专利名称：一种光敏剂结合蛋白/多肽及其在光动力基因治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于光动力学治疗技术领域，具体涉及一种光敏剂结合蛋白及多肽 (Photosensitizer binding Protein& P印tide，简称PBP)及其应用。本发明主要涉及卟啉类光敏剂的结合蛋白(PBPr)为eEFlAl蛋白及与该蛋白序列同源性达70%以上的蛋白分子、光敏剂结合多肽(PBPe)为25aa残基肽及与氨基酸序列同源性达70%以上的多肽。而 eEFlAl在某些光动力学治疗范围内的肿瘤，如结肠癌、膀胱癌、食道癌，皮肤癌以及乳腺癌中特异高表达，为光动力学治疗过程中光敏剂特异富集于肿瘤细胞提供合理的解释，为开发光敏剂前药物、设计特异靶向光敏剂提供有价值的参考，为光敏剂结合蛋白高表达介导的肿瘤光基因治疗提供了全新的策略和方法。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，但传统治疗效果十分有限。癌症的光动力疗法 (photodynamic therapy,PDT)是近年来颇受各国学者重视的一种癌症新疗法，这种疗法是利用某些染料类光敏物质在癌组织中积聚的浓度高于周围的正常组织，在激光等照射下可产生对细胞有破坏作用的单线态氧及自由基的特性，从而干扰肿瘤细胞的生长并导致死亡 [An Yen, et al , 1993] 0至于光敏剂富集于肿瘤细胞的机理尚不很清楚，导致PDT疗效受光敏剂在肿瘤与正常组织富集状态差异及其被动靶向扩散状态的限制。因此，探索光敏剂富集于肿瘤细胞的机制，从而高效增强光敏剂与肿瘤细胞的特异亲和力，是提高光动力学治疗效果的关键。本发明从人cDNA噬菌体展示库中发现一种与卟啉类光敏剂高度亲和的蛋白 eEFlAl，它在蛋白质翻译中有重要作用，并在体内外分别验证了其与光敏剂的高亲和作用及存在关系，提示其作为光动力学治疗中光敏剂富集肿瘤细胞的靶蛋白。同时，本发明首次提出光动力学治疗与基因治疗的联合治疗的方案，并为肿瘤的光动力学治疗提供新型治疗措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与卟啉类光敏剂高度亲和的蛋白与多肽，以及其在光动力基因治疗中的应用。本发明首先提供从人cDNA噬菌体展示库中筛选出的光敏剂结合噬菌体，利用PCR 扩增噬菌体外源目的基因，经测序其外源基因插入序列为SEQ ID NO. 1所示。该25aa残基肽被命名为光敏剂结合肽(PBPe)，eEFlAl蛋白被命名为光敏剂结合蛋白(PBft·)。该噬菌体表面展示与卟啉类光敏剂结合的蛋白末端多肽。本发明还提供一种与卟啉类光敏剂高度亲和的多肽一人类真核翻译延伸因子 eEFlAl的25aa残基。该多肽还包括与eEFlAl蛋白的25aa氨基酸序列同源性达70%以上的多肽。eEFlAl蛋白的25aa残基的分子量为2. 5kDa，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
本发明还提供一种与卟啉类光敏剂高度亲和的蛋白一人类真核翻译延伸因子 eEFlAl。该蛋白还包括与人类翻译延伸因子eEFlAl蛋白序列同源性达70%以上的蛋白分子，还包括为基因工程表达的具有与eEFlAl相似功能活性的融合蛋白。eEFlAl分子量为 49. 8kD，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示。本发明提供光敏剂结合蛋白/多肽与光敏剂ELISA非竞争性抑制结合实验方法， 其具体步骤如下
1、96孔板包被光敏剂结合蛋白/多肽，设不同的包被浓度梯度，每个浓度梯度分别重
复三孔。2、PBST洗去未包被于板上的蛋白或多肽，加入光敏剂，37°C孵育1. ，使之与蛋白或多肽充分结合。3、PBST洗去未结合的光敏剂，使用多功能酶标仪M5荧光通道测定光敏剂荧光强度。4、以不同的蛋白/多肽包被浓度为横坐标，以所测得的荧光强度为纵坐标，绘制曲线，获得荧光强度和蛋白/多肽包被浓度的关系。实验数据表明，随着光敏剂结合蛋白/多肽增加，结合的卟啉类光敏剂越多。本发明还提供了光敏剂结合蛋白/多肽与光敏剂亲和实验的方法。其具体步骤如下
1、用Biacore分子互作仪检测蛋白/多肽与光敏剂亲和常数。2、使蛋白偶联到CM5蛋白芯片上，通道1用乙醇胺封闭，通道2偶联蛋白/多肽。3、不同浓度的光敏剂以流相通过芯片上固相蛋白，每一浓度以合适的结合和解离参数进行结合和解离。4、采用芯片再生方法，从而测定不同浓度光敏剂与蛋白的结合解离曲线。5、根据不同浓度下的结合解离曲线，计算出亲和常数。实验数据表明，光敏剂结合蛋白与光敏剂亲和常数为2. 936 X 10_6，光敏剂结合多肽与光敏剂亲和常数为4. 965 X ΙΟ"80本发明还提供体内定性验证光敏剂结合蛋白高表达细胞富集更多光敏剂的实验方法，其具体步骤如下
1、构建光敏剂结合蛋白/多肽真核高表达载体，使其与荧光蛋白(与光敏剂荧光颜色区分的荧光蛋白)融合表达。2、分别将光敏剂结合蛋白/多肽真核高表达载体与其对照组(不表达或低表达组) 转染到细胞内，使细胞表达融合蛋白。3、转染Mh-4 !后，加入光敏剂或其前体物质，继续培养一段时间后，共聚焦显微镜荧光通道观察荧光蛋白，光敏剂特定特长激发下观察光敏剂分布情况。本发明还提供体内定量验证光敏剂结合蛋白高表达细胞富集更多光敏剂的实验方法，其具体步骤如下
1、分别将光敏剂结合蛋白/多肽真核高表达载体与其对照组(不表达或低表达组)转染到细胞内，使细胞表达融合蛋白。2、24h后，采用流式细胞仪分别分选出每组细胞内的GFP阳性细胞
3、将上述阳性细胞群分别按每孔一定数量的细胞(数量范围2500-20000)，接种到96孔板内，每组至少重复三孔，细胞在37°C 5% CO2条件下继续培养。4、待细胞贴壁生长后，加入光敏剂或其前体物质，继续培养一段时间，不超过48h， 在一定间隔时间，使用多功能酶标仪M5仪器荧光通道(光敏剂相应激发光和发射光波长下) 测定细胞内光敏剂荧光强度。5、以加入光敏剂后不同时间点为横坐标，以不同时间时测得的光敏剂光强度为纵坐标，绘制时间-荧光强度曲线。体内验证(定性与定量验证)光敏剂富集于光敏剂结合蛋白高表达细胞的实验数据表明，于PSP高表达细胞组富集更多量的ΡρΙΧ。本发明还提供介导eEFlAl高表达的实验方法，其具体过程为构建eEFlAl基因/ c基因片段到真核表达载体中，采用慢病毒、腺病毒、脂质体转染或其他途径协助eEFlAl转染到细胞体内进而使eEFlAl基因高表达。本发明还提供首创光基因治疗方案，其具体方法为介导eEFlAl高表达，并使卟啉类光敏剂富集于肿瘤细胞、再实施光动力学治疗，进而杀死肿瘤细胞的治疗方案。本发明还提供由光敏剂结合蛋白/多肽的抗体介导的介导的光敏剂吸附于细胞表面的光动力治疗方案，其具体方法为首先制备光敏剂结合蛋白/多肽的多克隆抗体或单克隆抗体，然后通过物理或化学方法将其交联到光敏剂上，再采用抗体交联光敏剂进行光动力学治疗实施。综上所述，本发明的光敏剂结合蛋白可以在体外和卟啉类光敏剂结合，在体内具有富集卟啉类光敏剂的作用，并通过腺病毒或慢病毒或其他方式转染该光敏剂结合蛋白基因于各种哺乳细胞，经人工调控诱导表达后，产生较好的光动力学治疗效果。另外，该光敏剂结合蛋白及多肽(PBP)在某些光动力学治疗范围内的肿瘤，如结肠癌、膀胱癌、食道癌，皮肤癌以及乳腺癌等中特异高表达，为光动力学治疗过程中光敏剂特异富集于肿瘤细胞提供合理的解释，为开发光敏剂前药物、设计特异靶向光敏剂提供有价值的参考，为光敏剂结合蛋白高表达介导的肿瘤光基因治疗指明方向。
图1为人工合成多肽的MS质谱鉴定图。图2为eEFlAl蛋白/人工合成多肽与PpIX的ELISA结合曲线图。图3为eEFlAl蛋白与PpIX的Biacore结合解离曲线图。图4为eEFlAl蛋白25aa残基人工合成多肽与PpIX的Biacore结合解离曲线图。图5为体内定性验证光敏剂结合蛋白/多肽高表达细胞富集更多PpIX的实验组图。图6为体内定量测定细胞内光敏剂结合蛋白/多肽表达量与PpIX富集量的关系曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如 Sambrook 等分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor LabortaryPress, 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1
PCR扩增噬菌体外源基因
以如专利2010105533095中所述方法从人肝cDNA噬菌体展示库中筛选出的与光敏剂结合的噬菌体为PCR反应模板，利用正向引物IectUP Primer和反向引物 T7SelectD0WN Primer,进行PCR扩增，获得T7载体外源基因PCR产物。实施例2
光敏剂结合噬菌体的基因Blast分析
1、上述PCR产物与pMD-19T载体连接后，转化克隆菌株XLl-Blue，挑取5_10个转化子培养，菌液PCR克隆筛选阳性转化子，送英俊上海生物公司测序，分析T7klect载体其外源插入序列见SEQ ID NO. 1。2、T7Select载体外源插入序列经NCBI Blast分析，确定其外源基因362碱基与 eEFlAl全长基因的1374-1735碱基序列完全一致，而其中编码基因为1374-1452，并且插入序列与载体融合后的一种ORF与eEFlal的一种ORF编码的氨基酸序列C端25aa —致， 25aa具体序列信息见SEQ ID NO. 2。实施例3
eEFlAl基因工程蛋白的获得
如专利201010504169. 2中所述方法获得，蛋白序列信息见SEQ ID NO. 3。实施例4
eEFlAl C末端25aa人工多肽的合成
上海格尼生物技术有限公司处合成25aa，合成纯度为97%，MS质谱鉴定结果见图3。实施例5
eEFlAl基因工程蛋白与PpIX分子的亲和实验
上述eEFlAl基因工程蛋白/人工合成光敏剂结合多肽与卟啉类光敏剂ELISA非竞争性抑制结合实验方法，其具体步骤如下
1、96孔板包被eEFlAl基因工程蛋白/人工合成多肽，包被浓度梯度为200ng，400ng， 600ng，800ng，lOOOng，每个浓度梯度分别重复三孔，包被液为NaC03 CpH 10. 0)缓冲液。2、PBST洗去未包被于板上的蛋白或多肽，每孔加入光敏剂PpIX 200ng，37°C孵育 1. 5h，使之与蛋白或多肽充分结合。3、PBST洗去未结合的光敏剂，使用多功能酶标仪M5荧光通道(Ex400nm，Em620nm) 测定光敏剂荧光强度。4、M5测得的荧光强度数据，见图3附表，eEFlAl蛋白/人工合成多肽与PpIX的 ELISA结合曲线，见图3。实施例6
eEFlAl基因工程蛋白与PpIX分子的互作实验
用Biacore X100分子互作仪检测eEFlAl与PpIX亲和常数，具体操作步骤如下 1、蛋白偶联buffer选择蛋白以4(^g/ml浓度溶于醋酸钠buffer(pH4. 0，4.5，5.0， 5. 5)，进行预偶联实验，结果显示醋酸钠buffer (pH5. 5)进行偶联的效果较好。2、蛋白偶联以醋酸钠buffer (pH5. 5)溶解的4(^g/ml蛋白溶液，设置偶联RU为10000,结果没有偶联成功。加大蛋白浓度至lOOPg/ml，设置偶联RU为5000，结果偶联成功。至此，CM5蛋白芯片通道1表面已成功偶联eEFlAl蛋白，偶联RU为5633。3、芯片再生条件选择以2000ng/ml浓度的光敏剂进样后，分别用Gly-HCl (pHl. 5，2. 0，2. 5，3. 0)，进行芯片再生，结果显示Gly-HCl (pHl. 5)再生效果较好。4、乙醇胺封闭CM5蛋白芯片通道1，在光敏剂进样过程中发现PpIX与通道1 (空白通道)有非特异结合，因此采用乙醇胺封闭。5、光敏剂浓度梯度选择光敏剂1，2，4，8，16，32μΜ。6,Biacore亲和程序实验设置结合反应条件为37°C，结合时间为200s，解离时间为600s，不同浓度的光敏剂分别进样，每次进样结束后，用Gly-HCl (pHl. 5)作为再生液，不同浓度的光敏剂与蛋白的结合解离曲线输出到Biacore分析软件。7、Biacore测得的PpIX与eEFlAl结合与解离曲线，见图3 ；PpIX与eEFlAl亲和常数kD值及其它常数值，见图3附表。实施例7
eEFlAl C末端25aa人工多肽与PpIX分子的互作实验
用Biacore XlOO分子互作仪检测eEFlAl C末端25aa人工合成多肽与PpIX亲和常数， 具体操作步骤如下
1、多肽偶联buffer选择多肽以4(^g/ml浓度溶于醋酸钠buffer(pH4.0，4.5，5.0， 5. 5)，进行预偶联实验，结果显示醋酸钠buffer (pH5. 5)进行偶联的效果较好。2、多肽偶联以醋酸钠buffer (pH5. 5)溶解的4(^g/ml多肽溶液，设置偶联RU为 10000，结果没有偶联成功。加大多肽浓度至lOOPg/ml，设置偶联RU为5000，仍然没有偶联成功。至此，采用连续进样偶联，使多肽最大限度的达到偶联饱和状态，结果成功偶联多肽， 偶联RU为1100。3、芯片再生条件选择以2000ng/ml浓度的光敏剂进样后，分别用Gly-HCl (pHl. 5，2.0，2. 5，3.0)，进行芯片再生，结果显示Gly-HCl (pHl. 5)再生效果很差。后又尝试0. 5mM NaOH再生，效果也不好，最后采用0. 5%SDS强再生溶液，再生效果很好。4、乙醇胺封闭CM5多肽芯片通道1。5、光敏剂浓度梯度选择根据步骤3)中再生溶液的选择，说明PpIX与多肽结合很强，因此选用光敏剂浓度为0. 5，1，1. 5，2，3，4μΜ。6,Biacore亲和实验程序设置结合反应条件为37°C，结合时间为200s，解离时间加长为1200s，不同浓度的光敏剂分别进样，每次进样结束后，用Gly-HCl (pHl. 5)作为再生液，不同浓度的光敏剂与多肽的结合解离曲线输出到Biacore分析软件。7、Biacore测得的PpIX与多肽结合与解离曲线，见图4 ；PpIX与多肽亲和常数kD 值及其它常数值，见图4附表。实施例8
体内定性验证光敏剂结合蛋白/多肽高表达细胞与PpIX富集关系细胞内分别高表达光敏剂结合蛋白/多肽与其对照组相比，分别在共聚焦显微镜下观察不同分组细胞内PpIX分别情况，其具体步骤如下
1、分别将eEFlAl蛋白基因全长序列(简称a)，其C末端25aa序列(简称c)，以及缺省 C末端25aa序列的eEFlAl蛋白序列(简称b)，插入到pEGFP_Cl真核表达质粒GFP表达序列后，构成GFP融合表达质粒pEGFP-Cl-a，pEGFP-Cl-b和pEGFP-Cl_c，使其分别表达融合蛋白 GFP-a，GFP-b 和 GFP_c。2、用含10%小牛血清的DMEM培养基培养!fepG2细胞，培养条件为37°C 5% CO2培养箱。3、分别将上述三种重组质粒pEGFP-Cl-a，pEGFP_Cl_b和pEGFP-Cl_c以及对照质粒pEGFP-Cl转染肝癌细胞H印G2内，使细胞分别表达GFP_a，GFP-b和GFP_c以及GFP蛋白。4、转染24h后，改换不含血清的DMEM培养基培养细胞，并加入光敏剂PpIX在体内转化的前体物质5-ALA (ImM),细胞继续培养Mi后，共聚焦显微镜绿色荧光通道观察GFP， 红色荧光通道观察PpIX分布情况，见图6。实施例9
体内定量测定光敏剂结合蛋白/多肽高表达细胞与PpIX富集关系细胞内分别高表达光敏剂结合蛋白/多肽与其对照组相比，分别用多功能酶标仪M5仪器检测细胞内PpIX富集量，不同其具体步骤如下
1、分别将上述三种重组质粒pEGFP-Cl-a，pEGFP-Cl-b和pEGFP-Cl_c以及对照质粒 pEGFP-Cl转染肝癌细胞H印G2内，使细胞充分表达蛋白Mh。2、24h后，采用流式细胞仪分别分选出每组细胞内的GFP阳性细胞，即得到分别表达GFP-a，GFP-b, GFP-c以及对照组GFP的100%阳性细胞群。3、将上述阳性细胞群分别按7000个细胞/孔的数量，接种到96孔板内，每组至少重复三孔，细胞在37°C 5% CO2条件下继续培养。4、待细胞贴壁生长后( 他)，改换不含血清的DMEM培养基培养细胞，并向每孔分别加入光敏剂5-ALA (0. 75mM)，继续培养，并在ai，4h，》i，12h, 24h时使用多功能酶标仪 M5仪器荧光通道(Ex400nm，Em620nm)测定细胞内PpIX荧光强度，测得数据见图6附表。5、以加入光敏剂后不同时间点为横坐标，以不同时间时测得的PpIX光强度为纵坐标，绘制时间-荧光强度曲线，见图6。图2附表eEFlAl蛋白/人工合成多肽与PpIX的ELISA结合实验数据。
权利要求
1.一种与卟啉类光敏剂结合的人肝CDNA噬菌体单克隆，其特征在于，外源插入序列与噬菌体载体ORF对框，表达人eEFlAl蛋白的25aa残基肽编码序列，序列为SEQ ID NO. 1所示，该25aa残基肽被命名为光敏剂结合肽，eEFlAl蛋白被命名为光敏剂结合蛋白。
2.一种卟啉类光敏剂结合蛋白，其特征在于，该蛋白为人类翻译延伸因子eEFlAl蛋白及与其蛋白结构70%相似度以上的蛋白分子，该结合蛋白为基因工程表达的具有与eEFlAl 相似功能活性的融合蛋白，eEFlAl分子量为49. 8kD，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示。
3.一种卟啉类光敏剂结合多肽，其特征在于，该多肽为eEFlAl蛋白的C末端25aa 及与其氨基酸序列近70%以上相似度的多肽，分子量为2. 5kDa，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 4。
4.一种用于介导如权利要求2所述eEFlAl高表达的方法，包括慢病毒转染、腺病毒转染或脂质体转染等其他协助eEFlAl转染到细胞体内进而使eEFlAl基因高表达的手段。
5.一种如权利要求7所述用于介导eEFlAl高表达方法，使卟啉类光敏剂富集于肿瘤细胞、再实施光动力学治疗，进而杀死肿瘤细胞。
6.一种由权利要求2或3所述光敏剂结合蛋白或多肽的抗体介导的光敏剂吸附于细胞表面的光动力治疗药物的应用。
全文摘要
本发明属于光动力基因治疗技术领域，具体为一种光敏剂结合蛋白及多肽及其应用。本发明通过从人肝cDNA噬菌体展示库中筛选一种光敏剂结合蛋白。该结合蛋白为人类真核翻译延伸因子eEF1A1蛋白及与其蛋白结构相似70%～80%的蛋白分子，光敏剂结合多肽为eEF1A1C末端25aa及其70%～80%相似的氨基酸序列。该光敏剂结合蛋白可以在体外和卟啉类光敏剂结合，在体内具有富集卟啉类光敏剂的作用，并通过腺病毒或慢病毒或其他方式转染该光敏剂结合蛋白基因于各种哺乳细胞，经人工调控诱导表达后，产生较好的光动力学治疗效果。另外，该光敏剂结合蛋白及多肽(PSP)为开发光敏剂前药物、设计特异靶向光敏剂提供有价值的参考。
文档编号A61K38/17GK102174478SQ201110000898
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者朱乃硕, 郭艳荣, 魏勋斌 申请人:复旦大学