施用到骨折周围的组织。这可以包括直接施用到其中已发生骨折的骨组织。可以施用到骨或骨折周围的结缔组织或施用到靠近骨并向骨供血的脉管系统(例如，血管)。可以直接施用到创伤位点，并且可以施用到由伤口初始愈合所形成的骨痂组织。药物和药物组合物可以配制根据本发明的药物和药物组合物以用于通过多种途径施用。可以将HS-2MSC配制成用于注射的流体或液体形式，或者配制为适合于应用至骨或骨折周围的其它组织的凝胶的一部分。优选地，以“治疗有效量”施用，与相应未治疗的骨折或者与使用从对照条件下的培养所获得的MSC治疗的骨折相比，这足以改善骨折的愈合。所施用的实际量以及施用速率和时间过程将取决于骨折的性质和严重程度。治疗处方(例如，剂量决策等)在全科医生及其他医生的职责范围内，并且通常将考虑骨折的性质、个体患者情况、递送位点、施用方法以及医师已知的其它因素。可以根据处方执业医生的指导施用单次或多次HS-2MSC剂量。纯粹通过举例说明，可以以约75 X IO6至约100 X IO6个细胞的剂量递送HS-2MSC，例如，至少50 X IO6个细胞，至少60 X IO6个细胞和至少70 X IO6个细胞中的一种。上述技术和规程的实例可见于雷明顿药物科学(Remington' s Pharmaceutical Sciences),第20版，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins。HS-2MSC可以与其它治疗一起用于治疗骨折，所述其它治疗如镇痛或抗炎药物的施用、骨固定和正骨(例如，在管型石膏夹中固定受伤的肢)、外科手术(例如，接合骨或移动骨以纠正移位、弯曲或脱臼)。如果需要手术，可以在手术程序期间将HS-2MSC直接施用到(例如，应用于)骨折处。本发明的药物组合物和药物可以采取涂覆和/或浸溃有HS-2MSC的生物材料的形式。植入物或假体可以由所述生物材料形成。这些植入物或假体可以通过手术植入以辅助
骨生长、再生、重构和/或重建。HS-2MSC可以应用于植入物或假体以加快所需位置处的新骨形成。所述生物材料可以涂覆或浸溃HS-2MSC。浸溃可以包括将HS-2MSC与生物材料接触从而允许将它们吸收和/或吸收到所述生物材料上和/或吸收到所述生物材料中。涂覆可以包括将HS-2MSC吸附到生物材料的表面上。生物材料的涂覆或浸溃可以包括将HS-2MSC接种到生物材料上或生物材料中。当施用到或植入到受试者中时，生物材料应允许所涂覆或浸溃的HS-2MSC从所述生物材料中释放。可以通过改变生物材料的结构(例如，孔隙度)来改变生物材料的释放动力学。除了用HS-2MSC涂覆或浸溃生物材料外，还可以将一种或多种生物活性分子浸溃或涂覆到生物材料上。例如，至少一种选自HS-2、BMP-2、BMP-4、OP-U FGF-U FGF-2、TGF-P I、TGF-^ 2, TGF-P 3、VEGF、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白。除了上述生物活性分子或者作为上述生物活性分子的替代，可以将一种或多种二膦酸酯与HS-2MSC —起浸溃或涂覆到生物材料上。有用的二膦酸酯的实例可以包括选自羟乙二磷酸酯；氯屈膦酸酯；胺丁羟磷酸酯；帕米膦酸酯；利塞膦酸酯；唑来膦酸酯中的至少一种。任选地，不将HS-2浸溃或涂覆到生物材料上。涂覆或浸溃了 HS-2MSC的生物材料可以在医学或兽医中均是有用的。将理解本发明可以改善患者的生活质量或潜在地延长动物的寿命，例如，用于配种的重要比赛用马。生物材料提供了支架或基质载体。生物材料可以适合于组织中的植入或者可以适合于施用(例如，作为溶液中的微胶囊)。植入物或假体应是生物相容性的，例如，无毒并且低免疫原性的(最优选地，无免疫原性的)。生物材料可以是生物可降解的，从而随着伤口愈合的发生，生物材料降解，从而最终仅在受试者中原位留下再生骨。作为另外一种选择，可以使用非生物可降解的生物材料(例如)以在较大的断裂处引导骨再生和/或用作骨愈合期间的结构支撑，并且在伤口成功愈合后，手术除去生物材料是可选的要求。
生物材料可以是软的和/或柔性的，例如，水凝胶、纤维蛋白网或网状物或者胶原海绵。“水凝胶”是在有机聚合物(可以是天然的或合成的)凝固或固化以产生捕获水或其它溶液分子从而形成凝胶的立体开放栅格结构时所形成的物质。可以通过聚集、凝聚、疏水性相互作用或交联发生固化。作为另外一种选择，生物材料可以是相对刚性的结构，例如，通过如塑料或生物惰性金属(如钛)的固体材料形成。生物材料可以具有多孔基质结构，其可以通过交联聚合物提供。优选地，该基质对骨生长所需的营养物和生长因子是可透过的。基质结构可以通过使用适合的交联剂(例如，钙盐、聚丙烯酸、肝素)使纤维交联来形成，例如，纤维蛋白或胶原，或者海藻酸钠、壳聚糖或其它多糖的液膜。可替代地(作为另外一种选择)，可以形成作为凝胶的支架，其通过胶原或海藻酸盐制备并使用本领域技术人 员所知的已建立的方法交联。用于基质形成的适合的聚合物材料包括(但不限于)生物可降解/生物可吸收的聚合物，其可以选自琼脂糖、胶原、纤维蛋白、壳聚糖、聚己酸内酯、聚(DL-丙交酯-共聚-己内酯)、聚(L-丙交酯-共聚-己内酯-共聚-乙交酯)、聚乙交酯、聚交酯、聚羟基脂肪酸酯、它们的共聚物，或者非生物可降解的聚合物，其可以选自醋酸纤维素；丁酸纤维素、海藻酸盐、聚砜、聚氨脂、聚丙烯腈、磺化聚砜、聚酰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它们的共聚物。由于其生物相容性和支持细胞附着和功能的有利性质，胶原是基质构建的优良材料(美国专利 No. 5019087 ；Tanaka, S. ; Takigawa, T. ; Ichihara, S. & Nakamura, T.Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolicacid-collagen nerveguide tube Polymer Engineering & Science 2006，46，1461-1467)。临床可用的胶原海绵是基质的一个实例并且在本领域中是熟知的(例如，来自Integra Life Sciences的胶原海绵)。纤维蛋白支架(例如，纤维蛋白胶)提供了替代性基质材料。作为伤口密封齐U、递送生长因子的储器以及作为放置和固定生物植入物的辅助物，纤维蛋白胶得到了广泛的临床应用(Rajesh Vasita, Dhirendra S Katti. Growth factor deliverysystems for tissue engineering:a materials perspective.Expert Reviews inMedical Devices. 2006; 3 (I) : 29-47 ；Wong C，Inman. E，Spaethe R. Helgerson S. Thromb.Haemost. 2003. 89(3):573-582 ;Pandit AS，Wilson DJj Feldman DS.Fibrin scaffoldas an effective vehicle for the delivery of acidic growth factor (FGF-I).J.Biomaterials Applications. 2000;14(3) :229-242 ；DeBlois Cote MF.DoillonCJ. Heparin-fibroblast growth factor fibrin complex: in vitro and in vivoapplications to collagen based materials. Biomaterials· 1994;15(9):665-672)。Luong-Van 等人(In vitro biocompatibility and bioactivity ofmicroencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28 (2007) 2127-2136)说明了来自聚己内酯微胶囊的HS的延长定位递送，该文献作为参考并入本文。生物材料的另一个实例是掺入羟基磷灰石或透明质酸的聚合物。生物材料可以补充其它细胞。例如，可以用成纤维细胞来源的饲养细胞“接种”生物材料(或共同合成该生物材料)，所述饲养细胞对于支持HS-2MSC的生长和维持可以是有用的。待治疗的受试者可以是任何动物或人。所述受试者优选地为哺乳动物。在一些实施方式中，所述受试者是人。在其它实施方式中，所述受试者是动物，更优选地，是非人哺乳动物。所述非人哺乳动物可以是家养宠物，或者是以商业目的饲养的动物，例如，比赛用马或家畜，如猪、羊或牛。照此，本发明可以具有兽医应用。非人哺乳动物包括兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它哨齿动物(包括哨齿目(Rodentia)中的任何动物)、猫、狗、猪、羊、山羊、牛(包括母牛或牛目(Bos)中的任何动物)、马(包括马目(Equidae)中的任何动物)、驴和非人灵长类。所述受试者可以是雄性或雌性。所述受试者可以是患者。硫酸乙酰肝素和HS-2硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖的高度多样化亚组，并且它们是由共价连接至蛋白质主链的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖侧链组成的。核心蛋白质可以以三种形式存 在称为基底膜蛋白聚糖的分泌形式、称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖的锚定在质膜上的形式以及称为多配体(蛋白)聚糖的跨膜形式。它们是哺乳动物细胞表面和大多数细胞外基质的普遍组成。“硫酸乙酰肝素”(“硫酸类肝素”或“HS”)最初在高尔基体中合成为由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)的串联重复所组成的多糖。随后，可以通过一系列步骤对初生多糖进行修饰GlcNAc的N-脱乙酰化/N-硫酸化,GlcA向艾杜糖醒酸(IdoA)的C5差向异构化，IdoA和GlcA在C2处的O-硫酸化，N-硫酸氨基葡萄糖(GlcNS)在C6处的O-硫酸化和GlcNS在C3处的偶然O-硫酸化。HS的N-脱乙酰化/N-硫酸化、2_0_、6-0-和3-0-硫酸化分别是通过HS N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶(HSNDST)、HS 2-0-磺基转移酶(HS2ST)、HS 6-0-磺基转移酶(HS6ST)和HS 3_0_磺基转移酶的特异性作用所介导的。在每个修饰步骤中，仅修饰了一部分潜在的底物，从而导致产生了相当大的序列多样性。HS的这种结构复杂性使得难以确定它的序列并且难以了解HS结构与功能之间的关系。硫酸乙酰肝素侧链是由通过(1->4 )糖苷键连接的交替排列的D-葡萄糖醛酸或者L-艾杜糖醛酸和D-氨基葡萄糖所组成的。氨基葡萄糖通常是N-乙酰化的或N-硫酸化的，并且糖醛酸和氨基葡萄糖均可以另外被O-硫酸化。特定HSPG对特定结合配体的特异性是由连接到氨基葡萄糖和糖醛酸上的羧基、乙酰基和硫酸酯基的特定类型所产生的。与肝素相比，硫酸乙酰肝素含有较少的N-和O-硫酸酯基和较多的N-乙酰基。硫酸乙酰肝素侧链通过四糖键(_葡萄糖醛酸基-β - (1->3)-半乳糖基-β - (1->3)-半乳糖基-β - (1->4)-木糖基-β -1-0-(丝氨酸))区连接到核心蛋白的丝氨酸残基。硫酸乙酰肝素链和核心蛋白均可以进行最终可以影响它们生物活性的一系列修饰。已认为HS的复杂性超过了核酸的复杂性(Lindahl等人，1998，J. Biol.Chem. 273, 24979 ；Sugahara 和 Kitagawa, 2000, Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 518)。HS 种类的变化是由被含有N-乙酰化氨基葡萄糖的二糖的未硫酸化区所分开的糖残基的非随机、高度硫酸化序列的合成所引起的。N-乙酰氨基葡萄糖向N-硫酸氨基葡萄糖的最初转化产生了对其它修饰的关注，包括葡萄糖醛酸向艾杜糖醛酸的差向异构化和氨基葡萄糖或艾杜糖醛酸上O-硫酸化的复杂类型。另外，在未修饰、低硫酸化的N-乙酰化序列中，己糖醛酸酯残基仍保持为葡萄糖醛酸酯，而在高度硫酸化的N-硫酸化区域中，以C-5差向异构体艾杜糖醛酸酯为主。这限制了任意给定链中可能的潜在二糖变体的数目，但是未限制每种变体的丰度。大部分修饰发生在N-硫酸化区域中，或直接与它们相邻，从而在成熟链中存在被低硫酸化域分开的高硫酸化区(Brickman 等人，(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。假设高度可变的硫酸乙酰肝素链通过自分泌、邻分泌和旁分泌反馈环的复杂组合在调节多种细胞外配基的作用中起关键作用，其包括生长和粘附因子的调控及其向细胞的呈递，从而控制胞内信号并借此控制干细胞的分化。例如，尽管可能在遗传学上说明了硫酸乙酸肝素糖胺聚糖(Alberts 等人，(1989) Garland Publishing, Inc, New York & London,第804和805页)，但是从单一来源分离的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖种类在生物活性上可能是不同的。如在Brickman等人，1998，Glycobiology 8，463中所示,根据促有丝分裂的状态，得自神经上皮细胞的两种单独的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖混合物可以特异地激活FGF-I或FGF-2中的一种。类似地，在W096/23003中说明了硫酸乙酰肝素(HS)与FGF-I或FGF-2中的一种相互作用的能力。根据本专利申请，在胚胎期约11至约13天从鼠细胞中获得了能够与FGF-I相互作用的各个HS，而在胚胎期约8至约10天获得了能够与FGF-2相互作用的HS。如上所述，HS的结构是高度复杂的并且在HS之间是可变的。的确，认为HS结构的变化在有助于每种HS在促进细胞生长和指导细胞分化中的不同活性中起到重要作用。认为这种结构复杂性超过了核酸的结构复杂性，并且尽管可以将HS结构的特征描述为具有特异和独特硫酸化类型的重复二糖单元的序列，但是目前尚没有与对核酸测序可用的那些技术相当的标准测序技术以用于确定HS序列结构。在不存在用于确定明确HS序列结构的简单方法的情况下，本领域的熟练技术人员通过多种分析技术明确地鉴别了并在结构上表征了 HS分子。这些技术包括二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量确定法中的一种或组合。这些分析技术是本领域技术人员所熟知和使用的。从HS产生二糖和四糖的两种技术包括亚硝酸消化和裂合酶消化。纯粹通过举例说明，以下提供了实施这些消化技术的一种方法的说明，该说明未限制本发明的范围。亚硝酸消化基于亚硝酸的硫酸乙酰肝素的解聚在完成时导致碳水化合物链最终降解为其各个二糖组分。 例如，可以通过分别在冰上将250 ill 0. 5皿的H2SOjPO. 5M的Ba (NO2) 2冷却15分钟来制备亚硝酸。冷却后，将Ba(NO2)2与H2S04混合并在用于除去硫酸钡沉淀的离心前涡流混合。将125 ill HNO2加入到悬浮于20 ill H2O中的GAG样品中并且涡流混合，然后在不时混合的情况下在25°C培育15分钟。培育后，将IM Na2CO3加入到样品中使其pH值为
6。接着，将100 ill 0. 25M的NaBH4在0. IM NaOH中的溶液加入到样品中并将混合物加热至50°C，保持20分钟。然后，将混合物冷却至25°C并加入酸化的冰醋酸使样品的pH值为3。然后，用IOM NaOH中和混合物并通过冷冻干燥缩小体积。将最终样品在Bio-Gel P-2柱上运行以分离二糖和四糖从而验证降解程度。裂合酶消化肝素酶III在葡萄糖醛酸键处切割糖链。一系列肝素酶(I、II和III)分别通过在特定硫酸化识别位点使某些硫酸乙酰肝素序列解聚而显示出相对特异的活性。肝素酶I沿HS链切割具有NS区的HS链。这导致硫酸化域的破坏。肝素酶III使具有NA域的HS解聚，从而导致碳水化合物链分解成各个硫酸化域。肝素酶II主要切割其中存在不同硫酸化类型的HS链的NA/NS “肩”域。注乙酰肝素聚合物的重复二糖主链为连接到氨基糖氨基葡萄糖上的糖醛酸。“NS”表示氨基糖，其在氨基上带有硫酸酯，从而能够使C2、C6和C3处的其它基团硫酸化。“NA”表示氨基未被硫酸化并且仍保持乙酰化。例如，对于使用肝素酶III在NA区中的解聚，在含有20mM Tris-HCl、O. lmg/mlBSA和4mM CaCl2的缓冲液(pH 7. 5)中制备了酶和冻干HS样品。纯粹通过举例说明，可以将肝素酶III以5mU/l μ gHS加入并且在37°C培育16h，然后通过加热至70°C，保持5分钟使反应停止。二糖和四糖可以通过柱色谱洗脱。在本发明中用于获得HS-2MSC的硫酸乙酰肝素是硫酸乙酰肝素2 (HS_2)。HS-2命名了 HSPG的糖链，并且已发现其对FGF-2具有亲合力。HS-2具有约25kDa的分子量，并且因此假设每个二糖的平均分子量为400Da，那么HS-2由约60个二糖组成。在Brickman等人(Glycobiology，第8卷，第5期，第463-471页，1998)中说明了 HS-2的二糖组成， 该参考文献以其全部内容作为参考并入本文。“硫酸乙酰肝素 2” 或 “HS-2” 表示 fcickman 等人((1998)，J. Biol.Chem. 273(8)，4350-4359)所描述的硫酸乙酰肝素并且它来源于(并且可得自)胚胎神经上皮，优选地哺乳动物的胚胎神经上皮，更优选地鼠胚胎神经上皮，并且它优选地能够与FGF-2相互作用。因此，如(上述)Brickman所述，该硫酸乙酰肝素2可得自胚胎期10天的鼠细胞的乙酰肝素蛋白聚糖。在本发明申请的实验部分中使用的HS-2来源于胚胎小鼠，并且已发现它对小鼠、人、大鼠、鸡、异爪蛙和果蝇细胞特别有效。根据这些结果，在本发明中考虑了任何高等生物(例如，昆虫或脊椎动物，如哺乳动物、鸟、爬行动物或鱼)中的普遍机制。因此，在本发明中涵盖了任何硫酸乙酰肝素2和能够与FGF-2相互作用并且能够促进或有利于干细胞离体(体外)增殖和/或维持的任何相应的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其包括该硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和有待于从特定物种分离的硫酸乙酰肝素2。对所分离的硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的功能性的分离和确定是本领域技术人员的知识范围内所熟知的并且可以如(例如)Brickman 等人，(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359 中所述的实施。HS-2可以得自胚胎期第10天(ElO)的小鼠神经上皮。图9中显示了多种处理后HS-2的分子量，所述处理包括链霉蛋白酶处理以除去任何相关蛋白组分、弱碱和肝素酶。可以通过分析对使用低pH值ΗΝ02、乙酰肝素酶(heparitinase)或乙酰肝素酶(heparanase)的处理敏感的化学键(linkage)的百分比来进一步表征HS-2。在图10中显示了结果。图11中显示了亚硝酸消化后HS-2的二糖组成。图12中显示了亚硝酸消化后HS-2的四糖组成。图13中显示了用肝素裂合酶混合物处理后HS-2的二糖组成。图14中显示了图13中所示的二糖的硫酸化特征。在本发明申请的其它地方描述了用于确定对使用低PH值ΗΝ02、乙酰肝素酶(heparitinase)或乙酰肝素酶(heparanase)的敏感处理；亚硝酸消化和肝素裂合酶消化敏感的化学键的百分比的方法。在本说明书中，对HS-2的引用包括得自胚胎期10天(ElO)的哺乳动物(优选地，小鼠)神经上皮的HS。对HS-2的引用还可以包括具有与Brickman等人在Glycobiology,第8卷，第5期，第463-471页，1998中所述的HS-2基本相似的结构和/或功能的HS。与Brickman等人的HS-2基本相似的HS可以包括HS，其具有(0分子量,其比图9中对于相应处理所示的分子量大或小不超过10%,更优选地，不超过5% ;和/或(ii)对低pH值亚硝酸、乙酰肝素酶(heparitinase)或乙酰肝素酶(heparanase)处理敏感的化学键的百分比，其比图10中对于相应处理所示的百分比大或小不超过10%，更优选地，不超过5% ;和/或(iii)亚硝酸消化二糖组成，其中存在对应于图11中所示那些的每种二糖并且每种二糖的百分比组成比图11中所示的百分比组成大或小不超过20%，更优选地，不超过15%、10%、5%、3%、2% 或 1% ;和 / 或(iv)亚硝酸消化四糖组成，其中存在对应于图12中所示那些的每种四糖并且每 种四糖的百分比组成比图12中所示的百分比组成大或小不超过20%，更优选地，不超过15%、10%、5%、3%、2% 或 1% ;和 / 或(V)肝素裂合酶二糖组成，其中存在对应于图13中所示那些的每种二糖并且每种二糖的百分比组成比图13中所示的百分比组成大或小不超过20%，更优选地，不超过15%、10% 或 5% O干细朐术语“干细胞”一般是指分裂时面临两种发育选择的细胞子细胞可以与原始细胞相同(自我更§ )或者它们可以是更特化的细胞类型的祖代(分化)。因此，干细胞能够采取一种或其它途径(存在其中可以形成每种细胞类型之一的其它途径)。因此，干细胞是非终末分化的并且能够产生其它类型细胞的细胞。可以从囊胚泡的内细胞团(ICM)中分离胚胎干细胞(ESC)，囊胚泡是植入发生时胚胎发育的一个阶段。多潜能干细胞是真正的干细胞，其具有在体内产生任何分化细胞的潜能。然而，它们不能有助于产生来源于滋养层的胚外膜。已发现了几种类型的多潜能干细胞。多能干细胞是真正的干细胞，但是只可以分化为有限的类型。例如，骨髓含有导致产生所有血液细胞但是不能产生其它类型细胞的多能干细胞。多能干细胞存在于成年动物中。据认为体内每种器官均含有它们，从而在这些器官中它们可以替代死细胞或受损细胞。鉴定干细胞的方法在本领域中是已知的并且包括标准测定方法的使用，如克隆测定、流式细胞术、长期培养和分子生物学技术，例如，PCR、RT-PCR和DNA印记。成熟干细胞包括多种类型，其包括形成神经元、皮肤和血液的干细胞，它们是骨髓移植中的活性成分。后面的这些干细胞类型(成熟干细胞)也是脐带来源的干细胞的主要代表。成熟干细胞可以在实验室中和在体内成熟为功能性、更特化的细胞类型，尽管细胞类型的确切数目受所选择的干细胞类型所限制。诱导的多潜能干细胞，通常缩写为iPS细胞或iPSC，是通过插入某些基因人工来源于非多潜能细胞(通常为成熟体细胞)的一类多潜能干细胞。在Takahashi, K. &Yamanaka(2006), Yamanaka S 等人(2007), Wernig M 等人(2007), Maherali N 等人(2007), Yu J 等人(2007)和Takahashi等人(2007)中对iPS细胞进行了综述和讨论，所有这些文献作为参考并入本文。通常通过将某些干细胞相关基因转染到非多潜能细胞(如成熟成纤维细胞)中获得了 iPS细胞。通常通过病毒载体实现转染，例如，通过反转录病毒重编程。转染的基因包括主转录调节子0ct-3/4 (Pouf51)和Sox2，尽管已表明其它基因提高了诱导效率。3_4周后，少量转染的细胞开始在形态和生物化学方面变得与多潜能干细胞类似，并且通常通过形态选择、倍增时间或通过报道基因和抗生素感染进行分离。可以通过使用一种或多种转录因子的转染从体细胞(如成纤维细胞)诱导IPSC。在一些情况下，使用0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4转化细胞。可以另外用包括转录因子和/或标志物基因的其它基因转染细胞。可以使用如Cre/loxP重组系统的转座子系统来引入基因，或者可以使用非整合载体来引入基因以产生无外源重编程基因的iPSC。可以使用病毒载体(如反转录病毒)实现转染。所述病毒可以是兼向性病毒。一旦细胞被转染，则它们可以在转移到ESC培养基前在饲养细胞上生长。
iPS细胞可以来源于任何适合的细胞类型，其包括肺、包皮成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、角化细胞、血液祖细胞、骨髓细胞、肝细胞、胃上皮细胞、胰腺细胞、神经干细胞、B淋巴细胞、ES来源的体细胞和胚胎成纤维细胞。在一些情况下，所述细胞不是人真皮成纤维细胞。IPSC可以表现出与ESC类似的基因表达模式和表型。诱导的多潜能干细胞的来源现在，已提供了用于分离多潜能干细胞但不导致胚胎破坏的几种方法，例如，通过转化(诱导)成熟体细胞或生殖细胞。这些方法包括I、通过核移植重编程。该技术包括将核从体细胞转移到卵母细胞或接合子中。在一些情况下，这可以导致产生动物-人杂交细胞。例如，可以通过人体细胞与动物卵母细胞或接合子的融合或者人卵母细胞或接合子与动物体细胞的融合来产生细胞。2、通过与胚胎干细胞融合重编程。该技术包括体细胞与胚胎干细胞的融合。该技术还可以导致产生动物-人杂交细胞，如以上I中所述。3、通过培养自发重编程。该技术包括在长期培养后从非多潜能细胞产生多潜能细胞。例如，已通过原生殖细胞(PGC)的长期培养产生了多潜能胚胎生殖(EG)细胞(Matsui 等人，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murineprimordial germ cells in culture. Cell 70，841-847，1992,其作为参考并入本文)。还已报道了在骨髓来源细胞的延长培养后多潜能干细胞的发育(Jiang等人，Pluripotency ofmesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418，41-49，2002,其作为参考并入本文)。他们将这些细胞表示为多能成熟祖细胞(MAPC)。Shinohara等人还表明在来自幼鼠精巢的种系干细胞(GS)的培养过程中可以产生多潜能干细胞，他们将这些细胞称为多能种系干细胞(mGS) (Kanatsu-Shinohara 等人，Generation of pluripotent stemcells from neonatal mouse testis. Cell 119，1001-1012，2004)。4、通过限定因子重编程。例如，通过向小鼠胚胎或成熟成纤维细胞通过反转录病毒介导引入转录因子(如0ct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4)产生了 iPS细胞，例如，如上所述。Kaji 等人(Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision ofreprogramming factors. Nature. 2009年3月I日在线发表)还说明了单个多能表达载体的非病毒转染，其包含可以使小鼠和人成纤维细胞重编程的与2A肽连接的C-MyC、Klf4、0Ct4和Sox2编码序列。通过该非病毒载体产生的iPS细胞显示出多潜能标志物的稳健表达，这表明了通过体外分化测定在功能上确认的重编程状态和成熟嵌合小鼠的形成。它们成功地从胚胎成纤维细胞建立了稳健表达多潜能标志物的重编程人细胞系。Shinya Yamanaka 在 Strategies and New Developments in the Generationof Patient-Specific Pluripotent Stem Cells (Cell Stem Cell I,2007 年 7月，a2007Elsevier Inc)中说明并讨论了方法1_4,该参考文献作为参考并入本文。5、从单个卵裂球或活检的卵裂球获得hESC系。参见Klimanskaya I, Chung Y，Becker S，Lu SJj Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from singleblastomeres. Nature 2006;444:512 ；Lei 等人，Xeno-free derivation and cultureof human embryonic stem cells:current status, problems and challenges.Cell Research(2007) 17:682-688 ；Chung Y，Klimanskaya I,BeckerS 等人，Embryonicand extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres.Nature. 2006;439:216-219 ；Klimanskaya I，Chung Y，Becker S 等人，Human embryonicstem cell lines derived from single blastomeres. Nature. 2006;444:481-485 ；Chung Y，Klimanskaya I，Becker S 等人，Human embryonic stem cell lines generated withoutembryo destruction. Cell Stem Cell. 2008; 2:113-117 和 Dusko Ilic 等人(Derivationof human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feederswith a minimal exposure to xenomaterials. Stem Cells And Development-paper inpre-publication)，所有参考文献作为参考并入本文。6、从停止分裂并且不能体外发育成桑椹胚和囊胚泡的停育胚胎获得hESC系。参见 Zhang X，Stojkovic P, Przyborski S 等人，Derivation of human embryonic stemcells from developing and arrested embryos. Stem Cells 2006;24:2669-2676 和 Lei等人，Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: currentstatus, problems and challenges. Cell Research (2007) 17:682-688，以上两篇参考文献作为参考并入本文。7、单性生殖(或单性生殖)。该技术包括非受精卵的化学或电学剌激以导致它发育成可以从中获得胚胎干细胞的卵裂球。例如，参见Lin等人，Multilineagepotential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes.StemCells. 2003:21 (2) :152-61,他们使用非受精的中期II期卵母细胞的化学激活来产生干细胞。8、胎儿来源的干细胞。就潜能性而言，这些细胞处于胚胎和成熟干细胞之间，并且可以用于获得多潜能或多能细胞。Chris H. Jo等人(Fetal mesenchymal stem cellsderived from human umbilical cord sustain primitive characteristics duringextensive expansion. Cell Tissue Res (2008) 334:423-433，其作为参考并入本文)已成功获得了表达具有多潜能性的标志物(包括Nanog、Oct-4、Sox_2、Rex-U SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-l_81，通过β _半乳糖苷酶染色以及末端酶活力的一致表达显示了衰老的基本证据)的人脐带来源的胎儿间充质干细胞(UC fMSC)o Winston Costa Pereira等人(Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cellsfrom human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation JTissue Eng Regen Med 2008; 2:394-399，其作为参考并入本文)从人脐带的华顿氏胶质中分离了纯间充质干细胞群体。还在Troyer & Weiss (Concise Review:ffharton ' sJelIy-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population. Stem Cells2008:26:591-599)中综述了来源于华顿氏胶质的间充质干细胞。Kim等人(Ex vivocharacteristics of human amniotic membrane-derived stem cells.Cloning StemCells 2007ffinter;9(4) :581-94，其作为参考并入本文)成功地从人羊膜中分离了人羊膜来源的间充质细胞。脐带是通常丢弃的组织并且来源于该组织的干细胞往往不会引起道德和伦理争议。诱导的多潜能干细胞具有以下优势可以通过不导致胚胎破坏的方法获得它们，更具体地，可以通过不导致人或哺乳动物胚胎破坏的方法获得它们。照此，可以通过使用并非专门通过必须包括破坏而从中获得那些细胞的人或动物胚胎的方法所制备的细胞来实施或实践本发明的方面。具体地，该可选的限制应考虑欧洲专利局扩大复审委员会2008年11月25日的决定G0002/06。间充质干细胞间充质干细胞以多能性著称并且表现出分化成不同细胞/组织系(包括软骨、骨、脂肪组织、腱和韧带)的潜能。这些多能间充质祖细胞被称为基质或间充质干细胞。骨髓含有两种主要细胞类型造血细胞和基质细胞。用于非造血组织的干细胞被称为间充质细胞，这是由于它们分化为间充质或基质细胞的能力。因此，在本说明书中，间充质干细胞(MSC)是指能够分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和内皮的多能干细胞。在本说明书中，MSC具体是指能够分化为作为骨形成过程中的一部分的成骨细胞的多能干细胞。通过微创技术能够容易地从骨髓获得间充质细胞并且可以将其在培养中扩增并允许分化成所需的系。可以通过应用特异生长因子来诱导分化。如骨形态发生蛋白(BMP)的转化生长因子β (TGF-β)超家族成员蛋白是间充质干细胞软骨形成和成骨分化的重要因子。适合的MSC可以得自或来源于从骨髓吸取物中采集的骨髓单核细胞(BMMNC)(例如，Wexler 等人，Adult bone marrow is a rich source of humanmesenchymal “stem，，cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121(2):368-374, 2003年4月)或脐带的华顿氏胶质(例如，Ta等人，Long-term Expansion and PluripotentMarker Array Analysis of Wharton' s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells. StemCells Dev. 2009 年 7 月 20 日(Epub))。可以通过在成骨培养基中的培养实现MSC向成骨系的分化。例如，将MSC以3000/cm2接种到6孔、12孔和腔室玻片中的维持培养基(DMEM、lg/l葡萄糖、10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50U/ml链霉素)中并保持24小时，然后更换为成骨培养基(维持培养基、IOnM地塞米松、25 μ g/ml抗坏血酸和IOmM β-甘油磷酸酯)。然后，将细胞维持多至28天，其中每3-4天更换一次培养基。14天后，可以在4%PFA中固定腔室玻片中的细胞并在4°C在PBS中储存以用于免疫组织化学。在14和28天后，以用于钙的茜素红S和用于磷酸钙的冯科萨氏染剂对细胞染色。还可以根据生产商的说明书使用Nucleospin RNA提取试剂盒(Macherey Nagel)提取RNA以用于分析,并且可以提取蛋白质样品以用于分析。可以通过在生脂培养基中的培养实现MSC向生脂系的分化。例如，将MSC以18000/cm2接种到维持培养基中并如上所述培育2天。除去培养基并在加入生脂维持培养基(DMEM、4. 5g/l葡萄糖、10%FCS、L-谷氨酰胺和青霉素和链霉素)或生脂培养基(生脂维持培养基，其具有10 y g/ml胰岛素、115 ii g/ml甲基-异丁基黄嘌呤、I U M地塞米松和20 y M吲哚美辛)前用PBS将细胞清洗一次。然后，将细胞维持多至28天，其中每3-4天更换一次培养基。在14和28天后，可以用油红0对细胞染色以染色脂类小滴。还可以提取RNA和蛋白质用于分析。可以通过在软骨形成培养基中的培养实现MSC向软骨形成系的分化。例如，对MSC计数并以5 X IO5个细胞/ml在添加或未添加10ng/mlTGF □ 3 (Cambrex)的软骨形成培养基(具有Cambrex软骨形成单一等分部分的DMEM)中再悬浮，然后将500ml等分部分置于15ml管中，随后以150 Xg在室温下离心10分钟并在37°C培育2天。两天后，管中将 含有松散的圆形小粒。将小粒维持21天，其中每3-4天更换一次培养基，然后使用Trizol(Invitrogen)分离RNA或者在4%PFA中固定细胞小粒并包埋以用于低温切片。在将玻片在-80°C储存以用于免疫组织化学之前进行连续切片。当在汇合条件下研究成骨和生脂分化时，可以以30000/cm2接种细胞并允许在转到相关分化培养基前达到汇合并如上所述进行培养。干细胞的培养可以使用任何适合的干细胞培养方法并且可以使用任何适合的容器使干细胞增殖。适合的容器包括在美国专利公开US2007/0264713 (Terstegge)中所述的那些。例如，容器可以包括生物反应器和旋转器。“生物反应器”是适合于(如)大规模培养真核细胞(例如，动物细胞或哺乳动物细胞)的容器。调控的生物反应器的典型培养体积在20ml至500ml之间。生物反应器可以包括调控的生物反应器，其中可以控制或监测一种或多种条件，例如，氧分压。用于测量和调控这些条件的设备在本领域中是已知的。例如，氧电极可以用于氧分压。可以通过所选气体混合物(例如，空气或者空气和/或氧和/或氮和/或二氧化碳的混合物)的量和组成来调控氧分压。Bailey, J E. (Bailey, J E.，生物化学工程基石出(Biochemical Engineering Fundamentals),第二版，McGraw-Hill, Inc.ISBN 0-07-003212-2Higher Education, (1986))或 Jackson A T. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993))说明了适合用于测量和调控氧分压的设备。其它适合的容器包括旋转器。旋转器是调控或未调控的生物反应器，其可以使用多种搅拌机构进行搅拌，如玻璃珠搅拌器、叶轮搅拌器及其它适合的搅拌器。旋转器的培养体积通常在20ml至500ml之间。滚瓶是由塑料或玻璃制成的圆形细胞培养瓶，其具有400至2000cm2的培养面积。沿着这些烧瓶的整个内表面培养细胞；通过“滚动”运动(即，围绕它们自身各自的轴转动瓶)完成了培养基对细胞的涂覆。作为另外一种选择，培养可以是静态的，即不使用培养/培养基主动搅拌的情况。通过减少对培养的搅拌，可以允许形成细胞聚集体。虽然可以使用一些搅拌来促进培养基相对于培养细胞的分布和流动，但是可以应用这种搅拌从而基本上不破坏聚集体形成。例如，可以使用低rpm搅拌,例如，小于30rpm或小于20rpm。传代增葙细胞培养方法可以包括培养期间的传代或分种。这些方法可以包括连续或持续传代。可以将培养中的细胞从基底或烧瓶中分离，并通过在组织培养基中稀释并重新铺板/重新培养来“分种”、继代或传代。术语“传代” 一般可以是指取出细胞培养等份，完全或部分分离细胞，稀释并接种到培养基中的过程。可以重复传代一次或多次。所述等份可以包含细胞培养的全部或部分。所述等份中的细胞可以是完全、部分或未汇合的。传代可以包括下列步骤顺序中的至少一些吸取、清洗、胰酶消化、培育、移去、抑制、再接种和等分。可以使用Hedrick Lab, UC SanDiego 所发表的规程(http: //hedricklab. ucsd. edu/Protocol/COSCell. html )。 可以通过任何适合的方式分离细胞，如在本领域中已知的机械或酶促方式。可以通过机械分离打散细胞，例如，使用细胞刮刀或移液管。可以通过用适合的筛网尺寸进行筛分来分离细胞，如通过100微米或500微米筛网。可以通过酶促分离来使细胞分开，例如，通过用收获的胶原酶或trypLE处理。所述分离可以是完全的或部分的。所述稀释可以是任何适合的稀释。细胞培养中的细胞可以以任何适合的比例分种。例如,细胞可以以I :2或以上、I :3或以上、I :4或以上或者I :5或以上的比例分种。因此，干细胞可以传代I次或以上。例如，干细胞可以传代2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25次或以上。传代可以表示为细胞生长的代。干细胞可以增殖 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代或以上。干细胞可以增殖至细胞倍增1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25 次或以上。共培养和饲养细胞方法可以包括在存在或不存在共培养的情况下培养干细胞。术语“共培养”是指在一起生长的两种或更多种不同种类的细胞的混合物。所述两种或更多种不同种类的细胞可以生长在相同表面(如颗粒或细胞容器表面)上或生长在不同表面上。不同种类的细胞可以生长在不同的颗粒上。饲养细胞可以表示不同类型细胞的培养所使用或所需要的细胞。在干细胞培养的背景下，饲养细胞具有保证存活、繁殖和维持细胞多潜能性或多能性的功能。可以通过直接共培养饲养细胞来确保多潜能性/多能性。例如，可以用饲养细胞层涂覆如培养皿的容器的内表面。饲养细胞向培养基中释放营养物。作为另外一种选择或另外，可以在培养基中培养饲养细胞以对培养基进行调节。所述条件培养基可以用于培养干细胞。因此，其中不存在或不需要饲养细胞的安排也是有可能的。除该组合明显不允许或者明确应避免以外，本发明包括所述方面和优选特征的组
口 ο本文所使用的章节标题仅是出于组织结构的目的，而不应视作对所述主题内容的限制。现在，将通过举例说明并参考附图对本发明的方面和实施方式进行说明。其它方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中所提到的所有文档均将作为参考并入本文。


现在，将参考附图对说明本发明原理的实施方式和实验进行讨论，其中图1.HS-2 提高了内源 FGF2。如通过 FGF2ELISA 所测量的，在 HS-2 (160ng/ml)中生长的人MSC (hMSC)所产生的内源FGF2水平比未给予HS-2的(基础)细胞更高。给予FGF2 (5ng/ml)的细胞也产生了 FGF2，但是与在HS-2中生长的细胞相比水平较低。给予HS-2和FGF2的组合的细胞产生了甚至更多的FGF2。图2. HS-2扩增的人MSC加速了骨愈合。(A)显示不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物骨折后3周时骨再生的二维X射线和三维显微CT图像的显微照片。(B)显示不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物骨折后3周时骨折位点处百分比骨体积的图。 图3. HS-2扩增的人MSC加速了骨愈合。(A)显示不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物骨折后7周时骨再生的二维X射线和三维显微CT图像的显微照片。(B)显示不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物骨折后7周时骨折位点处百分比骨体积的图。图4.冯科萨氏染色树脂组织学。显示不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物骨折后3周和7周时骨折位点处冯科萨氏染色的显微照片。黑色染色(冯科萨氏阳性)标记了钙化骨的区域。与对照和未处理的动物相比，用HS-2扩增细胞处理的动物提高了骨形成。图5.红色纳米点的存在表明移植的HS-2MSC在移植后存活多至7周，而对照MSC仅可以在3周时发现。蓝色(DAPI)对所有细胞染色，包括移植和宿主细胞。图6. HS2扩增的人MSC的存活。(左侧)对照(上)或HS_2处理的动物(下)7周时股骨的代表性组织切片。NB :新骨，BM :骨髓，SC :支架，HC :肥大软骨细胞，P :支架的孔，和0B:骨钙素阳性成骨细胞。括号描绘了缺损末端。(右侧)代表性DAPI染色的股骨低温切片，以显示缺损中存活的hMSC。DAPl将细胞核染成蓝色，而将用QTracker 预标记的hMSC染成荧光红色。将抗人核抗原的抗体用于确认植入的干细胞的存在，其在HS-2处理后特别显著。图7.显示不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物移植后7周时血管的血管性血友病因子(vWF)染色的显微照片。HS-2MSC治疗的骨折中对vWF染色的增强表明与对照MSC相比，HS2扩增的hMSC引起了较大程度的血管形成。图8.扭转生物力学。(A)显示通常骨的抗扭刚度的图。(B)不给予细胞、给予对照hMSC和HS-2扩增的hMSC的动物骨折后移植后的7周时的骨扭矩强度。给予HS-2MSC的动物中的扭矩强度显著大于不给予细胞或给予对照hMSC的动物中的扭矩强度。图9.来自ElO神经上皮的细胞外HS2的预估凡的总结。在多种处理后，在
IX 120cm的Sepharose CL-6B柱上对HS的来源进行分离。在弱碱处理前后确定纯化的全长HS的尺寸以确定每个蛋白质芯中不止一条链的存在。另外，通过从Bio-Gel P-IO柱分离未分辨的大寡糖并将它们在Sepharose CL-6B柱上再次运行来确定肝素酶敏感的二糖之间的大致距离。
图10. HS-2中对低pH值HNO2、乙酰肝素酶和肝素酶敏感的化学键的比例。用低pH值HNO2、肝素酶或乙酰肝素酶处理放射性标记的硫酸乙酰肝素2并在Bio-Gel P-IO柱上分离。通过2An/n在两个独立的实验中确定了对处理敏感的总化学键的百分比，其中An是该色谱峰中总放射性的百分比，而n是通过洗脱位置确定的寡糖中二糖重复单元的数目(Turnbull 和 Gallagher, 1990 ；Kato 等人,1994)。图11.来自ElO神经上皮的硫酸乙酰肝素的亚硝酸来源的二糖组成。用低pH值HNO2通过脱氨基裂解使放射性标记的HS-2解聚。在GAG的HNO2处理后分离二糖，然后将样品在I X 120cm的Bio-Gel P-2柱上运行。通过SAX-HPLC分离所得的二糖。对色谱峰下的面积积分以获得每种样品中二糖的组成和随后的百分比组成。图12.通过SAX-HPLC分离来自HNO2处理的HS-2的四糖。最初，在Bio-Gel P-2柱上分离来源于HNO2处理的硫酸乙酰肝素的四糖，然后在SAX-HPLC上进一步分离。通过计算每个峰中的放射性并将其与所有合并的峰中的总放射性相比来确定每个的百分比。左列中四糖峰的数目对应于得自SAX-HPLC的峰。通过将这些氚化样品与通过在相同条件下在相同色谱柱上运行的双35S/3H放射性标记的样品(得自Gordon Jayson博士, Universityof Manchester)所产生的峰相比,确定了硫酸化程度。 图13.肝素裂合酶处理后，来自ElO神经上皮的硫酸乙酰肝素的二糖组成。使用乙酰肝素裂合酶的混合物使硫酸乙酰肝素2完全解聚。在P-2柱上分离所得的不饱和二糖并通过强阴离子交换柱色谱法分离。对每条所得曲线下的面积积分以计算每种样品中每种二糖的百分比。数字表示两次运行(对于最初的GAG样品)和三次运行(对于2. 3D来源的样品)的平均值。从每种样品中回收了 97%以上的二糖。图14.来自图13中所示的HS-2混合物的二糖的硫酸化特征。图15.对HS-2的短期暴露提高了 hMSC的增殖。(A)暴露于提高的HS-2剂量的细胞的增殖；随后使用了 160ng/ml。测定重复三次。(B)在对照(上方)和含有HS-2的培养基(下方)中培养的细胞的相差显微照片，标尺=200 iim。(C)暴露于HS-28天后，通过膜联蛋白和AAD-7染色使用GUAVA软件所测量的活力水平。(D)在血清剥夺后，在短期暴露于对照或HS-2期间BrdU的掺入。(E)当在HS-2中培养3天时，处于细胞周期的S/G2/M期的细胞的比例。对照(黑色圆圈)和HS-2 (空心圆圈)。误差线代表标准偏差，n=3。(F)暴露于添加(灰色柱)或未添加外源HS-2 (空心柱)的提高的FCS浓度的hMSC的WST-I代谢测定。实验重复二次。图16.暴露于HS-2提高了从骨髓吸出物中对CFU-F hMSC的回收并刺激了 STR0-1阳性亚群的扩增。(A)如通过FACS所建立的早期hMSC的免疫表型。(B)对于作为STRO-I+或(C) STRO-1+胃的分选细胞的比例，扩增并定量了早期hMSC。对照用白色柱表示，而HS-2用灰色柱表示。对于B和C，误差线表示SD，n=3。(D)将低传代MSC置于对照培养基(黑色圆圈)或HS-2 (空心圆圈)中并且通过FACS对STR0-1阳性细胞的比例监测10次群体倍增。(E)细胞倍增10次后，我们对细胞进行集落效率测定。黑色柱表示HS-2中扩增的细胞，而空心柱表示对照培养基中扩增的细胞。误差线代表SD，n=3。图17. HS-2的存在在hMSC的大规模扩增期间富集了具有更长端粒的更原态的干细胞亚群。(A)将人MSC在对照或HS-2培养基中扩增45天并且将单个细胞所产生的细胞累积数目和群体倍增对时间作图。(B)在对照或HS-2中扩增至群体倍增15次的hMSC的平均端粒长度。将数值归一化为初始原代hMSC培养中端粒的长度。(C)来自3个不同人供体的细胞在对照或含有HS-2的培养基中扩增40天的培养中表面标志物的表达。星号表示O. 0001 (***)或O. 005 (**)水平的显著性。(D-F)如A中，在对照(白色柱)或HS-2 (灰色柱)培养基中扩增38天的hMSC的分化潜能。然后，扩增的细胞在生脂(D)、成骨(E)或软骨形成培养基(F)中分化28天。通过油红O染色(标尺=Imm)并且使用定量PCR对CCAAT/增强子结合蛋白_a(C/EBPa)和脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)测量了脂肪形成；通过碱性磷酸酶、茜素红(标尺=Imm)以及定量PCR对碱性磷酸酶(ALP)和骨涎蛋白2 (BSPII)测量了骨生成；通过H&E和阿辛蓝染色(标尺=500 μ m)以及定量PCR对胶原2al (Coll2a)和SOX9测量了软骨形成。图18. HS-2扩增了能够克隆并经历多向分化的hMSC。(A)在HS-2或对照培养基中扩增的细胞的单细胞集落形成。在96孔板中的HS-2或对照培养基中扩增13次H)的细胞的克隆频率。误差线代表标准偏差，n=3。(B)从在对照或HS-2培养基中扩增13次 H)的培养中获得的代表性克隆的多向分化测定。自上而下来自生脂培养的含脂肪细胞的相差显微照片，矿化的成骨培养的茜素红染色，软骨形成培养的H&E和阿辛蓝染色。(标尺=200 μm)图19. HS-2保护hMSC培养抵抗干细胞基因表达在时间上的损失。(A)通过化学发光GEArray (干细胞SuperArray#HS601. 2)所测量的维持在对照培养基或HS-2中的hMSC的基因表达的分层聚类分析。(B)干细胞相关基因表达的奇异值分解分析。将数据进行对数转化并且对芯片间变化(cross-chip variation)进行修正。在HS-2 (空心圆圈)中生长较长时间段的MSC与在对照培养基(实心圆圈)中生长较短时间的MSC聚类。(C)列出了显著调控的基因。图20.在HS-2中培养的hMSC保留了它们的免疫调节能力并且提高了体内骨形成。(A)在对照(ctrl)或HS-2补充培养基中培养21天的hMSC的免疫调节活性。在另外24h后，将来自两个不同供体的刺激性和反应性PBMC的混合物以不同的hMSC =PBMC的比值加入至孔中，然后在6天后通过FACS评价⑶3+Ki67+细胞的表达。阳性对照表示在不存在hMSC的情况下获得的CD3+Ki67+细胞的最大个数。对每次实验重复读数两次并且图中为两次独立实验的平均值土SD。(B)用HS-2扩增的hMSC (HS-2)和对照培养基(Ctrl)处理的股骨在3和7周时的代表性μ -CT图像。(C)如通过CTan软件所确定的3周和7周时的百分比骨体积。将结果表示为平均值土SD，对于每个处理组的每个时间点，n=6。(D)如B中所处理的股骨的代表性DAPI染色的低温切片，以显示缺损中存活的hMSC。DAPI将细胞核染成蓝色，而将用QTracker 预标记的hMSC染成荧光红色。(E)如B中所处理的股骨在7周时的代表性组织切片。NB :新骨，BM :骨髓，SC :支架，HC :肥大软骨细胞，P :支架的孔，和OB :骨钙素阳性成骨细胞。箭头描绘了缺损末端。图21.暴露于HS-2提高了从骨髓吸出物中对CFU-F hMSC的回收并刺激了 STR0-1阳性亚群的扩增。(A)从对照或含有HS-2的培养基中的3个不同骨髓单核细胞供体批次回收原代CFU-F hMSC和(B)对照和含有HS-2的培养基中I :15稀释的培养中的集落数目。用单个(p〈0. 05，t检验)或三个星号(p〈0. 0001,t检验)标记了对照和HS-2组之间的显著差异。(C)对照或含有HS-2的培养基中回收的CFU-F hMSC中的表面标志物表达的代表性实例。(D-F)三种不同hMSC的混合物的细胞累积数目的增加。以5000个细胞/cm2将低传代hMSC铺板并在添加或未添加160ng/ml HS-2的培养基中培养至亚汇合，在此之上对细胞胰蛋白酶化、计数并以5000个细胞/cm2重新接种到相应培养基中。将这重复2周的一段时间。数目以从一个细胞开始的细胞数目累积增加。(G)另外6天后，对照(绿色)或含有HS-2的培养基(蓝色)中回收的CFU-F hMSC的STRO-I表达谱的FACS分析。用红线表示同型对照。对照用白色柱表示，而HS-2用灰色柱表示。对于H和I，误差线表示SD，n=3。(J)将低传代MSC置于对照培养基(黑色圆圈)或HS-2 (空心圆圈)中并且通过FACS对STR0-1阳性细胞的比例监测10次群体倍增。图22.用于hMSC中端粒长度的相对定量的标准曲线。对来自人胚胎干细胞系BGOlV (ATCC)的汇合层的染色体DNA定量。通过RQ-PCR重复三次分析BGOlV cDNA的连续稀释的36B4 (,)和端粒重复( )的扩增，并且将cDNA的量作为平均Ct的函数作图。通过Excel计算图中所示的趋势线的公式并用于估计HS-2或对照培养基中扩增的hMSC中36B4和端粒重复的表达。图23. FGF2而不是HS-2的存在降低了 hMSC的生脂分化。汇合时，将hMSC更换至维持(对照；▲)或者补充或未补充(分化对照；《)160ng/mlHS-2(T)* 10ng/ml FGF2 (■)的 生脂培养基。将细胞培养32天，其中每周更换两次培养基。(A)四种分化条件中的细胞的相差显微照片(X200放大)。具有或不具有补充剂的维持培养基中的细胞不能积累脂肪。(B)每次更换培养基时的脂连素ELISA。收集样品，在_80°C储存并根据生产商的说明书使用脂连素ELISA试剂盒(Otsuka pharmaceutical)重复分析三次。与FGF-2相比，HS对脂连素水平无不利影响，这极大地抑制了其在所有时间点的表达。图24. FGF2而不是HS_2的存在降低了 hMSC的成骨分化。汇合时，将培养基更换为维持或补充或未补充(CTRL)160ng/ml HS-2或10ng/mlFGF2的成骨培养基。将细胞培养21天，其中每周更换两次培养基。16天后，将在补充了 FGF2的成骨培养基中培养的细胞从板中剥离。(A)14和21天后，四种分化条件中的细胞的相差显微照片(X200放大)。(B)如通过茜素红染色所确定的，在14和21天后hMSC的矿化。维持培养基中的细胞无法矿化。图25.用于定量PCR的Taqman引物/探针的列表。图26.局部加权平滑处理后的MA图。仅将Ctrl-d32的数据相对于Ctrl_d21的数据作图。对强度进行对数转化和中值缩放(median scaled)。用蓝色表示平滑处理前的数据，而用红色表示拟合值。图27.局部加权平滑处理后的数据图。如补充图26，对数据添加颜色。图28.通过角度选择所鉴别的基因列表。基于相对于原点的它们的加载物所对的角以及大于由2条最大差异轴所限定的投影空间上的90%的欧氏距离(欧几里德距离，Euclidean distance),分选基因。提供了 Unigene 号、Genbank RefSeq 号、基因符号和说明。图29.基于奇异向量系数的基因选择。系数的过滤是基于从原点(黑色十字)开始的欧氏距离的90%的。聚类表示相对于X轴每个聚类的基因所对的角。它们标为蓝色(群I)、红色(群2)和绿色(群3)并用椭圆圈起来。基因如图28中编号。图30.在对照、含有HS-2的培养基中培养21天后，基于所鉴别的生物标志物的三种hMSC患者混合物的投影。对照(红色圆圈)不同于HS (绿色圆圈)。(混合物I、2和3，分别为 hMSCU2 和 3 (图 23))。
图31.样品投影得分之间的自举欧氏距离。分布是大致正态的(中值距离在上下四分位数的中心)。虚线表示位于上下四分位数的四分位数间距离的相邻值。仅显示了相对于Ctrl-d21的比较。相对于对照距离，随后传代的HS距离基本不重叠。图32.自举统计表。a欧氏距离的估计值是基于前两个奇异向量的。bCL下限和cCL上限提供了在1000个自举重复内估计的95%的置信界限。
具体实施例方式通过举例，在以下所附说明中说明了本发明的一个或多个实施方式的细节，包括本发明人对实施本发明所考虑的最佳方式的具体细节。对本领域技术人员来说显而易见的是可以不限制于这些具体细节而实践本发明。 实施例I方法人MSC分离和细胞培养在37°C下在加湿的5%C02培育箱中，将人间充质干细胞(hMSC) (PT-2501 ；Lonza)维持在补充了 10%胎牛血清(FBS)、0. 1%青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM，1000mg/l葡萄糖中。以三天间隔更换培养基，并且每4-5天继代培养细胞(约80%汇合)；将来自2-5代的等分部分在液氮中冷冻备用。来自三位健康供体的未处理的原代人骨髓(#1M-125)购自Lonza并对其进行聚蔗糖(Ficoll)梯度分离以分离hMSC和消除不希望的细胞类型。然后，将细胞铺板并如先前所报告地培养{Rider，2008#85}。hMSC免疫表型的鉴定实施流式细胞分析以比较HS-2扩增和对照扩增的hMSC对CD49a、CD73 (BDBioscience)>CD 105 (eBioscience)和 STR0-1 (R&D Systems)的谱，或与如先前所报道的同型对比对照{Rider, 2008#85}进行比较。使用Guava PCA-96台式流式细胞仪和GuavaExpress 软件(Millipore)分析样品。集落形成单位-成纤维细胞在存在或不存在HS-2补充剂的情况下测定集落效率。如前所述{Rider, 2008#85}，将骨髓单核细胞(3X 105/cm2)或hMSC (30个细胞/cm2)在24孔板中重复铺板3次，并培养14天。对具有不与其它集落接触的超过50个细胞的集落进行计数。增殖和凋亡测定按照生产商的说明书在GUAVA PCA-96台式流式细胞仪(Millipore)上分析细胞数、细胞周期动力学(碘化丙啶)和细胞凋亡(膜联蛋白V)。根据生产商的建议(Roche)通过将细胞与WST-I培育来确定增殖相关代谢活性。将人MSC (3. 3X IO3)在96孔板中在添加HS-2的培养基或维持培养基中铺板并培养持续不同的时间点。对于BrdU测定，在加入添加或未添加HS-2的培养基之前，使细胞(2. I X IO5个细胞/cm2)在96孔板中附着(2h)，然后血清饥饿(O. 2%FBS)。按照生产商的说明书使用细胞增殖ELISA试剂盒(Roche)测量BrdU掺入。为了确定HS-2补充对累积细胞数(长期生长)的影响，将hMSC以5X103个细胞/cm2铺板并培养至85%汇合,用胰蛋白酶/EDTA剥离,计数(Guava Express软件),然后以5X IO3个细胞/cm2重新铺板。将该过程重复45天，其中每周更换两次培养基。端粒长度
在不同的时间点，从在存在或不存在HS-2的情况下扩增的细胞中分离染色体DNA。在 PBS 中清洗细胞并在 37°C下在缓冲液(IOmM Tris, pH 7. 5, IOmM EDTA, IOmM NaCl,1%SDS 0.05mg/ml并且不含核糖核酸酶A-脱氧核糖核酸酶)中细胞溶解过夜。将蛋白酶K (lmg/ml)加入至溶胞产物，并将其在37°C培育5h。用2体积纯乙醇和250mM NaCl沉淀DNA。在70%乙醇中清洗沉淀物，干燥并在H2O中再悬浮。将DNA定量并且如先前所报道的{Cawthon, 2002#39 ；Guillot, 2007#40 ；Cawthon, 2002#39 ；Guillot, 2007#40}，通过 RQ-PCR将12. 5ng用于36B4基因和端粒重复的扩增，该实验重复三次。根据由从人胚胎干细胞系BGOlV (Invitrogen)分离的染色体DNA所制备的标准曲线(Ct相对于log量)估计端粒重复和36B4的相对表达(图22)。干细胞微阵列在培养指定天数后，从对照和HS-2培养中纯化了总RNA。将重复三次(triplicate)的标记RNA样品混合(I 1 :1)并用作化学发光cDNA阵列上的探针(GEArrayS 系列人干细胞基因阵列，SuperArray Bioscience Corporation, Frederick, MD)。将该程 序对每组重复3次，总计每组3个重复三次的混合样品。使用Chemi-Smart 3000图像采集系统(Vilber Lourmat, Cedex, France)分析阵列。为了更全面地描述HS-2对hMSC基因表达测量的时间过程影响，我们基于使用奇异值分解(SVD)和主成分分析(PCA)对我们的微阵列的分析重建了遗传网络{Ghosh, 2002#147}。在(以下的)补充方法中描述了基于SVD投影的特征(signature，标记)的构造。先前已表明PCA足够灵敏从而能够使用其基因表达特征{Bild, 2006#34}和外切蛋白酶活性{Villanueva, 2006#41}来区分瘤的亚类。通过 DAVID 生物信息学资源 6. 7 (http: //david. abcc. ncifcrf. rov/) {Huang da, 2009#178 ；Dennis, 2003#184}和所产生的图形热图(http://api. imapbuilder.net/editor/)对基因表达中的折叠变化进行计算和数据分层聚类。免疫调节将在对照或含有HS-2的培养基中扩增21天的人MSC以I X IO5个细胞/孔接种到96孔板中。如先前所报道的{Rai, 2010#155}，在24小时后以不同的hMSC =PBMC的比值将来自两个不同供体的刺激性和反应性PBMC的混合物加入到孔中，并且将细胞培育6天，然后通过FACS评价⑶3+Ki67+细胞的表达。多向分化如前所述{Rai，2010#155 ；Rider, 2008#85}，在HS-2或对照培养基中将人MSC连续传代7代，然后在胰蛋白酶/EDTA中剥离并重新接种以比较在不存在HS-2的情况下用成骨、生脂或软骨形成补充剂刺激时它们沉积骨状基质、形成脂类小滴或分泌糖胺聚糖的能力。如前所述{Oest, 2007#49 ；Rai, 2010#155 ；Rai, 2007#48 ；Rider, 2008#85}，在相比较的培养中分离了总RNA并且确定了 mRNA转录本关于成骨、生脂和软骨形成生物标志物的水平(图25)。还对在HS-2或对照培养基中扩增的hMSC进行了 13次群体倍增的克隆测定。使用FACSAria(BD Bioscience)将单个细胞接种到96孔板中并在存在或不存在HS_2的情况下培养14天，并且如上所述评价了集落形成效率。从相比较的孔中，克隆的hMSC在存在或不存在HS-2的情况下连续传代并且如上所述再次评价了它们的多向潜能(miltilineagepotential)。体内骨形成
如前所述{Rai, 2004#46}，将含有hMSC :HS_2或对照扩增的hMSC (IXlO6个细胞；传代4次)的复合材料支架加载到聚(e -己内酯)_磷酸三钙(PCL-TCP)复合材料支架{Hutmacher, 2000#44 ；Hutmacher, 2001#45 ；Rai, #46 ；Rai,2005#47 ；Rai,2010#155}(Osteopore International)上，并置于24孔培养板中，与纤维蛋白Tisseel密封剂(Tisseel kit, Immuno, Austria)以3 :1的比例混合。细胞接种后，将Iml新鲜培养基加入到每个孔中，并且在移植前将细胞在加湿的气氛中在37°C和5%C02下培育过夜。大鼠股骨缺损模型为了确定HS-2扩增的hMSC对骨愈合的效力，将含有hMSC的复合材料支架植入到裸大鼠中的双侧股骨大段临界性(critical-sized)缺损中。按照所有适当的指导原则，使用18只雄性CBH/Rnu大鼠(重量220-260g)的研究规程经过了新加坡科技研究局实验动物保护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。如先前所建立的{Oest，2007#49 ；Rai, 2010#155 ；Rai, 2007#48}，实施所有手术程序。简要地，在通过近端后肢上的纵切使股骨暴露后，用常规模块固定板固定股骨并且用微型往复锯产生8mm双侧大段临界性缺损。每只大鼠在其中一个股骨缺损中接受hMSC接种的PCL-TCP支架，而对侧股骨缺损接受HS-2扩增的hMSC接种的PCL-TCP支架。在3周和7周安乐死后，收获样品并保存在10%的中性缓冲的福尔马林中以用于随后的二维放射照相 (每组n=6)、三维显微计算机断层扫描(y -CT)(每组n=6)、细胞存活分析(每组n=3)、组织学(每组n=3 )和免疫组织化学(每组n=3 )。石蜡组织学、细胞存活、二维放射照相和U -CT分析如先前所发表的{Rai，2010#155}，在手术后立即进行并且在3周和7周时再次进行股骨的石蜡组织学、细胞存活分析和成像。树脂组织学根据我们先前所建立的方法{Sawyer，2009#80}，对所选的股骨在甲基丙烯酸甲酯中进行未脱钙的树脂处理/包埋。将横截面切割为5 u m并用四铬染剂(MacNeal)/冯科萨氏染剂染色，并在Olympus Stereo (SZX12)显微镜下检查。免疫组织化学根据我们先前所建立的方法{Sawyer，2009#80}实施该程序。将组织切片与骨隹丐素的第一抗体(primary antibodies) (Abeam, Cambridge, UK)或相同浓度的小鼠IgG(Caltage Laboratories, Burlingame CA, USA ;作为阴性对照)一起培育。统计分析数据以至少三个独立实验(每个实验重复测量三次)的平均值土标准差表示。实施了双侧非配对t检验，并且用单个(p〈0. 05)、两个(p〈0. 005)或三个星号(p〈0. 0001)标记对照和HS-2组之间的显著性差异。结果HS-2提高了 hMSC生长并维持它们的活力我们先前已描述了对神经前体细胞具有有效生物活性的FGF-2结合HS (HS_2){Brickman, 1995#28 ；Nurcombe, 1993#29}。由于 FGF-2 是干细胞(包括 hMSC)有效的有丝分裂原，因此我们检查了 HS-2刺激hMSC扩增的生物活性。在该研究中，我们研究了 HS-2是否可以支持并加快hMSC的离体扩增以获得治疗数目的细胞而不损失多能性。此外，我们确定了当体内移植时，HS-2扩增的细胞是否能够提高骨形成。
典型(Pilot)实验显示HS-2提高细胞增殖的最佳剂量在ng/ml的范围内，其中160ng/ml获得了最大刺激活性(图23)，这与我们之前的研究一致{Dombrowski，2009#82}。160ng/ml的HS-2在6天的一段时间内将亚汇合hMSC的增殖提高了约65% (p〈0. 005)(图15A)，这与显微观察一致(图15B)。这种细胞数目的增加是由于细胞存活力的适度提高(数据未显示)和基于膜联蛋白V染色的细胞凋亡的降低(图15C)。为了区别HS-2对细胞周期动力学的影响与对增殖-静止过渡的影响，我们实施了血清剥夺实验(图MD和E)。在不存在/存在HS-2的情况下，用血清刺激血清剥夺静止细胞。在不存在/存在HS的情况下，血清刺激导致15h内进入S期，然而通过HS-2刺激，S期内的细胞数目要大得多(图15D)。类似地，在血清刺激后，HS-2提高了 G2/M细胞的量，而不是它们在时间上的表现(图15E)。因此，在血清刺激后，HS-2不影响通过Gl导致进入S期和G2的时间进展，而是影响从GO进入细胞周期的细胞数目。由于HS-2似乎影响G0/G1过渡，因此如通过监测增殖相关代谢活性的WST-1测定所测量的，我们考察了 HS-2是否可以改善FCS的增殖效力(图15F)。将FCS浓度逐渐从10%降低至1%导致增殖活性降低。然而，在存在HS-2的情况下，FCS的促有丝分裂活性显著得 到改善；例如，加入HS-2的2. 5%FCS的活性水平反映了无HS-2的7. 5%FCS的活性水平。此夕卜，与正常剂量的10%FCS相比，5%FCS或以上的活性水平在加入HS-2时均表现出更稳健的增殖活性。有趣地，HS-2的补充导致hMSC将大量FGF2释放到培养基中，从而表明了糖触发的自分泌环的形成/增强(数据未显示)。总体而言，这些结果表明HS-2通过刺激正常静止细胞群体进入细胞周期并保持它们的增殖来提高细胞数目。为了确定HS-2补充是否影响hMSC的免疫表型谱，我们实施了亚培养细胞的流式细胞分析。首先，我们建立了早期传代的hMSC的谱，并注意到了 CD73和CD105的高表达以及⑶49a和STR0-1的中度表达(图16A)。随后，将这些细胞在对照和HS-2补充培养基中进一步扩增并再次分析STR0-1表达(图16B和C)。HS-2处理导致显著更大的STR0-1表达，并且特别是STRO-1+胃群体。此外，在独立的实验中，我们在HS-2培养基中将低传代hMSC连续培养多至10次群体倍增(图16D)并且注意到STR0-1表达细胞比例的显著增加。这与维持在对照培养基中的细胞形成对比，对照培养基中表达STR0-1的细胞比例持续降低。该发现通过集落效率测定得到证实，其中在10次群体倍增后，与对照培养基中培养的细胞相比HS-2扩增的细胞所形成的集落多约50%(图16E)。总体而言，这些数据表明HS-2对随时间维持在培养中的STR0-1阳性群体具有显著影响。在HS-2中长期扩增的人MSC更易于增殖，并且还保持了它们的多能性由于HS-2对hMSC培养的生长具有有效的早期影响，因此我们接着设法确定了其长期影响。用于临床用途的hMSC的扩增通常需要将细胞培养多至一个月以达到治疗剂m (http: //osiris, com)。按照所建立的规程{Haynesworth, 1992#32 ；Jaiswal, 1997#33 ；Haynesworth, 1992#32 Jaiswal, 1997#33},我们在 HS-2 或对照培养基中扩增了 hMSC。仅21天后，补充HS-2的培养导致产生了比对照数量级更多的细胞(图17A)。为了确定HS-2补充对hMSC的长期影响，我们进行了检查端粒长度、CFU-F频率、免疫表型和多向分化潜能的一系列测定。在HS-2中扩增15次H)的细胞具有比在对照培养基中扩增的细胞显著更长的端粒(图17B)。值得注意的，如先前所报道的(数据未显示){Shi，2002#ll ；Simonsen, 2002#12}，不管培养处理，在这些细胞中不能检测到端粒酶活性。另外，重复传代与核型异常无关(数据未显示)。为了测试长时间暴露于HS-2是否会不利地影响hMSC表型，在至少15次后分析了表面标志物表达。在存在HS-2的情况下，STR0-1、⑶49a和⑶105的表达显著提高，而⑶73保持不变(图17C和D)，尽管存在HS-2的补充到这时获得了多13倍细胞的事实(图17A)。接着，我们使用组织学和PCR基方法的组合设法确定了在适当分化培养基中培养时这些细胞的生脂(图17E)、成骨(图17F)和软骨形成(图17G)潜能。值得注意的，HS-2扩增的细胞与对照相比具有类似的，或者在一些情况下具有提高的多能性。此外，这些细胞进入成骨或软骨形成系的能力是特别显著的。这些数据表明HS-2显著提高了具有较长端粒的高度多能(STR0-1表达)hMSC亚群的增殖。HS-2扩增的hMSC保留了 CFU-F并且在单细胞克隆后是多能的为了严格表明HS-2补充能够靶向真正的间充质干细胞的扩增而不是祖代的混合群体，我们评价了从先前在HS-2或对照培养基中扩增13次的hMSC中分离的单细胞克 隆的集落形成和多能性。将单细胞接种到96孔板中并培养2周。在HS-2中扩增的细胞(12%)比对照培养基中的细胞(7%)表现出更高的集落形成速率(图18A)。还通过生脂(月旨肪累积)、成骨(茜素红染色)和软骨形成(阿辛蓝染色)测定评价了相比较(parallel)集落的多向潜能(图18B)。这些数据进一步确认相对于扩增相同数的对照细胞，在存在HS-2的情况下扩增的hMSC保持了它们的多能性。HS-2中hMSC的扩增维持了它们的原态性最经常地，基于对组织培养塑料制品的粘附、免疫表型谱和多向测定{Dominici, 2006#185}以及体内骨形成{Shi, 2002#11}的评价报告了 hMSC干性的定性测量。我们还使用干细胞特异性阵列利用基因图谱(图19A)和主成分分析{Villanueva, 2006#41} (PCA ;图19B)来评价HS-2的影响。基于分层聚类的热图在功能上显示在对照中与细胞周期进展和促有丝分裂信号有关的基因下调，而在HS-2中参与细胞定型和分化的基因下调。特别值得注意地，在最上调的基因中，参与细胞粘附和生长的那些是显著的，而在最下调的基因中，fct和TGF家族成员是显著的。然后，将阵列数据投影到前两个最大差异的奇异向量上以通过奇异值分解(SVD)产生表达特征(图19B) {Alter, 2000#36 ；Holter, 2000#37}(补充方法)。这些数据显示在存在HS-2 (空心圆圈)的情况下扩增21天的hMSC具有独特的基因表达特征并且不与来自其它处理(如培养45天的对照细胞)的细胞聚类。然而，在存在HS-2的情况下培养32或45天的细胞和21或32天的对照细胞之间的聚类是明显的。这表明HS-2获得了幼小对照细胞所特有的干细胞基因特征。为了确定HS-2的影响是否稳健，将21天时来自两个其它供体的干细胞基因表达特征与第一供体相比较。还根据处理将它们聚类在一起。这表明HS-2的影响不是供体特异的，并且通过SVD产生的基因表达特征可以用于可靠地比较来自不同供体的细胞。HS-2扩增的hMSC在正位缺损中刺激稳健的骨形成由于hMSC已显示出施加免疫抑制作用{Aggarwal，2005#214 ；Shi, 2010#187}，我们首先设法确定HS-2中的连续扩增是否具有任何不利影响(图20A)。将人MSC在HS-2或对照中扩增21天，然后用来自两个不同供体的刺激性和反应性PBMC的混合物以不同的hMSC PBMC比例攻击6天，然后评价⑶3+Ki67+的表达。HS-2不损害hMSC的免疫抑制效果。
接着，我们设法确定当植入到临床相应体内骨缺损模型中时hMSC在HS-2中的长期离体扩增是否影响它们的治疗应用。在手术后3周和7周通过X射线和μ -CT成像评价骨缺损内的骨形成并且表明hMSC移植导致使用HS-2扩增的hMSC更显著的骨修复(图20B)。μ -CT图像的定量分析显示在用HS-2扩增的hMSC处理的缺损中加快了新骨形成(图20C)。由于仅在骨再生的后期发生，因此未在任何处理的股骨中观察到骨桥。为了评价植入的hMSC的体内存活，用Qtracker 荧光纳米颗粒预标记的细胞处理所选的缺损。植入后3周，在所有处理的股骨的骨缺损位点内存在标记的hMSC (图20D)。值得注意的，仅发现细胞质标记物共定位于DAPI阳性细胞，从而确认是通过植入的hMSC所保留的。用人核特异抗体的免疫染色进一步验证缺损位点内存在存活的hMSC。7周时，缺损位点中仍存在的唯一标记细胞是来自于HS-2中扩增的hMSC。
手术后7周，通过组织学评价进一步验证了植入的hMSC的治愈潜能。接受HS-2扩增的hMSC的缺损(defects)的H&E切片显示出新骨状组织、骨髓以及从宿主骨界面和皮下界面浸润缺损位点的肥大软骨细胞(表明软骨内骨化)(图20E)。冯科萨氏染色切片确认桥连大部分缺损并浸润支架孔的HS-2细胞组中的矿化骨状组织(染色黑色)的存在。类似地，在整个缺损位点大量骨钙素富集组织也是明显的。相反，用对照扩增的hMSC处理的缺损导致产生了很大程度缺少冯科萨氏染色和骨钙素染色的少量矿化组织(图20E)。因此，尽管HS-2扩增的hMSC广泛地离体扩增，但HS-2扩增的hMSC保留了它们刺激稳健骨形成的能力。此外，HS-2扩增的hMSC在缺损处提高的存活可以导致生物活性分子更大或更持续的分泌，从而导致骨形成的改善{Meirelles Lda，2009#58}。HS-2稳健扩增了从未分离的(unfractionated)骨髓吸出物中分离的hMSC由于HS-2在多能hMSC的培养扩增中证明了有效性，为了确定其直接临床应用，我们接着设法确定从未分离的骨髓中直接分离的细胞是否还对HS-2补充正响应。来自三位独立健康供体的吸出物含有塑料制品(plastic-adherent)附着的hMSC,在它们的增殖能力和它们的集落形成能力方面，hMSC对HS-2强烈响应(图20A和B)，因此证实了通过所建立的hMSC培养所获得的结果(图15和16)。流式细胞评价显示没有细胞表达造血标志物CD34或CD45 (数据未显示)，但确实表达了 hMSC标志物CD49a、CD73、CD105和STR0-1 (图21C和D)。由于来源于骨髓单核细胞(BMMNC)的大部分CFU-F包含在具有高STR0-1表达(STRO-Γ亮)的细胞亚群内{Gronthos, 1995#31 ；Gronthos, 2003#9}，因此我们确定了 HS-2对STRO-1+胃细胞的比例的影响(图21C和D)。HS-2扩增的细胞中的平均STRO-1+胃的含量为46. 4%，相比之下对照培养基中扩增的细胞为26. 6% (图21D)。因此，HS-2优先促进包含在骨髓吸出物内的STRO-I+^hMSC亚群的扩增。为了进一步评价HS-2扩增hMSC的能力，将通过塑料制品粘附从三位骨髓供体分离的低传代细胞在存在或不存在HS-2的情况下培养2周。在所有三种情况下，HS-2的补充加快了细胞数目的累积增加，这与先前在建立hMSC培养上的结果一致(图15和16)。讨论该研究的结果表明胚胎硫酸乙酰肝素(HS-2)可以用于优选真正hMSC的快速扩增而无需预期的免疫分选或使用始终导致非均匀培养的蛋白因子的可变混合物。此外，这些HS-2扩增的hMSC在植入到整形外科创伤的临床相应模型中时表现出优良的治疗应用。因此，HS-2作为独立方法使用以选择性富集并随后增殖最具治疗希望的hMSC亚群是特别有吸引力的。当前用于产生用于临床使用的hMSC的策略依赖于通过对塑料制品的粘附对它们分离，并且随后在将它们再植入前进行长时间离体扩增。由于成熟骨髓中hMSC极低的频率，因此需要该过程{Caplan, 2009#59 ；Gronthos, 2003#9 ；Pittenger, 2004#6 ；Psaltis, 2010#102}。通过hMSC生长潜力的年龄相关损失{Ciapetti, 2006#735}和在分离和培养时多种hMSC仍保持静止的事实{Terai，2005#38}进一步加剧了这种情况。照此，需要允许该特定亚群离体扩增的策略以实现有效处理方式。为了解决这种需要，已试验了一定范围的分离和扩增方法，其包括使用一定范围抗-抗原的mAb的预期免疫选择，所述抗原包括 STR0-1 {Dennis, 2002#736 ；Gronthos, 1994#740}、STR0-3 {Gronthos,2007#755}、CD49a{Rider,2007#508 ；Deschaseaux,2003#809}、CD146{Filshie, 1998#751 ；Shi,2003#747}、SSEA4{Gang, 2009#357}、LNGFR/CD271 {Jones, 2008#839}和 VCAM-I {Gronthos, 2003#9};使用一些因子的培养扩增，所述因子如 FGF-2{Solchaga, 2010#769 ； solchaga, 2005#15 ；ffalsh, 2000#18 ；Lee, 2009#376} 以及最近血小板来源产物{Avanzini, 2009#326 ；Capelli, 2007#510 ；Doucet, 2005#55 ；Kocaoemer, 2007#549 ；Schallmoser, 2007#516 ;Vogel, 2006#561}和限定专用培养基的使用{Hudson，2010#270}。尽管对这些策略进行了广泛的研究，但它们还未得到广泛接受。在免疫选择的靶标中，STRO-1+胃亚群已显示出对克隆源性基质细胞(CFU-F)的富集{Gronthos，1994#740}，但这需要长时间的细胞分选程序。相反，避免mAb基预选的HS-2处理在仅传代一次后提高了 STRO-1+hMSC (包括STRO-1+胃亚群)的增殖。值得注意的，HS-2中的连续传代导致STRO-I表达的进一步提高(从约45%提高至约70%)，这种提高未用标准培养条件重复。因此，在需要大规模hMSC扩增以获得有效剂量的治疗环境中，HS-2的存在将大大降低所需的培养时间。此外，HS-2优选已知作为有助于其治疗价值的旁分泌因子来源的高度多能的hMCS的扩增{Caplan，2009#59}。的确，用HS-2扩增的hMSC处理的临界性骨缺损表现出极大的骨修复改善，其中植入的细胞在缺损位点内存活多至7周。值得注意的，早在移植后3周时观察到了明显的新骨形成，但未观察到我们先前所报道的处理差异性{Rai, 2010#155}。使用HS-2扩增hMSC还消除了对预分化细胞的需要，预分化细胞是在一些模型中似乎能改善愈合结果的策略。特别值得注意的是尽管使用HS-2补充实现了多能hMSC的大规模扩增，但是这些细胞保持了它们的免疫抑制能力{Meirelles Lda, 2009#58}，一种与体内较高存活机会有关的能力{Stenderup，2001#8}。外源FGF-2已表现出调节hMSC自我更新{Ahn，2009#850 ；Sotiropoulou, 2006#622 ；Tsutsumi, 2001#17}，但是其长期使用还提高了它们的异质性{Walsh, 2000#847}并上调了 HLA I 类和诱导了低 HLA-DR表达{Sotiropoulou，2006#622}，从而损害了其临床使用。相反，我们表明连续补充HS-2类似地调节了 hMSC自我更新，还极大地改善了均一性水平，从而使其特别适合于在再生医学中使用。可以通过消除如细菌、病毒和朊病毒的传染物的一系列公认的酶促、化学和色谱步骤来提取和纯化这些高度带电的HS分子。与蛋白生长因子相反，HS对于一定范围的生物加工程序是能够恢复活力的，它是热稳定的并且具有化学耐受性{Luong-Van，2007#854 ；Luong-Van, 2006#855}，从而使其不但很好地适合作为培养补充剂，而且还适合于一定范围的生物医学应用。HS-2极大地扩增hMSC制剂的使用具有低异质性和优良的再生潜能，这应使它们未来的临床应用具有优势。补充方法使用GUAVA PCA-96台式流式细胞仪测定细胞。在每次传代时并且在增殖测定期间，使用Viacount FLEX试剂和软件确定细胞数目。对于表面标志物的分析，将细胞胰蛋白酶化,封闭Ih (PBS、5%FCS、1%BSA和10%人血清)，在染色缓冲液(PBS、2%FCS、0. 02%NaN3)中再悬浮，并且与小鼠抗STR0-1 (R&D Systems)或者小鼠IgM对照(Caltag)紧接PE结合的山羊抗小鼠IgM (Caltag)或者与PE结合的小鼠抗人CD49a、CD73、CD105 (均来自BDbioscience)和IgG对照(Caltag)培育。然后,使用Guava软件分析来自2000个事件的细胞。对于细胞周期分析，将细胞进行血清饥饿并如前所述更换培养基，然后在所提及的时间点之后胰蛋白酶化，在PBS/lmM EDTA中清洗两次，在冰冷的甲醇中固定并在4°C储存直至染色。将固定的细胞在染色缓冲液(参见上文)中清洗一次，在BD核糖核酸酶A/PI染色液(BD Bioscience)中染色并使用Guava软件分析。对于细胞凋亡测定,将细胞培养8天,然后使用Guava软件测量膜联蛋白和AAD-7的表达。
分化测定。对于生脂分化，将细胞(18000个细胞/cm2)接种到12孔板中并培养至汇合，此时将培养基更换为添加或未添加(对照)I μ M地塞米松、10 μ M胰岛素、20 μ M吲哚美辛和115 μ g/ml 3-异丁基-I-甲基黄嘌呤的脂肪细胞维持培养基(4500mg/l葡萄糖)，并且培养28天并用油红O染色。对于成骨分化，将细胞(3000个细胞/cm2)接种到12孔板中保持24h，然后更换至添加或未添加(对照)IOnM地塞米松、IOmM β -甘油-磷酸酯和25 μ g/ml L-抗坏血酸-2-磷酸酯的维持培养基中，培养28天，并用茜素红或碱性磷酸酶染色。对于软骨形成分化，将细胞(250000个细胞/管)在15ml管中在添加或未添加(对照)10ng/ml TGF- β 3的软骨形成培养基(Cambrex)中成颗粒并培养28天，在此将细胞固定、包埋、封固并用Η&Ε和阿辛蓝染色。在补充方法中描述了染色和组织学的详细内容，该补充方法对应于Li et al1的方法。对于所有分化实验，在第28天分离了总RNA并通过定量PCR分析系特异性基因表达。染色和组织学。甘油三酯的油红O染色；将细胞在PBS中清洗并在4%多聚甲醛(PFA) (Sigma)在PBS中的溶液中固定lh，用水清洗，并用3. 6 μ g/ml油红O (Sigma)在60%异丙醇中的溶液染色Ih并用水清洗。茜素红染色；将细胞在PBS中清洗，在4%PFA中固定10分钟，清洗并在O. 37%茜素红(pH 4. I，Sigma)中染色30分钟，再次清洗并空气干燥。按照生产商的说明书，使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma)实施碱性磷酸酶染色。将软骨细胞颗粒在PBS中清洗并在4%PFA中固定，在O.C.T.中包埋并封固到载玻片上。用H&E和阿辛蓝对固定并封固的软骨细胞载玻片染色。在Olympus BX51显微镜上分析染色的细胞。FGF2ELISA。将细胞以3000/cm2铺板，并根据我们前述的方法2在维持培养基(DMEMUg/Ι葡萄糖、10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50U/ml链霉素)中培养4天，在该维持培养基上除去培养基和基质结合蛋白并根据生产商的建议(R&D Systems)使用 FGF2QuantikineELISA 测量 FGF2 水平。RNA纯化和相对定量PCR。使用Nucleospin II试剂盒(Macherey-Nagel)纯化了来自后期培养(继续培养，carry-on culture)的总RNA、脂肪细胞和成骨细胞。用PBS清洗软骨细胞颗粒，用胶原酶II和IV处理,通过离心收集,在Trizol (Invitrogen)中再悬浮并分离RNA。评价RNA的质量和浓度并且根据生产商的建议使用Superscript III聚合酶(Invitrogen)将O. 5 μ g用于反转录。图25显示了用于定量PCR的Taqman引物/探针。使用Primer express (Applied Biosystems)设计并通过Proligo合成引物和探针。将探针序列修饰为双重标记的LNA (FAM/BHQ-1)杂交探针，(在表中，探针序列中的大写字母表示LNA核苷酸)。对于所有反应，将双重标记MGB (VIC/TAMRA)标记的18S rRNA引物探针用作对照。通过琼脂糖凝胶电泳分析所有PCR反应产物并测序以验证扩增子的特异性。每次定量PCR反应(总计20 μ I)中含有80ng cDNA (参见材料和方法)、300mM正向和反向引物、250μ M探针(ΙΟΟμ M胶原酶2al探针是唯一的例外)和10μ I Taqman Universalmaster mix (Applied Biosystems)。以类似的方式使用50nM正向和50nM反向引物以及IOOnM 探针进行 18S rRNA 检测。在 ABI Prism 7000 序列检测系统(Applied Biosystems)上实施定量PCR反应，重复三次，其中在95°C进行初始10分钟活化步骤，随后按照以下条件分别循环45次，950C，20秒；55°C，10秒；60°C，30秒；72°C，40秒。通过将基因的2(-Drt)值归一化为18S的2(_Dc;t)值并乘以IO6来计算相对表达单元。奇异值分解·这构成了获取原始数据中所存在的最大信息的数据集向新降维空间的线性投影的基础(即主成分分析)。干细胞阵列数据的局部加权回归(LOESS)归一化。来源于基于基因杂交技术的强度测定经常会受基因芯片间变化的影响，这妨碍了单个基因的有意义的比较。这些芯片间变化需要将芯片强度调整至常规分布。通过杂交中恒定全局差异的强度缩放的广泛使用的替代方法是使用LOESS平滑函数3将线性加性模型拟合至对数转化的基因强度值。然后，使用拟合的强度来推断微分式。我们首先通过对照之间的比较检验了改变相邻参数(α )对平滑函数的影响。对于0. α < 0.8的范围，未观察到数据图曲率的根本改变。然后，选择了守恒值或α=0. 2并应用于所有阵列。MA图仅显示了图中中等程度的改变(参见图27中Ctrl-d21相对于Ctrl-d32)，其中影响对于微分式的极值要更显著(图27-29)。干细胞阵列数据的奇异值分解。在这些实验中使用的基因表达微阵列数据是包括数百个基因及其共表达的高维度数据集。尽管这似乎是复杂的，但是区分HS-2和对照的大部分重要分子信息实际上是作为多个简单并且基础的模式(pattern)存在的。我们希望在数据集内发现最信息性的模式(或奇异向量)并使用它们通过奇异值分解获得HS-2对干性影响的稳健定义。在奇异值分解4前，首先通过采用其协方差矩阵对表示由行上的m个独立实验条件(硫酸乙酰肝素相对于对照的处理)和列上的η个变量(每个阵列上的基因)组成的干细胞阵列数据的矩阵A进行预处理。该矩阵分解如下
「02771 A=USVf.(1)其中S是由矩阵A' A CA'表示A的转置)的奇异值(λ ^ λ 2. . . λ η)组成的对角矩阵。U和V的列分别是对应于矩阵A' A和AA'的奇异向量。U和V均是正交矩阵，从而如下给出了这些向量上的投影C C = USV' V = AV = US (2)
因此，通过下式给出了与第一 t向量Var有关的方差的比例
权利要求
1.通过在存在HS-2的情况下的细胞培养所获得的间充质干细胞在制备用于治疗骨折的药物中的用途。
2.根据权利要求I所述的用途，其中所述药物在加强的间充质干细胞介导的骨折修复方法中使用。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述加强的间充质干细胞介导的骨折修复包括相对于通过使用由在不存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改善。
4.通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞，用在骨折治疗方法中。
5.一种药物组合物，包含通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞，其中所述药物组合物在骨折治疗方法中使用。
6.根据权利要求4所述的间充质干细胞或根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的药物组合物在包含加强的间充质干细胞介导的骨折修复的治疗方法中使用。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞或药物组合物，其中所述加强的间充质干细胞介导的骨折修复包括相对于通过使用由在不存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改善。
8.—种生物相容性植入物或假体，其包含生物材料和通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的植入物或假体，其中所述植入物或假体涂覆有通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
10.根据权利要求8所述的植入物或假体，其中所述植入物或假体浸溃有通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
11.一种形成生物相容性植入物或假体的方法，所述方法包括用通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞涂覆或浸溃生物材料的步骤。
12.—种治疗受试者骨折的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法是加强的间充质干细胞介导的骨折修复方法，所述方法包括相对于通过使用由在不存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞的治疗所获得的骨折修复速度，骨折修复速度的改善。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在施用间充质干细胞之前，所述方法包括与HS-2接触培养干细胞以产生所述治疗有效量的间充质干细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括将所述治疗有效量的间充质干细胞配制为药物组合物的步骤，所述药物组合物包含通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞和可药用载体、佐剂或稀释剂，其中将所述药物组合物施用给所述受试者。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述间充质干细胞或药物组合物施用至骨折周围的组织。
17.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞或药物组合物的施用包括将所述间充质干细胞或药物组合物注射到骨折周围的组织。
18.一种治疗受试者骨折的方法，所述方法包括通过手术将生物相容性植入物或假体植入到所述受试者骨折位点处或骨折位点周围的组织，所述植入物或假体包含生物材料和通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述植入物或假体涂覆有通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述植入物或假体浸溃有通过在存在HS-2的情况下的培养所获得的间充质干细胞。
全文摘要
在存在HS-2的情况下培养的间充质干细胞用于治疗骨折的用途。与使用无HS-2培养的间充质细胞的骨折治疗相比，使用这些细胞的骨折修复得到加强。可以将这些间充质干细胞配制到药物组合物中并直接注射到骨折周围的组织或在生物相容性植入物或假体中使用。
文档编号A61K31/727GK102971414SQ201080064450
公开日2013年3月13日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者西蒙·库尔, 维克托·努尔科姆比 申请人:新加坡科技研究局