专利名称：一种牛初乳提取物及其提取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牛初乳提取物及其提取方法和应用，具体涉及一种富含 Mir-30a-5p微囊泡的牛初乳提取物及其提取方法和应用。
背景技术：
癌症是危害人类健康和生命的头号杀手。近年来，全球新增癌症病例逐年上升，目前达到1200万例，中国内地每年新增癌症患者近200万，死亡约150万，目前发病率以每年 2. 5%的速度增加。尽管人类经过了无数的努力试图攻克癌症这一顽症，但即使在发达的国家，癌症的治愈率也仅为45% 50%，发展中的国家癌症治愈率更低。相当多的癌症晚期患者处在无休止地手术、放疗、化疗中，不但增加了患者们痛苦，还使患者家属劳民伤财，使他们背负了沉重的社会负担。目前治疗癌症的方法主要是手术摘除、放射治疗和化学治疗三种方式。但手术治疗难免破坏正常组织，威胁生命或造成畸型或功能丧失。放射治疗对扩散或侵润广泛的癌症达不到治疗效果，而且放射治疗时高剂量射线在杀灭癌细胞的同时也损伤了正常细胞。 化疗药物毒副作用较大，造成患者恶心、呕吐、脱发、白细胞减少、不育等。化疗本身也是诱发肿瘤的一个因素。临床实践证明，大剂量放、化疗只能导致虚弱的生命更加垂危，加速患者死亡。顺钼(DDP)是癌症化疗药物中的一种，具有抗瘤谱广、作用强、无交叉耐药，可与其他药物联合，广泛用于多种癌症的治疗，而且价格便宜。它是一种无机钼的金属络合物， 含一个二价钼及两个氨分子和两个氯原子，类似于双功能烷化剂，可与DNA形成链内和链间交叉联结，破坏DNA功能，阻止DNA复制，为细胞周期非特异性药物。肿瘤对化疗和放疗的耐受机制与癌细胞在不利环境下自吞噬有关。癌细胞在抗癌药物和放射刺激下，可通过吞噬自身的一部分机体作为营养度过暂时的不利环境以求得继续生存。一旦停止用药或化疗，这些癌细胞又可恢复恶性增生能力，导致病症复发。癌细胞的自吞噬生存机制对放疗和化疗效果不利。抑制癌细胞自吞噬，促进其凋亡，是提高药物疗效，增进患者康复的重要课题。癌细胞自吞噬受Beclin 1基因调节，beclin 1表达增高可促进细胞自吞噬。 Beclin 1基因受到抑制，则会引起细胞自吞噬水平降低，从而抑制癌细胞和肿瘤以自噬的方式继续存活，促进肿瘤组织消亡或癌细胞凋亡，增进患者康复。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种牛初乳提取物。本发明的另一目的是提供从牛奶中提取分离该牛初乳提取物的方法。本发明的又一目的是提供该牛初乳提取物的应用。 一种牛初乳提取物，该提取物含有序列为SEQ ID NO. 1 (UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG)
3的Mir-30a-5p微囊泡。其中，所述的牛初乳提取物通过如下方法获得将牛初乳以5000Xg离心30分钟后取中层液，再依次以12000 X g,35000 X g、70000 X g、110000 X g离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。所述的牛初乳为乳牛分娩后最初3日内所挤的乳汁。一种提取所述的牛初乳提取物的方法将牛初乳以5000Xg离心30分钟后取中层液，再依次以12000Xg,35000Xg、70000XgU 10000Xg离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。所述的牛初乳为乳牛分娩后最初3日内所挤的乳汁。所述的牛初乳提取物在制备治疗各种癌症的药物中的应用。所述的癌症为乳腺癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肺癌、肝癌、肾癌、食道癌、卵巢癌、 直肠癌、结肠癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨癌、鼻咽癌或脑瘤等。有益效果发明人首次发现牛初乳中含有丰富的Mir-3a-5p，是牛成乳中的6 8倍。并从牛初乳中分离到富含Mir-30a-5p微囊泡的提取物。使用该牛初乳提取物处理顺钼化疗后的癌细胞，可增加癌细胞中的Mir-30a-5p，而细胞自源性I^re Mir-30a变化不大，吞噬相关基因Beclin-I表达降低，抑制癌细胞依赖自吞噬而继续生存，自噬泡减少，自噬泡相关蛋白 LC3-II降低，促进癌细胞凋亡。本发明所需的牛初乳获得容易，所需设备简易，仅需高速离心机和超速离心机，方法简单实用，效果显著。
图1. Solexa分析牛初乳和牛成乳中micro RNA的含量。括号圈住的为mir-30a_5p。图2. Q-PCR验证牛初乳和成乳中mir-30a_5p的含量。图3.牛初乳各离心组分中的Mir-30a-5p含量比较。comp为未做组分分离的牛初乳，5kg代表离心力5000 X g，12kg代表离心力 12000 X g, 35kg代表离心力35000 X g, 70kg代表离心力70000 X g, 1 IOkg代表离心力 IlOOOOXg, up代表上层，mid代表中层，sed代表沉淀。图4.从牛初乳IlOOOOXg离心中层液中分离到的微囊泡，A 扫描电镜图；B 透射电镜图。图5.用牛乳IlOOOOXg离心中层液转染Hela细胞后癌细胞中的Mir-30a-5p含
量比较。图6.用牛乳110000 Xg离心中层液转染Hela细胞后癌细胞中的pre Mir-30a_5p
含量比较。图7.牛乳IlOOOOXg离心中层液处理后的Hela癌细胞中Beclin-I水平比较。图8.牛乳IlOOOOXg离心中层液抑制顺钼化疗过的Hela癌细胞自吞噬形成自噬泡数量比较。A 顺钼化疗后的Hela癌细胞加入牛乳IlOkXg离心组分后自吞噬泡数量的影响；B:顺钼化疗后的Hela癌细胞加入牛乳IlOkX g离心组分后自吞噬泡数量的变化；图9.牛乳IlOOOOXg离心中层液处理顺钼化疗过的Hela癌细胞，自噬体标志蛋白LC3-II/LC3-I的比例比较。A 顺钼化疗后的Hela癌细胞在加入牛乳IlOkX g离心组分后LC3-II/LC3-I的变化；B 顺钼化疗后的Hela癌细胞在加入牛乳IlOkX g离心组分后LC3-II/LC3-I比值的变化。图10.牛乳IlOOOOXg离心中层液促进Hela癌细胞凋亡效果比较。A 牛乳IlOkXg离心中层液对顺钼化疗后的Hela癌细胞凋亡率的影响；B 顺钼化疗后的Hela癌细胞加入牛乳IlOkX g离心中层液后凋亡率的变化。上述图5 10 中 FBS 胎牛血清；DDP 顺钼；Anti 含 mir-30a_5p inhibitor 的脂质体；MMV 牛成乳110000Xg离心所得中层液；CMV 牛初乳110000Xg离心所得中层液。
具体实施例方式实施例1. Solexa测量牛初乳与牛成乳中的micro RNA取Iml牛初乳与牛成乳分别加入15ml离心管，分别加入3ml苯酚混勻后各加 Iml氯仿混勻，以12000Xg离心lOmin，取上清液，各加Iml异丙醇混勻后，放在_20°C沉淀lh，再以12000Xg离心lOmin，弃上清，往沉淀中加入75%乙醇-DEPC水1ml，混勻后以 12000 Xg离心lOmin，弃上清，敞口置室温直至管内液体挥发干净，加入20 μ 1 DEPC水溶解，各取适量牛初乳和牛成乳提取总RNA作Solexa测试和Q-PCR，测试其中所含的micro RNA及相应含量。利用OligodT的beads富集总RNA样本中mirRNA，并逆转录为双链cDNA，逆转录-PCR 反应体系DEPC 7jC 4. 5 μ 1 ；5 XAMV buffer 2 μ 1 ；AMV 0. 5 μ 1 ；dNTP mixture 1 μ 1 ;RT Primer 1 μ 1 (SEQ ID NO. 2 5' GCAATTCAGTTGAGCACAAGACTGACCTTC 3' ) ；RNA 1μ 1。逆转录-PCR反应程序:16°C 30分钟，42°C 60分钟，85°C 5分钟，4°C保温，直至取出。Solexa 测试(Illumina Digital Gene Expression 试剂盒)1)采用4碱基识别酶DpnII酶切双链cDNA，链接Illumina adapter 1 ；2)利用MmeI酶切3，端20碱基，并在3，端链接Illumina adapter2 ；再加入Primer GXl和Primer GX2,进行15个循环的PCR扩增，PCR反应程序 980C 10 秒，60°C 30 秒，72°C 15 秒，72°C 10 分钟；3)扩增后样本通过6% TBE PAGE胶回收85碱基条带，纯化后通过Illumina基因表达测序法测序。Q-PCR 反应体系:DEPC 水 12 μ 1，10 X buffer (不含 MgCl2) 2 μ 1，MgCl2L 7 μ 1， dNTPmixture 0. 4μ 1, rTAQ 0. 3 μ 1，引物 0. 3 μ 1 (SEQ ID NO. 3 :5，CTGACCTTC 3，)，cDNA 3. 3 μ 1。
Q-PCR反应程序①95°C 5分钟，②95°C 15秒，③60°C 30秒，③重复40次循环。Solexa结果见图1，Solexa分析表明牛初乳中mir-30a-5p的含量是牛成乳中的 6. 5倍。Q-PCR验证牛初乳中的mir-30a-5p含量是牛成乳中的8倍(图2)。实施例2.牛初乳离心分离液和微囊泡的获得将牛初乳与牛成乳各均分成六管，每组先预留1管未做组分分离的牛乳作对照；其余五管均以5000Xg离心30分钟，取1份离心后的牛成乳与牛初乳，将各自的上层，中层和沉淀保存；余下的四管牛初乳、牛成乳均取中层液，再以12000Xg离心1小时，取离心后的牛初乳、牛成乳各一管，小心取出上、中、下层保留；其余三管牛初乳、牛成乳均取中层液，以35000Xg离心1小时，保留一管中的上、 中、下层；剩余二管的中层液用70000Xg离心1小时，将其中一管中的上、中、下层分别保存；牛初乳和牛成乳最后剩余的一管再以IlOOOOXg离心1小时后，将分层的上、中、 下组分分开收集，其中的中层液即为下文所称的IlOOOOXg离心中层液。以上各转速下所得的上层，中层液和沉淀组分以及未做组分分离的牛初乳测量蛋白质浓度，取含ι μ g蛋白质的上述各组分均抽提RNA，逆转录成CDNA，做定量实时PCR，测量这些组分中Mir-30a-5p的含量。结果见图3，由图可见等蛋白量条件下(1微克)，牛初乳差速离心分离所得各组分中以IlOOOOXg离心得到的中层液所含的mir-30a-5p最高。将IlOOOOXg离心得到的中层液固定脱水干燥，镀金后在扫描电镜观察，结果见图4A，可看到微囊泡，直径在30nm 300nm ；负染后在透射电镜下观察可见囊泡内有可着色成分(图4B)。实施例3.检测对比初牛乳IlOOOOXg离心中层液对化疗后癌细胞自吞噬的抑制以及对细胞凋亡的促进作用，并与牛成乳相同成分的效果比较。 用含顺钼(30ng/ml)的5 %小牛血清的DMEM培养基培养癌细胞(Hela细胞，中国科学院细胞库)6h，然后加入实施例2制备的初牛乳和成牛乳IlOOOOXg离心所得中层液(含蛋白量100yg/ml)培养细胞14h后，与光加顺钼、小牛血清培养基培养、加牛乳IlOOOOXg离心中层液同时加mir-30a-5p inhibitor(SEQ ID NO. 4 CUUCCAGUCGAUGUUUACA)脂质体培养的癌细胞对比，比较各组细胞凋亡比率，自吞噬标志蛋白Beclin-I的含量变化，每个细胞中平均自吞泡的个数，自吞泡标志蛋白LC3 II/LC3 I的比值，以及mir-30a-5p含量。3. 1取含蛋白量IOOyg的牛初乳和牛成乳IlOOOOXg离心中层液加入Iml含 30ng/ml顺钼(DDP)的5%小牛血清的DMEM培养液培养的Hela细胞14小时后，Q-PCR测得初牛乳IlOOOOXg离心中层液可显著提高细胞中Mir-30a-5p含量，而细胞自源性pre Mir-30a-5p差异不大，说明细胞中升高的mir-30a-5p来源于牛奶离心中层液(图5、图6)。3. 2将上述培养Mi的Hela细胞用培养基洗三遍，用胰酶消化3分钟，转入离心管 1700rpm离心5分钟，去除上清，加入100微升RIPA lysis (碧云天公司)裂解细胞30分钟， 然后以12000Xg离心10分钟，去沉淀，测蛋白浓度后，加入蛋白上样液100°C煮5分钟，然后上SDS-凝胶电泳80V，300mA转膜90分钟，牛奶封闭lh，用兔抗人Beclin-I免疫球蛋白(一抗)(Abeam公司)孵育过夜，洗净多余的一抗，再以羊抗兔免疫球蛋白(二抗)(Abeam 公司)孵育lh，洗净多余的二抗，在暗室曝光，结果见图7。结果可见Hela癌细胞经顺钼化疗后，自吞噬相关基因Beclin-I表达增加；加入含Mir_30a_5p的牛初乳110000 X g离心中层液则抑制beclin-Ι基因表达其蛋白；牛成乳IlOOOOXg离心中层液对细胞beclin-Ι基因表达的抑制效果不明显。3. 3将培养他的贴壁细胞用纯甲醇固定lh，然后用PBS洗三遍，用兔抗人LC3免疫球蛋白(一抗)(Abeam公司)孵育池，用PBS洗去游离的一抗，孵以FITC标记的羊抗兔免疫球蛋白(二抗)(Abeam公司)，室温Ih后，用PBS洗净多余的二抗，在荧光显微镜下观察，拍照，结果见图8。结果表明牛初乳IlOOOOXg离心中层液可抑制顺钼化疗过的Hela癌细胞自吞噬形成自噬泡，进而抑制癌细胞依赖自吞噬而继续生存。3. 4将上述培养Mi的Hela细胞用培养基洗三遍，用胰酶消化3分钟，转入离心管 1700rpm离心5分钟，去除上清，加入100微升RIPA lysis (碧云天公司)裂解细胞30分钟，然后以12000Xg离心10分钟，去沉淀，测蛋白浓度后，加入蛋白上样液100°C煮5分钟， 然后上SDS-凝胶电泳80V，300mA转膜90分钟，牛奶封闭lh，用兔抗人LC3 —抗(Abeam公司)孵育过夜，洗净多余的一抗，再以羊抗兔免疫球蛋白(二抗)(Abeam公司)孵育lh，洗净多余的二抗，在暗室曝光，结果见图9。结果可见牛初乳IlOOOOXg离心中层液处理顺钼化疗过的Hela癌细胞，自噬体标志蛋白LC3-II/LC3-I的比例降低。3. 5将细胞用胰酶消化3分钟，用PBS洗3遍，1700rpm离心弃去上清液，加含Ca2+ 的凋亡细胞荧光孵育液(BD公司)100微升，然后加入PI和Armexin-V孵育15分钟，上流式细胞仪测量和计数，结果见图10。结果显示顺钼处理Hela癌细胞14h后，加入IOOyg 蛋白/ml牛初乳IlOOOOXg离心中层液，约38. 5%的细胞凋亡，而不加牛乳的细胞仅凋亡 1.86%，加牛成乳IlOOOOXg离心中层液的细胞凋亡率为1.43%。
权利要求
1.一种牛初乳提取物，其特征在于该提取物含有序列为SEQ ID NO. 1的Mir-30a-5p微囊泡。
2.根据权利要求1所述的牛初乳提取物，其特征在于所述的牛初乳为母牛产犊后最初 3天内的乳汁。
3.根据权利要求2所述的牛初乳提取物，其特征在于所述的牛初乳提取物通过如下方法获得将牛初乳以5000Xg离心30分钟后取中层液，再依次以12000Xg、35000Xg、 70000Xg、110000Xg的离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心 1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。
4.一种提取权利要求1所述的牛初乳提取物的方法，其特征在于将牛初乳以5000Xg 离心30分钟后取中层液，再依次以12000 X g,35000 X g、70000 X g、110000 X g得离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。
5.根据权利要求4所述的提取权利要求1所述的牛初乳提取物的方法，其特征在于所述的母牛产犊后最初3天内的乳汁。
6.权利要求1所述的牛初乳提取物在制备治疗各种癌症的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的癌症为乳腺癌、宫颈癌、白血病、肺癌、肝癌、肾癌、食道癌、卵巢癌、直肠癌、结肠癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨癌、鼻咽癌或脑瘤。
全文摘要
本发明涉及一种牛初乳提取物及其提取方法和应用，该提取物含有序列为SEQ ID NO.1的Mir-30a-5p微囊泡，可通过如下方法获得将牛初乳以5000×g离心30分钟后取中层液，再依次以12000×g、35000×g、70000×g、110000×g离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的110000×g离心中层液即为所述的牛初乳提取物。实验证实本发明牛初乳提取物含有丰富的Mir-30a-5p，用它处理经顺铂化疗后的癌细胞，可有效抑制其依靠吞噬自身而继续生存，加速死亡，可增进化疗药物的治疗效果。
文档编号A61K35/20GK102172360SQ20111003972
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者吴临平, 张辰宇, 张骑鹏, 曾科, 邹珍友 申请人:南京大学